Структурный полиморфизм кандидатных генов при аллергических заболеваниях (бронхиальная астма, аллергический ринит, атопический дерматит) у детей

На правах рукописи

Дедков Андрей Анатольевич СТРУКТУРНЫЙ ПОЛИМОРФИЗМ КАНДИДАТНЫХ ГЕНОВ ПРИ АЛЛЕРГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ (БРОНХИАЛЬНАЯ АСТМА, АЛЛЕРГИЧЕСКИЙ РИНИТ, АТОПИЧЕСКИЙ ДЕРМАТИТ) У ДЕТЕЙ 03.02.07 – генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва – 2012

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном уч реждении высшего профессионального образования «Курский государствен ный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор, академик РАЕН, заслуженный деятель науки РФ Иванов Владимир Петрович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Щипков Валерий Петрович доктор медицинских наук, профессор Петрин Александр Николаевич

Ведущая организация: Федеральное государственное автономное образова тельное учреждение высшего профессионального образования «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»

Защита диссертации состоится «29» февраля 2012 г. в 15 часов на заседании диссертационного совета Д 212.203.05 в ФГБОУ ВПО Российский университет дружбы народов по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо Маклая, дом 8.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке ФГБОУ ВПО «Российский университет дружбы народов» по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, дом 6.

Автореферат размещен на сайте www.vak.ed.gov.ru Автореферат разослан «_» 20_г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук, доцент О.Б. Гигани

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В изучении патогенеза аллергических заболе ваний многие вопросы остаются открытыми. Однако тот факт, что в основе формирования заболеваний лежит комплекс генетических и иммунных факто ров, является неоспоримым. В то время как детальному описанию иммунологи ческих реакций уделено уже достаточно много внимания, вопросы генетической предрасположенности остаются малоизученными. Выявить конкретную причину, вы зывающую развитие бронхиальной астмы (БА), атопического дерматита (АД), аллер гического ринита (АР), зачастую не представляется возможным. Большинство авторов относят их к мультифакториальным заболеваниям (МФЗ). В изучении генетической природы МФЗ в настоящее время все большее значение приобретает выявление в раз личных популяциях специфичных генов и средовых факторов, взаимодействие кото рых формирует устойчивость организма к изменяющимся условиям окружающей среды. В связи с этим наиболее интересными ДНК-маркерами для изучения токсико генетической компоненты МФЗ являются полиморфные варианты генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков. Данная группа генов относится к «кандидат ным» ввиду их участия в метаболизме медиаторов воспаления, оксидативном стрессе, детоксикации химических соединений. На сегодняшний день метабо лические механизмы участия ФБК в аллергических реакциях изучены недоста точно. Основные научные исследования ведутся для атопической БА, и полу ченные результаты весьма противоречивы. Причиной этому может служить эт нический фактор, эволюционно сложившийся именно в данной популяционной группе. В Курской области уже были проведены исследования на взрослой вы борке больных БА, полученные результаты однозначно указывали на влияние данной группы генов на реализацию заболевания. В связи с чем изучение по лиморфизма генов детоксикации у детей той же популяции, представляется ак туальной темой. Полученные результаты могут помочь понять первопричину возникновения атопии и помочь в превентивной диагностике, не допуская кли нически развернутой картины заболевания.

Цель исследования: провести комплексный анализ вовлеченности по лиморфных вариантов генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков в формирование предрасположенности к аллергическим заболеваниям (бронхи альная астма, аллергический ринит, атопический дерматит) у детей.

Задачи исследования:

1. Провести анализ ассоциации аллелей и генотипов полиморфных вари антов генов ФБК: I462V гена CYP1A1, H139R гена EPHX1, I105V гена GSTP1, +/del гена GSTT1, +/del гена GSTM1 с предрасположенностью к аллергическим заболеваниям у детей.

2. Изучить проявления полового диморфизма и возрастной манифестации в ассоциациях полиморфизма генов ферментов биотрансформации ксенобиоти ков при аллергических заболеваниях у детей.

3. Исследовать взаимодействия между различными классами генов фер ментов биотрансформации ксенобиотиков и дать оценку их комплексного влияния на риск возникновения заболеваний.

4. Изучить вклад средовых факторов на реализацию наследственной предрасположенности к аллергическим заболеваниям у детей в зависимости от носительства генотипов ФБК.

5. Разработать регрессионные статистические модели индивидуального прогнозирования риска развития бронхиальной астмы, аллергического ринита, атопического дерматита у детей с учетом полового диморфизма на основании исследованных молекулярно-генетических маркеров и средовых факторов.

Научная новизна. Впервые проведен комплексный молекулярно генетический анализ вовлеченности генов ферментов биотрансформации ксено биотиков при различных нозологических формах детских аллергических забо леваний: бронхиальной астме, аллергическом рините и атопическом дерматите.

Установлены гены, полиморфные варианты которых ассоциировались с повы шенным риском развития БА (GSTP1, GSTM1), а также АД (GSTP1, GSTT1).

Выявлен выраженный половой диморфизм генотипов генов ФБК, ассоцииро вавшихся с предрасположенностью к БА у мальчиков (del/del GSTT1, del/del GSTM1, 105IV GSTP1), АД у мальчиков (del/del GSTT1) и у девочек (462IV CYP1A1), а также установлено модулирующее влияние на возраст манифеста рассмотренных заболеваний. Получены новые данные о взаимодействиях гено тип-среда, формирующие предрасположенность к повышенному риску разви тия бронхиальной астмы у детей, подвергающихся фактору пассивного куре ния.

