Валерий геннадиевич каталитическая субъединица энтеропептидазы человека: получение, характеризация ферментативных свойств и моделирование мутаций, облегчающих ренатурацию и повышающих специфичность фе

на правах рукописи

УДК 577.322.4

Остапченко Валерий Геннадиевич

КАТАЛИТИЧЕСКАЯ СУБЪЕДИНИЦА ЭНТЕРОПЕПТИДАЗЫ ЧЕЛОВЕКА:

ПОЛУЧЕНИЕ, ХАРАКТЕРИЗАЦИЯ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ СВОЙСТВ И

МОДЕЛИРОВАНИЕ МУТАЦИЙ, ОБЛЕГЧАЮЩИХ РЕНАТУРАЦИЮ И

ПОВЫШАЮЩИХ СПЕЦИФИЧНОСТЬ ФЕРМЕНТА

03.00.02 – Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва – 2006 Диссертация выполнена в Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН и на кафедре физико-химической биологии и биотехнологии МФТИ (ГУ) Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Долгих Дмитрий Александрович кандидат биологических наук Гаспарян Марине Эдуардовна

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук, Ефремов Роман Гербертович доцент доктор физико-математических наук Бычкова Валентина Егоровна

Ведущая организация: НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ

Защита состоится 20 декабря 2006 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета К 212.156.03 при Московском физико-техническом институте (государственном университете) по адресу: 141700, Московская обл., г. Долгопрудный, Институтский пер., 9, тел.: (495) 408-57-00, 408-56-27.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского физико-технического института (государственного университета).

Автореферат разослан «17» ноября 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета К 212.156. к.ф.-м.н., доцент Брагин В.Е.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Энтеропептидаза – ключевой фермент пищеварения млекопитающих. Она управляет каскадом пищеварительных ферментов, превращая трипсиноген в трипсин, который, в свою очередь, активирует другие зимогены, а также сам активно участвует непосредственно в протеолизе белковой пищи. Благодаря крайне редко встречающейся в других белках последовательности сайта узнавания (-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-) энтеропептидаза является широко используемым в биотехнологии инструментом для получения рекомбинантных гибридных белков, которые она расщепляет в этом сайте. Тем не менее, нередко наблюдаются случаи сниженной ферментативной активности энтеропептидазы по отношению к определенным гибридным белкам, а также потеря целевого продукта в результате неспецифического гидролиза.

В связи с этим важно оценить в полной мере специфичность энтеропептидазы. В последние годы подобная работа проделана в отношении десятков ферментов. Для многих из них определена специфичность по отношению не только к остатку, идущему непосредственно перед разрезаемой связью (Р1), но и к более удаленным остаткам, как с N-конца сайта узнавания (Р2-Рn), так и с С-конца (Р1’-Pn’). Для подобного исследования необходим многосторонний подход к изучению специфичности фермента, включая использование широких наборов или библиотек пептидных субстратов, а также исследование неспецифического гидролиза различных белков.

Не менее важной проблемой является понимание роли дистальных по отношению к разрезаемой связи аминокислотных остатков в ферментативном катализе. Считается, что их связывание с субстратом может понижать барьер реакции ферментативного расщепления путем передачи энергии по сети водородных связей. Кроме того, предполагается, что взаимодействия дистальных остатков с сайтами связывания протеиназы может влиять на внутренние движения фермента и субстрата, необходимые для осуществления некоторых этапов протеолитической реакции. Для проверки этого предположения необходимо накопление большого объема данных по подобным взаимодействиям, включая каталитические константы, энергетику процесса и молекулярную динамику взаимодействия фермент-субстрат.

Для полноценного исследования рекомбинантных белков очень важно наличие эффективных систем экспрессии, позволяющих нарабатывать белки в значительных количествах. В случае энтеропептидазы потребности современной науки довольно широки: помимо интереса ее изучения как важного элемента физиологии человека, энтеропептидаза стала важным инструментом биотехнологии, где используется для расщепления рекомбинантных гибридных белков. В связи со значительной трудностью получения в E. coli правильно сложенного белка с несколькими дисульфидными связями в цитоплазме, периплазме или секретированного в культуральную среду, часто используют такие условия экспрессии, при которых происходит агрегация белка и образование телец включения. В этом случае для получения правильно сложенного белка производят его ренатурацию из телец включения. Разработка и оптимизация процедуры ренатурации важна не только для получения конкретного белка, но и для выявления элементов структуры, важных для фолдинга родственных белков.

Цели исследования.

Целью данной диссертационной работы является получение рекомбинантной каталитической субъединицы энтеропептидазы человека, исследование ее ферментативных и физико-химических свойств, моделирование структурных изменений, облегчающих ее ренатурацию, и исследование структурных элементов, ответственных за специфичность фермента при расщеплении пептидных субстратов.

Задачи исследования.

1) Получить эффективную экспрессионную конструкцию для продукции рекомбинантной легкой цепи энтеропептидазы человека (L-HEP) в виде гибридного белка с тиоредоксином в E. coli и оптимизировать процедуру экспрессии.

2) Разработать и оптимизировать методики очистки и ренатурации гибридного белка тиоредоксин/L-HEP и очистки целевого белка L-HEP.

3) Охарактеризовать ферментативные свойства полученного препарата энтеропептидазы по гидролизу специфических и неспецифических пептидных субстратов, а также гибридных белков, содержащих сайт узнавания энтеропептидазы. Исследовать устойчивость препарата к денатурирующим агентам (детергенты, высокие концентрации солей, повышенная температура, кислые и щелочные рН и пр.).

4) С помощью методов молекулярного моделирования исследовать структуру L HEP на возможность введения мутаций для улучшения выхода ренатурации и повышения специфичности фермента.

Научная новизна и практическая значимость работы.

Все результаты, представленные в диссертационной работе, получены впервые, что следует из сравнения с отечественными и зарубежными публикациями.

1. Впервые осуществлена экспрессия каталитической субъединицы энтеропептидазы человека (L-HEP) в Escherichia coli в составе гибридного белка с тиоредоксином в качестве белка-носителя.

2. Разработана процедура ренатурации гибридного белка тиоредоксин/L-HEP, позволяющая получать до 10 мг активного фермента с литра культуры.

3. Впервые охарактеризована ферментативная активность каталитической субъединицы энтеропептидазы человека. Показано преимущество фермента человека по сравнению с ферментом быка при гидролизе рекомбинантных гибридных белков.

4. Показана высокая устойчивость ферментативной активности L-HEP к действию денатурирующих агентов, таких как детергенты, повышенная температура, отличная от физиологической кислотность буфера и восстанавливающие агенты.

Показано, что взаимодействие L-HEP с ингибиторами проходит по типу трипсин подобных сериновых протеиназ.

5. Показано, что высокие концентрации NaCl и CaCl2 ингибируют расщепление специфических субстратов L-HEP, при этом не влияя на скорость гидролиза неспецифических субстратов.

6. Построена пространственная модель L-HEP. Проведено молекулярное моделирование замещения цистеинов в положениях 122, 136 и 201 с целью получения фермента с более высоким выходом ренатурации. Получен мутантный вариант L-HEP/C122S, выход ренатурации которого в 4 раза выше, чем у дикого типа. Показано, что ферментативные свойства L-HEP и L-HEP/C122S практически не отличаются.

7. Показана вторичная специфичность L-HEP к хромогенным субстратам и белкам с ароматическими и большими гидрофобными остатками в положении Р2.

8. Впервые выявлены различия ферментативных свойств каталитических субъединиц энтеропептидаз человека и быка.

