Павел викторович деление мембранных нанотрубок, опосредованное белком динамином.

на правах рукописи

УДК 577.3

БАШКИРОВ ПАВЕЛ ВИКТОРОВИЧ

Деление мембранных нанотрубок, опосредованное белком

динамином.

Специальность 03.00.02. – биофизика

автореферат диссертации на соискание ученой степени

кандидата физико-математических наук

Москва 2007

Работа выполнена в Институте физической химии и электрохимии им. А. Н. Фрумкина РАН.

Научный руководитель:

член-корреспондент РАН, доктор химических наук Юрий Александрович Чизмаджев.

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук Константин Вольдемарович Шайтан, доктор физико-математических наук Валерий Иванович Иванов.

Ведущая организация:

Институт биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН.

Защита состоится «» г. в _ час. _ мин. на заседании дис сертационного совета К 212.156.03 при Московском физико-техническом институте по адресу:

141700, Московская обл., г. Долгопрудный, Институтский пер., д. 9, МФТИ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МФТИ.

Автореферат разослан «» _ 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат физико-математических наук В. Е. Брагин Введение. Актуальность исследования.

Деление клеточной мембраны – это такое топологическое преобразование, в результате которого происходит формирование новых мембранных структур. Оно лежит в основе фундаментальных клеточных процессов, таких как митоз, эндоцитоз, деление органелл и многих других. Для сохранения замкнутости объемов делящихся структур деление соединяющего их мембранного перешейка должно сопровождать ся формированием, так называемой, структуры полуделения (Kozlovsky and Kozlov, 2003), когда внутренний монослой перешейка локально сливается, а внешний оста ется интактным. Эти перестройки сопряжены с большими изгибными деформациями мембраны. В клеточных системах они создаются специализированными белковыми структурами, собирающимися на поверхности перешейка (Lee amd Schekman, 2004), который при этом зачастую представляет собой цилиндрическую мембранную на нотрубку (НТ) (Lollike and Lindau, 1999).

Динамин является одним из ключевых белков, опосредующих деление мем бран в различных клеточных системах (van der Bliek and Meyerowitz, 1991;

Chen et.

al., 1991). Существуют предположения, что именно он за счет энергии гидролиза ГТФ разрывает мембранную НТ, деформируя ее соответствующим образом (Sever et.

al., 2000). Блокировка ГТФазной активности динамина in vivo приводит к остановке эндоцитоза на стадии деления мембраны. При этом хорошо видно, что белок образу ет плотные полимерные спирали или стопки колец вокруг мембранных НТ, удержи вающих отпочковывающиеся везикулы (Takei et. al. 1995). Известно, что такая поли меризация запускает кооперативный гидролиз ГТФ (Tuma and Collins, 1995), так что его скорость увеличивается в тысячи раз, причем молекулы белка одной спирали практически одновременно гидролизуют ГТФ. Считается, что выделяющаяся при этом энергия расходуется на деформирование и деление мембранной НТ (Song and Schmid, 2003). О механизме превращения химической энергии в механическую рабо ту известно мало, при этом существующие на сегодняшний день представления за частую противоречивы. Большинство из предложенных гипотез были основаны на результатах анализа взаимодействия динамина с модельными липидными мембра нами. Динамин проявляет механическую активность in vitro: так было показано, что он формирует длинные НТ из липидных везикул, навиваясь вокруг них спиралью (Carr and Hinshaw, 1997). При последующем добавлении в систему ГТФ происходит расщепление НТ на небольшие липосомы (Sweitzer and Hinshaw, 1998). Предполага ют, что расщепление нанотрубок в таких системах происходит в результате струк турных изменений динаминовой спирали, таких как ее сужение, удлинение или скручивание (Sweitzer and Hinshaw, 1998;

Stowell et. al., 1999;

Roux et. al., 2006). Од нако до сих пор остается неразрешенным вопрос, каким образом такие трансформа ции спирали обеспечивают быструю, локальную и безутечечную перестройку бис лоя, необходимую для формирования везикул.

В клетке динамин функционирует в присутствии ГТФ. Протяженные динами новые структуры, которые образовывались in vitro на поверхности НТ (Takei et. al., 1995), формируются in vivo только при блокировании гидролиза ГТФ. Следователь но, функциональная белковая единица, опосредующая деление, относительно корот ка и нестабильна. К сожалению, высокая скорость деления и низкая разрешающая способность использующихся экспериментальных методов серьезно усложняют идентификацию деформаций НТ, вызываемых динамином. Дело в том, что элек тронная микроскопия, которая являлась важнейшим инструментом в исследовании взаимодействия динамина с мембранами, даёт статическую картину и не позволяет следить за делением в режиме реального времени.

В нашей лаборатории была разработана методика вытягивания липидных тру бок из плоской бислойной липидной мембраны (БЛМ) с помощью стеклянной мик ропипетки (Frolov et. al., 2003). Было показано, что в зависимости от длины трубки она может находиться в одной из двух форм: катеноидальная микротрубка (МТ) или цилиндрическая нанотрубка. Особенности формирования таких трубок позволяют вести непрерывное наблюдение за изменениями ионной проводимости их внутрен них каналов. Поэтому, полученные таким образом НТ могут быть использованы для исследования быстрых процессов деления мембран динамином. Учитывая ключевое значение динамина в широком круге клеточных процессов, детальное изучение дан ной проблемы представляется весьма актуальным.

Цели и задачи исследования.

Цель настоящей работы заключалась в исследовании механизма деления кле точных мембран с использованием модельной системы “липидная нанотрубка (НТ) – клеточный белок деления динамин”. В ходе работы были поставлены следующие за дачи:

1) Расширить экспериментальные возможности метода формирования мембранных НТ. Разработать способ измерения равновесного радиуса НТ. Исследовать его зави симость от липидного состава мембраны НТ. Разработать метод определения моду ля изгиба и латерального натяжения мембраны НТ.

2) Исследовать взаимодействие динамина с НТ. Найти необходимые условия, при которых происходит сорбция динамина на НТ. Для исследования сорбции использо вать метод второй гармоники и флуоресцентную микроскопию. Выяснить, как дина мин влияет на радиус и стабильность НТ, имеющих разный модуль изгиба мембра ны.

3) Исследовать особенности процесса деления НТ динамином в присутствии ГТФ.

Выяснить, что происходит с динаминовой спиралью в результате гидролиза ГТФ.

Проверить, протекает ли деление НТ в данной модельной системе без утечки.

4) На основе анализа полученных и литературных данных предложить и обосновать механизм деления НТ динамином.

Новизна исследования и его научно-прикладное значение.

В процессе выполнения работы были разработаны экспериментальные методы, позволяющие проводить измерения как геометрических размеров липидных нанот рубок (радиус и длину), так и механических параметров ее мембраны (модуль изгиба и латеральное натяжение), а также изучать их зависимость от липидного состава мембраны. Данные методы отличаются от встречающихся в литературе тем, что да ют возможность исследовать характеристики сильно изогнутых мембран, радиус кривизны которых сравним с их толщиной. Практическая ценность этих методов за ключается в том, что они позволяют делать оценки жесткости мембран наноскопи ческих липосом, все шире используемых в медицине в качестве переносчиков ле карств.

Было показано, что варьированием липидного состава или значения, прикла дываемого к мембранной трубке электрического напряжения, можно менять гео метрический размер НТ. Обнаруженные свойства мембранных трубок важны для выяснения роли липидного бислоя в управлении процессами экзо- и эндоцитоза.