Практическая значимость работы. Полученные в ходе исследования данные о взаимосвязях генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков при аллергопатологии в детском возрасте рекомендуются к применению врачами аллергологами и врачами медико-генетических консультаций для прогнозиро вания, разработки индивидуальных лечебных мероприятий и предотвращения дальнейшего развития патологии.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Генетическими маркерами подверженности к бронхиальной астме у де тей являются генотип 105IV гена GSTP1, del/del гена GSTM1 и отсутствие дико го генотипа 105II гена GSTP1. Фактором генетической предрасположенности к атопическому дерматиту – мутантный генотип 105VV гена GSTP1, делецион ный генотип ded/del гена GSTT1.

2. Для мальчиков повышенный риск развития бронхиальной астмы ассо циируется с генотипами: del/del гена GSTT1, del/del гена GSTM1, 105IV гена GSTP1, а атопического дерматита с del/del гена GSTT1. Для девочек повышен ный риск атопического дерматита ассоциирован с присутствием генотипа 462IV гена CYP1A1.

3. Для раннего развитие бронхиальной астмы характерно наличие геноти пов: del/del гена GSTM1, del/del гена GSTT1, атопического дерматита, мутантно го генотипа 105VV гена GSTP1. Позднее развитие БА ассоциировано с геноти пом: 105IV гена GSTP1, АД с делеционным генотипом del/del гена GSTT1, для АР поздний возраст начала заболевания сочетается с отсутствием функцио нального генотипа 462II гена CYP1A1.

4. Предрасположенность к повышенному риску БА у детей определяется сочетанием средового фактора (табачный дым) и наличием определенных гено типов: 139RR гена EPHX1, 105IV гена GSTP1.

5. Установленные комбинации генотипов определяют повышенный риск возникновения. Установленные межгенные различия были обусловлены накоп лением среди больных главным образом вариантных генотипов обеих фаз био трансформации.

Апробация работы. Материалы работы доложены и обсуждены на науч ных конференциях: Итоговой научной сессии КГМУ и отделения медико биологических наук Центрально-Черноземного научного центра РАМН (Курск, 2008, 2009), Международной научной конференции молодых ученых медиков (Курск, 2008, 2009, 2010), 2-го Международного конгресса «Иммунитет и бо лезни» (Москва, 2007), Международной дистанционной научной конференции «Инновации в медицине» (Курск, 2008, 2009, 2010), Межвузовской научной конференции студентов и молодых ученых «Молодежная наука и современ ность» (Курск, 2009, 2010). По материалам диссертации опубликовано 16 пе чатных работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых журналах, рекомендуемых ВАК Минобрнауки РФ для публикации результатов диссертационных исследо ваний по медицинским наукам.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 16 работ в цен тральной и местной печати, в том числе в 3 изданиях, рекомендуемых ВАК для публикаций материалов докторских и кандидатских диссертаций.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, об зора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав ре зультатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, прак тических рекомендаций, библиографического списка и приложений. Работа из ложена на 92 страницах машинописного текста, содержит 29 таблиц. Библио графический список используемой литературы включает 198 источников, 101 из которых – зарубежный.

Личный вклад автора. Диссертационная работа представляет собой за конченный, самостоятельно выполненный труд автора. Все представленные в диссертации результаты получены лично Дедковым А.А. на базе лаборатории медицинской генетики кафедры биологии, медицинской генетики и экологии ГБОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет» Минздрав соцразвития РФ, им проанализированы отечественные и зарубежные источники по теме диссертации, получены и обобщены результаты исследования, прове дена статистическая обработка и анализ полученных данных. В работах, вы полненных в соавторстве, использованы результаты исследований с долей лич ного участия автора 75-95%.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал исследования. Материалом для исследования послужила вы борка детей, постоянно проживающих на территории Курской области. Всего было рассмотрено 450 случаев аллергических заболеваний. Из них 150 детей страдали бронхиальной астмой, 150 - аллергическим ринитом, 150 атопическим дерматитом. Молекулярно-генетический анализ проводился на базе лаборато рии медицинской генетики кафедры биологии, медицинской генетики и эколо гии Курского государственного медицинского университета. Клинико лабораторные исследования проводились на базе областной детской клиниче ской больницы г. Курска.

Методы исследования. Молекулярно-генетический метод. Выделение геномной ДНК осуществляли из замороженной (-20°С) венозной крови стан дартным двухэтапным методом фенольно-хлороформной экстракции. Лейкоци ты, осажденные дважды с PBS центрифугированием, лизировали в ТЕ-буфере протеиназой К в присутствии 0,4% додецилсульфата натрия. Клеточную сус пензию инкубировали в течение ночи в термостате при температуре 42°С. Ге номную ДНК экстрагировали из клеточного лизата в 3 этапа: сначала фенолом, насыщенным 10 мМ Трис-HCl (рН=8,0) (1:1), затем фенолом и хлороформом (по одному объему фенола и хлороформа на два объема надосадочной жидко сти) и последний раз хлороформом (1:1). ДНК преципитировали 96% этанолом, высушивали, растворяли в ТЕ-буфере, замораживали и хранили при -20°С. Ам плификацию фрагментов ДНК методом полимеpазной цепной pеакции (ПЦР) проводили в 12 мкл реакционной смеси, содержащей 0,5 мкл образца геномной ДНК. Смесь для амплификации включала: 67 мМ Трис-HCl pH=8,8, 16,6 мМ сульфата аммония, 6,7 мкМ ЭДТА, 2,0-7,0 мМ MgCl2, 1 мМ -меркаптоэтанола, 1 мМ каждого dNTPs (dATP, dCTP, dTTP и dGTP), 15 нМ каждого из праймеров и 1 е.а. Taq-полимеразы. Амплификацию проводили на многоканальном термо циклере «Терцик» (НПО «ДНК-Технология», Москва). Обработка продуктов ПЦР проводилась специфическими рестриктазами согласно протоколам, опи санным производителями ферментов. После инкубации рестрикционной смеси проводили разделение фрагментов ДНК с помощью электрофореза. В зависи мости от размера разделяемых фрагментов ДНК использовали агарозный гель различной концентрации 0,8-3,5%, приготовленный на основе ТВЕ буфера (0,089 М Трис-НСl, 2 мМ ЭДТА, 0,089 М борная кислота), а также 6-8% ПААГ (соотношение акриламид : метиленбисакриламид 29 : 1). После электрофореза окрашенные этидиумбромидом гели визуализировали в проходящем ультра фиолетовом свете на приборе компьютерной видеосъемки GDS-8000 (UVP Inc, США) с помощью программного аналитического пакета LabWorksTM v4. (США). В рамках проводимого исследования изучали 5 полиморфизмов 5 генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков: CYP1A1 (I462V), EPHX (H139R), GSTM1 (+/0), GSTT1 (+/0), GSTP1 (I105V).