9. С помощью методов молекулярного моделирования определено, что аминокислотные остатки в положениях 96 и 219 ответственны за различие ферментативных свойств легких цепей энтеропептидаз быка и человека. Получены мутантные варианты L-HEP с заменой остатков в этих позициях на соответствующие остатки каталитической субъединицы энтеропептидазы быка (L-BEP). Показано, что остатки 96 и 219 влияют на константы связывания различных субстратов и частично определяют специфичность энтеропептидазы.

Разработанная методика получения рекомбинантной каталитической субъединицы энтеропептидазы человека позволяет не только облегчить дальнейшие исследования этого белка, но и более широко использовать технологию получения рекомбинантных белков в составе гибридов с белком-носителем.

Апробация результатов работы.

Основные материалы, изложенные в диссертации, докладывались и обсуждались на семинарах Лаборатории инженерии белка (ИБХ РАН), были представлены на международных конференциях, таких как Международный конгресс «Пиридоксальфосфат-зависимые ферменты: структура, молекулярная патология и медицина» (Москва, 2002), 15-ая зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2003), FEBS Форум для молодых ученых при 29-м конгрессе FEBS (Варшава, 2004), 30-й Конгресс FEBS «Мир белка» (Будапешт, 2005), 18-ая зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2006).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ.

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 2), материалов и методов (глава 3), результатов и обсуждения (глава 4), выводов и списка литературы.

Работы изложена на 108 страницах машинописного текста, содержит 17 рисунков, таблиц. Список литературы включает 125 источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Синтез гена L-HEP, его клонирование в плазмидные вектора и подбор экспрессионной системы.

Для получения последовательности ДНК, кодирующей легкую цепь энтеропептидазы человека (L-HEP), аминокислотные остатки 801-1035 (16-243 в нумерации химотрипсина), были синтезированы из 26 перекрывающихся на концах олигонуклеотидов. Для улучшения экспрессии в гене были заменены плохоэкспрессируемые в E. coli кодоны (согласно таблице встречаемости кодонов в геноме E. coli). Все олигонуклеотиды имели по 12-14 перекрывающихся нуклеотидов на Рисунок 1. Экспрессия и очистка L-HEP. Гибридный белок Trx/L-HEP экспрессировали в штамме Escherichia coli BL21(DE3), содержащем плазмиду pET-32a/L-HEP, и анализировали с помощью 12%-ного трис-трицинового ДСН-электрофореза в ПААГ. Дорожка 1, маркер молекулярного веса;

дорожка 2, клеточный лизат до индукции. Дорожки 3-5 представляют постиндукционные фракции белков;

дорожка 3, клеточный лизат и дорожки 4-5, растворимая и нерастворимая фракции, соответственно. Дорожка 6, автокаталитическое расщепление Trx/L-HEP после ренатурации нерастворимой фракции. Дорожка 7, L-HEP, очищенная на СИТ-агарозе.

обоих концах. Первый олигонуклеотид дополнительно кодировал сайт узнавания энтеропептидазы и сайт рестрикции Bgl II на 5’-конце. К последнему олигонуклеотиду добавляли сайт рестрикции Hind III на 5’-конце. Собранный с помощью полимеразной цепной реакции ген был клонирован в вектор pET-32a по рестрикционным сайтам Bgl II и Hind III. Данный вектор предназначен для продукции в E. coli гибридных белков с тиоредоксином на N-конце, целевым белком на С-конце и соединяющим их линкером, содержащим сайт узнавания энтеропептидазы (непосредственно перед целевым белком), а также два сайта для аффинной очистки: полигистидиновый и S-tag.

Полученной плазмидной ДНК pET-32/L-HEP трансформировали компетентные клетки E. coli XL-1 Blue для секвенирования последовательности и наработки плазмидной ДНК для дальнейшей экспрессии. Подбор штамма для экспрессии гибридного белка показал, что наилучшим образом для этой цели подходит штамм E.

coli BL21 (DE3), в котором экспрессия протекает под контролем Т7/lac-оперона. После проведения оптимизации условий экспрессии (подбор культуральной среды, температуры роста, концентрации индуктора IPTG) был достигнут очень высокий уровень экспрессии:

более 1 г гибридного белка Trx/L-HEP с 1 литра культуры (рис.1, дорожка 3).

Ренатурация гибридного белка Trx/L-HEP и очистка активного фермента L-HEP.

Наработанный бактериями гибридный белок Trx/L-HEP на 80% находился в составе телец включения (рисунок 1, дорожка 5). Тельца включения после процедуры отмывки содержали на 95% экспрессированный целевой белок. Очищенный из растворимой фракции гибридный белок Trx/L-HEP не расщеплялся автокаталитически и не проявлял активности даже после расщепления экзогенной энтеропептидазой (для чего использовался препарат каталитической субъединицы энтеропептидазы быка производства фирмы New England Biolabs). Активный фермент был получен с помощью ренатурации гибридного белка Trx/L-HEP из телец включения, после их солюбилизации в 6 М гуанидин-гидрохлориде. Для образования правильных дисульфидных связей была применена система буферов, содержащих пару окисленный/восстановленный глутатион.

Процедура ренатурации состояла из нескольких этапов. Сначала белок для полного восстановления цистеинов переводили в буфер с низким рН и пониженной концентрацией гуанидина (3 М). Затем в раствор добавляли окисленный глутатион для дисульфидного обмена с восстановленными SH-группами белка. На следующем этапе с помощью диализа избавлялись от избытка окисленного глутатиона и одновременно делали рН близким к физиологическому. Окончательный фолдинг белка проходил в буфере на основе аргинина, который параллельно ингибировал появляющуюся ферментативную активность. Кроме того, в буфере содержался восстановленный глутатион, способствующий дисульфидному обмену между полуцистин-глутатионами и образованию нативных дисульфидных связей.

После ренатурации гибридного белка от него автокаталитически отщеплялась L HEP – в процессе диализа белка против буфера, содержащего 50 мМ трис-гидрохлорид, рН 8.0, и 1 мМ CaCl2, в течение 3 ч. Активный фермент был очищен с помощью аффинной хроматографии на агарозе, конъюгированной с соевым ингибитором трипсина (СИТ) (рис.1, дорожка 7). Количество белка было определено по поглощению на длине волны 280 нм. Выход продукта (отношение количества чистого активного белка к количеству гибридного белка, взятому для ренатурации) до оптимизации ренатурации составил 1%.

Оптимизация проводилась по нескольким направлениям: изменение состава буферов для ренатурации и их рН, изменение температуры и длительности различных этапов диализа и инкубации, а также изменение концентрации ренатурируемого белка на разных стадиях ренатурации. В результате выход был увеличен до 2%, и удалось получить до 10 мг активного фермента с высокой степенью чистоты с 1 л культуры клеток (таблица 4).

Исследование ферментативных свойств L-HEP.

Для характеризации каталитических свойств L-HEP был проведен традиционный для исследования трипсин-подобных сериновых протеиназ набор тестов по расщеплению субстратов и ингибированию каталитической активности. В качестве субстратов были использованы синтетические субстраты Z-Lys-SBzl (субстрат трипсина) и GD4K-na (специфический субстрат энтеропептидазы – аналог активационного пептида трипсиногена), а также гибридные белки Trx/IL13 и Trx/hEGF. Гидролиз тиоэфира Z-Lys SBzl, пептидного флуоресцентного субстрата GD4K-na проводили согласно ранее описанным методикам. При гидролизе белкового субстрата его концентрация во всех случаях была в пределах 0.5-1 мг/мл, что соответствовало 15-50 мкМ. При измерении кинетических параметров ферментативная реакция гидролиза считалась соответствующей кинетике Михаэлиса-Ментен. Для расчета параметров бралось по две точки с концентрациями субстрата меньше и больше константы Михаэлиса. График зависимости скорости гидролиза от концентрации субстрата строился в двойных обратных координатах (1/V, 1/S) Лайна-Уивер-Берка (уравнение 1). Линейное приближение этой зависимости считалось с помощью программного пакета Origin 7.0 (Microcal, США).

