Исследование противоопухолевой активности аутологичных вакцин на основе белков теплового шока in vivo
На правах рукописи
КОСЕНКОВ Дмитрий Александрович ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТИ АУТОЛОГИЧНЫХ ВАКЦИН НА ОСНОВЕ БЕЛКОВ ТЕПЛОВОГО ШОКА IN VIVO 03.00.04 - Биохимия
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва 2008 2
Работа выполнена в ГОУ ВПО Московской медицинской академии им. И.М.
Сеченова Научные руководители:
член-корреспондент РАН, Северин Евгений Сергеевич профессор, доктор химических наук Ляшенко Алла Анатольевна кандидат биологических наук
Официальные оппоненты:
член-корреспондент РАМН, Караулов Александр Викторович профессор, доктор медицинских наук профессор, доктор биологических наук Болдырев Александр Александрович
Ведущая организация:
ГНЦ Институт Иммунологии Федерального медико-биологического агентства
Защита диссертации состоится «21» ноября 2008 г. в _ часов на заседании диссертационного совета Д 212.203.13 при Российском университете дружбы народов по адресу: 117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 8, медицинский факультет.
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу: 117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 6.
Автореферат разослан «» 2008 г.
Ученый секретарь диссертационного совета Д 212.203. профессор Е.В. Лукашева ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ Актуальность темы Современная медицинская наука располагает широким арсеналом средств лечения опухолевых заболеваний. Наиболее традиционным подходом к противоопухолевой терапии является сочетание хирургического и терапевтического методов лечения. При этом немаловажное значение в результативности применения противоопухолевой терапии должно отводиться иммунной системе пациента: адекватный уровень иммунной защиты зачастую определяет успех противоопухолевого лечения. Известно, что при удалении материнской опухоли риск развития метастазов многократно увеличивается, особенно у пациентов с ослабленной иммунной системой. Поэтому стимуляция, как общего, так и специфического противоопухолевого иммунного ответа является неотъемлемой частью современных подходов к лечению опухолей.
В современных иммуномодулирующих средствах используется широкий набор механизмов, приводящих к стимуляции неспецифического и специфического иммунного ответа, - базисной защиты от появления чужеродных агентов (в том числе клеток) в организме. Клетки, подвергшиеся вирусному или бактериальному заражению, при адекватном состоянии иммунной системы, в общем и целом, могут быть мишенями для иммунной системы. Однако опухолевые клетки, являющиеся частью организма человека, не распознаются иммунной системой человека. Это обусловлено в частности тем, что опухоли характеризуются низкой иммуногенностью: на их поверхности отсутствуют белки, чужеродные для организма, благодаря которым они могли бы отличаться от нормальных клеток, и, следовательно, быть распознанными и уничтоженными иммунной системой. Таким образом, наиболее важным направлением для решения данной проблемы является разработка вакцин, способных вызвать специфический иммунный ответ против опухоли.
Современные биологическая и медицинская науки успешно развивают первое направление. В настоящее время существует множество разработок противоопухолевых вакцин на основе самых разнообразных подходов. Среди них – рекомбинантные опухолевые антигены, клеточные опухолевые лизаты, целые опухолевые клетки, вакцины на основе дендритных клеток, ДНК вакцины и т.п. Однако, наряду с их неоспоримым достоинством, а именно способностью к стимуляции специфического иммунного ответа, все они обладают рядом недостатков: недостаточная индукция специфического иммунного ответа, технологические сложности изготовления, высокая стоимость и т.д.
Наиболее перспективным подходом, направленным на решение вышеуказанных проблем, является использование аутологичных вакцин.
Материалом для изготовления таких вакцин является собственная опухолевая ткань пациента, удаленная хирургическим путем. Согласно многочисленным литературным данным, наибольшую противоопухолевую активность проявляют аутологичные вакцины на основе белков теплового шока (HSP, от англ. heat shock protein). Выполняя шаперонную функцию, они практически постоянно находятся в комплексах с пептидами, характерными для данной клетки. Это свойство позволяет выделять из опухолевых клеток комплексы, состоящие из HSP и антигенов, специфических для данной опухоли.