Клинико-лабораторные методы. Первичная постановка диагноза осуще ствлялась на основе общеклинического обследования, проводимого квалифи цированными специалистами на базе областной детской клинической больницы г. Курска.

Вся исследуемая выборка также подвергалась общеклиническому иссле дованию: общий анализ крови, общий анализ мочи, анализ кала на яйца гель минтов и соскоб со слизистой прямой кишки на энтеробиоз, ЭКГ.

Комплекс клинико-лабораторных методов диагностики: постановка кож ных скарификационных проб с набором неинфекционных аллергенов (быто вых, клещевых, пищевых, пыльцевых) у детей старше 2 лет. Общий уровень IgЕ определяли с помощью иммуноферментного анализа.

Для больных БА в возрасте старше 6 лет проводилось исследование функции внешнего дыхания и пикфлоумерия. Отдельно у больных АР прово дилась риноцитоскопия для выявления тканевой эозинофилии.

Данный комплекс методов позволил выявить не только признаки наличия аллергопатологии, но и полностью дифференцировать диагноз.

Генетико-статистические методы. Статистический анализ полученных данных проводился на ПК с использованием пакета прикладных программ Sta tistiсa 6.0 фирмы StatSoft Inc. (США) и MS Excel (Реброва О.Ю., 2006). Для оценки соответствия распределений генотипов ожидаемым значениям при рав новесии Харди-Вайнберга (РХВ) в выборке и сравнении с частотами аллелей и генотипов разных групп проводили с помощью критерия 2 Пирсона, при ус ловии, когда объем выборки не превышал 10 случаев, использовали критерий с поправкой Йетса. Ожидаемую гетерозиготность рассчитывали по Nei. Об ассо циации аллелей или генотипов с предрасположенностью к заболеваниям суди ли по величине отношения шансов (OR) - показателю, отражающему, во сколь ко раз вероятность оказаться в группе «случай» (больные) отличается от веро ятности оказаться в группе «контроль» (здоровые) для носителя изучаемого ге нотипа. Межгенные взаимодействия изучали методом сопоставления частот парных сочетаний генотипов в группах больных и здоровых с расчетом критерия 2 и OR. Анализ взаимодействий генотип-среда проводился методом сопос тавления величин отношения шансов (OR), рассчитанных для индивидуальных генотипов в группах, сформированных по критерию наличия (ORf+) или отсутст вия (ORf-) средового фактора риска. Метод логистической регрессии исполь зовался для оценки влияния полиморфных генов ФБК на риск развития аллер гической патологии, ее клинические симптомы и особенности течения и разви тие осложнений.

Результаты и обсуждение собственных исследований 1. Сравнительный анализ распределения аллелей и генотипов ФБК в детерминации аллергических заболеваний (БА, АР, АД) у детей При анализе частот аллелей полиморфных вариантов генов контрольной группы с тремя нозологическими формами аллергических заболеваний, была вы явлена ассоциация вариантного аллеля 105Val гена GSTP1 с предрасположенно стью к БА (OR=1,57 95%CI 1,11–2,22, p=0,01) и АР (OR=0,65 95%CI 0,44–0,95, p=0,03). Распределение частот генотипов исследуемых полиморфизмов и их со ответствие популяционному равновесию Харди-Вайнберга (РХВ) проводилось раздельно в трех группах больных аллергическими заболеваниями и группе здоровых детей. Распределение генотипов в группе больных БА соответствова ло ожидаемому при равновесии РХВ (р0,05). С повышенным риском БА ассоции ровалось наличие гетерозиготного генотипа 105IV гена GSTP1(OR=1,69 95%CI 1,06–2,70, p=0,03), делеционного полиморфизма del/del GSTM1 (OR=1,72 95%CI 1,07–2,75, p=0,02) а также отсутствие дикого, гомозиготного генотипа 105II ге на GSTP1 (OR=1,91 95%CI 1,21–3,02, p=0,01), полиморфизма + GSTM (OR=1,72 95%CI 1,07–2,75, p=0,02). Мутантный генотип 139RR гена EPHX был несколько повышен у больных бронхиальной астмой, но не достигал ста тистически значимых различий (p=0,08).