1/V = 1/Vmax + Km/Vmax 1/S [Уравнение 1], где V – скорость гидролиза, Vmax = kcat E, Е – концентрация фермента в реакционной смеси, S – начальная концентрация субстрата в реакционной смеси.

Таблица 1. Сравнение кинетических параметров расщепления Z-Lys-SBzl и GD4K-na с помощью L-HEP и L-BEP. Величины Km и kcat выражены как среднее ± квадратичная ошибка результатов трех независимых измерений.

Z-Lys-SBzl GD4K-na -1 - -1 - kcat/Km (мM-1с-1) kcat/Km (мM с ) kcat (c ) Km (мM) kcat (c ) Km (мM) 133 ± 3 140 ± 7 950 ± 50 115 ± 5 0.16 ± 0.01 719 ± L-HEP 129 ± 4 120 ± 10 1075 ± 70 42.7 ± 4.0 0.61 ± 0.09 70 ± L-BEP Рисунок 2. Сравнение расщепления гибридного белка Trx/hEGF с помощью L-HEP и рекомбинантной легкой цепи энтеропептидазы быка (L-BEP, New England Biolabs).

А - Отдельные пробы, содержащие 15 мкг Trx/hEGF инкубировались при 20 С в течение 20 часов в 0.1 М трис гидрохлориде, рН 8.0, 1 мМ CaCl2 и 0,1% Tween с различными количествами относительных единиц активности (определяемых как изменение поглощения при 412 нм при расщеплении Z-Lys-SBzl) L-HEP и L-BEP. Дорожка 1, проба без фермента;

дорожки 2-4 и 5- соответствуют 0.0003, 0.0009 и 0. относительным единицам активности бычьей и человеческой энтеропептидаз, соответственно.

Б - пробы, содержащие 15 мкг Trx/hEGF, инкубировали при 25 °C с одинаковыми относительными единицами активности L-HEP и L-BEP (по расщеплению Z-Lys SBzl) в буфере, содержащем 0.1 М Tris HCl (pH 8.0) и 0.02 мМ CaCl2, различные интервалы времени. Пробы анализировали с помощью 12%-ного трис-трицинового ДСН-электрофореза в ПААГ, и окрашивали Кумасси бриллиантовым синим.

Оценка скорости расщепления гибридных белков с сайтом узнавания энтеропептидазы проводилась с помощью сканирования на денситометре ImageMaster VDS («Amersham Pharmacia Biotech», США).

Результаты показали (таблица 1, рисунок 2), что при расщеплении тиоэфира Z-Lys-SBzl константа специфичности kcat/Km L-HEP совпадает с kcat/Km рекомбинантной легкой цепи энтеропептидазы быка (L-BEP), а при расщеплении субстратов по специфическому сайту превышает ее на порядок. Эти результаты, с одной стороны, предполагают сходство ферментов в субстрат-связывающем центре S1 и конформации остатков, непосредственно участвующих в гидролизе субстрата, с другой – их отличие в субстрат-связывающих центрах S2-Sn.

Повышение содержания в реакционном буфере ионов Са2+ (0.1 мМ) ингибировало расщепление субстратов со специфическим сайтом, однако совершенно не влияло на расщепление Z-Lys-SBzl (рисунок 3). Эффект ингибирования, скорее всего, связан с координированием и ионным взаимодействием ионов кальция с тетрааспартатом субстрата, не дающих последнему связываться со вторичным субстрат-связывающим центром фермента. Хотя изучение первичной последовательности L-HEP не обнаружило в ней специализированных кальций-связывающих центров (в некоторых протеиназах семейства химотрипсина Са2+-связывающий регуляторный сайт образуют отрицательно заряженные остатки в положениях 70 и 80 полипептидной цепи), наблюдалась небольшая стимуляция активности микромолярными концентрациями ионов кальция (рисунок 3а).

Это может быть обусловлено незначительной стабилизацией структуры L-HEP при связывании ионов кальция кислыми остатками на поверхности молекулы.

Повышенные концентрации солей щелочных металлов (в частности, NaCl) ингибировали гидролиз специфических субстратов. Это, видимо, обусловлено экранированием заряженных остатков в окрестности активного центра и ослаблением электростатических взаимодействий пептида DDDDK с S2-S5 остатками фермента (в частности, с петлей 96-99).

Рисунок 3. Влияние ионов Ca2+ на скорость гидролиза GD4K-na и гибридного белка Trx/hEGF с помощью L-HEP:

а – гидролиз GD4K-na в присутствии различных концентраций CaCl2 или 1 мМ ЭДТА (точка 0 на абсциссе диаграммы);

б - пробы, содержащие 15 мкг Trx/hEGF, инкубировали при 25 °C с 0.001 ед. акт. L-HEP (по расщеплению Z-Lys-SBzl) в буфере, содержащем 0.1 М Tris-HCl (pH 8.0), в течение ч.

Было исследовано влияние различных ингибиторов на каталитическую активность L-HEP (таблица 2). Наибольшее влияние на фермент оказали конкурентные ингибиторы трипсин-подобных сериновых протеиназ (СИТ, бычий панкреатический ингибитор трипсина (апротинин), бензамидин) ингибитор химотрипсина леупептин и ингибитор цистеиновых протеиназ Е-64. На активность практически не влияли многие ингибиторы химотрипсина и мателлопротеиназ. В связи с высокой гомологией СИТ и природных ингибиторов трипсинов млекопитающих, было подробно изучено ингибирование гидролиза Z-Lys-SBzl L-HEP при связывании СИТ. Кинетические данные аппроксимировали методом нелинейной регрессии с помощью программы Origin 7. (Microcal, США) к уравнению 2, [P] = v0t + (V0 – Vs)(1 – exp(-kobst))/kobs [Уравнение 2], где [P] – концентрация 3-карбокси-4-нитрофеноксида во время t, Vs – скорость реакции в стационарном состоянии, V0 – начальная скорость реакции и kobs – константа видимой скорости перехода от V0 к Vs. Линейная зависимость kobs от концентрации СИТ (рисунок 4) показывает, что медленное ингибирование L-HEP соответствует следующему механизму связывания СИТ:

медленно k E + I V EI k Ингибирование по этому механизму не включает в себя медленную изомеризацию фермента либо комплекса фермент-ингибитор. Кинетические параметры ингибирования:

k1 = 0.033 нM-1 мин-1, k2 = 0.076 мин-1 и Ki* = k2/k1 = 2.3 нМ были определены из графика зависимости kobs от концентрации СИТ [I] (уравнение 3):

kobs = k2 + k1[I]/(1 + [S]/Km) [Уравнение 3], где [S] – это концентрация субстрата Z-Lys-SBzl, для которого Km – константа Михаэлиса.

Такой же механизм ингибирования с помощью СИТ с Ki* = 1.6 нМ наблюдался для L-BEP.

kobs (мин-1) OD Рисунок 4. Ингибирование L-HEP СИТ. А - Реакцию гидролиза Z-Lys-SBzl в присутствии 0, 1.5, 3, 6, 10, 20, 33, 50 нМ СИТ (сверху вниз) начинали добавлением 0.34 нМ L-HEP, и кривые непрерывно регистрировались в течение 30 мин. В каждом случае за исключением концентрации 1.5 нМ расход субстрата не превышал 10%. Б - График зависимости kobs от концентрации СИТ.

Таблица 2. Влияние ингибиторов Таблица 3. Влияние различных протеиназ на гидролитическую денатурирующих агентов на скорость активность L-HEP. Значения активностей расщепления Z-Lys-SBzl с помощью L представлены как средние ± HEP. В графе «Активность» представлено среднеквадратичное отклонение, исходя из отношение скорости гидролиза в присутствии трех независимых измерений. денатуранта к скорости в начальной реакции как среднее ± среднеквадратичное Активность, отклонение, исходя из трех независимых Ингибитор Концентрация % измерений.

