Механизмы формирования внутреннего центромерного домена кинетохора позвоночных животных.

На правах рукописи

БОЯРЧУК

Екатерина Юрьевна

МЕХАНИЗМЫ ФОРМИРОВАНИЯ ВНУТРЕННЕГО

ЦЕНТРОМЕРНОГО ДОМЕНА КИНЕТОХОРА

ПОЗВОНОЧНЫХ ЖИВОТНЫХ.

03.00.25 – гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Санкт-Петербург

2007 2

Работа выполнена в Институте цитологии РАН, Санкт-Петербург и Национальных институтах здоровья (США) Научные руководители: кандидат биологических наук Арнаутов Алексей Михайлович Национальные институты здоровья, Бетезда, США доктор биологических наук, академик Никольский Николай Николаевич Институт цитологии РАН,Санкт-Петербург

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Подгорная Ольга Игоревна Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург кандидат биологических наук Филатов Михаил Валентинович Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова РАН, Гатчина

Ведущая организация:

Санкт-Петербургский государственный университет, биолого-почвенный факультет, Санкт-Петербург

Защита состоится «25» мая 2007 года в 15 ч на заседании Диссертационного совета Д.002.230.01 при Институте цитологии РАН по адресу: Тихорецкий пр., д. 4, 194064, Санкт-Петербург. [email protected]

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН.

Автореферат разослан « » апреля 2007 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандита биологических наук Е.В. Каминская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Разделение генетического материала между дочерними клетками – один из важнейших шагов в ходе клеточного цикла. Для осуществления правильной сегрегации хромосом во время митоза в клетке происходят сложнейшие взаимодействия между микротрубочками (МТ) веретена деления и хроматином. Хромосомы присоединяются к МТ, растущим с противоположных полюсов митотического веретена, при помощи кинетохоров. Кинетохор представляет собой многокомпонентную белковую структуру, которая формируется на центромерном участке каждой сестринской хроматиды. Кинетохор может быть условно разделен на 2 субдомена:

внутренний центромерный домен (ВЦД) и наружный кинетохор (НК) (Cleveland et al., 2003). Компоненты наружного кинетохора участвуют в присоединении микротрубочек к хроматину и генерируют сигнал, блокирующий начало выхода из митоза до тех пор, пока все хромосомы не будут присоединены к митотическому веретену. Внутренний центромерный домен состоит из белков, вовлеченных в удержание сестринских хроматид до наступления анафазы и в регуляцию присоединения микротрубочек. Основные компоненты ВЦД – транзитный хромосомный комплекс (ТХК, анг., chromosomal passenger complex), кинезин MCAK и комплекс Sgo/PP2a (Shugoshin/фосфатаза РР2а) (Cleveland et al., 2003;

Rivera and Losada, 2006). Sgo в комплексе с РР2а блокирует диссоциацию комплекса Когезина в центромерном районе, предохраняя таким образом сестринские хроматиды от преждевременного расхождения. Кроме этого, Sgo регулирует динамику МТ веретена деления и стабилизирует кинетохорные МТ. ТХК состоит из киназы Aurora B, и белков INCENP, Survivin и Dasra A/Borealin. ТХК фосфорилирует гистон Н3, что является обязательным условием митотической конденсации хромосом, и необходим для инициации сборки кинетохора (Vagnarelli and Earnshaw, 2004). Более того, ТХК регулирует активность кинезина MCAK и, таким образом, участвует в регуляции полимеризации и деполимеризации тубулиновых филаментов и контролирует формирование правильного (амфителического) присоединения МТ веретена деления к кинетохорам (Andrews et al., 2004).

Сборка функционального кинетохора происходит заново в ходе каждого клеточного цикла. Считается, что сборка наружного кинетохора происходит в строгом иерархическом порядке;

т. е. связывание одних компонентов регулируется присутствием на кинетохоре других. (Vigneron et al., 2004).

Несмотря на значительные успехи в изучении строения наружного кинетохора, регуляция формирования ВЦД остается плохо изученной. Известно, что во время перехода из профазы в прометафазу ТХК переходит с плеч хромосом в ВЦД (Vagnarelli and Earnshaw, 2004). Механизм, регулирующий этот переход, неизвестен. Недавние исследования показали, что локализация белка MCAK во внутреннем центромерном домене зависит от ТХК (Andrews et al., 2004), а накопление в ВЦД белка Sgo регулируется компонентом НК Bub1 (Kitajima et al., 2004), но детали регуляции сборки функционального ВЦД не ясны. Поиск механизма регуляции сборки внутреннего центромерного домена и являлся предметом данной работы.

Цели и задачи исследования. Целью работы было изучение процесса формирования внутреннего центромерного домена кинетохора позвоночных животных. Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Выбрать модель, позволяющую изучать формирование кинетохоров позвоночных с применением биохимических методов, и приемлемую для дальнейших функциональных исследований.

2. Выявить биохимический путь (пути), который регулирует формирование внутреннего центромерного домена кинетохора.

3. Выяснить взаимозависимость формирования внутреннего центромерного домена, наружного кинетохора и митотической конденсации хромосом.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Киназа Bub1 контролирует расположение ТХК во внутреннем центромерном домене кинетохора в прометафазе митоза.

2. Киназа Bub1 абсолютно необходима для обеспечения связывания белка xSgo с митотическим хроматином.

3. ТХК регулирует локализацию белка xSgo во внутреннем центромерном домене.

4. Формирование как внутреннего центромерного домена, так и наружного кинетохора происходит независимо от митотической конденсации хроматина.

Научная новизна работы. Впервые показано, что компонент наружного кинетохора – белок Bub1 – опосредует расположение ТХК во внутреннем центромерном домене кинетохора в прометафазе. Эта функция Bub1 у позвоночных животных консервативна. Показано, что Bub1 регулирует стабильность ТХК. Также выявлено, что Bub1 обеспечивает связывание белка Sgo с митотическим хроматином, но не с кинетохором. При этом связывание самой киназы Bub1 с кинетохором не является обязательным условием для выполнения этой функции. Локализация белка Sgo во внутреннем центромерном домене в метафазе регулируется ТХК. Выполнение обеих функций по сборке ВЦД – регуляция связывания белка Sgo с хроматином и обеспечение правильной локализации ТХК – требует киназной активности Bub1. Также продемонстрировано, что формирование наружного и внутреннего центромерного доменов может происходит после митотической конденсации хроматина.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные могут быть использованы для дальнейшего изучения механизмов формирования кинетохора. Выявленные два различных пути регуляции формирования внутреннего центромерного домена позволяют предположить существование многоуровневой системы контроля сборки кинетохора. Более того, в свете предшествующих исследований, показавших роль белка Bub1 в формировании наружного кинетохора и в функционировании контрольной точки сборки веретена деления, наши данные говорят о роли этого фермента в координации многочисленных аспектов прохождения митоза и регуляции прохождения клеточного цикла.