В группе больных АР распределение генотипов соответствовало ожидае мому при равновесии РХВ (р0,05). У детей, больных АР, наблюдалась тенден ция в ассоциации дикого генотипа 462II гена CYP1A1 с предрасположенностью к заболеванию, которая не достигала статистически значимой разницы (OR=1,80 95%CI 0,94–3,44, p=0,08). Для большинства полиморфизмов в группе больных АД, распределение генотипов находилось в соответствии с РХВ (р0,05). Однако для полиморфизма 105IV гена GSTP1 отмечалось отклонение от РХВ (p=0,001), обусловленное повышением уровня фактической гетерозиготно сти (Но=0,313, Не=0,442, 2=12,7, р0,05). С повышенным риском развития АД у детей ассоциировались: наличие мутантного генотипа 105VV гена GSTP (OR=2,04 95%CI 1,02–4,08, p=0,04), делеционного полиморфизма del/del GSTT (OR=2,04 95%CI 1,16–3,59, p=0,01). Кроме того, наблюдалась тенденция в уве личении частоты нефункциональных генотипов del/del GSTM1 (OR=1,58 95%CI 0,99–2,53, p=0,06) и снижение нормальных генотипов + GSTM1 (OR=1, 95%CI 0,99–2,53, p=0,06) в группе больных АД, однако различия в частоте дан ных генотипов не достигали статистической значимости.

2. Изучение роли половозрастных особенностей в ассоциациях поли морфизма генов ФБК при аллергических заболеваниях у детей Учитывая известные данные что, фенотипические эффекты кандидатных генов при мультифакториальных заболеваниях проявляют половые различия по распространенности в популяции, представлялось актуальным провести анализ полиморфных вариантов генов ФБК с предрасположенностью к рассматривае мым аллергическим заболеваниям раздельно для мальчиков и девочек.

Как видно из представленных в таблице 1 результатов, наличие гетерози готного полиморфизма 462IV гена CYP1A1 (OR=4,43 95%CI 0,95–20,59, p=0,04) и отсутствие гомозиготного генотипа дикого типа 462II гена CYP1A1 (OR=4, 95%CI 0,95–20,59, p=0,04) ассоциировалось с риском развития АД и АР (OR=5,63 95%CI 1,16–27,22, p=0,02) только у девочек.

Таблица Проявления полового диморфизма в ассоциациях генотипов генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков с предрасположенностью к аллергическим заболеваниям Отношения шансов, OR (р0,05) Генотипы Бронхиальная астма Атопический дерматит Аллергический ринит М Д М Д М Д 462II CYP1A1 - - - 4,43 - 5, 462IV CYP1A1 - - - 4,43 - GSTM1 del/del 2,10 - - - - GSTM1+ 2,10 - - - - GSTT1 del/del 2,34 - 3,87 - - GSTT1+ 2,34 - 3,87 - - 105II GSTP1 2,05 - - - - 105IV GSTP1 1,85 - - - - М – мальчики, Д – девочки Наличие функционально неполноценного генотипа del/del GSTT1 ассо циировалось с повышенным риском развития БА (OR=2,34 95%CI 1,10–4,96, p=0,02) и АД (OR=3,87 95%CI 1,78–8,42, p=0,001) только у мальчиков. Также отсутствие нормального полиморфизма + GSTT1 ассоциировалось с предраспо ложенностью к БА (OR=2,34 95%CI 1,10–4,96, p=0,02) и АД (OR=3,87 95%CI 1,78–8,42, p=0,001) только у мальчиков. Отсутствие функционального генотипа + GSTM1 (OR=2,10 95%CI 1,20–3,66, p=0,01) и наличие делеционного поли морфизма del/del GSTM1 (OR=2,10 95%CI 1,20–3,66, p=0,01) ассоциировалось с повышенным риском развития БА у мальчиков. Кроме того, наличие гетерози готного генотипа 105IV гена GSTP1 (OR=1,85 95%CI 1,06–3,22, p=0,03) и от сутствие дикого гомозиготного генотипа 105II гена GSTP1 (OR=2,05 95%CI 1,18–3,56, p=0,01) ассоциировались с повышенным риском развития БА у маль чиков.

Неблагоприятные генетические комбинации в сочетании с ухудшающи мися условиями окружающей среды могут служить причиной раннего развития заболевания. Для проведения исследования нами были определены возрастные разделения детей по возрасту манифестации исследуемых заболеваний (табл. 2).

Таблица Проявления возрастных различий в ассоциациях генотипов генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков с предрасположенностью к аллергическим заболеваниям Отношения шансов, OR (р0,05) Генотипы Бронхиальная астма Атопический Аллергический дерматит ринит До 6 лет Старше До 3 лет Старше До 6 лет Старше 6 лет 3 лет 6 лет 462II CYP1A1 - - - - - 2, GSTM1 del/del 1,96 - - - - GSTM1+ 1,96 - - - - GSTT1 del/del 1,85 - - 2,79 GSTT1+ 1,85 - - 2,79 105II GSTP1 - 2,16 - - - 105IV GSTP1 - 2,03 - - - 105VV GSTP1 - - 2,4 - - Средний возраст манифеста БА составил 5,6±2,9 года. Учитывая эти дан ные, мы выбрали 6-летний возраст для разделения больных БА на две группы, с ранним возрастом (до 6 лет) и поздним (старше 6 лет) манифестом. У детей с АД был выбран возраст 3 лет как пограничный. У детей с АР возраст 6 лет. В таблице 2 представлены суммированные результаты статистически значимых ассоциаций генотипов ФБК с предрасположенностью к изучаемым аллергиче ским заболеваниям у детей.