СИТ 46.1 ± 1. 3 нМ Денатурирую Активность, Концентрация -щий агент % 6.0 ± 0. 33 нМ 70 ± Triton X-100 0.1% Апротинин 36.0 ± 1. 250 нМ 18 ± 1.0% 8.8 ± 0. 2 мкМ 80 ± Tween 20 0.1% 25 ± 1.0% Леупептин 6.3 ± 0. 10 мкМ 60 ± ДСН 0.1% Антипаин 15.7 ± 1. 10 мкМ 28 ± 1.0% 4.5 ± 0. 100 мкМ 90 ± Этанол 1.0% E-64 52.4 ± 1. 10 мкМ 70 ± 10.0% 16.3 ± 0. 100 мкМ 97 ± Имидазол 50 мM 68 ± Бензамидин 35.6 ± 0.9 250 мM 100 мкМ 100 ± ДТТ 5.0 мM 8.2 ± 0. 1 мМ 91 ± 20.0 мM Химостатин 81.1 ± 2. 100 мкМ 150 ± NaCl 0.1 M Пепстатин A 95.0 ± 1. 100 мкМ 225 ± 1.0 M Бестатин 93.0 ± 1. 100 мкМ 120 ± KCl 0.1 M ФМСФ 100 ± 45.9 ± 1. 1 мМ 1.0 M 50 ± Мочевина ТЛХК 87.0 ± 1.5 1.0 M 1 мМ 10 ± 6.0 M ЭДТА 100.0 ± 3. 10 мМ При расщеплении Z-Lys-SBzl L-HEP показала высокую толерантность по отношению к присутствию в реакционном буфере различных детергентов, солей и других реагентов (таблица 3). Влияние рН реакционного буфера на гидролиз малых субстратов было различным: в случае Z-Lys-SBzl наблюдалась колоколообразная кривая зависимости скорости гидролиза от рН с максимумом при рН 7.54. Гидролиз GD4K-na ускорялся при изменении рН от 6 до 9. Подобная картина наблюдалась при гидролизе пептидов другими ферментами, в частности наттокиназой, и может быть объяснена использованием ферментом гидроксил-иона вместо воды в ферментативной реакции.

Построение пространственной модели L-HEP.

Пространственная модель легкой цепи энтеропептидазы человека была построена (рисунок 5) на основе кристаллической структуры легкой цепи энтеропептидазы быка в комплексе с ингибитором VD4K-хлорметаном (1EKB в базе данных белковых структур PDB), чья аминокислотная последовательность идентична человеческому аналогу для 83% и гомологична для 93% остатков. Для построения пространственной модели использовали программный пакет Insight II (Accelrys, США). Из структуры была удалена молекула ингибитора и пептид, соответствующий части тяжелой цепи энтеропептидазы, связанный Рисунок 5. Пространственная модель L-HEP. 3-мерная структура легкой цепи энтеропептидазы человека была построена по гомологии ферментов человека и быка, на основе кристаллической структуры 1EKB с помощью программного пакета INSIGHT II. Синим цветом обозначены Р1-Р остатки субстрата. Отображены боковые цепи остатков каталитической триады и цистеинов L-HEP.

Номерами аминокислотной последовательности (по химотрипсиновой нумерации) обозначены цистеины, для которых было проведено моделирование замещений другими остатками.

с легкой цепью дисульфидной связью. Выравнивание аминокислотных последовательностей легких цепей энтеропептидаз человека и быка и последующее построение пространственной модели L-HEP проводили с помощью модуля Homology.

Минимизация конформационной энергии полученной модели белка проводилась в модуле Discover методом сопряженных градиентов.

Моделирование и получение мутантных вариантов L-HEP с увеличенным выходом ренатурации.

В связи с тем, что выход ренатурации L-HEP был очень низким (2%), был произведен поиск структурных изменений, приводящих к увеличению выхода ренатурации без потери высокой активности фермента. Одной из главных проблем ренатурации многих белков является образование правильных дисульфидных связей.

Большое количество остатков цистеина в L-HEP (9, из которых 8 образуют 4 дисульфида и один остается неспаренным) значительно затрудняет ее ренатурацию из-за высокой вероятности образования неправильных дисульфидных связей. На основе сравнения аминокислотных последовательностей энтеропептидазы и родственных ей сериновых протеиназ было предположено, что цистеины 122 (неспаренный), 136 и 201 (образующие дисульфидную связь) не обязательны для поддержания каталитической активности фермента. Было проведено выравнивание полученной модели с кристаллической структурой матриптазы (1ЕАХ) – наиболее близкого к энтеропептидазе фермента с отсутствующей дисульфидной связью Cys136-Cys201, – с помощью которого был выбран определенный набор вариантов замен цистеинов 122, 136 и 201, а также близлежащих остатков (с целью стабилизировать этот участок молекулы в отсутствие дисульфидной связи Cys136-Cys201). Анализ показал, что структурно близкие L-HEP сериновые протеиназы (матриптаза, тканевый активатор плазминогена (tPA)) в положении содержат остаток с крупной боковой цепью (Trp в случае матриптазы и Arg в случае tPA), который, вероятно, стабилизирует эту область фермента в отсутствие дисульфидной связи Cys136-Cys201.

Для полученного набора аминокислотных замен были построены модели соответствующих мутантных вариантов L-HEP тем же способом, что и модель L-HEP.

Полученные 3-мерные модели мутантных вариантов L-HEP оценивались по методу Айзенберга, в котором анализируется соответствие типов аминокислотных остатков их положению в структуре белка по полярности окружения и предпочтению ими определенного типа вторичной структуры. Кроме того, оценивалась энергия взаимодействия замененного аминокислотного остатка с окружением и заполненность внутреннего пространства молекулы белка.

Варианты L-HEP с заменами C122S, C136V/S137R/C201D (VRD), C136V/S137R/C201M (VRM), C136A/S137R/C201D (ARD), C136V/C201D (VD) (с наиболее оптимальными по критерию Айзенберга заменами остатков) были подвергнуты дальнейшему тестированию с помощью молекулярной динамики (МД). Для расчетов МД белков использовался программный пакет GROMACS (версия 3.2). Использовалось силовое поле GROMOS87, оптимальное для расчетов МД белков в окружении явно заданных молекул воды (молекулярная модель воды SPC). Для моделей L-HEP и ее мутантных вариантов были рассчитаны траектории МД длительностью 15 нс. Для всех траекторий были рассчитаны среднеквадратичное отклонение по позициям атомов белка относительно стартовой структуры (СКО) и их среднеквадратичные флуктуации относительно усредненной в МД структуры (СКФ). Анализ вторичной структуры белков в МД проводился с помощью программы DSSP. МД показала одинаковую стабильность как отдельных участков, так и целых молекул L-HEP/С122S и L-HEP, в случае же остальных мутантных вариантов наблюдались большие, чем у L-HEP, отклонения от исходной структуры. В целом все мутантные варианты были достаточно стабильны (СКО0.2 нм для атомов основной цепи), а их вторичная структура не претерпевала заметных изменений. Варианты с заменами C122S, VRD, и ARD были взяты для экспериментальной проверки.

Мутации в гене L-HEP были проведены с помощью процедуры точечного мутагенеза. Экспрессия мутантных вариантов и их ренатурация проводилась по методикам для L-HEP. Ренатурация L-HEP/C122S дала значительно повышенный по Таблица 4. Ренатурация Trx/L-HEP и Trx/C122S и очистка активного фермента. Приведены усредненные данные пяти независимых экспериментов.