Впервые исследована кинетика взаимодействия НТ с клеточным белком дина мином. При физиологических значениях концентраций, динамин за время ~ 10 с сжимает НТ до радиусов, сравнимых с толщиной липидного монослоя, что сущест венно меньше, чем предполагалось ранее. Показано, что радиус, до которого дина мин сжимает НТ, определяет возможность ее деления белком в присутствии ГТФ и регулируется жесткостью мембраны. Впервые сделана оценка энергии, выделяемой динамином при полимеризации в спираль: она оказалась сравнима с энергией, выде ляемой при гидролизе ГТФ.

Показано, что вопреки существующим предположениям гидролиз ГТФ не при водит ни к увеличению шага белковой спирали, ни к ее дальнейшему сжатию. Мы считаем, что в результате гидролиза ГТФ происходит лишь разъединение ее витков, вследствие чего спираль теряет жесткость. Показано, что в зависимости от первона чального радиуса и длины участка спирали, гидролизовавшего ГТФ, возможно как расширение, так и сужение с последующим делением НТ.

Полученные данные позволяют не только ответить на многие вопросы, связан ные с делением мембранных НТ динамином, но и судить о роли липидного бислоя в этом процессе. Они заставляют пересмотреть существующие на сегодняшний день предположения о самом механизме деления мембран динамином и конформацион ных изменениях белка, происходящих при этом.

Апробация диссертационной работы.

Основные результаты, изложенные в диссертационной работе, докладывались и обсуждались на конференции молодых ученых ИФХЭ РАН (2007);

на конферен ции “Laboratory of Cellular and Molecular Biophysics Annual Scientific Retreat” (Бетес да, США;

2006, 2007), на 50-ом съезде американского биофизического общества (Солт-Лейк Сити, США;

2006), на международной конференции “EMBO workshop on Cell Membrane Organization and Dynamics” (Бильбао, Испания;

2006) и на научных семинарах лаборатории биоэлектрохимии ИФХЭ РАН (Москва;

2004-2007).

Публикации.

Основные положения диссертационной работы опубликованы в 5 печатных работах.

Объем и структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, изложения материалов и методов исследования, глав результатов работы и их обсуждения, выводов. Работа изложена на страницах, включает иллюстраций. Библиография включает ра бот.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Формирование мембраны.

Бислойную липидную мембрану (БЛМ) формировали по методу Рудина Мюллера на 100 мкм отверстии в тефлоновой пленке, разделяющей два отсека спе циальной ячейки, заполненной электролитом (0.1 мМ KCl, 10 мМ HEPES, pH 7.0).

Отверстие обрабатывалось раствором фосфолипидов (“Avanti Polar Lipids Inc.”, США) в смеси октан/декан 1/1 (оба “Sigma”, США) в концентрации 10 мг/мл и вы сушивалось в аргоне. После погружения ячейки в раствор электролита на отверстие кисточкой наносилась капля раствора фосфолипидов в сквалане (“Sigma”, США) с концентрацией 10-30 мг/мл, из которой в течение нескольких минут спонтанно обра зовывалась БЛМ. При этом растворитель и лишний липид уходили в объёмную фазу, окружающую БЛМ, – мениск. В экспериментах использовались следующие фосфо липиды: 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфолхолин (ДОФХ), 1-олеоил-2-гидрокси-sn глицеро-3-фосфохолин (ОФХ), 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (ДОФЭ), 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фософсерин (ДОФС), 1-олеоил-2-гидрокси-sn-3 фосфосерин (ОФС), флуоресцентно меченый 1,2-диолеоил-sn-3-фосфоэтаноламин N-(лизамин родамин B сульфонил) (ДОФЭ-Родамин) и холестерин в соотношениях, указанных в тексте.

Формирование мембранных трубок.

Для формирования и исследования электрических свойств мембран и мем бранных трубок использовали установку (рис.1), состоящую из пэтч-пипетки, уни версального генератора PAR-175 (“Princeton Applied Research”, США), пэтч-кламп усилителя EPC-7 (“Heka”, Германия), четырехполосного фильтра F-900 (“Frequency Devices”, США) и осциллографа OS-1420 (“GOULD”, Англия). Для изменения поло жения пипетки использовали контроллеры движения Model 860-C2 (“Newport”, США) и микроконтроллер движения Model ESA-CSA (“Newport”, США), последний - для высокоточного (шаг 50 нм) перемещения по вертикали. В процессе формирова ния БЛМ на хлорсеребряные электроды посредством пэтч-кламп усилителя подавал ся пилообразный сигнал с генератора и измерялся емкостной ток мембраны в режи ме фиксации потенциала. Процесс образования липидного бислоя фиксировался по резкому увеличению емкости и одновременно по исчезновению изображения в мик роскопе (толщина БЛМ ~ 4нм – много меньше длины волны видимого света). Затем с помощью микроманипулятора к мембране подводили пэтч-пипетку, так что между кончиком микропипетки и мембраной формировался плотный контакт (сопротивле ние контакта 1—10 Гом) (рис. 1б), что было видно по резкому уменьшению емкост ного тока. Для разрушения мембраны под пипеткой скачком менялось гидростатиче ское давление, что приводило к появлению тока проводимости. После этого, отводя пипетку от плоской мембраны, вытягивали мембранную трубку (рис. 1в,г). Затем к электродам прикладывали постоянную разность потенциалов, и измеряли ток прово димости через мембранную трубку. Плавное изменение длины трубки осуществля лось с помощью микроконтроллера. Показания индикатора микроконтроллера, зна чения приложенного к концам трубки электрического напряжения и измеряемого тока через нее оцифровали и записывали на жесткий диск компьютера с помощью АЦП L-305/L-1210 (“L-card”, Россия). Частота опроса 1кГц. Сигнал предварительно пропускали через фильтр низких частот F-900;

частота среза 0,5 кГц. Показания микроконтроллера позже пересчитывались в значение вертикального смещения кон чика пипетки L относительно своего низшего положения с помощью построенной для этой цели калибровочной кривой.

Рис. 1. Формирование мембранной нанотрубки (НТ). а – плоская БЛМ. б – формирование плотного контакта между пэтч-пипеткой и БЛМ с последующим разрушением мембраны под пипеткой. в формирование мембранной катеноидальной микротрубки (МТ) в начале отведения пипетки от БЛМ. г – образование мембранной НТ в результате коллапса МТ при достижении критической длины.

Для визуализации НТ использовали флуоресцентную микроскопию (рис. 6а) на основе инвертированного микроскопа Olympus IX-70 (Olympus Inc., Япония). В этом случае НТ вытягивали пэтч-пипеткой из гигантских однослойных липосом (ГОЛ), содержащих 3 мольных % ДОФЭ-Родамина. ГОЛ получали методом электроформа ции (Ангелова) на платиновых электродах в 200 мМ растворе глюкозы и 10 мМ Hepes при pH = 7,0. После образования ГОЛ на электродах этот раствор с помощью перфузионного насоса меняли на раствор электролита (100 мМ KCl и 10 мМ Hepes, pH = 7,0). Изображение НТ снималось и записывалось на жесткий диск компьютера с помощью CCD-камеры (Intesified VE1000SIT MIT, США).

Аппликация динамина и ГТФ.

Использовалось два способа добавления динамина и ГТФ к мембранным на нотрубкам. В первом случае чистый? динамин или динамин с ГТФ добавляли в рас твор электролита до формирования НТ. Конечная концентрация белка и нуклеотида при этом была 0.04 мг/мл и 1мМ соответственно. Во втором случае динамин и ГТФ апплицировали непосредственно на НТ. Для этого их добавляли с помощью микро пипеток, которые вплотную подводились к нанотрубкам. Одна из пипеток была за полнена раствором динамина в концетрации 0.4 мг/мл, другая, если было необходи мо, ГТФ в концентрации 10 мМ. Разница гидростатического давления на границе кончика пипетки с раствором равнялась нулю, таким образом, могли существовать только диффузионные потоки белка или нуклеотида. Для локализации и определе ния размера диффузионного облака вокруг кончика пипетки мы добавляли в раствор внутри пипетки флуоресцентно меченые 40-ка нанометровые полиэтиленгликоливые шарики (биды). Пипетки с динамином и ГТФ подводили к НТ так, чтобы НТ оказы валась внутри окрашенной диффузионной области. Когда это было необходимо, пи петки отводились от НТ, и объемные концентрации белка или ГТФ около НТ до вольно быстро становились пренебрежимо малыми.

