Молекулярно-генетические основы сахарного диабета типа 1 и его осложнений

На правах рукописи

Балхиярова Жанна Радиковна МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ САХАРНОГО ДИАБЕТА ТИПА 1 И ЕГО ОСЛОЖНЕНИЙ 03.00.15 – генетика 14.00.03 – эндокринология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва-2009

Работа выполнена в Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук и Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет Росздрава» Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Мустафина Ольга Евгеньевна доктор медицинских наук, профессор Моругова Татьяна Вячеславовна

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Асанов Алий Юрьевич доктор медицинских наук, профессор Кураева Тамара Леонидовна Ведущая организация. Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный медико-стоматологический университет»

Защита диссертации состоится «16» декабря 2009 г. в «» часов на заседании диссертационного совета Д 212.203.05 при ГОУ ВПО «Российский университет дружбы народов» по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо Маклая, д. 8.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке ГОУ ВПО «Российский университет дружбы народов» по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 6.

Автореферат разослан «» ноября 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, О.Б. Гигани кандидат биологических наук, доцент

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Сахарный диабет типа 1 (СД1) – хроническое заболевание, которое встречается у 0,4% населения до 30 лет, а в течение всей жизни риск заболевания составляет 1% (Karvonen M. et al., 2000). Считается, что СД1 развивается вследствие аутоиммунной деструкции бета-клеток островков Лангерганса поджелудочной железы и абсолютной недостаточности выработки инсулина (Дедов И.И. и др., 2002). СД1 повышает риск ранней смертности в результате развития острых и хронических осложнений.

В России заболеваемость СД1 составляет 13,3 на 100 тыс. населения, в Башкортостане в 2008 году – 9,7 на 100 тыс. населения (Дедов И.И. и др., 2008;

Байбурина Г.Г. и др., 2009).

СД1 – многофакторное полигенное заболевание. Оно развивается при воздействии факторов окружающей среды на генетически предрасположенный организм. Вклад генетических факторов в развитие СД1 составляет 60–80% (Дедов И.И. и др., 2002). К настоящему времени сформирован список генов кандидатов СД1 (http://www.t1dbase.org/page/CandidateGenes). С изучением молекулярно-генетических основ СД1 открываются перспективы в решении медицинских и социальных проблем, связанных с заболеванием. Центральным звеном аутоиммунной деструкции бета-клеток поджелудочной железы является нарушение регуляции процесса апоптоза. Активация программируемой клеточной смерти происходит под влиянием увеличенной выработки оксида азота (NO) и повышения экспрессии FAS-рецепторов. Важную роль в апоптозе играют цитокины. Одним из основных механизмов прогрессирования СД является нарушение дифференцировки Т-клеток с увеличенным образованием Т-хелперов 1-го типа, вырабатывающих провоспалительные цитокины (ИЛ-6, ИЛ-12, ЛТА), оказывающие цитотоксическое воздействие на бета-клетки.

Противовоспалительные цитокины при этом синтезируются (ИЛ-10) в недостаточном количестве. В связи с вышеизложенным, представляется актуальным изучить вклад генов цитокинов и апоптоза в развитие СД1.

При молекулярно-генетическом исследовании многофакторных заболеваний, в том числе СД1, для расчета индивидуального прогноза и создания основанных на нем рекомендаций необходимо учитывать специфику конкретной популяции. Население республики Башкортостан в целом, башкирский и татарский этносы в частности, с точки зрения генетической структуры популяций являются своеобразными: в состав их генофонда в разных пропорциях входят европеоидные и монголоидные компоненты. Поэтому важно обоснование генетического маркирования СД в Башкортостане, по крайней мере, по тем локусам, которые ассоциированы с риском заболевания в других популяциях и этносах.

Цель работы состояла в молекулярно-генетическом анализе предрасположенности к СД1 и его осложнениям с использованием полиморфных маркеров генов цитокиновой сети и апоптоза в этнически однородных группах (русские, татары и башкиры) населения Республики Башкортостан.

Задачи исследования:

Охарактеризовать клинические особенности пациентов с СД1 и оценить 1.

влияние отягощенного по СД1 и СД2 семейного анамнеза на риск развития осложнений у больных СД1 и возраст дебюта заболевания.

В группе больных и группе сравнения определить частоты аллелей 2.

и генотипов по полиморфным локусам генов интерлейкина 12 (IL12B, 1159AC), интерлейкина 10 (IL10, -627CA), интерлейкина 6 (IL6, -572GC), лимфотоксина (LTA, 252AG), рецептора интерлейкина 1 типа 1 (IL1R1, 3653ТG), рецептора фактора некроза опухолей альфа типа 1 (TNFR1, 36ТС), рецептора FAS (FAS, 670AG), индуцибельной синтазы оксида азота (NOS2, 150СТ), каспазы- (CASP1, -877СТ), гена рецептора витамина D (VDR, 352CT).

Провести анализ ассоциаций аллельных вариантов исследуемых генов с СД1.

3.

Оценить вклад аллельных вариантов перечисленных генов в развитие 4.

поздних осложнений СД1 (нефропатии, ретинопатии, дислипидемии).

Научная новизна исследования: Получены новые данные по ассоциациям полиморфных локусов генов цитокиновой сети (IL12B, IL6, IL10), апоптоза (LTA, IL1R1, TNFR1, FAS) и гена VDR с СД1 и его клиническими проявлениями в трех этнических группах населения Республики Башкортостан (русских, татар и башкир). Обнаружены ассоциации аллельных вариантов генов LTA (252AG), FAS (-670AG) и TNFR1 (36АG) с СД1 у этнических русских и татар. Выявлены генотипы повышенного риска СД1 у женщин:

IL10 627*А/*А (татар), IL10 627*С/*А (русских) и VDR 352*C/*C (башкир).