Аутологичная вакцинация активно изучается во многих ведущих медицинских центрах: согласно данным компании Antigenics, в настоящее время к участию в проведении клинических испытаний на основе HSP-вакцин допущено 69 клиник Европы и Америки. В настоящее время проводимые испытания находятся на различных стадиях (I, II, III фазы), что подтверждает противоопухолевую эффективность HSP-вакцин. В проведенных на данный момент клинических испытаниях уже показана стимуляция специфического иммунного ответа у 75% пациентов, что является высоким показателем и свидетельствует в пользу перспективности данного метода.
Несмотря на успешные результаты, полученные при изучении иммунотерапевтического лечения аутологичными HSP-вакцинами, остается нерешенным вопрос о том, как, при наличии специфического иммунологического стимулятора повысить (комплексов «HSP-пептид»), собственную иммуногенность опухоли и ее метастазов.
Важной проблемой, которая не позволяет расширить использование данного метода, является ограниченное количество опухоли, что осложняет получение необходимой дозировки вакцины. Следовательно, актуальным является поиск способов повышения иммуногенности опухоли и ее метастазов, а также повышение в ней количества антигенного материала, составляющего основу данной вакцины (в данном случае пептидных комплексов с HSP).
В данной работе предложена попытка решить указанные проблемы с целью повышения противоопухолевой эффективности аутологичных вакцин. Эта задача решалась двумя способами. Во-первых, основу получаемой вакцины составили не один, как в исследованиях Srivastava et al., а три белка теплового шока: hsp70, hsp90 и grp94 (далее hsp96). Это позволяет существенно увеличить количество антигенного материала и расширить его спектр. Во-вторых, до хирургического удаления опухоли пациенту проводилась терапия препаратом (59Fe). Онкофер™ на основе радиоактивного железа способно Fe накапливаться в опухолевой ткани за счет связывания с белками переносчиками, количество которых в новообразованиях повышено, и за счет излучения вызывать некроз опухолевых клеток и тромбозы в микроциркуляторном русле. Это, в свою очередь, вызывает гипоксический стресс, который способствует усилению продукции комплексов HSP со специфическими пептидами и, как следствие, ведет к повышению иммуногенности опухолевых клеток.
Цель и задачи исследования Цель исследования: изучение противоопухолевой активности продукта на основе антиапоптотических аутологичных HSP в комплексе с опухолевыми антигенами, а также их комбинации с внешним стрессовым фактором in vivo.
Задачи исследования:
1. Разработать методику выделения и очистки комплексов «HSP+опухолевый антиген» из опухолевой ткани.
2. Оценить цитотоксичность полученного продукта in vitro.
3. Изучить влияние полученного продукта на неспецифический иммунный ответ ex vivo.
4. Оценить возможность использования внешнего стрессового фактора для повышения продукции HSP, как источника иммуногенного материала.
5. Провести сравнительную оценку противоопухолевой активности аутологичных HSP (монопрепарат), внешнего стрессового фактора, а также их сочетания.
Научная новизна Впервые разработана методика единовременного выделения и очистки пептидных комплексов на основе трех белков теплового шока, показана цитотоксическая безопасность данных комплексов in vitro.
Продемонстрирована способность полученного продукта активировать неспецифический иммунный ответ ex vivo в зависимости от используемой дозы и времени. Впервые исследована возможность применения Fe59, как внешнего стрессового фактора, с целью повышения содержания белков теплового шока в опухолевой ткани, и впервые доказано, что эффективность комбинации полученного продукта с исследуемым стрессовым фактором in vivo является более высокой по сравнению с использованием монопрепаратов.
Практическая значимость работы Результаты представленной работы позволяют повысить эффективность использования аутологичных противоопухолевых вакцин на основе белков теплового шока за счет одновременного увеличения количества иммуногенного материала в вакцине и повышения иммуногенности самой опухолевой ткани.