Измерение адсорбции динамина на поверхности БЛМ.

Метод, который мы использовали для исследования адсорбции динамина на БЛМ, основан на электрострикции мембраны (Соколов и Кузьмин, 1984), в результа те которой ее емкость C квадратично зависит от трансмембранного потенциала U:

C = C0 + U 2 (I).

Если динамин сорбируется на поверхность отрицательно заряженной мембраны, то его добавление только с одной стороны симметричной БЛМ приведет к возникнове нию трансмембранного напряжения Vt на ней, так как белок скомпенсирует часть от рицательного заряда на одной из сторон БЛМ и нарушит равенство поверхностных зарядов ее монослоев. Прикладывая при этом к мембране переменное электрическое поле U0sin(t) и измеряя амплитуду второй гармоники емкостного тока, находим значение Vt согласно уравнению:

I 2 = U 02Vt sin t (II), которое получено в предположении, что 1.

Мы использовали генератор сигнала низких частот модель ГЗ – 102 (СССР) для прикладывания переменного синусоидального напряжения к БЛМ с, = 300 Гц, и U0 = 300 мВ;

пэтч-кламп усилитель EPC-7 (“Heka”, Германия) использовали для компенсации емкости мембраны C0 и измерения емкостного тока, который, в свою очередь, шел на вход фазочувствительного усилителя LI-575 (Synchotrach, Япония).

Полученный с выхода фазочувствительного усилителя сигнал, соответствующий ам плитуде тока второй гармоники, оцифровывали и записывали на жесткий диск ком пьютера с помощью АЦП L-305/L-1210 (“L-card”, Россия). В начале каждого экспе римента, перед добавлением динамина, снималась калибровочная зависимость Vt от амплитуды I2, которая аппроксимировалась линейной функцией. Для этого наряду с переменным напряжением U0sin(t) к мембране прикладывали постоянную разность потенциалов Vt, которую варьировали от -50 до 50 мВ с шагом 5 мВ. Таким образом, после аппликации динамина, согласно измеренному значению амплитуды тока вто рой гармоники, находили величину трансмембранного напряжения, возникающего за счет адсорбции динамина.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Связь равновесного радиуса НТ с механическими параметрами БЛМ.

Для нахождения значения равновесного радиуса НТ решали задачу о миними зации функционала свободной поверхностной энергии мембранного цилиндра, свя занного с резервуаром липида (мениском) и имеющего постоянную длину lNT. В на шем случае связь НТ с мениском осуществлялась посредством плоской БЛМ, а дли на НТ определялась положением кончика пипетки. Согласно предварительным оценкам, радиусы вытягиваемых из БЛМ нанотрубок сравнимы с толщиной бислоя (Frolov et. al., 2003), поэтому свободную энергию НТ находили как сумму свободных энергий ее внутреннего и внешнего монослоя. На рисунке 2 представлено схемати ческое изображение НТ в виде двух коаксиальных бесконечно тонких цилиндров, соответствующих нейтральным поверхностям внутреннего и внешнего монослоев НТ. Расстояние между этими цилиндрами фиксировано и равно h – толщине гидро фобной прослойки мембраны.

Согласно приближению Хельфриха (Helfrich, 1973), функционал свободной поверхностной энергии мембраны W зависит от числа молекул поверхности мембра ны n, площади поверхности A и ее кривизны J:

W = W (n, A, J ) (1), Вариация энергии, соответственно, имеет вид:

dW = µdn + dA + BdJ (2), где µ – химический потенциал молекулы в мембране, – латеральное натяжение мембраны, а B действующий на нее изгибающий момент, который Рис.2. Схематическое изображение мембранной НТ, представленной в виде двух коаксиальных бесконечно тонких цилиндров одинаковой длины lNT, соответствующих внешнему и внутреннему монослою НТ, радиусы которых равны, соответственно, re и ri.

для малых отклонений кривизны J от своего спонтанного значения J0 определяется выражением B = Ak (J J 0 ), где k – модуль изгиба монослоя. В тоже время из экстен сивности W, n и A следует, что:

W = µn + A (3).

Из уравнений (2) и (3) получаем:

k (J J 0 )2 a µ = µ0 + a0 (4), где µ0 – стандартный химический потенциал молекулы липида, а a0 – площадь, при ходящаяся на одну молекулу липида. В соответствии с уравнениями (3) и (4) выра жение свободной поверхностной энергии НТ, изображенной на рисунке 2, будет иметь вид:

k (J i J 0 )2 + Ae k (J e J 0 )2 + µN W = µ 0 ni + µ 0 ne + Ai (5), 2 где нижний индекс i соответствует внутреннему монослою, e – внешнему, а N – число молекул в мениске, для которого выполняется соотношение:

N + ni + ne = N 0 = const (6).

Путем несложных преобразований с использованием выражений (4) и (6) уравнение (5) можно переписать в ином виде:

k2 k k k J 0 Ae J 02 + Ai ( J i J 0 ) + Ae ( J e J 0 ) + µN W = p Ai + p Ae Ai 2 (7), 2 2 2 где латеральное натяжение плоского монослоя p дается формулой:

µ µ k p = 0 + J0 (8).

a0 Для цилиндра A = 2rlNT, Ji = -1/ri и Je = 1/re, где ri и re – радиусы внешнего и внут реннего монослоя НТ, причем re - ri = h = const. В равновесии dW = 0, так что варьи рование выражения (7) по ri, позволяет получить соотношение, определяющее связь внутреннего радиуса НТ с механическими параметрами мембраны:

1 + =0 (9), (ri + h ) ri K где 0 = 2p – натяжение бислоя, K = 2k – модуль изгиба бислоя, а h – его толщина.

Из уравнения (9) видно, что значение внутреннего радиуса НТ не зависит от значе ния спонтанной кривизны монослоев мембраны.

Экспериментальное определение радиуса НТ. Зависимость радиуса НТ от липидного состава БЛМ.

Для точного определения значения радиуса мембранной нанотрубки проводи ли анализ зависимости проводимости НТ от ее длины. Измеряемая в эксперименте проводимость G состоит из проводимости нанотрубки GNT и фоновой проводимости Gbg, связанной с электрической утечкой в месте контакта мембраны со стеклянной пэтч-пипеткой и проводимостью плоской БЛМ (см рис.1), G = GNT + Gbg. Длина на нотрубки lNT равна разности между измеряемым вертикальным смещением кончика пипетки L относительно его самого нижнего положения (смотри материалы и мето ды) и параметром Lbg, равным расстоянию между плоской БЛМ и самым нижним по ложением кончика пипетки, lNT = L – Lbg. Считая, что форма НТ слабо отличается от цилиндрической и предполагая, что при движении пипетки меняется только lNT, мы аппроксимировали экспериментальную зависимость G от L гиперболической функ цией, следующего вида:

G= + Gbg (10), L Lbg rNT здесь - проводимость НТ единичной длины, =, где - удельное сопротивле ние раствора электролита, а rNT – радиус люмена НТ (далее – просто радиус НТ). Из найденного в процессе аппроксимации параметра и определяли значение радиуса НТ. Для 100 мМ раствора KCl удельное сопротивление равно 1 Ом·м.