Найдены ассоциации с возрастом манифестации СД1 полиморфных маркеров генов IL12B (1159AC), IL10 (–627CA), TNFR1 (36ТС) у русских и IL1R (3653ТG) у башкир. Установлено, что у этнических русских генотип вовлечен в развитие нефропатии, повышенный риск IL10 627*С/*А дислипидемии маркирует генотип IL12B 1159*А/*А, а носители генотипа IL6 -572*G/*G имеют повышенный риск развития диабетической ретинопатии.

Практическая значимость работы. Результаты работы могут быть использованы при разработке основ медико-генетического консультирования больных СД1 и членов их семей. Полученные данные позволят прогнозировать развитие СД1, формировать группы риска и осуществлять в них активный мониторинг.

Внедрение в практику. Результаты и основные положения диссертационной работы внедрены в диагностическую и лечебно профилактическую деятельность МУ ГКБ№21 ГО г. Уфы и включены в учебный процесс кафедры эндокринологии и ИПО ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет Росздрава».

Положения, выносимые на защиту:

В структуру наследственной предрасположенности к СД1 вносят вклад 1.

аллельные варианты генов цитокиновой сети и апоптоза.

Существуют этнические особенности в структуре наследственной 2.

предрасположенности к СД1 и его поздним осложнениям. В их развитие вносит вклад полиморфизм генов LTA, FAS, TNFR1, IL10, IL12B, IL6 у русских, генов LTA, FAS, TNFR1, IL1R1 у татар, гена VDR у башкир.

С возрастом дебюта заболевания ассоциированы полиморфные локусы:

3.

IL12B (1159AC), IL10 (-627CA), IL6 (-572GC), TNFR1 (36ТС), IL1R1 (3653ТG).

Аллельные варианты генов и 4. IL10 (-627CA) VDR (352CТ) ассоциированы с СД1 только у женщин.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на V Всероссийском конгрессе эндокринологов “Высокие медицинские технологии в эндокринологии” (Москва, 2006), 42-м Ежегодном съезде Европейской ассоциации по изучению диабета (Copenhagen/Malmoe, 2006), 9-м Европейском обществе эндокринологов (Birmingham, 2007), 4-м Конгрессе эндокринологов (Rovinj, 2007), 40-й Европейской конференции по генетике человека (Barcelona, 2007), Научно-практической конференции эндокринологов Республики Башкортостан “Актуальные вопросы эндокринологии” (Уфа, 2008, 2009), Всероссийском Конгрессе “Диабет и почки” (Москва, 2009). Результаты работы отмечены дипломом степени на Всероссийском 1-й 4-м диабетологическом конгрессе (Москва, 2008), дипломом лауреата Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов “Актуальные проблемы современной эндокринологии” (Москва, 2008).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 22 работы, из которых 1 статья в рецензируемом журнале ВАК, 1 учебное пособие, 1 патент на изобретение.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа включает в себя следующие разделы: введение, обзор литературы, материал и методы, результаты исследования, обсуждение, выводы, список используемых источников, приложение. Работа изложена на 160 страницах машинописного текста, содержит 50 таблиц и 5 рисунков. Список используемых источников включает 254 ссылки на 34 работы отечественных и 220 работ зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Обследовано 339 пациентов с диагнозом СД1: 132 русских, 137 татар и башкир (таблица 1). Различий между группами больных разной этнической принадлежности по календарному возрасту, возрасту манифестации заболевания, частотам осложнений СД1 не было.

Таблица 1 – Характеристика больных сахарным диабетом типа Женщины, n=169 Мужчины, n= Средний возраст: 27,7±1,0 лет Средний возраст 32,6±1,0 лет Средний возраст начала заболевания:

18,4±0,8 лет 22,7±1,0 лет Сахарный диабет типа 1 без осложнений, n=132 (38,9%) Диабетическая ретинопатия (ДР), n=132 (38,9%) I стадия, n=60 (45,5%) II стадия, n=61 (46,2%) III стадия, n=11 (8,3%) Диабетическая нефропатия (ДН), n=114 (33,9%) I стадия, n=41 (36,0%) II стадия, n=56 (49,1%) III стадия, n=17 (14,9%) Полинейропатия, n= 89 (26,3%) Дислипидемия (ДЛП), n= 80 (23,6%) В контрольную группу вошли 970 практически здоровых лиц разной этнической принадлежности: русских (178 мужчин и 210 женщин), татар ( мужчины и 119 женщин) и башкир (99 мужчин и 131 женщина), средний возраст составил у мужчин 36,2 (36,2±0,4) лет, у женщин 35,6 (35,6±0,5) лет, неродственных между собой, без клинических симптомов СД и наследственной отягощенности по изучаемому заболеванию. У всех обследуемых было получено письменное информированное добровольное согласие на проведение биомедицинских исследований.

Лабораторно-инструментальные методы исследования включали определение сахара в крови в течение суток глюкозооксидантным методом на анализаторе гликированного гемоглобина жидкостной “Super GL”;

хроматографии под давлением на экспресс-системе “Glycomat DS5”. Диагноз сахарного диабета устанавливался согласно критериям ВОЗ (1999):

концентрация глюкозы в цельной капиллярной крови натощак 6,1 ммоль/л, постпрандиальная гликемия 11,1 ммоль/л. Верификация диагноза СД основывалась на клинических признаках, свидетельствующих об абсолютном дефиците инсулина (похудание и кетоацидоз в дебюте заболевания), а также показателях гликемии. Диагноз аутоиммунного СД1 у впервые выявленных больных был подтвержден наличием иммунологических маркеров заболевания, а именно аутоантител к глютаматдекарбоксилазе, инсулину и бета-клеткам, а также снижением уровня С-пептида (менее 0,78 нг/мл натощак) и инсулина (менее 20 мкЕд/мл). Определение аутоантител, С-пептида и инсулина проводили на планшетном иммуноферментном анализаторе “Star Fax 3200”.