Теоретические результаты работы используются в курсе «Структура и функция хроматина» для магистров СПбГУ, а также могут быть использованы в учебных спецкурсах по клеточной биологии, читаемых на биолого медицинских факультетах высших учебных заведений.

Апробация работы. По теме диссертации опубликовано 2 статьи и 4 тезисных сообщения, представленных на XV Всероссийском совещании «Структура и функция ядра» (СПб, 2005), и на международных конференциях: American Society for Cell Biology, 44th meeting (Washington, DC, 2004), The Cell Cycle (Cold Spring Harbor, 2006) и American Society for Cell Biology, 46th meeting (San Diego, CA, 2006) Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста и состоит из введения, глав «Обзор литературы», «Материал и методика», «Результаты», «Обсуждение», «Заключение», выводов и списка цитируемой литературы. Иллюстрационный материал представлен рисунками, из них 15 цветных.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКИ Рекомбинантные белки и антитела. кДНК, кодирующие xenopus Bub1K871R и xenopus Aurora B K122R были получена методом ПЦР. Нарушения киназной активности в белке xenopus Bub1K871R были описаны ранее (Sharp-Baker and Chen, 2001). Мутация К122R была внесена в последовательность xenopus Aurora В исходя из данных о нарушениях киназной активности в гомологе этой киназы у человека (Ditchfield et al., 2003). Bub1 и Bub1K871R были клонированы в модифицированный вектор pGEM, содержащий 5' и 3' UTR -глобина X.

laevis. Aurora B и Aurora BK122R, слитые с zz последовательностью (двумя z доменами – производными от домена связывания белка А Staphylococcus aureus;

zz последовательность была клонирована из вектора pEZZ (Amersham Bioscience)), были клонированы в сходным образом модифицированный вектор, содержащий промотер SP6 (оба вектора любезно предоставлены д-ром Йем-Бо Ши, Национальные Институты Здравоохранения, Бетезда, США). Транскрипцию РНК проводили при помощи транскрипционного набора mМessage mМACHINE (Ambion). Экспрессию белков в экстракте ооцитов проводили по протоколу Р-Х Чен (Sharp-Baker and Chen, 2001). 6His-Bub1 и 6His-Bub1K871R экспрессировали в клетках High Five (культура клеток Trichopulsia ni, Invitrogen, бакуловирусы любезно предоставлены д-ром Дж. Маллером, Университет Колорадо, Денвер, США).

В работе были использованы антитела против следующих белков: RCC1, PIASy и топоизомераза II были получены в лаборатории д-ра М. Дассо (Национальные Институты Здравоохранения, Бетезда, США) и охарактеризованы ранее, промежуточная цепь динеина (Dynein IC, Abcam, clone 74.1), p150glued, hAurora B (Beckman Dickens), Survivin (R&D;), фосфорилированная форма гистона H3 (pH3 S10, Upstate Biotechnology), xenopus Bub3 and Mad2 (предоставлены д-ром Р-Х Чен, Корнелльский университет, Итака, США), xenopus Dasra A (любезно предоставлены д-ром Х.

Фунабики, Университет Рокфеллера, Нью-Йорк, США), xenopus INCENP (любезно предоставлены д-ром Т. Стукенбергом, Университет Вирджинии, Шарлотсвилль, США), xenopus Циклин В (любезно предоставлены д-ром Т.

Хантом, Лондонский Исследовательский институт, Лондон, Великобритания), hBub1 (Sigma, клон 14H5). Сыворотка CREST была любезно предоставлена д ром И. Успенским (Национальные Институты Здравоохронения, Бетезда, США). Поликлональные антитела против xenopus Bub1 (ак 274-467), xenopus Aurora B, xenopus RanGAP1, Scc1 (пептид: EPYSDIIATPGPRFH), xenopus BubR1 (ак 189-359), hMCAK( пептид: C-IQKQKRRSVNSKIPA), xenopus Sgo (ак 1-663), xenopus Cenp-A (пептид: MRPGSTPPSRRKSRPPRRVS-C) были получены при иммунизации кроликов или куриц и аффинно очищены. Все вторичные антитела, конъюгированные с флуорохромами Alexa Fluor – 488, 568 или 647, были приобретены в фирме Molecular Probes Inc.

Приготовление цитоплазматического экстракта из ооцитов X. laevis.

Ядра спермиев и цитоплазматические экстракты из зрелых ооцитов X. laevis.

были получены согласно опубликованным ранее протоколам (Kornbluth, 2001).

Ядра спермиев добавляли в концентрации 1000-4000 ядер на 1 мкл экстракта.

При индукции митоза добавляли нокодазол (Sigma) в концентрации 20 мкг/мл.

Для иммуноистощения белка из экстрактов конъюгированные с белком А магнитные частицы (Dynal Co) инкубировали в течение 16 ч с указанными антителами или с контрольными IgG из сыворотки кролика (Vector) при +4°C, а затем ковалентно связывали, используя диметил пимелимидат•2 HCl (Dimethyl pimelimidate•2 HCl, Pierce) по протоколу производителя. Частицы инкубировали в 10%-ном растворе гидролизованного желатина (Sigma) в буфере CSF-XB (10 мМ Hepes-KOH, pH 7.7, 100 мМ KCl, 2 мМ MgCl2, 5 мМ EGTA) 20 мин., промывали буфером CSF-XB и инкубировали в течение 1 ч с экстрактами при +23°C или при +4°C. Магнитные частицы вместе с образовавшимися имммунными комплексами удаляли из экстракта сильным магнитом.