На рисунке 3а приведены экспериментальная зависимость проводимости НТ от ее длины и аппроксимирующая эту зависимость функция, построенная по форму ле (10). Для всех имеющихся данных эта функция хорошо описывала подобную за висимость – среднеквадратичное отклонение не превышало 5 пС. Погрешность ап проксимации составляла 0.4 пС, доверительная вероятность 0.99. В каждом отдель ном эксперименте погрешность определения радиуса НТ не превышала 5%. Было показано, что радиусы НТ, вытянутых из одной и той же БЛМ, не различались в пре делах погрешностей, что было ожидаемым, так как согласно формуле (9) равновес ное значение rNT определяется исключительно механическими параметрами бислоя.

Кроме того, было найдено, что в пределах используемых скоростей движения пипет ки (от 0.05 мкм/c до 0.4 мкм/с) разброс вычисляемых значений радиусов НТ не пре вышал точности их определения, что говорит о квазистационарности процесса изме нения длины НТ на таких скоростях.

Рис.3. а – аппроксимация экспериментальной зависимости проводимости G от положения кончи ка пипетки L гиперболической функцией (10). Точки соответствуют дискретным моментам реги страции G и L. Сплошной линией изображена аппроксимирующая функция, при = 60.8 пСм/мкм, Lbg = 11.1 мкм, Gbg = 1.7 пСм. б – радиус НТ, вытянутых из фосфолипидных мембран (ДОФХ:ДОФЭ 2:1) с разным содержанием холестерина (кривая 1);

радиус НТ, вытянутых из фосфолипидных мембран (ДОФХ:ДОФЭ 2:1) с разным содержанием смеси холестерин:ОФХ 1: (кривая 2);

по оси абсцисс отложена концентрация холестерина в БЛМ, а по оси ординат радиус НТ.

Используя разработанный метод определения радиусов НТ, мы провели иссле дование влияния липидного состава на значения радиуса. Все эксперименты прово дились в эквивалентных условиях (t = 250С, 100 мМ KCl, pH = 7.0, прикладываемое к концам НТ напряжение U = 50 мВ). Минимальным радиусом обладали НТ, которые вытягивались из мембран, состоящих только из фосфолипидов ДОФХ:ДОФЭ в соот ношении 2:1. Среднее значение радиуса таких НТ составляло всего 2 нм. Однако размер НТ существенно увеличивался при добавлении к таким мембранам холесте рина. На рисунке 3б кривая 1 отображает зависимость радиуса НТ от мольной кон центрации холестерина в фосфолипидной мембране. Увеличение радиуса НТ с рос том концентрации холестерина в мембране, в первую очередь, вызвано тем, что хо лестерин, как это хорошо известно, увеличивает модуль изгиба фосфолипидных мембран за счет конденсирующего эффекта, оказываемого им на жирнокислотные хвосты липидов. Добавка к фосфолипидным мембранам смеси лизоли пид:холестерин в соотношении 1:1 приводила к еще более значительному росту ра диуса НТ, вытягиваемых из таких мембран. На кривой 2 рисунка 3б представлены значения, которые принимает радиус НТ, в зависимости от содержания смеси ОФХ:Холестерин 1:1 в фосфолипидной мембране ДОФХ:ДОФЭ 2:1. Радиус НТ, со стоящей на 80 % из лизолипида и холестерина, составляет 20 нм, что в десять раз больше радиуса фосфолипидной НТ. Таким образом, добавка смеси лизолипида с холестерином к фосфолипидным мембранам приводит к существенному увеличению диапазона радиусов, вытягиваемых из БЛМ нанотрубок. Так, варьируя липидный со став БЛМ, мы показали, что радиус НТ может принимать значения от 2 до 20 нм.

Влияние электрического напряжения, приложенного к концам НТ, на ее размер, форму и проводимость. Измерение механических параметров НТ.

В нашей системе для определения радиуса НТ нужно проводить измерения те кущего через нее электрического тока, для чего необходимо прикладывать разность потенциалов U к НТ. Здесь стоит отметить, что в экспериментальной системе, кото рая отображена на рисунке 1, разность потенциалов на БЛМ равна прикладываемой к электродам (мы не учитываем сопротивление пипетки). Дело в том, что электриче ское сопротивление в месте контакта мембраны со стеклянной пипеткой много меньше сопротивления самой мембраны и мениска. Таким образом, трансмембран ный потенциал меняется вдоль НТ от 0 у кончика пипетки до прикладываемого зна чения U у плоской БЛМ. Согласно уравнению электрокапилярности Липпмана:

C0Vt = 0 (11), где – натяжение БЛМ, а C0 – ее удельная емкость. Как следует из уравнения (II), электрическое поле приводит к уменьшению латерального натяжения мембраны НТ вдоль трубки. Таким образом, форма НТ будет отклоняться от цилиндрической со гласно формуле (9). Для нахождения новой формы НТ снова решали вариационную задачу о нахождении минимума функционала ее свободной поверхностной энергии.

Единственное отличие здесь заключается в том, что мембрану представляли не в ви де двух коаксиальных цилиндров, а в виде одного с нейтральной поверхностью, ле жащей на границе раздела монослоев. Это связано с тем, что трансмембранный по тенциал невозможно “поделить” между монослоями. Для симметричной мембраны J0 = 0, поэтому выражение свободной поверхностной энергии dW элемента мембра ны площадью dA будет иметь вид:

C0Vt 2 K dW = 0 dA + J 2 dA (12), 2 здесь K – модуль изгиба бислоя. В предположении, что C0Vt2 0 (это верно вплоть до 200 мВ, так как латеральное натяжение БЛМ около 1дин/см, а удельная емкость мкФ/см2), отклонение формы НТ от цилиндра будет малым. Введем значение радиу са НТ как функцию y(x), где x – координата вдоль оси НТ:

y ( x) = r + z ( x) (13), где r – радиус нейтральной поверхности бислоя, а z(x) – малое отклонение от него.

Тогда элемент площади нейтральной поверхности НТ будет равен:

dA = 2y ( x ) 1 + ( y ( x) ) dx (14), а кривизна будет определяться выражением:

y( x) J ( x) = (15).

(1 + ( y( x)) ) y( x) 1 + ( y( x) ) Распределение напряжения вдоль НТ будет иметь вид:

(r + z (q)) dq x V ( x) = U (16), (r + z (q)) dq t l NT откуда видно, что Vt(0) = 0, а Vt(lNT) = U. Свободная энергия всей НТ записывается как:

l NT l NT dW W= dx = f ( x)dx (17), dx 0 и минимизируется с помощью стандартного уравнения Эйлера-Лагранжа:

f d f d 2 f +2 =0 (18).

z dx z dx z Раскладывая функцию f(x) по z(x) до второго порядка и предполагая, что Vt(x) не за висит от формы трубки, получаем дифференциальное уравнение:

C0Vt 2 ( x) K K K 0 2 + 3 z ( x) 0 rz ( x) + z ( x) + Krz ( 4 ) ( x) = 0 (19).

2r r 2 2r Если в уравнение (19) подставить z(x) = 0 и Vt(x) = 0, то получившееся соотношение будет определять связь равновесного радиуса нейтральной поверхности НТ с меха ническими параметрами БЛМ:

1 2 = (20).

r K Выражение (20) очень похоже на (9), и если учесть, что 0 = 2p, а K = 2k, то легко получить уравнение, связывающее внутренний радиус НТ и радиус r нейтральной поверхности:

1 1 1 = 2+ (21).