Стадии ДН устанавливали согласно классификации М.В. Шестаковой (2000). Стадии ДР определяли по классификации E.Kohner и M. Porta (1991).

СКФ определяли по формуле Кокрофта-Гольта (Cockcroft-Gault, 1976).

Содержание липидов (ТГ, ОХС, ХС-ЛПВП) и креатинина в плазме крови определяли спектрофотометрическим методом при помощи диагностических наборов фирмы “Cormay”. Уровень ХС-ЛПНП, ХС-ЛПОНП вычисляли по формулам Фридвальда (Friedewold W. et al., 1972). Прогностический показатель КА определяли по формуле, предложенной А.Н. Климовым (1989). Параметры липидного обмена оценивали согласно критериям Международной федерации диабета (2005).

ДНК выделяли из цельной венозной крови методом фенольно-хлороформной экстракции (Mathew M. et al., 1984). Анализ генетического полиморфизма осуществляли методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) или ПЦР с последующим рестрикционным анализом. Анализ продуктов ПЦР проводили при помощи электрофореза в агарозном или полиакриламидном геле с последующим окрашиванием раствором бромистого этидия и визуализацией в УФ-свете.

Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием пакета прикладных программ Statistica for Windows V. 6.0, программного обеспечения MSExcel’98 (Мicrosoft) и компьютерной программы RxS (RowsxColumns) (Roff P.A. et al., 1989). Рассчитывали средние значения исследуемых величин, их стандартные отклонения, ошибку среднего и 95%-ый доверительный интервал. Частоты генотипов и аллелей сравнивали с использованием точного двустороннего критерия Фишера. Относительный риск заболевания (OR, соотношение шансов, odds ratio) вычисляли по формуле Bland J.M. (2000). Соответствие наблюдаемого распределения значений количественных показателей нормальному закону распределения оценивалось с использованием критерия Шапиро-Уилка. При сравнении групп по количественному признаку в случае соответствия его нормальному распределению использовался t-критерий Стьюдента для независимых групп, равенство дисперсий распределений признаков проверялось при помощи критерия Левена, в противном случае применялся U-критерий Манна-Уитни (Гланц С., 1999;

Реброва О.Ю., 2002).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Исследование влияния наследственной предрасположенности к сахарному диабету на возраст манифестации заболевания и риск поздних осложнений В результате изучения семейного анамнеза выявлено, что 32% больных СД1 имели наследственную отягощенность по СД1 или СД2. В связи с этим, нами был проведен корреляционный анализ для выявления возможной связи между наследственной предрасположенностью к СД1, возрастом дебюта заболевания и его поздними осложнениями. Выявлена обратная зависимость между возрастом манифестации заболевания и отягощенным семейным анамнезом по СД1 у пациентов (r=-0,20, р=0,001). У больных, имевших родственников с СД1, заболевание возникало раньше (r=16,8±1,3 лет), чем у больных с неотягощенным семейным анамнезом (r=21,7±0,8 лет, р=0,002).

У больных СД1 с неотягощенным семейным анамнезом по СД1 уровень ХС-ЛПВП был значительно выше, чем у пациентов, имевших больных родственников (1,29 и 2,39 ммоль/л, соответственно, р=0,001) (таблица 2).

Таблица 2 – Показатели липидного обмена у больных сахарным диабетом типа 1 в зависимости от семейного анамнеза по данному заболеванию Больные с Больные с неотягощенным отягощенным Показатель анамнезом по СД1, р анамнезом по СД1, ммоль/л ммоль/л ОХС 4,69±0,10 4,72±0,32 0, ХС-ЛПВП 2,39±0,67 1,29±0,25 0, ХС-ЛПНП 2,44±0,13 2,32±0,28 0, ХС-ЛПОНП 0,58±0,03 0,63±0,10 0, ТГ 1,25±0,06 1,38±0,22 0, КА 2,66±0,13 3,20±0,32 0, Обнаружена взаимосвязь между отягощенным семейным анамнезом по СД2 и наличием диабетической нефропатии у больных СД1 (r=0,16, p=0,029).

Показатель OR составил 2,08 (CI: 1,02–4,26). В работах других авторов также показано, что у больных СД1, у ближайших родственников которых выявлен СД2, предрасположенность к нефропатии в 3 раза выше (Lin J. et al., 2008).

Анализ ассоциаций аллельных вариантов генов-кандидатов с сахарным диабетом типа Выявлены статистически значимые различия между группой больных СД и контрольной группой в распределении частот аллелей и генотипов по полиморфным локусам генов LTA (252АG), FAS (-670AG) и TNFR1 (36AG).

У этнических татар генотип LTA 252*A/*А и аллель LTA 252*A встречаются достоверно реже, чем в контрольной группе (36,80% против 51,90%, P=0,01 и 60,80% против 70,46%, P=0,01, соответственно) (рисунок 1).