Апробация диссертации Апробация работы проведена на заседании кафедры биохимии ГОУ ВПО ММА им. И.М. Сеченова (6 декабря 2007 г.) Основные положения и результаты работы докладывались и обсуждались:
– на II Российской конференции по иммунотерапии и иммунореабилитологии (февраль 2005 г., г. Москва);
– на Международной конференции медицина и II «Молекулярная биобезопасность» (октябрь 2005 г., г. Москва);
– на научно-практической конференции «Молекулярнi основи i клiнiчнi проблеми резистентности до лiкарських засобiв» (ноябрь 2006 г., г. Киев);
– на XXXII конгрессе FEBS «Molecular Machines» (июль 2007 г., г. Вена).
Публикации По результатам проведенных исследований опубликовано 8 печатных работ.
Основные положения, выносимые на защиту 1. Предложена методика единовременного выделения и очистки аутологичной вакцины на основе трех белков теплового шока.
2. Аутологичные белки теплового шока в комплексе с опухолевыми антигенами не обладают цитотоксической активностью по отношению к клеткам линии MCF7.
3. Полученный продукт дозо- и времязависимо увеличивает продукцию TNF в крови больных животных, то есть обладает способностью к активации неспецифического иммунного ответа.
4. Применение Fe, как внешнего стрессового фактора, позволяет добиться повышения уровня эндогенных белков теплового шока – материала для аутологичных вакцин.
5. Сравнительная оценка противоопухолевой активности аутологичных комплексов на основе HSP (монопрепарат), 59Fe, а также их сочетания показала, что наибольшей противоопухолевой активностью обладает комбинированное применение.
Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 124 страницах машинописного текста и состоит из введения, 3 глав и выводов;
включает библиографический указатель из источников, в том числе 17 отечественных, 130 иностранных, иллюстрирована 16 таблицами, 53 рисунками.
Результаты исследования Для выделения и очистки HSP-пептидных комплексов нами была разработана методика, включавшая следующие стадии: гомогенизация в гипотоническом буфере, центрифугирование, двухступенчатое осаждение белков, гель-фильтрация на Sephadex G50, аффинная хроматография на гепарин-сефарозе (Рис. 1) и ультрафильтрация. Свойства полученного продукта оценивали по содержанию эндотоксина при помощи LAL-теста, а также по содержанию белков теплового шока при помощи иммуноферментного анализа (ELISA). В результате было показано, что содержание эндотоксина составило менее 0,06 ЕЭ/мл, при этом количество белка в конечном продукте составило около 1 мг/мл.
Рис. 1. Фракционирование белков на колонке с гепарин-сефарозой ( = 1, см, h = 9,7 см;
V = 12,9 мл).
Разработанная методика позволила с высокой степенью очистки (около 60%) единовременно выделить пептидные комплексы на основе 3 белков теплового шока: hsp70, hsp90, hsp96, что было доказано окрашиванием серебром геля после электрофоретического разделения белков в денатурирующих условиях (Рис. 2), а также методом вестерн-блота (Рис. 3).
Рис. 2. Электрофореграмма белковых фракций после гомогенизирования (дорожка 1) и после ультрафильтрации (дорожка 2).
Рис. 3. Определение молекулярной массы HSP в полученном продукте методом вестерн-блота в денатурирующих условиях на ПААГ.
Для изучения возможности применения полученного продукта in vivo полученного продукта нами было проведено исследование цитотоксичности in vitro на опухолевых клетках линии MCF7 (аденокарцинома молочной железы человека) с использованием МТТ-теста и теста на стимуляцию синтеза ДНК (т.е. стимуляцию пролиферации). В ходе исследования было показано, что продукт не вызывает гибели клеток: при сравнении с контролем статистически достоверных отличий не было (Рис. 4). Таким образом, был сделан вывод об отсутствии влияния выделенных пептидных комплексов на выживаемость клеток линии MCF7.
Рис. 4. Результаты исследования цитотоксической активности полученного продукта.
Кроме того, продукт не снижал пролиферации опухолевых клеток (включение С14-тимидина статистически достоверно не отличалось от контроля) следовательно, отсутствовало влияние пептидных (Рис. 5), комплексов на основе HSP на пролиферацию клеток линии MCF7. Таким образом, было доказано отсутствие у полученного продукта цитотоксической активности.