Установлено, что наличие делеционного полиморфизма del/del GSTM (OR=1,93 95%CI 0,93–4,01, p=0,01), как и отсутствие функционального геноти па + GSTM1 (OR=2,10 95%CI 1,10–4,01, p=0,02) ассоциировались с риском раннего развития астмы. Аналогичные отсутствие генотипа + GSTT1 (OR=1, 95%CI 0,98–3,47, p=0,05) и наличие функционально неполноценного генотипа del/del GSTT1 (OR=1,85 95%CI 0,98–3,47, p=0,05) ассоциировались с риском раннего развития БА. У детей с поздним развитием бронхиальной астмы повы шенный риск развития заболевания ассоциировался с отсутствием нормального генотипа 105II гена GSTP1 (OR=2,16 95%CI 1,14–4,10, p=0,02) и носительством гетерозиготного полиморфизма 105IV гена GSTP1 (OR=2,03 95%CI 1,08–3,81, p=0,03). В группе детей с ранней манифестацией атопического дерматита му тантный полиморфизм 105VV гена GSTP1 повышал риск развития заболевания более чем в 2 раза (OR=2,40 95%CI 1,15–5,01, p=0,02). Отсутствие генотипа + GSTT1 (OR=2,79 95%CI 1,34–5,80, p=0,01) и наличие генотипа del/del GSTT (OR=2,79 95%CI 1,34–5,80, p=0,01) ассоциировались с повышенным риском позднего развития атопического дерматита. Отсутствие генотипа 462II CYP1A (OR=2,21 95%CI 1,03–4,75, p=0,02) ассоциировалось с повышенным риском позднего развития аллергического ринита у детей.

3. Оценка связи комбинаций генотипов и роль взаимодействий гено тип-среда в формировании предрасположенности к аллергическим заболе ваниям у детей Основные различия между группами здоровых и больных БА мальчиков определялись сочетаниями всех 5 изучаемых генных локусов, парные комбина ции которых формировали 12 ассоциаций с подверженностью к заболеванию.

Так, 6 комбинаций генотипов определяли повышенный риск возникновения БА у мальчиков: GSTT1 del GSTM1 del (OR=3,80), GSTT1 del GSTP1 105IV (OR=3,50), GSTT1 del CYP1A1 462II (OR=2,83), GSTM1 del CYP1A1 462II (OR=1,88), GSTM1 del EPHX1 139HR (OR=2,87), GSTP1 105IV CYP1A1 462II (OR=1,98). В то же время сочетания генотипов GSTM1+ GSTT1+ (OR=0,42), GSTT1 + GSTP1 105II (OR=0,46), GSTT1 + CYP1A1 462II (OR=0,47), GSTT + EPHX1 139HH (OR=0,5), GSTM1 + GSTP1 105II (OR=0,29), GSTP1 105II CYP1A1 462II (OR=0,46) обладали протективными свойствами в отношении риска развития БА у мальчиков. В группе девочек, больных БА, статистически значимых комбинаций не установлено.

У мальчиков ассоциации парных комбинаций генотипов с АР формирова лись посредством взаимодействия следующих 4 локусов: +/del GSTT1, +/del GSTM1, I105V GSTP1, I462V CYP1A1. Так, 2 комбинации генотипов определяли повышенный риск возникновения АР у мальчиков: GSTT1 del GSTP1 105II (OR=3,41), GSTM1 del GSTP1 105II (OR=2,85). Пониженный риск развития АР у мальчиков определяло лишь одно межгенное сочетание: GSTP1 105IV CYP1A1 462II (OR=0,51). У девочек обнаружена ассоциация с предрасположен ностью к АР по одной межгенной комбинации: GSTM1 del EPHX1 139HH (OR=3,48).

У мальчиков наследственная компонента предрасположенности к АД формировалась взаимодействием 5 локусов. Наиболее патогенетически важны ми межгенными взаимодействиями, определяющими предрасположенность к АД, а также существенно повышающими риск развития АД у мальчиков были следующие комбинации генотипов: GSTT1 del GSTM1 + (OR=2,96), GSTT1 del GSTP1 105II (OR=3,78), GSTT1 del CYP1A1 462II (OR=4,17), GSTT1 del EPHX1 139HH (OR=3,53), GSTM1 del GSTP1 105II (OR=2,96), CYP1A1 462IV EPHX1 139HR (OR=4,72). Протективными в отношении риска развития АД у мальчиков были парные межгенные сочетания генотипов: GSTT1 + GSTM1 + (OR=0,41), GSTT1 + GSTP1 105IV (OR=0,41), GSTT1 + CYP1A1 462II (OR=0,42), GSTT1 + EPHX1 139HH (OR=0,38), GSTM1 + GSTP1 105II (OR=0,50). У девочек обнаружены ассоциации 4 межгенных сочетаний геноти пов с АД, образованные взаимодействием 4 генных локусов: +/del GSTM1, I105V GSTP1, H139R EPHX1, CYP1A1 I462V, эти парные сочетания, которые снижали риск развития АД, в целом совпадали с таковыми у мальчиков: GSTM + GSTP1 105II (OR=0,42), GSTM1 + CYP1A1 462II (OR=0,44), CYP1A1 462II EPHX1 139HR (OR=0,43). И лишь одна комбинация ассоциировалась с повы шенным риском АД у девочек: GSTM1 del EPHX1 139HH (OR=4,69).