2 ri (ri + h ) r Подставляя (20) в (19) получаем:

Kz ( x) C0Vt 2 ( x) Krz ( 4) ( x) + =0 (22).

r3 Разложение Vt(x) имеет вид:

Ux l NT x 1 2 z (q)dq + 2 z (q)dq l NT xr Vt ( x) (23).

l NT r 0 Не учитывая члены следующего порядка малости типа U2z(x), оставляем в скобках из выражения (23) только 1;

после подстановки (23) в (22) получаем уравнение, опреде ляющее форму НТ:

Kz ( x ) C0U 2 x Krz ( x) + = ( 4) (24).

r3 2l NT Общее решение однородной части (24) представляет собой гармоническую функ цию, амплитуда которой экспоненциально затухает с характерной длиной, равной 2r. Частное решение уравнения (28) имеет вид:

C0U 2 r 3 z ( x) = 2 x (25).

2l NT K Таким образом, находим, что при наложении разности потенциалов к концам НТ, ее форму в первом приближении можно считать параболической. Следует отметить, что в этом случае сохраняется гиперболическая зависимость ее проводимости от длины. Сопротивление R такой трубки для z(x)r определяется выражением:

l NT l NT l C U 2 r dx 2 z ( x) R= 2 1 dx = NT 1 0 (26), r 2 3K (r + z ( x) )2 r 0 r откуда видно, что оно линейно зависит от длины.

Теперь найдем связь между измеряемым радиусом rNT нанотрубки, ее механи ческими параметрами и прикладываемому к концам НТ напряжению. Во-первых, определяемый экспериментально радиус НТ (см. Экспериментальное определение радиуса НТ) соответствует радиусу люмена некоторого эффективного мембранного цилиндра, имеющего ту же проводимость и длину, что и НТ. Во-вторых, согласно уравнению (26) равновесный радиус нейтральной поверхности такого цилиндра reff будет зависеть от прикладываемого к концам НТ напряжения следующим образом:

1 C U (27), = 2 reff r 3K где r – равновесный радиус нейтральной поверхности цилиндрической НТ (когда U = 0), или, с учетом (20):

1 2 0 C0U (28).

= reff K 3K И, в-третьих, как следует из уравнения (21), равновесный радиус эффективного ци линдра связан с измеряемым rNT выражением:

1 1 1 = (29).

+ reff 2 (rNT + a )2 (rNT + a + h ) Здесь учтено, что ri = rNT + a, где a – толщина слоя полярных головок липидов во внутреннем монослое, равная 0.5 нм. Таким образом, окончательное выражение, свя зывающее измеряемый радиус люмена НТ с механическими параметрами БЛМ и прикладываемым напряжением, имеет вид:

4 0 2C0U 1 (30).

+ = (rNT + a )2 (rNT + a + h )2 K 3K Следовательно, с ростом U должно происходить увеличение измеряемых значений радиусов НТ. Такая зависимость представлена на рисунке 4а. Построение зависимо сти левой части выражения (30), которая определяется экспериментально, от квадра та приложенного к НТ напряжения, как это изображено на рисунке 4б, дает возмож ность по углу наклона найти модуль изгиба K мембраны, а по точке пересечения с осью ординат - латеральное натяжение 0. Ниже приведена таблица найденных зна чений K и 0 для БЛМ различного липидного состава.

Из таблицы видно, что жесткость фосфолипидных БЛМ увеличивается с рос том концентрации в них холестерина. В то же время ее латеральное натяжение прак тически не меняется и равно примерно 1 дин/см, что совпадает с величиной, найден ной методом выдувания (Черномордик и др., 1987). Однако модули изгиба мембран, измеренные нами на НТ, оказались в два раза меньше полученных на гигантских ли посомах (Bo and Waugh, 1989;

Rawicz et. al., 2000;

Henriksen et. al., 2004;

). Это несо ответствие, скорее всего, вызвано тем, что радиусы структур, для которых опреде ляют модули изгиба мембран, отличаются на порядки. Поэтому если мы имеем дело с многокомпонентной мембраной, и значение спонтанных кривизн этих компонент сильно различаются, как в случае ДОФХ и ДОФЭ (Leikin et. al., 1996;

Chen and Rand, 1997), то липидные составы внешнего и внутреннего монослоев НТ будут разными.

Это, в свою очередь, должно приводить к уменьшению жесткости мембраны НТ (Kozlov and Helfrich, 1992). Что касается фосфолипидных мембран, содержащих ли золипид и холестерин, то, насколько нам известно, подобных измерений ранее не проводилось. Модуль изгиба таких мембран измерен нами впервые. Видно, что он аномально высок, что, скорее всего, связано с плотной упаковкой холестерина с ли золипидом в бислое. В работах (Ramsammy et. al., 1983) было показано, что они мо гут образовывать между собой водородные связи.

Рис.4. а – зависимость измеряемого rNT от приложенного к концам НТ напряжения. б – определе ние механических параметров бислоя из зависимости правой части уравнения (30) от квадрата приложенного к НТ напряжения.

ДОФХ:ДОФЭ 2:1 + Холестерин ДОФХ:ДОФЭ 2:1+Хол:ОФХ 1: K, Дж·10-20 Хол:ОФХ% K, Дж·10-, дин/см, дин/см Хол % 0 3.6 ± 0.3 1.2±0.4 0 3.6 ± 0.3 1.2±0. 5 4.6 ± 0.6 1.0±0.2 10 12.8±1.6 0.9±0. 10 5.8 ± 0.6 1.1±0.3 20 35.3±3.3 0.9±0. 15 6.8 ± 0.7 1.1±0.2 40 76.4±5.6 0.8±0. Таблица 1. Зависимость механических параметров БЛМ от ее липидного состава.

Отметим, что зависимость радиусов НТ от концентрации лизолипидов и холе стерина в бислое может иметь определенное биологическое значение. Согласно по следним исследованиям внутриклеточного и межклеточного транспорта (Duman et.

al, 2003;

Rustom et. al., 2004), цилиндрические мембранные образования играют важ ную роль в этом процессе. Эффективность такого транспорта зависит от проницае мости мембранных трубок, а значит, от их размеров. Можно предположить, что хо лестерин и лизолипид используются клетками в качестве модуляторов селективно сти клеточных мембранных НТ.

Исследование механизма деления клеточной мембраны в модельной системе «НТ + ГТФаза динамин».

Взаимодействие НТ с динамином. Для исследования деления мембранной НТ белком динамином, ее вытягивали из БЛМ, содержащих 15-30 % отрицательно заряженных липидов (фосфотидилсерин, ФС). Использовались мембраны двух ли пидных композиций - ДОФХ:ДОФЭ:ДОФС:Холестерин 27.5:27.5:15:30 и ДОФХ:ДОФЭ:ОФС:Холестерин 30:30:20:20, имеющих практически одинаковую плотность поверхностного заряда, но разное значение модуля изгиба, 17±3 kT и 150±20 kT соответственно, что позволяло получать НТ двух типов: с радиусом лю мена 6.1±0.5 нм и 21±0.5 нм (далее такие трубки с r = 21 нм будем называть широ кими или шНТ).

Для подтверждения факта адсорбции динамина на поверхность БЛМ, содер жащих ФС, использовали метод измерения второй гармоники трансмембранного по тенциала (см. Материалы и Методы). Было обнаружено, что регистрируемый эффект возникал только при высоком содержании ДОФС в мембране, более 80%. На рисун ке 5а показано, что добавление динамина с одной из сторон БЛМ (ДОФС:Холестерин 85:15) в конечной концентрации 0.04 мг/мл приводит к возник новению трансмембранного потенциала равного 10 мВ;

характерное время адсорб ции составляло минуты. Эффект кратковременной аппликации динамина к поверх ности БЛМ посредством перфузионной пипетки изображен на рисунке 5б;

он демон стрирует, что процесс адсорбции белка на плоскую мембрану обратим.