Рис. 5. Результаты исследования влияния полученного продукта на синтез ДНК (пролиферацию клеток).
Для определения биологической активности полученных аутологичных HSP-пептидных комплексов нами было проведено исследование их влияния на продукцию TNF- – одного из основных цитокинов, выделяющихся при неспецифическом иммунном ответе.
В ходе эксперимента было показано, что при совместной инкубации клеток моноцитарно-макрофагального ряда из мышей с аденокарциномой молочной железы с HSP-пептидными комплексами происходила активация продукции TNF-. Как показано в таблице 1, изменение концентрации данного цитокина у мышей с аденокарциномой молочной железы до лечения зависело от добавляемого в лунку количества белка (HSP-пептидных комплексов).
Аналогичные данные были получены при добавлении в лунку с клетками стандартного иммуномодулятора – Полиоксидония™ (Таблица 2). Однако достоверные различия в концентрациях TNF- в лунках с добавлением 1 и нг иммуномодулятора отсутствовали. Различия по концентрации были достоверными в лунках с добавлением 10 и 100 нг препарата.
Последующее сравнение полученных данных с данными от добавления HSP пептидных комплексов или Полиоксидония™ к клеткам моноцитарно макрофагального ряда здоровых мышей (Таблицы 1, 2) также показало зависимость действия препаратов от добавляемой дозы.
Полученые сведения позволили сделать вывод о зависимости стимуляции неспецифического иммунного ответа от используемой дозы препарата, причем зависимость от используемой дозы в большей степени наблюдалась у HSP пептидных комплексов. Это свидетельствовало о большей специфичности, по сравнению с Полиоксидонием™, их влияния на стимуляцию выделения провоспалительного цитокина TNF-.
Таблица Концентрация TNF- у мышей через 24 часа после добавления HSP-пептидных комплексов Концентрация TNF- 1 нг белка/лунка 10 нг белка/лунка 100 нг белка/лунка Мыши с аденокар циномой молочной 115,4 пг/106 клеток 404,8 пг/106 клеток 202,3 пг/106 клеток железы до лечения Мыши с аденокар циномой молочной 3,8 пг/106 клеток 2,6 пг/106 клеток 5,99 пг/106 клеток железы после лечения Здоровые мыши 77,5 пг/106 клеток 90,9 пг/106 клеток 49,5 пг/106 клеток Таблица Концентрация TNF- у мышей через 24 часа после добавления Полиоксидония™ Концентрация TNF- 1 нг белка/лунка 10 нг белка/лунка 100 нг белка/лунка Мыши с аденокар циномой молочной 28,2 пг/106 клеток 32,0 пг/106 клеток 14,6 пг/106 клеток железы до лечения Мыши с аденокар циномой молочной 0,28 пг/106 клеток 0,57 пг/106 клеток 0,77 пг/106 клеток железы после лечения Здоровые мыши 111,9 пг/106 клеток 30,5 пг/106 клеток 10,2 пг/106 клеток На основании полученных данных была проведена оценка изменения концентрации TNF- в зависимости от времени. Было показано, что после добавления HSP-пептидных комплексов к клеткам больных мышей со временем происходило увеличение концентрации TNF- в лунках (Рис. 6А).
При этом, подобный эффект не наблюдался в случае применения Полиоксидония™ (Рис. 6Б).
Основываясь на полученных результатах, был сделан вывод, что полученный продукт способен специфически (дозо- и времязависимо) индуцировать продукцию в отличие от стандартного TNF-, иммуномодулятора то есть стимулировать (Полиоксидония™), неспецифический иммунный ответ.
Стоит отметить, что данные, полученные нами по препарату Полиоксидоний™, совпадают с данными, полученными ранее в работах по изучению активации неспецифического иммунного ответа лимфоцитов периферической крови [Dyakonova V.A., 2004] и свидетельствуют об отсутствии специфической стимуляции продукции TNF- этим препаратом.