Тельца Ренатурированный и Гибридный включения со 100 мл очищенный на СИТ-агарозе Выход ренатурации, % белок культуры, мг фермент, мг Trx/L-HEP 1.1 ± 0.2 2.0 % (58.6 мг L-HEP) 100 мг Trx/C122S 4.6 ± 0.3 7.8 % (58.6 мг C122S) сравнению с L-HEP (до 8%) выход активного фермента (таблица 4). Как и в случае L-HEP было проведено тестирование ферментативных свойств и стабильности L-HEP/C122S. В случае гидролиза Z-Lys-SBzl, GD4K-na и гибридных белков наблюдалась одинаковая с L HEP активность мутанта. Кроме того, стабильность мутантного белка по отношению к денатурирующим агентам (детергенты, соли, рН, температура и др.) осталась на том же высоком уровне.

Для остальных мутантных вариантов (с заменами VRD и ARD) используемая процедура ренатурации дала количество активного фермента достаточное лишь для автокаталитического расщепления за время, в 10-20 раз превышающее аналогичное в случае L-HEP. Этот факт не позволил получить необходимые для анализа количества активных мутантных вариантов L-HEP/VRD и L-HEP/ARD.

Можно предположить несколько причин, по которым при использованной методике ренатурации не было получено достаточные количества активных ферментов L HEP/VRD и L-HEP/ARD. Основная – это то, что удаляемая дисульфидная связь может быть критически важна при фолдинге белка in vitro. Возможно, дисульфидная связь 136 201 поддерживает необходимую для высокой активности напряженную внутреннюю структуру белка. Поэтому стабилизация с помощью невалентных взаимодействий может не уравновешивать дестабилизацию, обусловленную разрывом ковалентной связи. Другая предполагаемая причина – это образование растворимого белка в неактивной конформации. Ее анализ в таком случае затруднен сложностью ее очистки, так как она не связывается с СИТ-агарозой. Кроме того, судя по тому, что основная масса белка после диализа из ренатурационного буфера выпадает в осадок, выход ренатурации, очевидно, не растет, а падает.

Исследование специфичности L-HEP.

Специфичность является важнейшей характеристикой ферментов. Ранее считалось, что энтеропептидаза расщепляет пептид исключительно на С-конце последовательности DDDDK. В последнее время были зафиксированы факты гидролиза белков энтеропептидазой и в других сайтах. Предполагая существование вторичной специфичности энтеропептидазы (соответствующей другому физиологическому субстрату), а также учитывая важность высокой специфичности при расщеплении гибридных белков, было проведено подробное изучение гидролиза различных субстратов, не содержащих последовательность DDDDK, с помощью L-HEP. Для определения предпочтительных для легкой цепи энтеропептидазы человека сайтов расщепления отличных от такового в трипсиногене был проведено расщепление ряда хромогенных пептидных субстратов с остатком лизина или аргинина в положении Р1 и варьирующимися остатками в положениях Р2-Р4. Гидролиз и хромогенных трипептидов XY(R/K)-pNA и тетрапептидов XYZ(R/K)-pNA проводили по ранее описанным методикам. Было показано, что L-HEP предпочитает аргинин лизину в положении Р1, а субстраты с ароматическими или большими гидрофобными остатками в положении Р расщепляются всего лишь в несколько раз медленнее, чем Z-Lys-SBzl (таблица 5). Было проведено сравнение специфичности легких цепей энтеропептидаз человека и быка. В качестве последней был взят препарат американской фирмы New England Biolabs, представляющий собой легкую цепь энтеропептидазы быка, экспрессированную в бактериях. Оказалось, что подобные субстраты расщепляются бычьим ферментом от 2 (в случае Z-AFR-pNA) до 5 и более раз медленнее. Как и в случае расщепления специфического субстрата GD4K-na разница обуславливается различием как в Km, так и kcat.

Таблица 5. Гидролиз неспецифических субстратов с помощью L-HEP. Значения констант представлены как средние ± среднеквадратичное отклонение, исходя из трех независимых измерений.

L-HEP L-BEP Субстрат kcat/Km, kcat/Km, kcat, с-1 kcat, с- Km, мкМ Km, мкМ мМ-1 с-1 мМ-1 с- 133 ± 4 140 ± 7 950 ± 30 129 ± 4 120 ± 6 969 ± Z-Lys-SBzl 23.5 ± 0.9 76 ± 4 309 ± 11 26.3 ± 1.0 192 ± 10 137 ± For-Ala-Phe-Arg-pNA 17.5 ± 0.7 67 ± 4 261 ± 10 19.1 ± 0.9 155 ± 8 123 ± Z-Ala-Phe-Arg-pNA 28.9 ± 2.0 110 ± 5.5 255 ± 15 28.5 ± 2.3 461 ± 20 61 ± Z-Ala-Ala-Phe-Arg-pNA 14.4 ± 0.6 91 ± 5 158 ± 7 12.5 ± 0.5 305 ± 15 41 ± Z-Gly-Pro-Arg-pNA 18.2 ± 0.8 167 ± 8 109 ± 5 15.4 ± 0.5 280 ± 15 55 ± For-Ala-Phe-Lys-pNA 10.0 ± 0.4 109 ± 5 92 ± 5 9.3 ± 0.7 360 ± 18 28.4 ± 1. Z-Ala-Tyr-Arg-pNA 15.2 ± 0.7 234 ± 11 65 ± 3 7.2 ± 0.7 640 ± 25 11.3 ± 1. Z-Ala-Leu-Arg-pNA 11.5 ± 0.5 240 ± 12 48 ± 3 9.5 ± 0.5 515 ± 20 18.5 ± 2. Z-Ala-Trp-Arg-pNA 11.6 ± 1.0 268 ± 15 42.9 ± 2.5 7.1 ± 1.0 930 ± 50 7.6 ± 1. Z-Ala-Ala-Leu-Arg-pNA 9.5 ± 0.7 356 ± 16 26.7 ± 1.6 3.3 ± 0.4 680 ± 30 4.8 ± 1. Z-Ala-Ala-Arg-pNA 6.2 ± 0.3 265 ± 13 23.4 ± 1.3 4.4 ± 0.2 720 ± 30 6.1 ± 0. Z-Pro-Phe-Arg-pNA 7.6 ± 0.3 420 ± 20 18.2 ± 1.0 4.0 ± 0.2 2100 ± 90 1.9 ± 0. Z-Ala-Met-Arg-pNA Неспецифический гидролиз проявлялся и при обработке энтеропептидазой гибридных белков. В частности, при расщеплении гибридного белка Trx/TRAIL наблюдалось появление посторонних продуктов расщепления. Было исследовано расщепление белков TRAIL и BSA, у которых отсутствуют специфический сайт, но есть много сайтов трипсинолиза, в том числе и с одним-двумя отрицательно заряженными остатками в позициях Р2-Р5. Результаты инкубации этих белков с L-HEP анализировали с помощью электрофореза и масс-спектрального анализа. TRAIL расщеплялся преимущественно по сайту QEEIKEN, содержащему большую гидрофобную цепь в положении Р2 и отрицательно заряженные остатки в положении Р3 и Р4 (рисунок 9А, дорожка 3). Расщепление BSA происходило преимущественно по сайту DEHVKLV, также содержащему отрицательно заряженные остатки, в этом случае в позициях Р4 и Р (рисунок 9Б, дорожка 3). Сравнение гидролиза этих белков под действием L-HEP и L-BEP (дорожки 2 и 3, соответственно, на рисунке 9) показало, что L-BEP практически не расщепляет пептиды в указанных сайтах.

Для выяснения причин, обуславливающих такое различие, было проведено моделирование взаимодействия каталитических субъединиц энтеропептидаз человека и быка с различными субстратами.

Моделирование взаимодействия активного центра энтеропептидазы с пептидными субстратами.