Рис.5. а – возникновение трансмембранного потенциала на БЛМ (липидный состав ДОФС:Хол 85:15) при добавлении с одной из ее сторон динамина с конечной концентрацией 0.04 мг/мл, мо мент добавления белка отмечен стрелкой. б – обратимость сорбции динамина на БЛМ (липидный состав ДОФС:Хол 85:15). Динамин добавляли посредством перфузионной пипетки, концентрация белка в пипетке составляла 0.4 мг/мл. Время начала аппликации белка отмечено стрелкой вниз, время прекращения – стрелкой вверх.

Данные, полученные с помощью флуоресцентной микроскопии, свидетельст вуют о том, что динамин сорбируется на поверхности НТ, мембрана которой содер жит ДОФС. На рисунке 6а представлены последовательно сделанные фотографии НТ, вытянутой из гигантской униламелярной липосомы до добавления динамина и после кратковременной его аппликации. Липидный состав липосомы был таков:

ДОФС:ДОФХ:ДОФЭ:Хол:ДОФЭ-родамин 15:27.5:24.5:30:3, причем родамин ис пользовался в качестве флуоресцентной метки. Из сравнения фотографий видно, что динамин сорбируется и формирует на поверхности НТ белковую структуру, которая сжимает трубку. Для исследования динамики этого процесса мы измеряли проводи мость внутренних каналов НТ и шНТ.

Для определения эффекта, оказываемого динамином на геометрию НТ, мы добавля ли его (концентрация 0.4 мг/мл) посредством перфузионной пипетки, которую под водили к НТ на расстояние не более 2 мкм (см. Материалы и Методы). Постепенное уменьшение проводимости свидетельствовало о сужении трубки, предположительно вызванным сжатием ее динаминовой спиралью. В течение десятков секунд проводи мость достигала нового стационарного уровня (рис. 6б). В аналогичных эксперимен тах с шНТ характер изменения проводимости сохранялся, но только становился бо лее медленным (см. рис 6б). Кроме изменения стационарного уровня проводимости, адсорбция динамина влияла на устойчивость НТ к уменьшению ее длины: так, если длину свободной НТ можно было укоротить практически до 0, то после аппликации динамина НТ рвалась (см. рис 6б) при достижении некоторой длины, отличной от 0.

Рост проводимости свидетельствовало том, что белок только частично покрывал по верхность трубки. После того как длина НТ достигала некоторого значения, даль нейшее укорочение становилось невозможным - трубка рвалась в ответ на механиче ское воздействие.

Рис.6.Поджатие НТ динамином. а - динамин добавили к флуоресцентно меченной НТ между 0 с и 5 с посредством перфузионной пипетки. Концентрация белка в пипетке 0.4мг/мл. Состав мембра ны ДОФС:ДОФХ:ДОФЭ:Хол:ДОФЭ-родамин 15:27.5:24.5:30:3. Масштаб 5 мкм. б – уменьшение проводимости НТ (черная кривая) и шНТ (серая кривая) в результате кратковременной добавки к ним динамина;

последующая попытка укоротить НТ приводит к ее разрыву (проводимость резко падает до фонового уровня Gbg). Правая ось ординат соответствует относительной проводимо G Gbg сти нанотрубки, которая находится из соотношения Gотн =, левая ось ординат соот Ginit Gbg ветствует длине НТ (верхняя кривая справа от пунктирной линии), ось абсцисс – время, для НТ единица шкалы 1 с, а для шНТ 10 с.

Так как во время локальной перфузии белка степень покрытия нанотрубки ди намином сильно варьировалась, в другой серии экспериментов НТ вытягивали в присутствии динамина (концентрация 4 мкМ) в растворе электролита. Показано, что в используемых концентрациях динамин не оказывал влияния на проводимость НТ.

Напротив, проводимость НТ начинала постепенно уменьшаться сразу после ее обра зования (см. рис 7а). Это подтверждает тот факт, что динамин собирается в спираль только на мембранах, имеющих достаточную кривизну (Yoshida et. al., 2004). После того как проводимость НТ достигает стабильного уровня, ее реакция на уменьшение длины НТ исчезает. Это свидетельствовало о том, что динамин полностью покрывал НТ, образуя на ее поверхности стабильную белковую спираль, способную навязы вать НТ большую кривизну. При этом сохранялась возможность дальнейшего удли нения НТ (рис. 7б). После того как пэтч-пипетка отводилась от БЛМ, и, тем самым, вытягивался новый свободный участок НТ, динамин довольно быстро собирался на нем и сжимал его (рис. 7б). Зная длину вытянутого участка трубки (она в точности равнялась смещению пипетки), мы нашли, что независимо от его длины значение радиуса люмена, до которого сжималась НТ, составляло 2.5±0.5 нм (SD, n=4), в то время как для шНТ эта величина была равна 12±2 нм (SD, n=4). Соответственно, ди намин вызывал уменьшение проводимости нанотрубки в три раза (см. рис.8в, два ле вых столбца);

усреднение проводилось по 15 экспериментам с НТ и 9 экспериментам с шНТ.

Меняя липидный состав мембраны, мы обнаружили, что конечный размер сжатой динамином нанотрубки зависит от жесткости мембраны. Это говорит о том, что энергия, выделяемая белком в процессе его полимеризации, не намного превос ходит изгибную энергию НТ. Тем не менее, для сжатия нанотрубок до столь малых радиусов она должна быть существенной. В случае шНТ, найденное нами значение оказалось порядка 10 kBT на одну молекулу динамина. При вычислении мы предпо лагали, что упаковка динамина на поверхности шНТ аналогична той, что наблюда лась на нанотрубках того же размера в других экспериментальных системах(Zhang and Hinshaw, 2001). Таким образом, можно сделать заключение, что в отсутствии ГТФ динамин кластеризуется на поверхности липидных нанотрубок, формируя же сткую структуру, которая достаточно сильно их сжимает, причем степень поджатия определяется жесткостью их мембраны. Деления НТ без ГТФ не происходит.

Рис.7. а – влияние динамина на формирование НТ (динамин присутствует в растворе электроли та в концентрации 0.04 мг/мл), серая кривая отображает поведение НТ в отсутствии белка, про водимость НТ нормирована относительно начальной проводимости. б – изменение проводимости сжатой динамином НТ после ее удлинения;

пунктирная линия отмечает начало уменьшения про водимости НТ только за счет сжатия белком вновь вытянутого участка.

Взаимодействие НТ с динамином в присутствии ГТФ. Инициировать деле ние можно было ГТФ, который добавляли двумя способами: либо с помощью перфу зионной пипетки после адсорбции динамина на НТ, либо введением в раствор элек тролита одновременно с динамином до формирования НТ (см. Материалы и Мето ды). В первом случае исследовали эффект, который оказывал гидролиз ГТФ на ди наминовую спираль. Добавление нуклеотида к сжатым динамином НТ и шНТ при водило к быстрому росту их проводимости (см. рис. 8а). Относительная проводи мость шНТ при этом обычно достигала нового стационарного уровня, который был ниже 1 (см. рис. 8в, центральная пара столбцов). Причем она быстро возвращалась к исходному значению после удаления ГТФ из раствора (см. рис. 8а). В 6 из 6 экспе риментов деления шНТ после добавления ГТФ не наблюдалось, а НТ, напротив, в из 3 случаев рвалась. После предварительного роста ее проводимость мгновенно па дала до 0, что и соответствовало ее разрыву. Время роста менялось от эксперимента к эксперименту, относительная проводимость НТ при этом успевала вырасти при мерно вдвое (см. рис. 8в, центральная пара столбцов).