500, концентрация, пкг/10^6 кл 400, 300, 200, 100, 0, 2 часа 24 часа 48 часов 104,4 404,8 482, 10 нг А 500, концентрация, пкг/10^6 кл 400, 300, 200, 100, 0, 2 часа 24 часа 48 часов 9,5 32,0 19, 10 нг Б Рис. 6. Концентрация TNF- в клетках мышей с аденокарциномой молочной железы до лечения через 24 часа после добавления 10 нг/лунку HSP-пептидных комплексов (А), 10 нг/лунку Полиоксидония™ (Б).
При оценке продолжительности влияния вакцины было показано, что при воздействии как вакцины, так и Полиоксидония™ на клетки моноцитарно макрофагального ряда мышей с аденокарциномой молочной железы после лечения практически не происходит активации продукции TNF-, по сравнению со здоровой мышью. Эти данные доказывают, что его продукция стабилизировалась и находилась на постоянном низком уровне.
Зависимость от используемой дозы HSP-пептидных комплексов сохранялась и после лечения, однако, как было указано, в значительно меньшей степени.
Так, при добавлении того или иного препарата в лунку к клеткам больных мышей после лечения концентрация TNF- изменялась в зависимости от дозировки (таблицы 1, 2), однако в обоих случаях эти изменения были статистически не значимыми.
Таким образом, показано, что полученный продукт, обогащенный «HSP пептидными комплексами», выделенный по разработанной методике из ткани аденокарциномы молочной железы, вызывает специфическую активацию продукции TNF- клетками макрофагально-моноцитарного ряда мыши с аденокарциномой молочной железы. Выделенные по разработанной методике белковые фракции на основе HSP способны индуцировать продукцию TNF специфически, то есть в зависимости от используемой дозы и времени с момента введения. Кроме того, дальнейшая стабильная продукция данного цитокина на низком уровне во время и после лечения свидетельствует в пользу отсутствия в организме больных животных активного некроза и воспалительных реакций, что косвенно свидетельствует об активации апоптоза, вызванного стимуляцией специфического противоопухолевого иммунного ответа.
Для повышения содержания HSP (стресс-белков) нами в качестве внешнего стрессового фактора был выбран химиотерапевтический препарат Онкофер™ на основе радиоактивного железа, способный избирательно накапливаться в опухолевой ткани молочной железы. Содержание белков теплового шока исследовалось методом иммуногистохимии. В ходе эксперимента было показано, что после воздействия радиации в опухолевых клетках значительно возрастает продукция HSP (Рис. 7).
Таким образом, использование внешнего стрессового фактора позволяет добиться повышения содержания иммуногенного материала в опухолевой ткани.
Рис. 7. Влияние радиоактивного железа Fe на продукцию HSP в опухолевой ткани молочной железы. Окрашивание гематоксилином. Стрелками показан белок hsp70.
Для исследования противоопухолевого действия полученных вакцин нами был проведен эксперимент in vivo.
Содержание экспериментальных животных и работу с ними проводили в сертифицированном виварии с использованием общепринятых методов в соответствии с требованиями правил Надлежащей Лабораторной Практики (GLP) и Руководства по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ [Хабриев Р.У., 2005].
Экспериментальным животным (мышам линии С57Bl6) была перевита опухоль аденокарциномы молочной железы Ca755 (в соответствии с нормативной документацией по доклиническому изучению новых фармакологических веществ, стандартом по изучению противоопухолевых препаратов для лечения опухоли молочной железы на экспериментальных животных), из которой затем были выделены и очищены комплексы на основе белков теплового шока и то есть получена hsp70, hsp90 hsp96, противоопухолевая вакцина.
Мыши были разделены на 5 групп (по 18 животных в каждой):
норму (отрицательный контроль), группу, не получавшую терапию (аутологичную вакцину или Онкофер™) (положительный контроль), группу, получавшую только аутологичную вакцину, группу, получавшую только внешний стрессовый фактор 59Fe, группу, получавшую комбинированную терапию, то есть аутологичную вакцину и 59Fe.
Оценка противоопухолевого действия была проведена в соответствии с общепринятыми требованиями, а также требованиями Руководства по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ [Хабриев Р.У., 2005]. Измерение частоты метастазирования было исключено вследствие того, что аденокарцинома молочной железы мыши Ca755 не образует метастазов.