русские контроль татары 53, больные 60 51, 46, 48, 50 40,0 38, 37, 36, Частота, % Частота, % 15,2 14, 11, 20 7, 10 Генотип *А/*А *А/*G *G/*G *A/*A *A/*G *G/*G Рисунок 1 – Распределение частот генотипов по полиморфному локусу 252АG гена LTA у больных СД1 и контрольной группе Показатель OR заболевания составляет по генотипу LTA 252*A/*А 0, (CI: 0,35–0,84) и аллелю LTA 252*A – 0,65 (CI: 0,47–0,90). Это дает основания считать генотип LTA 252*A/*А и аллель LTA 252*A маркерами пониженного риска в отношении развития СД1 у татар. У больных СД1, русских по этнической принадлежности, генотип LTA 252*G/*G и аллель LTA 252*G наблюдается чаще, чем в контрольной группе (14,96% против 6,96%, P=0,01 и 34,25% против 24,96%, P=0,04 соответственно) (рисунок 1). Поэтому генотип LTA 252*G/*G и аллель LTA 252*G можно отнести к маркерам повышенного риска развития СД1 у русских, OR по данному генотипу и аллелю составляет 2,35 (CI: 1,24–4,46) и 1,41 (CI: 1,04–1,92). У этнических башкир не выявлено ассоциации полиморфного локуса LTA 252АG с СД1.

В таблице 3 представлены распределения частот генотипов и аллелей по полиморфному локусу -670AG гена FAS.

У больных СД1 по сравнению с контрольной группой, татар по этнической принадлежности, частота генотипа FAS -670*A/*G повышена (Р=0,03), а частота генотипа понижена FAS -670*A/*A – (Р=0,049).

Соответственно, OR по генотипу FAS -670*A/*G составляет 1,66 (CI: 1,08–2,55) и по генотипу FAS -670*A/*A OR=0,63 (CI: 0,41–0,98). Среди больных СД (русских по этнической принадлежности) по сравнению с группой контроля чаще встречаются носители генотипа FAS -670*G/*G (P=0,01), что позволяет отнести данный генотип к предрасполагающим к заболеванию (OR=2,38, CI: 1,28–4,45). Группа больных СД1, башкир по этнической принадлежности, по частотам аллелей и генотипов не отличается от контрольной группы.

Таблица 3 – Результаты анализа ассоциаций полиморфного локуса -670AG гена FAS с сахарным диабетом типа Этническая Генотип/ Контроль Больные Р группа аллель n p±sp(%) n p±sp(%) *A/*A 131 45,02±2,92 42 34,43±4,3 0, *А/*G 104 35,74±2,81 58 47,54±4,52 0, Татары *G/*G 56 19,24±2,31 22 18,03±3,48 0, *А 366 62,89±2,0 142 58,2±3, 0, *G 216 37,11±2,0 102 41,8±3, *A/*A 164 46,99±2,67 44 36,97±4,43 0, *А/*G 157 44,99±2,66 55 46,22±4,57 0, Русские *G/*G 28 8,02±1,45 20 16,81±3,43 0, *А 485 69,48±1,74 143 60,08±3, 0, *G 213 30,52±1,74 95 39,92±3, Примечание здесь и далее: n – численность, p– частота генотипа или аллеля;

sp– ошибка частоты;

Р– уровень значимости различий.

Обнаружены ассоциации полиморфного локуса 36AG гена TNFR с СД1. У больных по сравнению с группой контроля, татар по этнической принадлежности, наблюдается значимое снижение частоты генотипа TNFR1 36*A/*A (16,15% против 26,00%, P=0,04). Показатель OR заболевания по данному генотипу составляет 0,55 (CI: 0,32-0,95), что позволяет отнести его к маркерам пониженного риска в отношении развития СД1 у татар. В то же время, не выявлено статистически значимых различий по частотам генотипов между группами больных СД1 и контрольной, ни у русских, ни у башкир.

Анализ ассоциаций полиморфизма генов IL10 и VDR с сахарным диабетом типа 1 в зависимости от гендерной принадлежности При анализе ассоциаций полиморфного локуса 627CA гена IL10 с СД выявлено следующее. Частота генотипа IL10627*C/*А у больных СД1 женщин, русских по этнической принадлежности, повышена (55,22% по сравнению с 37,11% в контрольной группе, P=0,01);

OR СД1 составляет 2,09 (CI: 1,17–3,73), что позволяет сделать заключение о значении данного генотипа как маркера риска заболевания у женщин (таблица 4). Также обнаружено снижение частоты генотипа IL10 -627*А/*А у больных женщин, татарок по этнической принадлежности 1,64% (по сравнению с 12,38% в контрольной группе, P=0,02);

показатель OR по генотипу IL10 -627*А/*А составляет 0,12 (CI: 0,02–0,94), следовательно, этот генотип можно оценивать как маркер пониженного риска СД у женщин (татары). У мужчин, русских и татар по этнической принадлежности, не выявлено ассоциации полиморфного локуса 627CA гена IL10 с СД1. Не обнаружено ассоциаций этого локуса с СД1 у башкир.