4. Влияние пассивного курения на предрасположенность к изучае мым аллергическим заболеваниям Типичным примером генно-средового взаимодействия, лежащего в осно ве любого мультифакториального заболевания, является фактор пассивного ку рения. В таблице 3 суммированы статистически ассоциации полиморфных ва риантов генов ФБК с риском развития БА, АР, АД в зависимости от фактора курения. В группе детей, больных БА, имеющих контакт с табачным дымом, мутантный генотип 139RR гена EPHX1, был ассоциирован более чем с 9-кратным увеличением риска развития астмы (OR=9,09 95%CI 1,13–72,84, p=0,03). Кроме того, в этой же группе выявлена ассоциация гетерозиготного ге нотипа 105IV гена GSTP1 с повышенным риском развития БА (OR=2,10 95%CI 1,10–4,01, p=0,02).

У детей, не имеющих контакта с табачным дымом, значимых ассоциаций ни по одному полиморфизму не установлено.

Таблица Влияние табачного дыма на риск развития аллергических заболеваний у детей с различными генотипами Отношения шансов, OR (р0,05) Генотипы Бронхиальная астма Атопический дерматит Аллергический ринит НК ПК НК ПК НК ПК EPHX1 139RR 0,68 0,97 3,29 0,99 0, 9,09* GSTP1 105IV 1,28 0,76 0,95 0,87 0, 2,10* НК – не подвержены курению, ПК – подвержены курению 5. Прогнозирование риска развития БА, АР, АД на основании анали за данных генотипирования полиморфизмов генов ФБК и средовых фак торов С целью внедрения результатов исследования в практическую работу дет ских аллергологов и врачей медико-генетических консультаций для превентив ной диагностики, нами были разработаны критерии прогнозирования риска возникновения БА, АД, АР с учетом полового диморфизма. Изучение влияния генотипов полиморфных вариантов генов и средовых факторов на риск разви тия аллергических заболеваний у детей проводили посредством логистического регрессионного анализа, который позволяет строить статистическую модель прогнозирования вероятности наступления события по имеющимся прогности чески ценным признакам (в нашем исследовании это полиморфные варианты генов ферментов детоксикации ксенобиотиков и средовые факторы).

Результатом логистического регрессионного анализа является расчет оце нок регрессионных коэффициентов b0, b1, b2 … bi уравнения:

y=b0+b1X1+b2X2+…+biXi, где Х1…Хi – независимые признаки (прогностически ценные).

Значение у в уравнении регрессии – это натуральный логарифм отноше ния шансов для изучаемого события. Вероятность этого события для каждого конкретного объекта исследования может быть вычислена по формуле:

Р=еу/(1+еу), где е – математическая константа, равная 2,72.

Наиболее прогностически ценной моделью в отношении риска развития БА у мальчиков была модель, включающая следующие предикторы: 2 поли морфизма генов ФБК - +/del GSTT1, +/del GSTM1, реакция на прививки, психо эмоциональная обстановка в семье до развития болезни Пациент А. Генотип + GSTT1, генотип + GSTM1, психоэмоциональная обстановка в семье до развития болезни удовлетворительная, реакции на при вивки не было.

Y = 4,35 + (-1,847 1) + (-1,963 1) + (-2,088 2) + 1,581 1 = - 2, P = 2,72-2,055/(1+2,72-2,055) = 0, Пациент Б. Генотип del/del GSTT1, генотип del/del GSTM1, психоэмоцио нальная обстановка в семье до развития болезни удовлетворительная, реакций на введение прививки в виде гиперемии.

Для пациента Б.:

Y = 4,35 + (-1,847 0) + (-1,963 0) + (-2,088 2) + 1,581 2 = 3, P = 2,723,336/(1+2,723,336) = 0, Таким образом, у пациента А. вероятность возникновения БА составляет 11%, а у пациента Б. – 96%.

Среди всех оцененных моделей в отношении риска возникновения АД у мальчиков наиболее прогностически ценной была следующая модель: генотип +/del GSTT1, фактор грудного вскармливания, частота ОРЗ.

Пациент Е. Генотип + GSTT, находился на грудном вскармливании, час тота ОРЗ до 2 раз в год.

Y = 4,552 + (-1,004 1) + (-1,523 2) + (-1,15 2) = -1, P = 2,72-1,792/(1+2,72-1,792) = 0, Пациент Н. Генотип del/del GSTT1, находился на искусственном вскарм ливании, частота ОРЗ 3-4 раза в год.

Y = 4,552 + (-1,004 0) + (-1,523 0) + (-1,15 3) = 1, P = 2,721,102/(1+2,721,102) = 0, Вероятность развития АД у пациента Е. - 14%, а у пациента Н. составляет 75%.

В отношении риска возникновения АД у девочек наиболее значимая мо дель включала следующие предикторы: генотип I462V CYP1A1, фактор грудно го вскармливания, частота ОРЗ.

Пациент И. Генотип 462II CYP1A1, находилась на грудном вскармлива нии, частота ОРЗ до 2 раз в год.

Y = 5,065 + (-1,21 1) + (-0,286 2) + (-2,079 2) = -0, P = 2,72-0,875/(1+2,72-0,875) = 0, Пациент Г. Генотип 462IV CYP1A1, находилась на искусственном вскармливании, частота ОРЗ до 2 раз в год.

Y = 5,065 + (-1,21 0) + (-0,286 0) + (-2,079 2) = 0, P = 2,720,907/(1+2,720,907) = 0, Таким образом, у пациента И. вероятность возникновения АД составляет - 29%, а у пациента Г. – 72%.

Наиболее значимая модель риска развития АР у девочек включала сле дующие предикторы: генотип I462V CYP1A1, фактор грудного вскармливания, частота ОРЗ, наличие вредностей на работе у матери.

Пациент Ж. Генотип 462II CYP1A1, находилась на грудном вскармлива нии, частота ОРЗ до 2 раз в год, на работе матери не имелось вредностей.