Статистическая обработка данных проводилась с применением непараметрического критерия Wilcoxon на программном обеспечении Statistica 6.0™ («StatSoft», Россия). Выбранный уровень значимости составлял р 0,05.
Противоопухолевое действие вакцин оценили по следующим параметрам:
изменение размеров опухоли;
выживаемость экспериментальных животных;
гистологическое исследование опухолевой ткани;
дополнительные показатели от корма, двигательная (аппетит/отказ активность, морфология внутренних органов, общий внешний вид, топография внутренних органов).
При исследовании изменения размеров опухоли нами использовались угловые коэффициенты для оценки скорости роста опухолевой ткани. В последние дни эксперимента наибольшая скорость роста наблюдалась в положительном контроле (угловой коэффициент 2517). Скорости опухолевого роста в группах, получавших только аутологичную вакцину или только внешний стрессовый фактор коэффициенты и (угловые 1760 1694, соответственно), была одинаковой. При этом значительно меньшая скорость роста (угловой коэффициент 1108) наблюдалась в группе, получавшей комбинированную терапию (HSP+59Fe). Следует отметить, что к окончанию эксперимента наименьший размер опухолей наблюдался в группе, получавшей радиоактивное железо. Таким образом, использование Fe привело к временной остановке роста опухоли, однако не повлияло на темпы ее роста.
Сочетание же Fe с аутологичной вакциной позволило получить заметное замедление темпов роста опухолевой ткани, что особенно видно в период между 20 и 22 днями эксперимента (Рис. 8).
K+ Fe-59 HSP HSP+Fe- Объем опухоли, мм 12 день 16 день 20 день 22 день Рис. 8. Динамика роста опухоли в контрольной и опытных группах.
При статистической обработке данных по динамике роста опухоли было показано, что статистически значимые различия в размерах опухоли появляются 4 дня спустя после начала лечения в группах, получавших Fe и комбинированную терапию, и наблюдаются во всех группах с 8 дня лечения.
В ходе гистологического исследования было показано, что в положительном контроле на 22 день эксперимента наблюдались крупные опухолевые клетки, образовывавшие солидно-тубулярные структуры. У опухолей наблюдалась четко организованная структура, формирование которой было особенно заметно при сравнении с состоянием опухолевой ткани на 12 день эксперимента перед началом лечения (Рис. 9).
В группе, получавшей иммунотерапию пептидными комплексами на основе HSP, в опухолевой ткани отмечалась тенденция к относительному уменьшению объема паренхимы по сравнению со стромой. Клетки опухолей были часто атрофичными, строили тонкие трабекулярные структуры. Кроме того, в опухолях наблюдалось большое количество апоптотических телец, свидетельствующих о цитотоксическом действии иммунной системы на опухоль (Рис. 9).
В группе, получавшей лечение радиоактивным железом, наблюдались обширные очаги некроза и лейкоцитарный инфильтрат, а также отмечался тромбоз сосудов, что соответствовало механизму действия препарата Онкофер™ (Рис. 9).
В группе, получавшей комбинированную терапию, наблюдались обширнейшие очаги некроза, лейкоцитарный инфильтрат, а также наличие апоптотических телец, что свидетельствовало о совместном действии и противоопухолевой вакцины и о наибольшей Fe эффективности данной комбинации (Рис. 9).
Апоптотические тельца Опухолевые клетки Трабекул структуры Инфильтрат Апоптотические тельца Некроз Некроз HSP+59Fe (24 день) Fe (24 день) Рис. 9. Результаты гистологического исследования отрицательного контроля (Норма), опухолевой ткани до лечения (12 день эксперимента) (Опухоль), положительного контроля к окончанию эксперимента (24 день) (Контроль+), опухолевых тканей групп, получавших аутологичную иммунотерапию к окончанию эксперимента (24 день) (HSP), радиоактивное железо к окончанию эксперимента (24 день) (59Fe), комбинированную терапию к окончанию эксперимента (24 день) (HSP+59Fe). Окрашивание гематоксилин-эозином.