Таблица 4 – Распределение частот генотипов и аллелей полиморфизма 627CA гена IL10 в группе больных сахарным диабетом типа 1 женщин и в контрольной группе Этническая Генотип/ Контроль Больные Р группа аллель n p±sp(%) n p±sp(%) *C/*C 52 49,52±4,88 32 52,46±6,39 0, *C/*A 40 38,1±4,74 28 45,9±6,38 0, Татары *A/*A 13 12,38±3,21 1 1,64±1,63 0, *C 144 68,57±3,20 92 75,41±3, 0, *A 66 31,43±3,20 30 24,59±3, *C/*C 88 55,35±3,94 28 41,79±6,03 0, *C/*A 59 37,11±3,83 37 55,22±6,08 0, Русские *A/*A 12 7,55±2,10 2 2,99±2,08 0, *C 235 73,9±2,46 93 69,4±3, 0, *A 83 26,1±2,46 41 30,6±3, В группе больных женщин, башкирок по этнической принадлежности, при сравнении с группой контроля, выявлена более высокая частота аллеля VDR 352*T (37,20 и 21,20%, Р=0,04, соответственно), и более низкая частота генотипа VDR 352*C/*C (39,70 и 60,60%, Р=0,048) (рисунок 2). Показатель OR по аллелю VDR 352*Т составил 2,01 (СI: 1,05–3,86), а по генотипу VDR 352*С/*С 0,43 (СI: 0,21–0,90). Таким образом, выявлены ассоциации с СД1 у этнических русских и татар (IL10 -627CA), а также башкир (VDR 352CT).

контроль 60, больные 60 48, 40, Частота, % 36, 10, 3, Генотип *С/*С *С/*Т *Т/*Т Рисунок 2 – Распределение частот генотипов полиморфного локуса 352CT гена VDR у больных СД1 и в контрольной группе женщин, этнических башкирок Анализ ассоциаций полиморфных вариантов генов-кандидатов с возрастом дебюта сахарного диабета типа Представляет интерес проведение анализа ассоциаций полиморфных локусов с СД1 с учетом возраста его манифестации. Среди этнических русских обнаружено следующее. Генотип IL12B 1159*С/*С встречается в группе больных с поздним развитием заболевания чаще (16,28%), чем в группе больных с ранним дебютом заболевания (1,92%, Р=0,02), поэтому его можно отнести к маркерам риска позднего начала заболевания (рисунок 3). Генотип выявлен только у больных СД1 с развитием заболевания IL10 -627*А/*А в возрасте до 18 лет, тогда как у больных с началом СД1 после 18 лет он не обнаружен (11,54% и 0%, Р=0,03). Отмечается повышение частоты генотипа IL10 -627*С/*А в группе больных с ранним возрастом манифестации СД (59,62%) по сравнению с таковым в контрольной группе (37,12%, Р=0,03).

Генотип IL10627*С/*С значительно реже встречался в группе больных с началом заболевания в возрасте 18 лет и младше (28,85%) чем в группе сравнения (55,52%, Р=0,01) и у пациентов с поздним дебютом СД1 (59,09%, Р=0,04). Соответственно, частота аллеля IL10627*А выше у больных с ранним началом заболевания (41,35%), чем в контрольной группе (25,92%, Р=0,003) и у пациентов в поздним дебютом СД1 (20,45%, Р=0,03). В группе пациентов с ранним развитием СД1 по сравнению с теми, у кого отмечено позднее начало заболевания частота встречаемости генотипа IL6-572*G/*G выше (88,68% против 71,11%, Р=0,04), а генотипа IL6-572*G/*С ниже (29,89% и 11,32% соответственно, Р=0,04).

IL10 627CA % IL12B 1159AC 65,5 67,3 59, 55,8 59, 55, 60 Частота, % 40, 37, 40 29,5 27, 28, 30, 16, 11, 20 7, 5,0 1,9 0, *С/*С *С/*А *А/*А *А/*А *А/*С *С/*С Генотип TNFR1 36AG IL6 -527GC 88, 58, 76, 54, 71, 46, 42, Частота, % Частота, % 27, 27, 40 23, 28,9 17, 11, 22, 1,4 4, 0,0 0, Генотип *A/*A *A/*G *G/*G *G/*G *G/*C *C/*C больные СД1 с поздним дебютом контроль больные СД1 с ранним дебютом Рисунок 3 – Распределение частот генотипов полиморфных локусов генов IL12B, IL10, IL6 и TNFR1 в группах контроля и больных СД1 с ранним и поздним дебютом заболевания (русских по этнической принадлежности) В группе больных СД1, русских по этнической принадлежности, генотип TNFR1 36*A/*A встречается существенно чаще у лиц с поздним (после 18 лет) дебютом заболевания (26,98%) по сравнению с пациентами, которые заболели в 18 лет и младше (4,00%, Р=0,001). В то же время, частота аллеля TNFR1 36*G достоверно выше в группе больных с ранним началом СД1 (69,00%), чем у больных с поздним дебютом СД1 (50,00%, Р=0,004) и в группе сравнения (47,13%, Р=0,0).

Выявлена ассоциация полиморфного локуса 3653СТ гена IL1R1 с СД в зависимости от возраста манифестации у этнических башкир. Генотип IL1R13653*T/*T встречается значительно реже в группе больных с ранним началом заболевания (3,30%), чем у больных с поздним дебютом СД1 (32,00%, Р=0,003);

генотип IL1R13653*G/*G у пациентов с ранней манифестацией СД встречался значительно чаще (53,30%), чем у больных с поздним началом СД (24,00%, Р=0,01).

Анализ ассоциаций генов-кандидатов с поздними осложнениями сахарным диабетом типа Осложнения СД1 – причина инвалидизации и ранней смертности пациентов. Проведен анализ ассоциаций полиморфизма 1159CA гена IL12B с СД1 с учетом поздних осложнений заболевания. Оказалось, что генотип IL12B1159*А/*А значительно чаще встречается в группе больных СД1, у которых повышено содержание ОХС, по сравнению с больными, имеющими нормальный уровень ОХС (68,97% против 40,62% у татар, 74,19% против 45,83% у русских, соответственно). У русских аллель IL12B 1159*А в группе больных с ДЛП встречается достоверно чаще (85,48%), чем у больных без нарушения липидного обмена (66,67%). Можно полагать, что полиморфный локус 1159CA гена IL12B ассоциирован с риском развития ДЛП у больных СД1.