Очистка хроматина. Для получения очищенной фракции сформированных в экстрактах хромосом 100 мкл цитоплазматического экстракта, содержащего хроматин, разбавляли в 5 раз 0.8-кратным буфером CSF-XB содержащим 20 мМ -глицерофосфата, 5% глицерина и 0.5% Triton X 100, инкубировали при комнатной температуре в течение 1 мин., наслаивали на подушку, содержащую буфер CSF-XB и 35% глицерина, и центрифугировали при 10000g в течение 5 мин. при +4°C. Осадок пипетировали в том же буфере, наслаивали на подушку и центрифугировали при тех же условиях. К осадкам добавляли 60 мкл буфера Лэммли и кипятили в течение 5 мин. Для очистки хроматина из интерфазных экстрактов 100 мкл экстракта, содержащего хроматин, разбавляли 0.8-кратным буфером CSF-XB, содержащим 20 мM глицерофосфата, 5% глицерина, инкубировали в течение 1 мин. при комнатной температуре и центрифугировали так же, как и хромосомы.

Для иммунофлуоресцентного анализа 30 мкл экстракта, содержащего хроматин, разбавляли в 10 раз 0.8–кратным буфером CSF-XB, содержащим 250 мM сахарозы. Хроматин фиксировали, добаляя равный объем того же буфера, содержащего 4% параформальдегида. После 30 мин. фиксации при комнатной температуре хроматин осаждали на покровные стекла центрифугированием через подушку, содержащую 40% глицерина. Для окраски антинелами против Cenp-A, хроматин фиксировали в течение 5 мин., добавляя 5 объемов 0.8-кратнрого буфера СSF-XB, содержащего 4% параформальдегида, осаждали на стекла через подушку и затем фиксировали в течение 5 мин. охлажденным метанолом при -20°C.

Клеточные линии, их культивирование, получение стабильных клеточных линий, РНК интерференция. В работе использовали клеточную линию HeLa. Клетки культивировали на среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота. Конструкция EGFP Survivin была любезно предоставлена д-ром С. Дмитровым (институт Альбера Боннуа, Ля Тронш, Франция). Клеточная линия, экспрессирующая EGFP Survivin, была сделана с использованием реагента Effectin (Qiagen) по протоколу производителя. Дуплексы РНК для истощения Ламина А/С и Bub (нуклеотиды 273-295) были транфицированы при помощи реагента Oligofectamin (Invitrogen) по протоколу производителя. Клетки анализировали спустя 48 часов после трансфекции. Перед фиксацией клетки инкубировали в течение 1 ч в присутствии 0,4 мкг/мл нокодазола.

Иммунофлуоресценция и анализ изображений. Клетки промывали PBS, содержащим 1 мМ MgCl2 и фиксировали 4%-ным формалином. После фиксации клетки пермеабилизовали 0.2% Triton X-100. Осажденный на стекла хроматин и пермеабилизированые клетки инкубировали 40 мин в 3%-ном растворе бычьего сывороточного альбумина (Sigma) в ТВS, содержащем 0,1% Tween-20, окрашивали первичными антителами в течение 1 ч при комнатной температуре, а затем – вторичными антителами в течение 40 мин. ДНК окрашивали красителем Хёхст 33342 (4 мкг/мл). Образцы анализировали при помощи микроскопа Axioskop;

Carl Zeiss MicroImaging, Inc., с объективом Iris 100x/1.4 или 40x/1.3 (Carl Zeiss MicroImaging, Inc.). Изображения снимались камерой Orca II;

Hamamatsu Photonics K.K. Управление системой осуществлялось программным обеспечением Openlab Software (Improvision).В случае Рис. 5 изображения были получены с использование конфокального микроскопа Zeiss LSM 510 Meta system. Масштабные отрезки – 20 мкм (кроме специально отмеченных случаев).

Иммунопреципитация и zz-преципитация. Взаимодействие белков изучали с помощью методов иммунопреципитаци и zz-преципитации. Для иммунопреципитации конъюгированные с белком А частицы Сефарозы (Amercham Bioscience) связывали с антителами в течение 16 ч при +4°C. ЦСФ экстракты разбавляли в 5 раз буфером CSF-XB, содержащем 20 мM глицерофосфата, 10 мкг/мл ингибиторов протеаз (леупептина, пепстатина и химостатина) и инкубировали с антителами, связанными с сефарозой в течение 2 ч при +4°C. После окончания инкубации частицы промывали буфером CSF XB, содержащем 20 мМ -глицерофосфата и 0,5% Triton X-100. Иммунные комплексы элюировали с сефарозы 0.1 M глицином (pH 2.4), растворяли в двукратном буфере для SDS-электрофореза, кипятили и использовали для элeктрофореза с последующим выявлением белков методом Вестерн-блотинга или окраской геля серебром или красителем кумаси синий.

Для zz-преципитации в экстракты добавляли рекомбинантные Aurora B– zz или Aurora BK122R–zz и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. После окончания инкубации экстракты разбавляли в 5 раз буфером CSF-XB, содержащем 20 мМ -глицерофосфата и 10 мкг/мл ингибиторов протеаз, и инкубировали с IgG-Сефарозой (Amercham Bioscience) в течение 2 ч при +4°C. По окончании инкубации частицы cефарозы промывали 3 раза буфером CSF-XB, содержащем 20 мМ -глицерофосфата и 0.5% Triton-X100. Комплексы элюировали с IgG-Cефарозы 0.1 M глицином (pH 2.4). и использовали для элeктрофореза с последующим выявлением белков методом Вестерн-блотинга.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Выбор модели для изучения строения и регуляции формирования кинетохора Одной из распространенных моделей для исследования регуляции сборки кинетохора и его функции являются цитоплазматические экстракты из зрелых ооцитов Xenopus laevis. Эта система позволяет воспроизвести in vitro процессы репликации, конденсации и сегрегации хромосом (Maresca and Heald, 2006).

Среди основных достоинств системы следует отметить способность цитоплазматических экстрактов поддерживать в течение долгого времени определенную стадию клеточного цикла (митоз или интерфазу) и возможность воспроизведения в экстрактах многочисленных морфологических и биохимических процессов, которые происходят in vivo в течение клеточного цикла. Более того, система экстрактов X. laevis позволяет получить биохимический нокаут любого белка путем его истощения из цитоплазматического экстракта аффинными антителами, и таким образом исследовать роль данного белка в ходе клеточного цикла.