Оценка дополнительных показателей эффективности лечения у экспериментальных животных во всех группах была проведена во всех группах.
К окончанию эксперимента в каждой группе были зафиксированы значительные объемы опухолей при сравнении с общими размерами животного (Рис. 10).
А Б Рис. 10. Внешний вид экспериментальных животных в начале (А) и в конце (Б) эксперимента.
При оценке двигательной активности была очевидна прямая связь ее с объемом опухоли. Так, в положительном контроле и группе, получавшей монотерапию аутологичной вакциной, наблюдался наибольший размер опухоли, двигательная активность животных была самой низкой, особенно с дня эксперимента. С 20 дня эксперимента двигательная активность начала резко снижаться в группе, получавшей Онкофер™, одновременно с ускорением темпов роста опухолей. Это свидетельствовало об ухудшении общего состояния животных в данной группе. При этом в группе, получавшей комбинированную терапию, активность животных была близка к отрицательному контролю. Это свидетельствовало о наибольшем положительном влиянии именно комбинированной противоопухолевой терапии на качество жизни животных.
Вывод был также подтвержден при сравнении общего внешнего вида животных в группах. На 17-20 дни эксперимента некоторые опухоли в каждой из групп стали изъязвляться, при этом массивные кровотечения наблюдались только у положительного контроля. В группе, получавшей комбинированную терапию, наблюдалось активное рубцевание опухолей, что по предварительным данным свидетельствовало об активно протекающих в организме мышей иммунных реакциях.
При оценке целостности кожного покрова было показано, что в положительном контроле на 20-22 дни эксперимента наблюдалось нарушение его целостности. При этом в группе, получавшей комбинированную терапию, шерстный покров был гладким, у мышей в положительном контроле и группе, получавшей монотерапию радиоактивным железом, шерстный покров был сильно взъерошенным. Это также доказывало, что лучше всего переносилось сочетание пептидных комплексов на основе HSP с 59Fe.
К окончанию эксперимента у животных отмечалось снижение аппетита, а в случае положительного контроля и группы, получавшей аутологичную иммунотерапию, – полный отказ от корма.
При вскрытии было показано, что большой объем опухолей во всех группах к 20-22 дням эксперимента, значительно смещал внутренние органы. В частности, это приводило к сдавливанию пищевода и желудка и, как следствие, отказу от корма.
Стоит отметить, что при оценке морфологии внутренних органов наблюдалось выраженное увеличение размеров селезенки у животных, получавших монотерапию вакциной, и комбинированную терапию, т.е. групп, получавших иммунотерапевтическое лечение. Поскольку селезенка является кроветворным органом, производящим лимфоциты и моноциты, ее увеличение свидетельствовало об индукции стимуляции кроветворения введением противоопухолевых вакцин.
Таким образом, полученные дополнительные показатели эффективности противоопухолевой терапии в различных группах подтвердили иммуностимулирующие свойства противоопухолевых вакцин на основе «HSP пептидных комплексов», а также показали, что наиболее положительное влияние на качество жизни животных оказывает комбинированное введение вакцины с Fe, данная комбинация обладает наибольшей противоопухолевой эффективностью.
Выводы 1. Разработана методика единовременного выделения и очистки аутологичной вакцины на основе трех белков теплового шока. Конечный продукт характеризуется высокой степенью очистки (60%) и низким содержанием эндотоксина (менее 0,06 ЕЭ/мл).
2. Аутологичные белки теплового шока в комплексе с опухолевыми антигенами не обладают цитотоксической активностью по отношению к клеткам линии MCF7. Доказано, что статистически достоверных отличий от контроля по выживаемости клеток, а также изменений пролиферации (по включению 14С-тимидина) нет.
3. Полученный продукт дозо- и время зависимо увеличивает продукцию TNF в крови больных животных, то есть обладает способностью к активации неспецифического иммунного ответа.
4. При определении содержания белка hsp70 в опухолевой ткани молочной железы методом иммуногистохимического исследования показано, что применение Fe, как внешнего стрессового фактора, позволяет добиться повышения уровня эндогенных белков теплового шока – материала для аутологичных вакцин.