Обнаружено, что у больных СД1 с диабетической нефропатией, этнических русских, частота генотипа IL10 -627*C/*А выше (68,29%), чем у больных без данного осложнения (20,0%, P=0,004) (рисунок 4). Таким образом, генотип IL10 - 627*C/*А можно отнести к маркерам риска диабетической нефропатии у больных СД1, русских по этнической принадлежности.

Выявлено, что у больных СД1, этнических русских, генотип IL6 -572*G/*G и аллель IL6 -572*G чаще встречаются у пациентов с диабетической ретинопатией (88,46% и 94,23% соответственно), чем у пациентов без данного осложнения (42,86% и 71,43%, Р=0,012 и Р=0,018 соответственно). Это позволяет отнести генотип IL6 -572*G/*G к маркерам повышенного риска развития диабетической ретинопатии у больных СД1, русских по этнической принадлежности. У татар и башкир не выявлено подобных ассоциаций.

Полиморфные локусы других рассмотренных в данном исследовании генов не ассоциированы с осложнениями СД1.

88, 76, 80 68, 60, 55, Частота, % 57, Частота,% 37, 42, 40 26, 22, 20, 20, 20 11, 7,4 4, 1,3 0,0 0, 0 *С/*С *С/*А *А/*А *G/*G *G/*C *C/*C Генотип контроль контроль больные СД1 без нефропатии больные СД1 без ретинопатии больные СД1 с нефропатией больные СД1 с ретинопатией Рисунок 4 – Распределение частот генотипов полиморфных локусов 627CA гена IL10 и IL6 -572GС в контрольной группе и у больных СД1 в зависимости от наличия микрососудистых осложнений (русские) ВЫВОДЫ 1. На возраст манифестации сахарного диабета типа 1 и развитие его поздних осложнений оказывает влияние семейный анамнез по СД1 и СД2.

У больных, имевших родственников с сахарным диабетом типа 1, заболевание возникало раньше, и уровень ХС-ЛПВП был значительно ниже, чем у пациентов с неотягощенным семейным анамнезом. Частота диабетической нефропатии у больных сахарным диабетом типа 1, имевших родственников с сахарным диабетом типа 2, была существенно выше, чем у пациентов с неотягощенным семейным анамнезом.

2. Впервые в популяциях трех этнических групп, русских, татар и башкир, охарактеризован полиморфизм генов-кандидатов сахарного диабета типа 1:

IL12B (1159AC), IL10 (-627CA), IL6 (-572GC), LTA (252AG), IL1R (3653ТG), TNFR1 (36ТС), FAS (-670AG), NOS2 (150СТ), CASP1 (-877СТ) и VDR (352CT). Показано, что предрасположенность к СД1 и его поздним осложнениям формируется в связи с полиморфизмом генов LTA, FAS, TNFR1, IL10, IL12B, IL6 у русских, генов LTA, FAS, TNFR1, IL1R1 – у татар, гена VDR – у башкир.

3. Аллельные варианты генов LTA, FAS и TNFR1 ассоциированы с сахарным диабетом типа 1 (у русских и татар). Риск развития заболевания повышен у носителей генотипа LTA 252*G/*G, генотипа FAS670*G/*G (русских), генотипа и понижен у носителей генотипов FAS670*А/*G (татар), FAS670*А/*А, LTA 252*А/*А и TNFR1 36*A/*A (татар по этнической принадлежности).

4. Значимость аллельных вариантов генов-кандидатов для определения риска развития сахарного диабета типа 1 проявляется в зависимости от гендерной принадлежности. У женщин с генотипом VDR 36*С/*С (башкирок) и у женщин с генотипом IL10627*А/*А (татарок) риск СД1 понижен, в то время, как у женщин (башкирок), имеющих аллель VDR352*Т, и женщин (русских) с генотипом IL10627*С/*А риск сахарного диабета типа 1 повышен.

5. С возрастом манифестации сахарного диабета типа 1 ассоциированы аллельные варианты генов IL12B, IL10, IL6, TNFR1 и IL1R1. Риск позднего (после 18 лет) развития заболевания повышен у носителей генотипа IL12B 1159*C/*C, IL6 -572*G/*С, TNFR1 36*A/*A, а риск раннего (до 18 лет) дебюта заболевания повышен у носителей генотипов IL10 -627*С/*А, IL6 -572*G/*G и аллеля TNFR1 36*G (русских), генотипа IL1R13653*Т/*Т (башкир по этнической принадлежности).

6. Поздние осложнения сахарного диабета типа 1 ассоциированы с полиморфными вариантами генов IL6, IL10, IL12B. Маркером повышенного риска развития нефропатии является генотип IL10 627*С/*А (у русских), повышенный риск дислипидемии имеют носители генотипа IL12B 1159*А/*А, повышенный риск развития диабетической ретинопатии – носители генотипа IL6 -572*G/*G (русские).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. Для оценки риска развития СД1 в популяциях башкир, русских и татар Башкортостана целесообразно исследовать полиморфные варианты генов системы цитокинов (IL12B (1159AC), IL10 (-627CA), IL6 (–572GC)), апоптоза (LTA (-252AG), IL1R1 (3653ТG), TNFR1 (36ТС), FAS (-670AG), VDR (352CT)). С целью оценки риска поздних осложнений рекомендовано проводить генотипирование по полиморфниым маркерам генов IL12B (1159AC), IL10 (-627CA), IL6 (-572GC).