Зрелые ооциты остановлены на стадии метафазы II мейоза действием цитостатического фактора (ЦСФ) (Kornbluth, 2001). Полученная центрифугированием цитоплазматическая фракция (ЦСФ-экстракты) сохраняет все биохимические особенности таких ооцитов. In vivo проникновение спермия вызывает выброс ионов кальция из внутренних компартментов ооцита.

Повышение цитоплазаматической концентрации Са2+ приводит к инактивации ЦСФ и завершению ооцитом мейотического деления. Добавление CaCl2 в ЦСФ экстракты имитирует выброс ионов кальция и приводит к инактивации ЦСФ и переходу экстрактов в интерфазу. Существуют два метода получения митотических хромосом с использованием экстрактов ооцитов (рис. 1).

Рисунок 1. Схема получения ЦСФ- и М-хромосом: Для получения ЦСФ хромосом в ЦСФ-экстракты добавляли 4000 ядер спермиев/мкл и нокодазол в конечной концентрации 20 мкг/мл. Хромосомы очищали после 2 ч инкубации при 23°C. Для получения М-хромосом в ЦСФ-экстрактах индуцировали интерфазу добавлением 0,06 мМ CaCl2, а затем к таким экстрактам добавляли 2000 ядер спермиев/мкл. Через 1 ч в экстрактах индуцировали переход в митоз, добавляя 2/3 объема ЦСФ-экстрактов и нокодазол. Хромосомы очищали через ч после инициации митоза.

По первому методу ядра спермиев добавляются непосредственно в ЦСФ экстракт. Это приводит к формированию нереплицированных митотических хромосом (ЦСФ-хромосом). При использовании второго метода в ЦСФ экстрактах сначала инициируют интерфазу, и ядра спермиев добавляют уже в интерфазные экстракты, где образуется ядро, и ДНК спермия проходит репликацию. Добавление к интерфазным экстрактам 2/3 объема ЦСФ экстрактов приводит к переходу экстрактов в митоз и формированию реплицированных митотических хромосом (М-хромосом). Обоснованность использования ЦСФ-хромосом для исследования структуры и регуляции формирования кинетохора представлялась нам спорной, так как в последние годы стали накапливаться данные о существенных нарушениях в структуре ЦСФ-хромосом (Sawin and Mitchison, 1991;

Maresca et al., 2005).

Для того, чтобы определить, являются ли ЦСФ-хромосомы адекватной моделью для изучения процесса сборки кинетохора, мы сравнили количество некоторых белков кинетохора на ЦСФ- и М-хромосомах. Уровень белков наружного кинетохора Bub1, BubR1 и субъединицы динактина p150glued, а также некоторых компонентов ВЦД – белков Aurora B и Dasra A – был значительно снижен в ЦСФ- хромосомах (рис. 2А). Кроме того, расположение компонентов ТХК (Aurora B и Survivin) в ЦСФ-хромосомах было нарушено. В М-хромосомах Aurora B и Survivin связаны исключительно с ВЦД, тогда как в ЦСФ-хромосомах значительная доля Aurora B и Survivin располагалась на плечах хромосом (рис. 2Б). Следует отметить, что в прометафазе в соматических клетках компоненты ТХК располагаются строго во внутреннем центромерном домене ((Vagnarelli and Earnshaw, 2004), рис. 5А).

А Б Рисунок 2. Кинетохоры, сформированные на ЦСФ-хромосомах, имеют нарушенную структуру. (А) Очищенные ЦСФ- и М-хромосомы, полученные согласно схеме, изображенной на рис. 1, анализировали методом Вестерн-блотинга с антителами против указанных белков.Уровень фосфорилированного гистона Н3 (pH3) и гистонов Н2А/Н2B использовали в качестве контроля загрузки. Количество гистонов H2A/H2B выявляли методом SDS-PAGE с последующей окраской серебром. (Б) ЦСФ- и М хромосомы анализировали методом непрямой иммунофлуоресценции с антителами против белков Aurora B, и Bub1;

ДНК (здесь и далее) окрашивали красителем Хёхст Более того, отсутствие белка Bub1 в экстрактах по-разному влияло на сборку кинетохоров на ЦСФ- и М-хромосомах. Истощение Bub1 из экстрактов при формировании М-хромосом приводило к снижению количества связанных с хроматином белков BubR1 и p150glued (рис. 3А). Сходное уменьшение количества связанных с хроматином белков НК в отсутствии Bub1 характерно и для кинетохоров соматических клеток (Johnson et al., 2004). В отличие от М хромосом и соматических клеток, отсутствие Bub1 при сборке кинетохоров на ЦСФ-хромосомах полностью блокировало связывание BubR1 и p150glued с хроматином (рис. 3А, Б). Основываясь на полученных результатах, мы заключили, что организация кинетохоров на М-хромосомах сходна с организацией кинетохоров соматических клеток. Поэтому в дальнейших исследованиях в качестве модели для анализа организации и способов регуляции сборки кинетохора были использованы М-хромосомы.

А Б Рисунок 3. Различная чувствительность к отсутствию белка Bub1 при сборке наружного кинетохоров в ЦСФ и М-хромосомах. (А) Образцы цитоплазматических экстрактов и очищенные ЦСФ- и М хромосомы, сформированные в контрольных экстрактах или экстрактах, лишенных Bub (Bub1), анализировали методом Вестерн-блотинга с антителами против указанных белков;

уровень фосфорилированного гистона Н3 (рН3) и гистонов Н2А/Н2B использовали в качестве контроля загрузки. Количество гистонов H2A/H2B выявляли методом SDS-PAGE с последующей окраской серебром.

(Б) Хромосомы анализировали методом непрямой иммунофлуоресценции с антителами против BubR1 и p150glued.

2.1. Bub1 контролирует расположение транзитного хромосомного комплекса во внутреннем центромерном домене в системе экстрактов ооцитов Xenopus laevis ТХК представляет собой комплекс, состоящий из киназы Aurora B и белков INCENP, Survivin и Dasra A. Блокирование активности киназы Aurora B или отсутствие одного из компонентов комплекса приводит к аномальной ориентации хромосом, их неправильной сегрегации, потере способности клетки к генерации сигнала контрольной точки сборки веретена деления и многим другим нарушениям прохождения митоза (Vagnarelli and Earnshaw, 2004). Сходные нарушения наблюдаются и в клетках, где отсутствует белок Bub1 (Johnson et al., 2004;

Meraldi and Sorger, 2005), что говорит о потенциальной связи между ТХК и Bub1. В то же время, недавние исследования показали, что белок Bub1 регулирует расположение одного из компонентов ВЦД – белка Sgo (Kitajima et al., 2004). Основываясь на этих данных, мы предположили, что Bub1 может быть регулятором организации всего внутреннего центромерного домена.