За основу модели комплекса фермента с субстратом был выбран комплекс легкой цепи энтеропептидазы быка с ковалентно связанным ингибитором VD4K-хлорметаном (1EKB в базе данных PDB). Первоначально в качестве субстрата было решено взять наиболее часто используемый при оценке специфической ферментативной активности энтеропептидазы пептид глицил-тетрааспартил-лизил--нафтиламид (GD4K-na). Однако, пробные запуски МД этих комплексов показали быстрое нарушение каталитически активной конфигурации активного центра энтеропептидазы, которая не восстанавливалась в течение разумного для МД эксперимента (5-15 нс) времени. Поэтому для работы был взят субстрат, содержащий, кроме остатков GD4K, изолейцин в Р1'-положении (как в трипсиногене). Для построения комплекса L-HEP с субстратом GD4KI было проведено выравнивание пространственных структур L-BEP и L-HEP. При этом молекулу ингибитора копировалась в структуру L-HEP и, с помощью модуля Builder, проводилась модификация несовпадающих фрагментов молекулы субстрата. Затем проводилась минимизация конформационной энергии комплекса с помощью процедуры, использованной при построении модели L-HEP. Аналогичным образом были получены модели комплексов L-BEP и L-HEP с пептидами AAFR, AALR и EEIK.

Анализ ближайшего окружения субстрата (10 ) позволил выделить несколько структурных различий ферментов человека и быка, способных повлиять на связывание субстрата. С помощью программы Insight II было проведено сравнение взаимодействия субстрата с остатками, находящимися в этих положениях в L-HEP и L-BEP (рисунок 6).

Анализ электростатических взаимодействий и водородных связей между ферментом и субстратом при сравнении комплексов L-HEP и L-BEP со специфическим субстратом, указывает, что остатки 96 и 219 отвечают за различие каталитических констант у ферментов быка и человека.

Стабильность полученных комплексов фермент-субстрат исследовалась с помощью метода МД. Был проведен сравнительный анализ взаимодействий L-BEP, L-HEP и ее мутантных вариантов с субстратами по структурам, извлеченным из траекторий МД.

Полученные МД траектории были проанализированы, с целью установить интервалы с относительно стабильным взаиморасположением фермента и субстрата. Оценивались расстояния между заряженными частями следующих пар остатков: Lys-P1 – Asp187, Asp-P2 – Lys(Arg)96, Asp-P2 – Lys99, Asp-P3 – Lys99/219, Asp-P4 – Lys(Arg)96/99/219, Asp-P5 – Lys219. Кроме того, в качестве параметра, характеризующего близость взаиморасположения фермент-субстрат к реакционно-способному, оценивались расстояния между O (Asp102) & N1(His57), N2(His57) & O(Ser195). Анализ случайно выбранных структур из МД траекторий показал, что в случае L-HEP и ее мутантного варианта L-HEP/R96K (имеющих в своем составе лизин-219) субстрат стремится усилить электростатические и водородные связи с ферментом, максимально приближаясь к боковой цепи лизина-219 (правда, преимущественно за счет взаимодействия не с Р3, что предполагалось из анализа комплексов до МД, а с Р4 и Р5). При отсутствии положительного заряда в данной позиции полипептидной цепи фермента (L-BEP и мутантные варианты L-HEP/K219Q и L-HEP/R96K/K219Q) отрицательно заряженные остатки Р2-Р5 ориентируются либо вдоль петли 216-220, либо возле петли 96-99, либо отклоняются в сторону петли 172-175, что стабилизируется электростатическим взаимодействием с Arg224.

Усредненные в МД энергии электростатических и Ван-дер-Ваальсовых взаимодействий между остатками фермента и субстрата были оценены с помощью модуля g_nbi из пакета GROMACS на непрерывном интервале размером в 1 нс. Для этого брались точки с периодичностью 1 пс, в них вычислялась энергия невалентных взаимодействий (включая электростатические и Ван-дер-Ваальсовы взаимодействия), а на заключительном этапе вычислялось среднее арифметическое всех показаний. Подобное измерение производилось для трех независимых МД траекторий для каждой пары фермент/субстрат. По энергии взаимодействия субстрата с мутантными вариантами Рисунок 6. Сравнение пространственных структур комплексов L-BEP и L-HEP со специфическим субстратом. Модели взаимодействия энтеропептидаз со специфическим субстратом были построены на основе кристаллической структуры комплекса легкой цепи энтеропептидазы с ингибитором VD4K-cm (1EKB). При сравнении картин взаимодействий L-BEP (А) и L-HEP (Б) с остатками субстрата Р1-Р5 хорошо видны отличия, обусловленные присутствием в случае L-HEP положительно заряженного остатка лизина в положении 219 и заменой в положении 96 остатка лизина на более объемный остаток аргинина.

Рисунок 7. Комплексы энтеропептидаза/субстрат, полученные в ходе молекулярной динамики. Структуры комплексов представляют конечные точки траекторий МД. Для сравнения комплексов было произведено их выравнивание по атомам основной цепи с помощью программы INSIGHT II. Субстрат (выделен синим цветом) в случае L-HEP и L-HEP/R96K (А) ориентировался вдоль петли 216-220 (центральная нижняя часть рисунка). В случае же L-BEP, L-HEP/K219Q и L-HEP/R96K/K219Q (Б) субстрат мог занять как положение вдоль петли 216-220, так и отклоняться в сторону петель 96-99 (правый верхний угол) или 172-175 (левый верхний угол).

L-HEP/R96K и L-HEP/K219Q занимали промежуточное положение по отношению к L-HEP и L-BEP, что говорит о влиянии остатков 96 и 219 на связывание субстратов энтеропептидазой, и предполагает, что они играют большую роль в различии констант связывания субстрата X-D4K-Y энтеропептидазами человека и быка. Изменения в энергии взаимодействия с субстратом, вызванные введением в L-HEP мутаций R96K, K219Q и R96K/K219Q (с заменами остатков L-HEP на соответствующие им остатки L-BEP), обосновывают разницу в константах Михаэлиса L-HEP и L-BEP по отношению к специфическим субстратам, однако ничего не говорят о наблюдаемом различии каталитических констант L-HEP и L-BEP.

В МД экспериментах с субстратом выяснилось, что хотя структура гидрофобного ядра каталитического домена энтеропептидазы остаётся во время динамики практически неизменной, некоторые экспонированные на поверхность петлевые участки очень подвижны. В частности, это касается субстрат-связывающих регионов 96-99, 216-220. Это в определенной мере объясняет способность энтеропептидазы гидролизовать неспецифические субстраты, хотя и с меньшим сродством.

Как и в комплексах некоторых других химотрипсин-подобных сериновых протеиназ с субстратами/ингибиторами, в кристаллическом комплексе каталитической субъединицы энтеропептидазы быка с аналогом активационного пептида трипсиногена VD4K-хлорметаном наблюдается образование антипараллельной -структуры между Р1-Р остатками субстрата и 214-216 остатками фермента. При этом образование водородных связей между субстратом и ферментом не только улучшает связывание субстрата, но и в значительной мере определяет положение субстрата в активном центре. С помощью МД экспериментов было обнаружено, что большее число водородных связей между основными цепями L-HEP и GD4KI образуется в случае присутствия положительно заряженного остатка в позиции 219 фермента, взаимодействие с которым аспартатов субстрата способствует выстраиванию последнего вдоль петли 216-220 фермента и образованию между ними -структуры (рисунок 7, А). Такая картина наблюдалась во всех траекториях с участием L-HEP и L-HEP/R96K. В случае L-BEP, а также L-HEP/K219Q и L-HEP/R96K/K219Q (рисунок 7, Б) наблюдалась другая картина: N-концевая часть субстрата практически в каждой траектории располагалась по-разному по отношению к субстрат-связывающим центрам фермента. Это объясняется отсутствием преобладающего центра связывания для отрицательно заряженных остатков Asp-P4 и Asp-P5, каковым в L-HEP является Lys219.