2. При выявлении генетических маркеров повышенного риска СД необходимо проводить раннюю профилактику заболевания у лиц, относящихся к группе риска развития СД1, выбор адекватных методов терапии у лиц с диагностированным заболеванием.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Генетические аспекты сахарного диабета типа 1 в Республике Башкортостан / Д.Ш. Хамзина-Каримова, Ж.Р. Балхиярова, О.Е. Мустафина, Т.В. Моругова // Материалы Республиканской научно-практической конференции эндокринологов. – Уфа, 2003. – С. 54–56.

2. Авзалетдинова, Д.Ш. Связь сочетаний полиморфного маркера -511Т/С гена интерлейкина 1 и специфичностей гена DRB1 с сахарным диабетом типа у татар Башкортостана / Д.Ш. Авзалетдинова, Ж.Р. Балхиярова // Вопросы теоретической и практической медицины: матер. 69-й итоговой науч.-практич.

конф. – Уфа, 2004. – С. 5–7.

3. Исследование FokI полиморфизма гена рецептора витамина Д при сахарном диабете типа 1 в популяциях народов Башкортостана // Ж.Р. Балхиярова, Д.Ш. Авзалетдинова, Т.В. Моругова, О.Е. Мустафина / Высокие медицинские технологии в эндокринологии: Материалы V Всероссийского конгресса эндокринологов. - Москва, 2006. – С. 22.

4. DNA typing in Russian patients with type 1 diabetes mellitus / D. Avzaletdinova, Z. Balhiyarova, T. Morugova, O. Mustafina / Diabetologia: 42th Annual Meeting of the European Association for the Study of Diabetes. – Copenhagen/Malmoe, 2006. – Vol. 49, №1. – P. 176.

5. The IL6 -572G/C and IL12B -1159C/A polymorphisms and type 1 diabetes mellitus in Tatars of Bashkortostan / Z. Balhiyarova, T. Morugova, D. Avzaletdinova, O. Mustafina // 7thBMHG. – Skopje, 2006. – P. 99.

6. Анализ ассоциаций полиморфизма С1159А гена интерлейкина 12В с сахарным диабетом типа 1 в этнических группах Башкортостана / Ж.Р. Балхиярова, Т.В. Моругова, Д.Ш. Авзалетдинова, О.Е. Мустафина // Сахарный диабет. – 2007. - №4. - С.3-5.

7. The interleukine-6 -572G/С polymorphism is associated with type 1 diabetes mellius in Russians and Tatars // J. Balhiyarova, T. Morugova, D. Avzaletdinova, O. Mustafina / Endocrine Abstracts: 9th European Society of Endocrinology. – Birmingham, 2007. – P. 13.

8. Association between interleukin-10 627C/A gene polymorphism and Type Diabetes Mellitus in Russians and Tatars / Z.R. Balhiyarova, T.V. Мorugova, D.S. Аvzaletdinova, O.Е. Mustafina // Fourth Croatian Congress of Еndoсrinology with international participation. – Rovinj, 2007. – Р. 109.

9. Polymorphisms of the NOS2, TNFB and TNFR1 genes are associated with Type Diabetes Mellitus in Tatars and Russians from Bashkortostan / Z. R. Balkhiyarova, D. S.Avzaletdinova, T. V. Morugova, O. E. Mustafina // European Journal of Human Genetics: 40th European Human Genetics Conference. – Barselona, 2008. – Vol. 9, № 2 P. 356.

10. Исследование -627С/A полиморфизма гена интерлейкина-10 при сахарном диабете типа 1 в популяциях народов Башкортостана / Ж.Р. Балхиярова, Т.В. Моругова, Д.Ш. Авзалетдинова, О.Е. Мустафина // Материалы 4-го Всероссийского диабетологического конгресса. Москва, 2008. С. 6.

11. Анализ ассоциаций 252G/A полиморфизма гена лимфотоксина при сахарном диабете типа 1 в популяциях народов Башкортостана / Ж.Р. Балхиярова, Т.В. Моругова, Д.Ш. Авзалетдинова, О.Е. Мустафина // Материалы 4-го Всероссийского диабетологического конгресса Москва, 2008. С. 340.

12. Association between TNFR1 gene 36A/G polymorphism and Type 1 Diabetes Mellitus in Tatars and Russians / Balkhiyarova Z.R., Avzaletdinova D.S., Morugova T.V., Mustafina O.E // 19th International Congress of Genetics. – Berlin, 2008. – Р. 65.

13. Исследование генов апоптоза при сахарном диабете типа 1 в популяциях народов Башкортостана Балхиярова Ж.Р., Авзалетдинова Д.Ш., / Моругова Т.В., Мустафина О.Е Материалы Всероссийской научно // практической конференции молодых ученых и специалистов “Актуальные проблемы современной эндокринологии”. – Москва, 2008. – С. 127.

Особенности генетической предрасположенности к диабетической 14.

нефропатии у больных сахарным диабетом типа 1 проживающих в республике Башкортостан / Ж.Р. Балхиярова, Т.В. Моругова, Д.Ш. Авзалетдтнова, О.Е. Мустафина // Материалы I съезда терапевтов Республики Башкортостан «Актуальные вопросы внутренних болезней». – Уфа, 2008. – С. 133–134.

Генетические аспекты сахарного диабета: Учебное пособие.

15. / Д.Ш. Авзалетдтнова, Т.В. Моругова, Ж.Р. Балхиярова, О.Е. Мустафина // – Уфа, 2008. – 80 с.

16. Особенности течения сахарного диабета типа 1 в зависимости от наследственной предрасположенности / Ж.Р. Балхиярова, Т.В. Моругова, Д.Ш. Авзалетдинова, О.Е. Мустафина // Материалы научно-практической конференции «Актуальные вопросы эндокринологии». – Уфа, 2009. – С. 35–38.