А В Г Б Рисунок 4. Bub1 контролирует расположение ТХК во внутреннем центромерном домене кинетохора в системе цитоплазматических экстрактов ооцитов X. laevis. (A, Б) Тотальные цитоплазматические экстракты и очищенный митотический хроматин, сформированный в контрольных или лишенных эндогенного Bub1 (Bub1) экстрактах, анализировали методом Вестерн-блотинга с использованием антител против компонентов НК (BubR1, p150glued, Mad2, Bub3 и промежуточной цепи динеина (Dynein IC)), компонентов ТХК (Aurora B, Survivin, Dasra A) и фосфорилированной формы гистона Н3 (рН3). Уровень топоизомеразы II (Topo II) использовали в качестве контроля загрузки. (В, Г) Очищенный митотический хроматин анализировали методом непрямой иммунофлуоресценции (В) с антителами против Aurora B и BubR1, (Г) против Survivin и p150glued. На (Г) показаны индивидуальные хромосомы.

Масштабные отрезки – 20 мкм (В) и 3 мкм (Г).

Для определения роли Bub1 в формировании внутреннего центромерного домена были проанализированы М-хромосомы, сформированные в контрольных экстрактах и экстрактах, лишенных эндогенного Bub1.

Истощение Bub1 приводило к снижению уровня многих белков наружного кинетохора (рис. 3А, 4А), что согласуется с ранее опубликованными результатами (Sharp-Baker and Chen, 2001;

Vigneron et al., 2004). При истощении Bub1 падало также и количество связанных с хроматином компонентов ТХК (рис. 4А, Б). Более того, расположение ТХК в отсутствие Bub1 было нарушено.

В хромосомах, сформированных в контрольных экстрактах, белок Аurora B располагался строго в ВЦД (рис. 4В), тогда как в отсутствии белка Bub Aurora B распределялся равномерно по всей длине хромосом.

Иммунофлуоресцентный анализ расположения белка Survivin на М хромосомах, сформированных в экстрактах, лишенных Bub1, выявил сходные нарушения в локализации этого компонента ТХК: в отличие от четкого расположения в ВЦД в контрольных образцах, белок Survivin не накапливался на кинетохоре в отсутствии Bub1.

2.2. Bub1 контролирует расположение транзитного хромосомного комплекса во внутреннем центромерном домене в соматических клетках Чтобы определить, является ли зависимость расположения транзитного хромосомного комплекса от белка Bub1 общей для позвоночных, было проанализировано расположение ТХК в присутствии и в отсутствии Bub1 в соматических клетках. Истощение Bub1 из клеток HeLa проводили методом интерференции РНК (иРНК).

Б А Рисунок 5. Белок Bub1 необходим для правильной локализации ТХК на кинетохоре в соматических клетках.

(А) Клетки линии HeLа трансфецировали дуплексами РНК, специфичными для последовательностей Ламина А/С (Ламин А/С) или Bub1 (Bub1).

Через 24 ч после трансфекции клетки обрабатывали нокодазолом в течение 1 ч, фиксировали и окрашивали антителами против белков Bub1 и Aurora B.

(Б) Клетки линии HeLa, экспрессирующие Survivin-ЕGFP, обрабатывали как в (А) и окрашивали антителами против центромерного маркера CREST.

В контрольных клетках киназа Aurora B располагалась строго в ВЦД, тогда как в отсутствии Bub1 Aurora B была связана с хроматином и не имела четко выраженной локализации (рис. 5А). Количество связанного с хроматином белка Aurora B также было снижено. Сходные результаты были получены при анализе клеточной линии HeLa, конститутивно экспрессирующей Survivin ЕGFP: спустя 24 ч после обработки специфическими дуплексами РНК большинство клеток, находящихся в прометафазе митоза, имело диффузное распределение белка Survivin-ЕGFP по плечам хромосом, тогда как в контрольных образцах (после обработки дуплексами, специфическими для Ламина А/С) Survivin-ЕGFP был сконцентрирован в ВЦД (рис. 5Б).

Основываясь на этих данных и данных, полученных с использованием системы цитоплазматических экстрактов ооцитов X. laevis, мы заключили, что у позвоночных роль Bub1 в контроле расположения ТХК во внутреннем центромерном домене кинетохора в митозе консервативна.

2.3. Bub1 контролирует стабильность транзитного хромосомного комплекса Известно, что целостность ТХК необходима для связывания компонентов этого комплекса с хроматином (Sampath et al., 2004). Следовательно, падение уровня связанного с хроматином ТХК в отсутствии Bub1 могло быть вызвано биохимическими изменениями в ТХК. Изменения стабильности ТХК оценивали, используя взаимодействие компонентов ТХК с рекомбинантным компонентом комплекса – киназой Aurora B, слитой с zz-последовательностью (Aurora B-zz). Рекомбинантный белок добавляли в контрольные экстракты и экстракты, лишенные Bub1, в концентрации близкой к эндогенному количеству Aurora B. Сформировавшийся на рекомбинантном белке Aurora B-zz комплекс очищали при помощи IgG-сефарозы (zz-преципитация). Было обнаружено, что в отсутствие Bub1 компоненты ТХК (INCENP, Dasra A, Survivin) менее эффективно связываются с Aurora B-zz (рис. 6). Следует отметить, что падение эффективности формирования комплекса не было вызвано деградацией компонентов комплекса в отсутствии белка Bub1 в экстрактах (рис. 6).

Известно, что стабильность ТХК регулируется киназной активностью Aurora B (Honda et al., 2003). В наших экспериментах истощение Bub1 из экстрактов не приводило к падению уровня фосфорилирования гистона Н (рис. 4Б) – одного из наиболее изученных субстратов киназы Aurora B (Murnion et al., 2001), и, следовательно, нарушение локализации Aurora B на хроматине и отсутствие в экстрактах Bub1 не блокировало полностью активность киназы.