Было проведено исследование взаимодействия L-HEP и L-BEP с другими пептидами, в частности, AAFR и AALR. Наблюдалась незначительная разница в энергии нековалентных взаимодействий пептидов с ферментами, которая, тем не менее, не объясняет полностью различие в скоростях гидролиза этих субстратов с помощью L-HEP и L-BEP. Длинные гидрофобные боковые цепи фенилаланина и лейцина примерно одинаково располагаются по отношению к субстрат-связывающим центрам ферментов человека и быка: вблизи гидрофобной части боковой цепи Lys99. Наиболее вероятная причина наблюдаемой разницы в константах специфичности L-HEP и L-BEP по отношению к этим субстратам – это большая приспособленность L-HEP к гидролизу амидной связи вне зависимости от Р2-Рn остатков субстрата.

Получение и исследование каталитических свойств мутантных вариантов L-HEP с заменами R96K, K219Q и R96K/K219Q.

Мутации в ген L-HEP были введены с помощью сайт-направленного мутагенеза.

Экспрессию гибридных белков, ренатурацию и очистку мутантных вариантов фермента проводили с помощью процедур, используемых для L-HEP. Тиоэфир Z-Lys-SBzl, как и ожидалось, гидролизовался всеми тремя мутантами с теми же кинетическими параметрами, что и в случае L-HEP. При расщеплении специфического пептидного субстрата GD4K-na наблюдалась другая картина (таблица 6). Мутации K219Q и R96K/K219Q приводили к понижению по сравнению с L-HEP констант специфичности в 1.76 и 2.4 раза, соответственно, сохраняя, тем не менее, преимущество над L-BEP (5- и 4-кратное, соответственно). Ухудшение происходило преимущественно за счет уменьшения константы Михаэлиса, отвечающей за связывание субстрата. Это соответствует результатам моделирования, предполагающим, что при вхождении молекулы GD4K-na в щель активного центра L-HEP устанавливается электростатическое взаимодействие между положительно заряженной боковой цепью Lys219 и отрицательно заряженными P3-Р5, отсутствующее в случае L-BEP.

Таблица 6. Сравнение кинетических параметров L-HEP, L-BEP и L-HEP/R96K, L HEP/K219Q и L-HEP/R96K/K219Q. Значения констант представлены как средние ± среднеквадратичное отклонение, исходя из трех независимых измерений.

Z-Lys-SBzl, в 0.1 М Tris-HCl, GD4K-na, в 25 mM Tris-HCl, pH 8.0 0.1 мМ CaCl2, pH 8. Фермент kcat/Km, с-1 kcat/Km, с- kcat, с-1 kcat, с- Km, мкМ Km, мкМ мМ-1 мМ- 133 ± 3 140 ± 7 950 ± 50 117 ± 8 42 ± 3 2790 ± L-HEP 121 ± 3 115 ± 5 1050 ± 50 115 ± 5 40 ± 3 2875 ± L-HEP/R96K 131 ± 4 121 ± 8 1080 ± 70 145 ± 10 92 ± 8 1580 ± L-HEP/K219Q L-HEP/R96K/K219Q 140 ± 5 135 ± 8 1040 ± 60 102 ± 7 88 ± 8 1160 ± 129 ± 4 120 ± 10 1075 ± 70 47 ± 4 160 ± 10 295 ± L-BEP Рисунок 8. Картина расщепления cлитного белка Trx/hEGF под действием L-BEP, L-HEP и ее мутантных вариантов.

А. Титрование расщепления cлитного белка Trx/hEGF. В реакционную смесь, содержащую мкг гибридного белка, добавляли различные количества L-BEP, L-HEP, L-HEP/R96K и L HEP/K219Q (0.0003, 0.001 и 0.003 ед.ак. по Z-Lys-SBzl) и инкубировали в течение 16 ч при комнатной температуре.

Б. Кинетика расщепления гибридного белка Trx/hEGF с помощью L-HEP и L-HEP/R96K/K219Q.

Для электрофореза отбирались пробы инкубации 15 мкг гибридного белка с 0.001 ед. акт. в течение 30 мин, 1, 2, 4, 8 и 16 ч.

Остатки Asp-P2 и Asp-P4 также могли бы усиливать связывание субстрата с ферментом за счет более сильной связи с Arg96, чем с Lys96. Однако, судя по сохранению мутантным вариантом R96K полной активности L-HEP по расщеплению GD4K-na, эта разница не сказывается ни на Km, ни на kcat. Этот результат можно объяснить тем, что Lys предположительно связывает не взаимодействующие с другими остатками фермента Asp-P3 и Asp-P5, в то время как Arg96 взаимодействует с уже связанными с Lys99 Asp-P2 и Asp-P4. Сохранение у мутантов высокой каталитической константы может быть объяснено отличием L-HEP и L-BEP не в центрах связывания субстрата, а в элементах активных центров, участвующих непосредственно в разрезании пептидной связи (включая остатки каталитической триады и амидные группы, стабилизирующие оксианион субстрата). Это предположение подтверждается тем фактом, что одинаковая гидролитическая активность у ферментов быка и человека наблюдается только при расщеплении тиоэфира Z-Lys-SBzl, тогда как все проверенные субстраты с амидной связью лучше гидролизует фермент человека.

Иная ситуация наблюдается при расщеплении мутантными вариантами L-HEP гибридных белков с сайтами узнавания энтеропептидазы (рисунок 8). L-HEP/R96K, L-HEP/K219Q и L-HEP/R96K/K219Q расщепляли гибридный белок Trx/hEGF приблизительно так же эффективно, как и L-HEP. Предполагается следующая причина нечувствительности гидролиза гибридных белков к мутациям в субстрат связывающем центре L-HEP. Конформация участка гибридного белка, связывающегося с L-HEP в данном случае такова, что либо взаимодействие субстрата с боковой цепью остатка 219 фермента отсутствует, либо влияет на связывание/расщепление незначительно. Это можно объяснить более жесткой, чем в GD4K-na, структурой пептидной цепи субстрата, ограничивающей возможные конформации сайта DDDDK энергетически выгодными для соседних с ним участков гибридного белка.

Показательный результат влияния исследуемых остатков на ферментативный катализ был получен в опытах неспецифического расщепления белков TRAIL и BSA по сайтам QEEIKEN и DEHVKLV, соответственно, где отрицательно заряженные боковые Рисунок 9. Гидролиз белков TRAIL и BSA под действием L-BEP, L-HEP и ее мутантных вариантов R96K, K219Q и R96K/K219Q.

A. TRAIL: Дорожка 1– контроль, 15 мкг TRAIL без добавления фермента;

дорожки 2-6 – результаты инкубирования смеси, содержащей 15 мкг TRAI с 0.1 ед.ак. L-BEP, L-HEP, R96K, K219Q и R96K/K219Q, соответственно, в течение 24 ч при 25° С.

Б. BSA: Дорожка 1 - контроль (20 мкг БСА без фермента);

дорожки 2-6 - результаты инкубирования смеси, содержащей 20 мкг БСА с 1 ед.ак. (по Z-Lys-SBzl) L-BEP, L-HEP, R96K, К219Q и R96K/К219Q, соответственно, в течение 24 ч при 25° С.