17. Роль гена апоптоза FAS в развитии диабетической полинейропатии / Ж.Р. Балхиярова, Т.В. Моругова, Д.Ш. Авзалетдинова, О.Е. Мустафина Материалы научно-практической конференции вопросы “Актуальные эндокринологии”. – Уфа, 2009. – С. 19–21.

18. Патент на изобретение № 2368325 «Способ прогнозирования развития сахарного диабета типа 1 в популяциях народов Башкортостана», 2008.

19. Медико-генетическое консультирование по сахарному диабету типа в республике Башкортостан: достижения, проблемы, перспективы / Д.Ш. Авзалетдинова, Т.В. Моругова, Ж.Р. Балхиярова, Т.Р. Насибуллин, О.Е. Мустафина Материалы научно-практической конференции // эндокринологов Республики Башкортостан. – Уфа, 2008. – С. 4–6.

20. Основные эпидемиологические показатели сахарного диабета у взрослых в Республике Башкортостан за 2001–2007 гг. / Г.Г. Байбурина, Т.В. Моругова, Г.Х. Мустафина, Ж.Р. Балхиярова Материалы научно-практической // конференции эндокринологов Республики Башкортостан. – Уфа, 2008. – С. 8–14.

21. Особенности генетической предрасположенности к сахарному диабету типа 1 / Ж.Р. Балхиярова, Т.В. Моругова, Д.Ш. Авзалетдинова, О.Е. Мустафина // Съезд генетиков и селекционеров, посвященный 200-летию со дня рождения Ч. Дарвина и Пятый съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров.

– Москва, 2009. – с. 388.

22. Роль генов цитокиновой сети в развитии нефропатии у пациентов с сахарным диабетом типа 1 / Ж.Р. Балхиярова, Д.Ш. Авзалетдинова, Т.В. Моругова, О.Е. Мустафина // Всероссийский конгресс “Диабет и почки”. – Москва, 2009. – с. 11.

АННОТАЦИЯ ДИССЕРТАЦИИ Диссертация посвящена актуальной научной проблеме изучения молекулярно-генетических основ сахарного диабета типа 1 (CД1).

Исследование проведено на обширной выборке больных (n=339) с использованием клинико-лабораторных, биохимических и молекулярно генетических методов. Автором получен значительный объем оригинального фактического материала. Установлено, что в структуру наследственной предрасположенности к СД1 и его осложнениям вносят вклад аллельные варианты генов цитокинов и апоптоза: IL12B (1159AC), IL10 (-627CA), IL6 (-572GC), LTA (-252AG), IL1R1 (3653ТG), TNFR1 (36ТС), FAS и Выявлены маркеры, (-670AG), CASP1 (-877СТ) VDR (352CT).

предрасполагающие к развитию заболевания, а также протективные маркеры.

Показано, что на характер ассоциаций аллельных вариантов генов с СД влияют этническая и гендерная принадлежности. Полученные результаты характеризуются научной новизной и могут быть рекомендованы для медико генетического консультирования по СД1. При генетическом тестировании риска развития СД1 и его осложнений с использованием аллельных вариантов генов необходимо учитывать этническую и гендерную принадлежность пациентов и членов их семей.

The thesis is devoted to an actual scientific problem of molecule-genetic bases of type 1 diabetes mellitus (T1D) studying. An extensive sample of patients (n=339) was examined by clinical, laboratory, biochemical and molecule-genetic methods.

The author has received a considerable volume of original actual material. It has established that in structure of hereditary predisposition to T1D and its complications the allelic variants contribution of cytokine and apoptosis-genes bring: IL12B (1159AC), IL10 (-627CA), IL6 (-572GC), LTA (-252AG), IL1R (3653ТG), TNFR1 (36ТС), FAS (-670AG), CASP1 (-877СТ) and VDR (352CT). The markers contributing to disease development and also protective markers are revealed. It is shown that genes allelic variants associated with T1D are influenced by ethnic and gender accessories. Received results are characterized by scientific novelty and can be recommended for medico-genetic consultation for T1D.

The genetic analysis of T1D and its complications risk using genes allelic variants are necessary to consider an ethnic and gender accessory of patients and relatives.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ ДН диабетическая нефропатия – ДР диабетическая ретинопатия – ИЛ интерлейкин – КА коэффициент атерогенности – ОХС общий холестерин – ПЦР полимеразная цепная реакция – СД сахарный диабет типа – СКФ скорость клубочковой фильтрации – ТГ триглицериды – ХС-ЛПВП холестерин липопротеидов высокой плотности – ХС-ЛПНП холестерин липопротеидов низкой плотности – ХС-ЛПОНП холестерин липопротеидов очень низкой плотности – (confidence interval) – 95%-й доверительный интервал CI – (nitric oxide synthase) – синтаза оксида азота NOS – (interleukin) - интерлейкин IL – (odds ratio) - показатель соотношения шансов OR – коэффициент корреляции r – (vitamin D receptor) – рецептор витамина D VDR – Издательская лицензия № 06788 от 01.11.2001 г.

ООО «Издательство «Здравоохранение Башкортостана» 450000, РБ, г. Уфа, а/я 1293;

тел./факс (347) 250-13-82.

Подписано в печать 11.11.2009 г.

Формат 6084/16. Гарнитура Times New Roman.

Бумага офсетная. Отпечатано на ризографе.

Усл. печ. л. 1,4. Уч.-изд. л. 1,5.

Тираж 100. Заказ № 505.