Y = 3,773 + (-2,197 1) + (-1,807 2) + (-1,073 2) + 1,936 1 = -2, P = 2,72-2,248/(1+2,72-2,248) = 0, Пациент В. Генотип 462IV CYP1A1, находилась на грудном вскармлива нии, частота ОРЗ до 2 раз в год, имелись вредности на работе матери.

Y = 3,773 + (-2,197 0) + (-1,807 2) + (-1,073 2) + 1,936 2 = 1, P = 2,721,885/(1+2,721,885) = 0, Вероятность развития АД у пациента Ж. составляет - 9%, а у пациента В.

- 86%.

Разработанные нами модели рекомендуется использовать для формиро вания групп риска развития аллергических заболеваний у детей с учетом поло вого диморфизма, а также для верификации диагноза и проведения лечебно профилактических мероприятий по предупреждению их развития.

ВЫВОДЫ 1. Установлены статистически значимые ассоциации генотипов фермен тов биотрансформации ксенобиотиков с риском развития бронхиальной астмы генотипы 105IV GSTP1, del/del GSTM1 и отсутствие 105II GSTP1 а также ато пического дерматита – генотипы 105VV GSTP1, del/del GSTT1.

2. В ассоциациях генотипов ферментов биотрансформации ксенобиоти ков с изучаемыми аллергическими заболеваниями наблюдался выраженный по ловой диморфизм: для мальчиков повышенный риск развития бронхиальной астмы ассоциировался с генотипами del/del GSTT1, del/del GSTM1, 105IV GSTP1. Риск развития атопического дерматита для мальчиков - с полиморфиз мом del/del GSTT1. Повышенный риск атопического дерматита для девочек с присутствием генотипа 462IV CYP1A1.

3. Генотипы ферментов биотрансформации ксенобиотиков оказывали мо дулирующее влияние на возраст манифеста рассмотренных заболеваний. На раннее развитие бронхиальной астмы оказывали влияние генотипы: del/del GSTM1, del/del GSTT1, на позднее 105IV GSTP1. Для раннего развития атопиче ского дерматита был характерен генотип 105VV GSTP1, для позднего - del/del GSTT1. Для аллергического ринита поздний возраст начала заболевания соче тался с отсутствием функционального генотипа 462II CYP1A1.

4. Выявлены статистически значимые взаимодействия генотип-среда, формирующие предрасположенность к повышенному риску развития бронхи альной астмы у детей, подвергающихся фактору пассивного курения, потенци рующиеся влиянием генотипов 139RR EPHX1, 105IV GSTP1.

5. Анализ частот парных взаимодействий генотипов ФБК выявил стати стически значимые различия в их распределении между группами больных и здоровых детей. Установленные межгенные различия были обусловлены нако плением среди больных, главным образом, вариантных генотипов обеих фаз биотрансформации.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. Рекомендовать для внедрения в практику медико-генетического кон сультирования тестирование полиморфизма генов ферментов биотрансформа ции ксенобиотиков в качестве превентивной диагностики бронхиальной астмы, атопического дерматита, аллергического ринита.

2. При консультировании детей для оценки вероятности развития брон хиальной астмы, атопического дерматита, аллергического ринита рекомендует ся использовать приемы математического прогнозирования с учетом комплекса диагностически ценных признаков, разделенных по полу, установленных в хо де логистического регрессионного анализа.

3. Рекомендовать введение в практику лабораторной диагностики аллер гических заболеваний (бронхиальной астмы, аллергического ринита и атопиче ского дерматита) и тестирования полиморфизмов генов ФБК с последующим их использованием в вопросах прогнозирования и разработки индивидуальных лечебных мероприятий для предупреждения дальнейшего развития заболева ний.

Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Дедков А.А. Связь генетических и иммунологических факторов в формировании атопического дерматита у детей / А.Д. Богомазов, Н.Г. Булатни кова // Иммунитет и болезни: материалы 2-го Междунар. конгр. – М., 2007. – С. 73.

2. Дедков, А.А. Некоторые генетические аспекты бронхиальной астмы у детей / А.Д. Богомазов, Н.Г. Булатникова // Иммунитет и болезни: материалы 2-го Междунар. конгр. – М., 2007. – С. 73.

3. Дедков, А.А. Иммунологические факторы развития аллергического ринита у детей / А.Д. Богомазов, Н.Г. Булатникова // Иммунитет и болезни: ма териалы 2-го Междунар. конгр. – М., 2007. – С. 74.

4. Дедков, А.А. Генетические и иммунологические механизмы в разви тии бронхиальной астмы у детей / Н.Г. Дедкова, А.Д. Богомазов, И.Ю. Растор гуев // Молодежная наука: от фундаментальной идеи до инновационных проек тов: материалы 73-й межвуз. науч. конф. студентов и молодых ученых (15-16 апр. 2008 г.): в 2 ч. – Курск: Изд-во КГМУ, 2007. – Ч. I. – С. 296.

5. Дедков, А.А. Анализ заболеваемости детей бронхиальной астмой на территории Курской области / Н.Г. Дедкова, А.Д. Богомазов, И.Ю. Расторгуев // Молодежная наука: от фундаментальной идеи до инновационных проектов: ма териалы 73-й межвуз. науч. конф. студентов и молодых ученых (15-16 апр.

2008 г.): в 2 ч. – Курск: Изд-во КГМУ, 2007 – Ч. I. – С. 297-298.

6. Дедков, А.А. Анализ заболеваемости аллергическим ринитом у детей Курской области / Н.Г. Дедкова, А.Д. Богомазов // Материалы Первой Между народной дистанционной научной конференции «Инновации в медицине» / КГМУ. – Курск, 2008. – С. 86-87.