Тем не менее, чтобы исключить возможность того, что нарушение формирования комплекса с рекомбинантной формой Aurora B в отсутствии Bub1 было вызвано изменением киназной активности Aurora B, в экспериментах по формированию комплекса была использована форма Aurora B-zz с мутацией, инактивирующей киназную активность (Aurora BK122R zz). Белки INCENP, Dasra A и Survivin значительно хуже связывались с Aurora BK122R-zz в контрольных экстрактах (рис. 6), что согласуется с данными о необходимости киназной активности Aurora B для формирования ТХК (Honda et al., 2003). Однако в отсутствие в экстрактах белка Bub1 образование комплекса практически полностью блокировалось. Эти результаты указывают на то, что Bub1 контролирует стабильность ТХК независимо от киназной активности Aurora B.

Рисунок 6. Bub стабилизирует TХК.

Рекомбинантные белки Aurora B-zz или Aurora BK122R-zz добавляли в контрольные экстракты или экстракты, лишенные эндогенного Bub1 (Bub1).

Сформированный на рекомбинантном белке комплекс очищали с помощью IgG-сефарозы (zz-преципитация).

Количество компонентов ТХК в элюатах проверяли методом Вестерн блотинга.

2.4. Киназная активность Bub1 абсолютно необходима для связывания ТХК с внутренним центомерным доменом Ранее было показано, что присутствие Bub1 на кинетохоре усиливает связывание белков наружного кинетохора посредством белок-белковых взаимодействий и независимо от киназной активности Bub1 (Sharp-Baker and Chen, 2001). Для того, чтобы определить, требуется ли киназная активность Bub1 для правильного расположения ТХК в ВЦД, мы получили рекомбинантные белки: Bub1 дикого типа (wt) и Bub1, киназная активность которого была нарушена точечной мутацией в киназном домене – Bub1K871R.

Рекомбинантные белки добавляли в экстракты, лишенные белка Bub1, в концентрации, близкой к концентрации эндогенного Bub1. Анализ сформированного в таких экстрактах митотического хроматина показал, что рекомбинантный Bub1 дикого типа способен восстановить расположение ТХК во внутреннем центромерном домене (рис. 7). Усиление связывания с хроматином компонентов HK не требовало киназной активности Bub1 (рис 7Б), что согласуется с результатами предшествующих исследований (Sharp-Baker and Chen, 2001). Однако киназная активность Bub1 оказалась абсолютно необходимой для восстановления правильной локализации ТХК. Добавление Bub1K871R приводило к восстановлению уровня компонентов НК, связанных с хроматином, но не восстанавливало нарушенного расположения ТХК, вызванного истощением эндогенного белка Bub1 из экстрактов.

Б А Рисунок 7. Киназная активность Bub1 необходима для локализации ТХК во внутреннем центромерном домене. (A) В экстракты, лишенные эндогенного Bub1(Bub1), добавляли буфер (Буф) или рекомбинантные белки: Bub1 дикого типа (WT) или форму Bub1 с нарушенной киназной активностью Bub1K871R (K871R).

Очищенный хроматин, сформированный в таких экстрактах, анализировали методом Вестерн-блотинга с применением антител против указанных белков. Уровень RCC1 использовали в качестве контроля загрузки. (Б) Очищенный хроматин, полученный как в (А), окрашивали антителами против BubR1 и Aurora B.

Таким образом, Bub1 контролирует расположение транзитного хромосомного комплекса во внутреннем домене кинетохора во время митоза у позвоночных, причем эта функция требует киназной активности Bub 3.1. Bub1 контролирует связывание xSgo с митотическим хроматином Недавние исследования на дрожжах и млекопитающих показали, что Bub контролирует связывание с кинетохорами еще одного компонента ВЦД – белка Sgo (Kitajima et al., 2004;

Tang et al., 2004). Также известно, что в дрожжах S.

pombe для накопления Sgo на кинетохоре требуется киназная активность Bub (Kitajima et al., 2004). В отличие от опубликованных данных, где отсутствие Bub1 приводило только к нарушению расположения Sgo на хромосоме, анализ митотического хроматина, сформированного в экстрактах, лишенных эндогенного Bub1, показал, что в системе цитоплазматических экстрактов xenopus Sgo (xSgo) не способен связаться с хроматином в отсутствие Bub (рис. 7А, 8). Добавление рекомбинантного Bub1 или BubK871R в экстракты, лишенные эндогенного Bub1, показало, что для связывания xSgo с митотическим хроматином требуется киназная активность Bub1: только добавление Bub1 дикого типа приводило к появлению xSgo на хроматине (рис. 7А, 8). Следует отметить, что добавление рекомбинантного Bub приводило к восстановлению не только связывания xSgo c хроматином, но и его расположения в ВЦД (рис. 8).

Рисунок 8. Киназая активность Bub1 необходима для связывания xSgo с митотическим хроматином.

Очищенный митотический хроматин, сформированный как на рис. 7, окрашивали антителами против xSgo и BubR1.

3.2. Для связывания xSgo с митотическим хроматином не требуется накопления киназы Bub1 на кинетохоре Белок Bub1 является компонентом наружного кинетохора и связывается с кинетохором в профазе митоза. Мы исследовали вопрос о том, требуется ли накопление Bub1 на кинетохоре для формирования ВЦД, или же растворимая форма киназы Bub1 также способна выполнять эту функцию. Известно, что истощение Aurora B из экстрактов полностью ингибирует связывание Bub1 с хроматином (Vigneron et al., 2004). Наши исследования подтвердили опубликованные ранее данные: белок Bub1 не связывался с хроматином в отсутствие ТХК (рис. 9). При этом количество Bub1 в экстрактах и его киназная активность не изменялись. В отсутствие ТХК белок xSgo связывался с митотическим хроматином, хотя и не так эффективно, как в контроле (рис. 9).

Этот результат позволяет предположить, что растворимая форма Bub способна вызвать связывание xSgo с митотическим хроматином.

Рисунок 9. Растворимая киназа Bub1 способна контролировать связывание xSgo с митотическим хроматином. Тотальные цитоплазматические экстракты и очищенный митотический хроматин, сформированный в контрольных экстрактах, экстрактах, лишенных Bub1 (Bub1), ТХК (ТХК) или совместно ТХК и Bub1 (ТХК/Bub1), анализировали методом Вестерн блотинга с антителами против указанных белков.