Структурный анализ на основе электронной микроскопии показал, что гидро лиз ГТФ может приводить к изменению шага и/или радиуса динаминовой спирали, что согласно существующим предположениям, должно вызывать дальнейшее суже ние и деление нанотрубки (Sweitzer and Hinshaw, 1998;

Stowell et. al., 1999). Однако обнаруженный нами рост проводимости нанотрубки не вписывается в рамки этих предположений. Стоит отметить, что его скорость сравнима с наблюдаемыми транс формациями динаминовой спирали под воздействием гидролиза ГТФ. Действитель но, рост проводимости вызван скорее изменением организации динамина в спирали, чем десорбцией его с мембраны, которая согласно ряду работ существенно медлен нее (Tuma and Collins, 1995). Кроме того, сжимающая способность белковой спирали быстро восстанавливается после удаления ГТФ из системы (см. рис. 8а). Следова тельно, изменения ее структуры все же происходят, но они не направлены на суже ние НТ.

В цитоплазме клетки динамин всегда находится вместе с ГТФ. Поэтому во второй серии экспериментов исследовали взаимодействие белка с нанотрубками в присутствии ГТФ. Одновременная аппликация динамина (0.04 мг/мл) и ГТФ (1 мМ) приводила к такому же скачкообразному делению НТ (см. рис. 8б) – проводимость НТ менее чем за 1 мс падала до 0 (см. рис. 9б). Обрыв НТ наблюдался в 11 из 14 та ких экспериментов. Поджатие НТ перед этим если и наблюдалось, то было незначи тельным: на рисунке 8в черный столбец из правой пары соответствует значению от носительной проводимости НТ, которое она достигала перед делением. Когда вместо ГТФ использовали его негидролизуемый аналог ГТФS, динамин не рвал НТ, а сжи мал их так же, как делал это без ГТФ (в 4 из 4 экспериментов). В отличие от НТ в присутствии ГТФ и динамина шНТ оставалась стабильной, при этом она слегка поджималась (см. рис. 8б). Поджатие было примерно вдвое слабее, чем в присутст вии одного динамина (см. рис 8в). Стоит отметить, что уровень относительной про водимости, который достигала шНТ, не зависел от способа введения ГТФ – после динамина или одновременно с ним (см. рис. 8в). Длину такой шНТ можно было спо койно уменьшать практически до 0, трубка не рвалась. Полученные данные свиде тельствует о том, что гидролиз ГТФ препятствует образованию протяженной жест кой белковой структуры и, тем самым, не позволяет динамину сжимать НТ и шНТ по всей длине.

Далее было показано, что деление НТ в этих условиях не сопровождалось формированием проводящих дефектов в ее мембране. Для этого в верхний отсек ячейки, изображенный на рисунке 1, погружали третий электрод, с помощью кото рого следили за электрической утечкой мембраны. В момент обрыва НТ никаких всплесков ее проводимости не было. Это говорит о том, что деление НТ идет через образование структуры полуделения, что возможно только после того, как НТ будет сжата так, что ее внутренний монослой сможет локально перезамкнуться. Следова тельно, динаминовая спираль, конформационные изменения в которой приводят к делению НТ, очень короткая. В противном случае мы наблюдали бы значительное уменьшение проводимости нанотрубки перед ее делением.

Рис.8. Влияние динамина и ГТФ на относительную проводимость нанотрубок. а – добавление ГТФ к сжатым динамином нанотрубкам приводит к росту проводимости как НТ (черная кривая), так и шНТ (серая кривая). НТ всегда рвалась после некоторого периода роста ее проводимости, в то время как шНТ оставалась стабильной и снова быстро сжималась после удаления ГТФ. б – одновременная аппликация динамина и ГТФ вызывала быстрое деление НТ (черная кривая) и сла бое поджатие шНТ (серая кривая), длину шНТ можно было свободно варьировать. в – характер ные уровни проводимости, которые достигают НТ (черные столбцы) и шНТ (серые толбцы) по сле инкубации с динамином;

после добавления ГТФ к нанотрубкам, сжатым динамином;

после ин кубации одновременно с динамином и ГТФ (для НТ в последних двух случаях имеется в виду прово димость, предшествующая ее разрыву).

Для регистрации формирования на поверхности НТ таких коротких динамино вых структур был проведен ряд экспериментов с короткими НТ. Для этого, в присут ствии динамина (0.04 мг/мл) и ГТФ (1 мМ) нанотрубку сразу после формирования быстро укорачивали до 400 ± 200 нм длины (см. рис. 9а). В 18 из 18 экспериментов делению короткой НТ всегда предшествовали медленные волнообразные флуктуа ции ее проводимости (см. рис. 9а), тогда как в отсутствии ГТФ колебания проводи мости не наблюдались. Из анализа изменения проводимости НТ в этих эксперимен тах можно выделить два процесса: медленный (десятки секунд), соответствующий обратимому изменению геометрии НТ (сужение/расширение участка НТ), и быстрый (доли миллисекунд), соответствующий непосредственно делению НТ. Мы считаем, что быстрый процесс напрямую не связан с конформационными изменениями дина миновой спирали, так как они никогда не наблюдались в экспериментах с шНТ, а распределение времен жизни НТ в этих условиях было довольно широким (см. рис.

9в). Кроме того, маловероятно, что первое же конформационное изменение всегда приводит к делению НТ. Поэтому медленным процессам, описанным выше, скорее всего, соответствуют конформационные изменения динаминовой спирали на по верхности НТ.

Можно предположить, что жесткость динаминовой спирали определяется только латеральным (т.н. стэкинг) взаимодействием плотно примыкающих друг к другу витков, о котором известно, что оно ответственно не только за самосборку спирали, но и ускорение гидролиза ГТФ. Тогда, согласно нашим данным, коопера тивный гидролиз ГТФ должен приводить к разъединению витков, в результате чего спираль теряет жесткость и перестает фиксировать форму НТ. Более того, с помо щью электронной микроскопии ранее было показано, что в присутствии ГТФ дина мин формирует нерегулярную спираль, имеющую большое количество протяженных участков с неплотной упаковкой динамина (Stowell et. al., 1999). Это объясняет как наблюдаемое расширение сжатых динамином нанотрубок после добавления к ним ГТФ (см. рис. 8а), так и колебания проводимости коротких НТ (см. рис. 9а), которые отражают динамическое равновесие спирали между “жестким” и “мягким” состоя ниями. Из анализа амплитуды этих колебаний мы нашли, что в присутствии ГТФ ( мМ) спираль содержит от 3 до 5 жестких витков.

Рис. 9. Деление короткой НТ динамином в присутствии ГТФ. а – Делению коротких НТ предше ствуют волнообразные колебания ее проводимости. б – Одновременное измерение проводимости НТ (черная кривая) и проводимости утечки сквозь стенку НТ (серая кривая). Сноска наверху изо бражает деление с большим временным разрешением. в – Гистограмма времен жизни коротких НТ в присутствии динамина и ГТФ.