7. Дедков, А.А. Генетические аспекты наследования бронхиальной аст мы / Н.Г. Дедкова, А.Д. Богомазов // Материалы Первой Международной дис танционной научной конференции «Инновации в медицине» / КГМУ. – Курск, 2008. – С. 88-89.

8. Дедков, А.А. Влияние наследственности на уровень заболеваемости детей атопическим дерматитом на территории Курской области / А.Д. Богома зов, В.П. Иванов, В.А. Афанасьев // Университетская наука: теория, практика, инновации: сб. тр. 73-й науч. конф. КГМУ и сессии Центр.-Чернозем. науч.

центра РАМН: в 3 т. – Курск: Изд-во КГМУ, 2008 – Ч. I. – С. 384-386.

9. Дедков, А.А. Изучение некоторых генетических аспектов и структуры заболеваемости бронхиальной астмы у детей на территории Курской области / А.Д. Богомазов, В.П. Иванов, В.А. Афанасьев // Университетская наука: теория, практика, инновации: сб. тр. 73-й науч. конф. КГМУ и сессии Центр.-Чернозем.

науч. центра РАМН: в 3 т. – Курск: КГМУ, 2008 – Ч. I. – С. 386-389.

10. Дедков, А.А. Наследственная предрасположенность в реализации брон хиальной астмы / Н.Г. Дедкова, М.С. Соболев // Молодежная наука и современ ность: материалы 74-й межвуз. итог. науч. конф. студентов и молодых ученых, посвященная Году молодежи в России (21-22 апр. 2009 г.). в 3 ч. – Курск: Изд во КГМУ, 2009. – Ч. 2. – С. 23-24.

11. Дедков, А.А. Изучение структуры заболеваемости бронхиальной аст мой детей на территории Курской области / Н.Г. Дедкова, М.С. Соболев, А.Н. Каплин // Молодежная наука и современность: материалы 74-й межвуз.

итог. науч. конф. студентов и молодых ученых, посвященная Году молодежи в России (21-22 апр. 2009 г.). в 3 ч. – Курск: Изд-во КГМУ, 2009. – Ч. 2. – С. 25-26.

12. Дедков, А.А. Задействованность иммунологических и генетических факторов в развитии бронхиальной астмы у детей на территории Курской об ласти / А.А. Дедков, И.Г. Хмелевская // Материалы IV Международной научной конференции молодых ученых-медиков (25-26 фев. 2010 г.): в 3 т. / под ред.

В.А. Лазаренко. – Курск: Изд-во КГМУ, 2010. – Т. 1. – С. 325-327.

13. Дедков, А.А. Изучение структуры заболеваемости детей атопическим дерматитом на территории Курской области / А.А. Дедков, Хмелевская И.Г. // Материалы IV Международной научной конференции молодых ученых меди ков (25-26 фев. 2010 г.) : в 3 т. / под ред. В.А. Лазаренко. – Курск: Изд-во КГМУ, 2010. – Т. 1. – С. 327-330.

14. Исследование связи полиморфизма Ile105Val гена GSTP1 с разви тием атопической бронхиальной астмы у детей в Курской области / А.А. Дедков, А.Д. Богомазов, В.П. Иванов и др. // Курский науч.-практ.

вестн. «Человек и его здоровье». – 2011. – № 1. – С. 31-36.

15. Дедков, А.А. Анализ полиморфизма гена глутатион-S-трансферазы (Ile105Val) GSTP1 при атопическом дерматите у детей / А.А. Дедков, А.Д. Богомазов // Врач-аспирант. – 2011. – № 1.3(44). – С. 418-424.

16. Анализ ассоциаций полиморфизма гена микросомальной эпоксид гидролазы (His139Arg) с риском развития бронхиальной астмы у детей в Курской области / А.А. Дедков, А.Д. Богомазов, В.П. Иванов и др. // Естест венные и технические науки. – 2011. - № 2(52). – С. 111-117.

Дедков Андрей Анатольевич Структурный полиморфизм кандидатных генов при аллергических заболеваниях (бронхиальная астма, аллергический ринит, атопический дерматит) у детей В работе представлены результаты исследования, отражающие вовлечен ность генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков в формирование ал лергических заболеваний у детей. Установлен выраженный половой димор физм и модулирующее влияние на возраст манифеста наиболее распространен ных атопических заболеваний: бронхиальной астмы, аллергического ринита и атопического дерматита. Разработаны критерии раннего прогнозирования риска возникновения изучаемых заболеваний. Результаты исследования рекоменду ются к использованию в научных исследованиях, а также в практической меди цине.

Dedkov Andrey Anatolyevich The structural polymorphism of the candidate genes in children with the allergic diseases (bronchial asthma, allergic rhinitis and atopic dermatitis) The results of this work represent the role of the xenobiotics biotransformation enzymes genes in the developing of the allergic diseases in children. It has been found pronounced sexual dimorphism and modulating influence on the onset of mani festation of the most widespread atopic diseases: bronchial asthma, allergic rhinitis and atopic dermatitis. The prognostic criterias were elaborated to predict the risk of developing of these diseases. The results of this investigation are recommended to application in the scientific researches and practical medicine.

Лицензия ЛР № 020862 от 30.04.99 г.

Сдано в набор 01.11.2011 г. Подписано в печать 03.11.2011 г.

Формат 30х421/8. Бумага офсетная. Гарнитура Times New Rom.

Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,0.

Тираж 100 экз. Заказ №. 177"А".

Издательство Курского государственного медицинского университета 305041, г. Курск, ул. К. Маркса, 3.