Для доказательства этой гипотезы было произведено совместное истощение из экстрактов компонентов ТХК и Bub1. Отсутствие ТХК и Bub1 приводило к потере связывания xSgo митотическим хроматином. Таким образом, наши результаты показали, что хотя для связывания Sgo с митотическим хроматином киназная активность Bub1 абсолютно необходима, физическая связь самой киназы Bub1 с кинетохором для выполнения этой функции не требуется, и Bub1 регулирует накапливание xSgo на митотическом хроматине независимо от своей локализации.

3.3. Транзитный хромосомный комплекс необходим для правильного расположения xSgo на кинетохоре Как было отмечено выше, отсутствие ТХК в экстрактах приводило к некоторому уменьшению количества связанного с хроматином xSgo. Более подробное исследование хроматина, сформированного в отсутствии ТХК, выявило, что в отличие от четкой локализации xSgo в ВЦД в контрольных образцах, в отсутствии ТХК белок xSgo диффузно располагался на хроматине (рис. 10А). Таким образом, наличие киназной активности Bub1 достаточно для связывания xSgo с хроматином, тогда как для правильного расположения xSgo на кинетохоре требуется присутствие ТХК.

Б А В Рисунок 10. ТХК необходим для правильного расположения xSgo на кинетохоре. (А) Хроматин, сформированный в контрольных экстрактах и в экстрактах, лишенных ТХК (ТХК), окрашивали антителами против xSgo.(Б) ТХК и xSgo преципитировали из ЦСФ-экстрактов указанными антителами. Полученные иммунные комплексы анализировали методом Вестерн-блотинга антителами против Aurora B и xSgo. (В) ТХК, преципитированный антителами против Aurora B, анализировали методом SDS-PAGE с последующей окраской красителем кумаси синий. Стрелками указаны положения компонентов ТХК и xSgo.

Одним из возможных механизмов регуляции расположения xSgo в ВЦД может служить прямое физическое взаимодействие между ТХК и xSgo.

Реципрокная иммунопреципитация с использованием антител против Aurora B и xSgo показала, что ТХК и xSgo образуют комплекс (рис. 9Б). Следует, однако, отметить, что xSgo не является стохиометрическим компонентом ТХК (рис. 9В). Таким образом, физическое взаимодействие между ТХК и xSgo может обуславливать связывание последнего именно в ВЦД в митозе.

Опубликованные недавно исследования регуляции локализации Sgo в клетках D. melanogaster отчасти подтверждают наши результаты. Резник и др. показали в своей работе, что фосфорилирование dmSgo киназой Aurora B необходимо для накопления этого белка на кинетохоре (Resnick et al., 2006) 4. Формирование внутреннего центромерного домена и наружного кинетохора происходит независимо от митотической конденсации хроматина Чтобы определить точку клеточного цикла, в которой присутствие киназы Bub1 необходимо для формирования ВЦД, был проделан следующий эксперимент: митотические хромосомы формировали в экстрактах, лишенных Bub1, после чего к таким сформированным хромосомам добавляли рекомбинантный Bub1 или Bub1K871R (рис. 11).

Рисунок 11. Схема эксперимента. В контрольных или лишенных эндогенного Bub1 (Bub1) ЦСФ-экстрактах индуцировали переход в интерфазу. Через 60 мин. в таких экстрактах вызывали преход из интерфазы в митоз. Через 30 мин. в экстракты, лишенные эндогенного Bub1, добавляли буфер (Буф) или рекомбинантные белки 6His Bub1 (Bub1) или 6His-Bub1K871R(Bub1K871R). Хроматин очищали в момент добавления рекомбинантных белков (30’) и после 30 минут инкубации (60’).

Согласно нашим предыдущим результатам (рис. 4 и 8), в хромосомах, сформированных в отсутствии Bub1, киназа Aurora B располагалась на плечах хромосом, и xSgo не связывался с хроматином (рис. 12А, Б). Увеличение времени формирования митотического хроматина не приводило к накоплению Aurora B в ВЦД и связыванию xSgo с хроматином. Добавление рекомбинантного Bub1 к таким предсформированным хромосомам полностью восстанавливало правильное расположение Aurora B и xSgo в ВЦД и способствовало формированию полноценного наружного кинетохора.

Добавление Bub1K871R восстанавливало только формирование НК, но не приводило к сборке функционального ВЦД на таких хромосомах. Таким образом, Bub1 способен индуцировать сборку ВЦК на уже предсформированных митотических хромосомах. Более того, наши результаты предполагают, что сборка ВЦД происходит независимо от многих аспектов митотической конденсации.

Б А Рисунок 12. Сборка ВЦД не зависит от митотической конденсации хроматина. Cформированный и очищенный согласно схеме на рис. хроматин анализировали (А) методом Вестерн-блотинга с указанными антителами и (Б) методом непрямой иммунофлуоресценции с антителами против Aurora B и BubR1. Масштабный отрезок – 2мкм.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Основываясь на изложенных выше наблюдениях, можно предложить следующую схему сборки кинетохора. Во время профазы митоза киназа Aurora B инициирует формирование кинетохора. Один из возможных механизмов процесса инициации может быть фосфорилирование некоего центромерного белка, например Cenp-A (Zeitlin et al., 2001). Это приводит к связыванию с кинетохором различнх компонентов наружного кинетохора, в том числе и белка Bub1. Связывание Bub1 c кинетохором приводит в дальнейшем к формированию субдомена НК, вовлеченного в регуляцию контрольной точки сборки веретена деления. Связанная с кинетохором или растворимая киназа Bub1 также контролирует формирование ВЦД двумя способами.

Во-первых, киназа Bub1 способствует перемещению ТХК с плеч хромосом в ВЦД. Весьма вероятно, что киназа Bub1 контролирует не только стабильность ТХК, но и его связывание с неким, не установленным в настоящее время, компонентом ВЦД, который обеспечивает связывание ТХК с кинетохором. Это предположение отчасти подтверждается данными о невозможности восстановления нарушений, возникающих при истощении ТХК из экстрактов, добавлением смеси рекомбинантных компонентов ТХК (Sampath et al., 2004).

Исходя из этих результатов, также можно предположить существование не известных пока субъединиц ТХК помимо четырех описанных (Aurora B, INCENP, Survivin, Dasra A). Так же возможно, что Bub1 фосфорилирует компонент ВЦД, который обеспечивает физическое связывание ТХК с хроматином в этом домене.