Механизм деления НТ ГТФазой динамином. Нами показано, что, с одной стороны, гидролиз ГТФ необходим для деления НТ, но, с другой, его энергия расхо дуется не на дальнейшее сужение и деление мембраны НТ, а на разъединение витков динаминовой спирали, в результате чего последняя теряет жесткость. Так как дина мин вызывал деление только НТ, а шНТ оставалась стабильной, мы считаем, что именно значение радиуса, который динамин навязывает нанотрубке до гидролиза ГТФ, определяет возможность ее дальнейшего деления. В теоретической работе (Kozlovsy and Kozlov, 2003) было показано, что образование структуры полуделения, а вслед за этим и само деление возможно, если радиус кривизны внутреннего моно слоя станет меньше 2 нм (радиус люмена ~ 1.5 нм). Поэтому динаминовая спираль сама по себе (без ГТФ) не способна поделить НТ, т.к. она не обеспечивает такого плотного сжатия – радиус люмена, до которого динамин сжимает НТ, равен 2.5 ± 0. нм. Для того чтобы мембрана НТ начала провисать между соседними витками такой спирали, ее внутренний радиус должен стать меньше критического: rc 2 нм - при этом значении расстояние между витками (в случае плотной упаковки это 13 нм) становится равным внешнему диаметру НТ. Если же внутренний радиус НТ не сколько больше rc, то для обеспечения ее локального сужения и деления необходимо увеличение расстояния между любыми соседними витками. Чем больше радиус лю мена, тем дальше должны расходиться витки. Следовательно, при близких к rc зна чениях даже незначительное увеличение расстояния между витками спирали может привести к делению НТ. Наше предположение заключается в том, что именно так и происходит деление мембраны в системе “мембранная НТ – ГТФаза динамин”. А именно, динамин сорбируется и наращивает спираль на поверхности НТ, сжимая ее под собой практически до rc. Латеральное взаимодействие витков спирали запускает кооперативный гидролиз ГТФ, который в свою очередь приводит к их разъедине нию. Далее, как показали теоретические расчеты (Akimov et. al., 2007), в зависимо сти от длины участка спирали, потерявшего жесткость, может происходить как про висание, так и расширение НТ (см. рис. 10). Расчеты проводились в предположении, что поток липида под спиралью затруднен, и площадь НТ между витками сохраняет ся. Стоит отметить, что чем длиннее будут участки спирали, оставшиеся жесткими, тем больше времени потребуется на увеличение расстояния между ними. За это вре мя количество гидролизовавших ГТФ примыкающих витков может стать больше, так что заключенной в них НТ будет уже более выгодно расширяться (см. рис. 10).

Это объясняет наблюдаемый нами предварительный рост проводимости НТ перед делением при добавлении ГТФ к НТ после динамина (см. рис. 8а).

Рис. 10. Механизм деления НТ динамином. а – НТ, сжатая жесткой динаминовой спиралью (же сткие участки отмечены черным цветом), серыми стрелками отмечен виток, гидролизующий ГТФ. б – в результате гидролиза ГТФ один из витков перестал плотно контактировать с сосед ними (отмечен серым цветом). в – оставшиеся жесткими участки спирали не успевают разой тись, прежде чем число гидролизовавших ГТФ витков увеличится ( на рис. б они отмечены серы ми стрелками), после этого происходит расширение НТ. г – оставшиеся жесткими участки спи рали расходятся, в результате чего НТ локально сужается и формирует структуру полуделения, которая приводит к полному делнию НТ.

Энергия, необходимая для сжатия НТ до rc сравнима с энергией, выделяемой в результате кооперативного гидролиза ГТФ динаминовой спиралью (см. выше). Та ким образом, можно сказать, что динаминовая спираль работает по принципу завод ного механизма. Выделяемая в процессе самосборки белком энергия идет на дефор мацию мембраны НТ, а энергия гидролиза ГТФ расходуется на размыкание витков его спирали, динамин при этом возвращается практически в исходное состояние, ко гда он снова готов скручиваться и сжимать НТ.

Нами показана тесная взаимосвязь между динамином и липидным бислоем, что имеет биологическую значимость. Чувствительный к кривизне динамин будет полимеризоваться только на поверхности сильно изогнутых мембранных перешей ков и будет регулировать их проводимость и/или делить их в зависимости от геомет рических и механических параметров последних. Вариацией липидного состава пе решейка можно управлять процессом его деления. В присутствии ГТФ динамин мо жет существенно менять проницаемость перешейка, периодически сжимая – разжи мая его, так что флуктуации его проводимости будут типа “kiss-and-run” (Newton et.

al., 2006). Суммируя все выше сказанное, мы можем сделать вывод о том, что “со трудничество” динамина с липидными мембранами предоставляет клетке универ сальный инструмент, позволяющий контролировать многие аспекты поведения мем бранных НТ.

ВЫВОДЫ.

1. Разработан метод определения механических параметров мембраны нанотрубки НТ (модуль изгиба, латеральное натяжение), основанный на анализе стационарной формы НТ, к концам которой приложена разность потенциалов. Показано, что жест кость многокомпонентной мембраны уменьшается с ростом ее кривизны. Это может быть связано с перераспределением липидных молекул, имеющих разное значение спонтанной кривизны, между внутренним и внешним монослоем мембраны. Когда радиус кривизны становится сравним с толщиной бислоя, модуль изгиба уменьшает ся вдвое.

2. Показано, что система, состоящая из отрицательно заряженной липидной нанот рубки и ГТФазы динамина, адекватно воспроизводит основные стадии деления кле точной мембраны. Динамин сжимает НТ, сорбируясь и формируя стабильную струк туру на ее поверхности. Возможность деления НТ динамином в присутствии ГТФ определяется жесткостью ее мембраны, причем деление происходит без образования проводящих дефектов в стенке НТ.

3. Показано, что конформационные изменения динаминовой спирали в результате гидролиза ГТФ не вызывают ни дальнейшего ее сужения, ни увеличения ее шага. В действительности гидролиз ГТФ приводит к исчезновению стекинг-взаимодействия между витками спирали, они разъединяются, а спираль в итоге теряет жесткость.

Показано, что в физиологических условиях динамин формирует на поверхности НТ спирали, имеющие всего 3-5 жестких витков.

4. Радиус, до которого динамин сжимает НТ, является критическим параметром, оп ределяющим возможность деления, а он в свою очередь зависит от модуля изгиба мембраны. Таким образом, нами показано, что молекулы липида наравне с динами ном могут выполнять регуляторную роль в процессе деления клеточной мембраны.

5. На основе полученных данных было выдвинуто предположение о механизме де ления НТ динамином. Согласно ему энергия гидролиза ГТФ расходуется на разъе динение витков спирали динамина. Дальнейшая эволюция НТ зависит от радиуса, до которого она была сжата динамином, а также от длины участка спирали, гидролизо вавшего ГТФ.

РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ 1. П. В. Башкиров. “Мембранные нанотрубки в электрическом поле как система для измерения механических параметров липидного бислоя.” Биологические мембраны, 2007, том 24, № 2, с 183-192.

2. Bashkirov P. V. “Membrane Nanotubes in Electrical Field as a Model to Measure Mechanical Parameters of Lipid Bilayer” Biochemistry (Moscow), series A: Mem brane and Cell Biology, 2007, Vol. 1, № 2, pp. 176-184.

3. Bashkirov P.V., Lizunov V. A., Zimmerberg J., Frolov V.A. “Membrane nanotubes pulled from planar BLM: membrane mechanics at very high curvatures.” // Bio physical Society’s 50-th Annual meeting, 18-22 Feb 2006, Salt Lake City, Utah, USA. Biophysical Journal, January 2006, Vol. 90, p. 784.

4. Frolov V. A., Bashkirov P. V., Lizunov V. A., Zimmerberg J. “Regulation of perme ability through membrane nanotubes via shape transformation” // EMBO workshop on Cell Membrane Organization and Dynamics, 3-7 Jun 2006, Bilbao, Spain. Тези сы, стр. 18.

5. Akimov S. A., Bashkirov P. V., Zimmerberg J., Frolov V. A., “A possible role of curvature scaffolding in dynamin-induced fission of membrane nanotube” // Society of general physiologists 61-th annual meeting and symposium, Membrane biophys ics of fusion, fission and rafts in health and disease, Marine Biological Labora tory, Woods Hole, MA, Sep. 5-9, 2007, proceedings p. 18a