цепи отсутствуют в Р2 и в Р2-Р3 положениях. В обоих случаях мутанты с одиночными заменами и, особенно, с двойной менее активно расщепляли белки по этим сайтам, значительно приблизившись в этом отношении к легкой цепи энтеропептидазы быка (рисунок 9). Результаты моделирования взаимодействия пептида EEIK с L-HEP предполагают, что в случае TRAIL любой из пары Arg96/Lys219 улучшает связывание белкового субстрата с ферментом, поэтому, хотя одиночные замены дают незначительное падение неспецифического гидролиза TRAIL, двойная замена значительно увеличивает специфичность фермента. В случае BSA основное понижение активности происходит при замене Arg96Lys. Видимо, Arg96 «отталкивает» Val-P2 от петли 96-99, способствуя образованию антипараллельной -структуры между субстратом и петлей 216-220. Также можно предположить, что в случае лизина-96 образуется участок энергетически невыгодного интерфейса между ферментом и субстратом, обусловленный большей концентрацией положительного заряда возле гидрофобной боковой цепи Val-P2. Сама по себе замена Lys219Gln незначительно уменьшает гидролиз BSA энтеропептидазой, однако при двойной замене наблюдается кооперативный эффект. Можно сделать вывод, что в данном случае Arg96 способствует образованию выгодной для гидролиза конформации субстрата в активном центре энтеропептидазы, а Lys219 лишь закрепляет ее.

Данные результаты, с одной стороны, говорят о важности остатков 96 и 219 для гидролиза пептидных субстратов, а, с другой стороны, обосновывают различие каталитических параметров ферментов быка и человека, главным образом, не отличающимися S2-S5 сайтами связывания, а различиями в самой каталитической машине. Последние могут включать в себя различия в пространственном размещении остатков каталитической триады и ее расположение по отношению к оксианионной дыре и S1 сайту. Именно они могут позволить L-HEP с большей (по сравнению с L-BEP) скоростью расщеплять амидные субстраты, которые значительно более требовательны к механике фермента, чем сложные эфиры и тиоэфиры.

Для проверки этого предположения было решено провести сравнение каталитических параметров гидролиза Р1-субстратов, содержащих в месте гидролиза тиоэфирную или амидную связь. В качестве амидного субстрата были протестированы лизин- и аргинин-паранитроанилиды, однако ни один из них не гидролизовался со скоростью доступной для спектрофотометрической детекции. Этот результат предполагает, что конформация такого субстрата в связанном состоянии не позволяет ферменту провести гидролиз амидной связи. Причиной этого может быть только необходимость существования амидного субстрата в некой напряженной конформации, для которой необходимо присутствие Р2-Рn остатков. Учитывая тот факт, что энтеропептидаза расщепляет не только специфические субстраты с аспартатами в этих положениях, но и различные другие субстраты (табл. 5), можно сделать вывод, что критическим для создания подобной конформации является установление определенного набора водородных связей между основной цепью субстрата и фермента. Такие водородные связи (подобные наблюдающимся в антипараллельной -структуре) показаны как для кристаллической структуры комплекса легкой цепи энтеропептидазы быка с ингибитором-аналогом активационного пептида трипсиногена, так и при моделировании динамики взаимодействия L-BEP, L-HEP и ее мутантных вариантов с пептидными субстратами. В связи с тем, что участок 216-220 более стабилен, чем лабильная петля 96-99, выравнивание субстрата происходит именно по нему, а положительно заряженные остатки, окружающие щель активного центра, в большей степени фильтруют субстраты и стабилизируют необходимую для гидролиза конформацию комплекса фермент/субстрат.

Выводы.

1. Синтезирован ген каталитической субъединицы энтеропептидазы человека (L HEP) и осуществлена ее экспрессия в Escherichia coli в составе гибридного белка с тиоредоксином в качестве белка-носителя.

2. Разработана процедура ренатурации гибридного белка тиоредоксин/L-HEP, позволяющая получать до 10 мг активного фермента с литра культуры.

3. Впервые охарактеризованы ферментативные свойства легкой цепи энтеропептидазы человека. Определены кинетические параметры L-HEP по гидролизу пептидных субстратов и гибридных белков, содержащих сайт узнавания энтеропептидазы DDDDK. Обнаружено, что константа специфичности (kcat/Km) L HEP при гидролизе подобных субстратов на порядок превышает константу специфичности L-BEP.

4. Показано, что взаимодействие L-HEP с ингибиторами проходит по типу трипсин подобных сериновых протеиназ. Показано, что ионы одно- и двухвалентных металлов (Na+, Ca2+) ингибируют гидролиз специфических субстратов. Изучение влияния денатурирующих агентов на L-HEP показало ее высокую стабильность.

5. Построена пространственная модель L-HEP. С помощью молекулярного моделирования найдена мутация C122S, введение которой в L-HEP повышает выход ренатурации в 4 раза. Показана критичность образования дисульфидной связи 136-201 для рефолдинга L-HEP.

6. Обнаружена вторичная специфичность L-HEP по отношению к хромогенным субстратам и белкам, содержащим в положении Р2 ароматические и большие гидрофобные боковые цепи. Показано, что L-HEP расщепляет белковые субстраты, даже если в сайте связывания субстрата в позициях Р2-Р5 содержится менее 4-х остатков с отрицательно заряженными боковыми цепями (Asp/Glu).

7. С помощью методов молекулярного моделирование показано, что аминокислотные остатки в положениях 96 и 219 отвечают за различия каталитических свойств легких цепей энтеропептидаз быка и человека. Показано, что введение в L-HEP мутаций R96K и K219Q улучшает специфичность белка, практически не меняя скорость гидролиза специфических субстратов.

8. Показан кооперативный эффект улучшения специфичности при одновременном введении мутаций R96K и K219Q в L-HEP. Неспецифическое расщепление белков TRAIL и BSA по сайтам QEEIK и DEHVK значительно уменьшается при использовании мутантного варианта L-HEP/R96K/K219Q, по сравнению с диким типом и вариантами с одиночными заменами R96K и K219Q.

Материалы диссертации изложены в следующих работах:

1. Гаспарян М. Э., Остапченко В. Г., Шульга А. А., Долгих Д. А. Синтез гена и экспрессия в E. coli каталитической субъединицы энтеропептидазы человека.

Международный конгресс «Пиридоксальфосфат-зависимые ферменты:

структура, молекулярная патология и медицина», Москва, май 2002, сборник трудов, стр. 58.

2. Остапченко В. Г., Гаспарян М. Э., Долгих Д. А. Экспрессия рекомбинантной каталитической субъединицы энтеропептидазы человека в E. coli и характеризация ее ферментативной активности. XV зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, 10-14 февраля 2003, сборник тезисов, стр. 7.

3. Marine E. Gasparian, Valeriy G. Ostapchenko, Alexey A. Schulga, Dmitry A. Dolgikh, and Mikhail P. Kirpichnikov. Expression, purification and characterization of human enteropeptidase catalytic subunit in Escherichia coli. Protein Expression & Purification, 31/1, September 2003, pp. 133-139.

4. V.G. Ostapchenko, M.E. Gasparian, D.A. Dolgikh. Production in E. coli and investigation of recombinant catalytical cubunit of human enteropeptidase. FEBS Forum For Young Scientists, Warsaw, June 24-26 2004,

Abstract

book, p. 27.

5. M. E. Gasparian, V. G. Ostapchenko, D. A. Dolgikh and M. P. Kirpichnikov Kinetic characterization of recombinant human enteropeptidase light chain and its mutant C122S.

the FEBS Journal, vol. 272, suppl. 1, July 2005. 30th FEBS Congress “The Protein World”, abstracts, p. 168.

6. Гаспарян М. Э., Остапченко В. Г., Долгих Д. А., Кирпичников М. П.

Биохимическая характеристика рекомбинантной легкой цепи энтеропептидазы человека. Биохимия, 2006, том 71, вып. 2, с. 149 – 7. Остапченко В. Г., Гаспарян М. Э., Долгих Д. А. Исследование вторичного центра связывания субстратов энтеропептидазы. XVIII зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, 7-10 февраля 2006, сборник тезисов, стр. 44.