Во-вторых, Bub1 может фосфорилировать сам белок Sgo или компонент хроматина, который связывается с Sgо, и вызывать таким образом накопление Sgo на хроматине. Связавшийся с хроматином Sgo при участии ТХК накапливается в ВЦД.

ВЫВОДЫ 1. Реплицированые митотические хромосомы, сформированные в цитоплзазматических экстрактах зрелых ооцитов Xenopus laevis, могут служить хорошей моделью для изучения строения, сборки и функционирования кинетохора позвоночных.

2. Киназа Bub1 контролирует расположение транзитного хромосомного комплекса во внутреннем центромерном домене кинетохора позвоночных.

3. Киназа Bub1 обеспечивает связывание белка xSgo с митотическим хроматином.

4. Накопление xSgo на кинетохоре требует присутствия транзитного хромосомного комплекса.

5. Процессы формирования наружного кинетохора и внутреннего центромерного домена происходят независимо от митотической конденсации хроматина.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Boyarchuk Y, Arnaoutov A, Dasso M. Bub1 is essential for the kinetochore localization of Aurora B/Survivin complex in Xenopus egg extracts. American Society for cell biology, 44th meeting, Washington, DC, 2004, p. 551-552) 2. Боярчук Е. Ю., Зенин В.В., Никольский Н.Н. Белок Bub1 необходим для формирования центромерного домена митотических хромосом. Цитология 2005, 47 (9), 796. Тезисы XV Всероссийского совещания «Структура и функция ядра», СПб, 3. Boyarchuk Y., Salic A., Dasso, M., Arnaoutov A. Shugoshin has two functions during cell cycle in Xenopus egg extracts (The Сell Сycle. Cold Spring Harbor, NY, 2006, p. 29) 4. Boyarchuk Y., Salic A., Dasso, M., Arnaoutov A. Bub1 Is Essential for Assembly of the Inner Centromere. American Society for cell biology, 46th meeting, San Diego, CA, 2006, pr. 701) 5. Boyarchuk Y.Yu., Nikolsky N.N., Dasso M., Arnaoutov A.M. Assembly of correct kinetochore architecture in Xenopus egg extract requires transition of sperm DNA through interphase. Cell and Tissue Biology 2007, 1 (1): 80- 6. Boyarchuk Y., Salic A., Dasso, M., Arnaoutov A. Bub1 is essential for assembly of the functional inner centromere. J. Cell Biol. 2007, 176: 919-928.

Список сокращений:

ВЦД внутренний центромерный домен МТ микротрубочки М-хромосомы хромосомы, полученные после репликации хроматина спермиев (см. рис. 1) НК наружный кинетохор ТХК транзитный хромосомный комплекс ЦСФ цитостатический фактор ЦСФ-хромосомы хромосомы, полученные при добавлении хроматина спермиев в ЦФС экстракты (см. рис. 1) ЦСФ-экстракты цитоплазматические экстракты, полученные из зрелых ооцитов, остановленных в метафазе II мейоза СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ Аndrews, P.D. et al.. 2004. Aurora B regulates MCAK at the mitotic centromere. Dev Cell 6:253 68. Cleveland, D.W. et al. 2003. Centromeres and kinetochores: from epigenetics to mitotic checkpoint signaling. Cell 112:407-421. Ditchfield, C. et al. 2003. Aurora B couples chromosome alignment with anaphase by targeting BubR1, Mad2, and Cenp-E to kinetochores. J. Cell Biol.

161:267-280. Honda, R. et al. 2003. Exploring the functional interactions between Aurora B, INCENP, and survivin in mitosis. Mol Biol Cell 14:3325-41. Johnson, V.L. et al. 2004. Bub1 is required for kinetochore localization of BubR1, Cenp-E, Cenp-F and Mad2, and chromosome congression. J Cell Sci 117:1577-89. Kitajima, T.S. et al. 2004. The conserved kinetochore protein shugoshin protects centromeric cohesion during meiosis. Nature 427:510-7. Kornbluth, S.Y. et al.

2001. Analysis of the cell cycle using Xenopus egg extratcs. In Current Protocols in Cell Biology.

11.11.11-11.11.13. Maresca, T.J. et al. 2005. Histone H1 is essential for mitotic chromosome architecture and segregation in Xenopus laevis egg extracts. J. Cell Biol. 169:859-869. Maresca, T.J. and R.Heald. 2006. Methods for studying spindle assembly and chromosome condensation in Xenopus egg extracts. Methods Mol. Biol. 322:459-474. Meraldi, P. and P.K.Sorger. 2005. A dual role for Bub1 in the spindle checkpoint and chromosome congression. Embo J 24:1621-33.

Murnion, M.E. et al. 2001. Chromatin-associated protein phosphatase 1 regulates aurora-B and histone H3 phosphorylation. J. Biol. Chem. 276:26656-26665. Resnick, T.D. et al. 2006. INCENP and Aurora B promote meiotic sister chromatid cohesion through localization of the Shugoshin MEI-S332 in Drosophila. Dev. Cell 11:57-68. Rivera, T. and A.Losada. 2006. Shugoshin and PP2A, shared duties at the centromere. Bioessays 28:775-779. Sampath, S.C. et al. 2004. The chromosomal passenger complex is required for chromatin-induced microtubule stabilization and spindle assembly. Cell 118:187-202. Sawin, K.E. and T.J.Mitchison. 1991. Mitotic spindle assembly by two different pathways in vitro. J. Cell Biol. 112:925-940. Sharp-Baker, H. and R.H.Chen. 2001. Spindle checkpoint protein Bub1 is required for kinetochore localization of Mad1, Mad2, Bub3, and CENP-E, independently of its kinase activity. J Cell Biol 153:1239-50. Tang, Z.

et al. 2004. Human Bub1 protects centromeric sister-chromatid cohesion through Shugoshin during mitosis. Proc Natl Acad Sci U S A 101:18012-7. Vagnarelli, P. and W.C.Earnshaw. 2004.

Chromosomal passengers: the four-dimensional regulation of mitotic events. Chromosoma 113:211-222. Vigneron, S. et al. 2004. Kinetochore localization of spindle checkpoint proteins:

who controls whom? Mol Biol Cell 15:4584-96. Zeitlin, S.G. et al.. 2001. CENP-A is phosphorylated by Aurora B kinase and plays an unexpected role in completion of cytokinesis. J.

Cell Biol. 155:1147-1157.