5. Проведена сравнительная оценка противоопухолевой активности аутологичных комплексов на основе внешнего HSP (монопрепарат), стрессового фактора, а также их сочетания. В результате показано, что наибольшей противоопухолевой активностью обладает их комбинированное применение. Оно приводило к появлению апоптотических телец в опухоли, снижению темпов роста опухоли и улучшению качества жизни экспериментальных животных.
Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Коваленко Н.А., Обухова В.В., Кешелава В.В., Косенков Д.А. и др.
Методика выделения и очистки комплексов «белок теплового шока + пептид» из опухолевой ткани молочной железы человека // Материалы II Российской конференции по иммунотерапии и иммунореабилитологии. - Аллергология и иммунология. – 2005. – Т. 6, № 2. – С. 183-184.
2. Коваленко Н.А., Обухова В.В., Косенков Д.А. и др. Очистка белков теплового шока из опухолевой ткани молочной железы человека в присутствии амикацина сульфата Материалы Международной конференции // II «Молекулярная медицина и биобезопасность». – М., 2005. – С. 160.
3. Савватеева М.В., Кузнецова Е.М., Косенков Д.А. и др. Определение уровня продукции TNF- лимфоцитами периферической крови под действием обогащенной фракции белков теплового шока в комплексе с опухолевыми антигенами, выделенной из опухоли молочной железы человека // Матерiали всеукраiтськоi науково-практичноi конференцii. – Киев, 2006. – С. 51.
4. Коваленко И.А., Обухова В.В., Косенков Д.А. и др. Выделение и очистка белков теплового шока из опухолевой ткани молочной железы человека // Иммунология, 2007;
Т.28, N 2. – С. 86-90.
5. Руденко Е.Д., Косенков Д.А. Противоопухолевые вакцины XXI века // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии, 2007;
N 1. – С. 44-48.
6. Обухов А.А., Зыкова Е.С., Косенков Д.А. Белки теплового шока и апоптоз // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии, 2007;
N 2. – С. 52-56.
7. Косенков Д.А., Ляшенко А.А., Кешелава В.В. и др. Основные виды противоопухолевых вакцин // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии, 2007;
N 3. – С. 3-9.
8. Savvateeva M., Kuznetsova E., Zhdanov D., Kosenkov D. et al. Activation of non-specific immunity by autologous HSP-peptide complexes from breast adenocarcinoma in human macrophages // The FEBS Journal. – 2007. – Vol. 274, Suppl. 1. – P. 159.
Косенков Дмитрий Александрович «Исследование противоопухолевой активности аутологичных вакцин на основе белков теплового шока in vivo» на соискание ученой степени кандидата биологических наук.
Одним из наиболее перспективных подходов, направленным на решение проблем современной противоопухолевой иммунотерапии, является использование аутологичных вакцин. В данной работе изучено влияние радиоактивного железа (59Fe) на содержание белков теплового шока в опухолевой ткани молочной железы. Кроме того, в работе предложен способ получения вакцины, путем единовременного выделения и очистки трех белков теплового шока: hsp70, hsp90 и grp94. Изучены также цитотоксичность и влияние полученной аутологичной вакцины на неспецифический и специфический иммунитет.
Результаты представленной работы позволяют повысить эффективность использования аутологичных противоопухолевых вакцин на основе белков теплового шока.
“The study of antitumor activity of autologous heat shock protein-based vaccines in vivo” One of the most promising ways, that can solve the problems of the present-day antitumor immunotherapy, is the use of autologous vaccines. In the current study, the influence of radioactive iron (59Fe) to the quantity of heat shock proteins in breast cancer tissue is studied. Besides, in the study the way to produce a vaccine by simultaneous purification of three heat shock proteins:
hsp70, hsp90 and grp94 is introduced. Also cytotoxicity and the influence of autologous vaccine to produce non-specific and specific immunity are studied. The results of the work allow to raise the effectiveness of the use of autologous antitumor heat shock protein-based vaccines.