Молекулярно-генетические маркеры невынашивания беременности и плацентарной недостаточности
На правах рукописи
Никитина Людмила Александровна МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ НЕВЫНАШИВАНИЯ БЕРЕМЕННОСТИ И ПЛАЦЕНТАРНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ 14.00.01 - акушерство и гинекология 03.00.04 - биохимия
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
МОСКВА 2007
Работа выполнена на кафедре биологической и медицинской химии Московского Государственного универси тета имени М.В. Ломоносова, в отделении патологии беременности клиники акушерства и гинекологии имени C.Ф. Снегирева Московской медицинской академии имени И.М. Сечено ва.
Научные руководители:
доктор медицинских наук, профессор, зав. отделением патологии беременности клиники акушерства и гинекологии ММА им. И.М. Сеченова Е.М. Демидова доктор биологических наук, ст. научный сотрудник кафедры биологической и медицинской химии МГУ им. М.В. Ломоносова В.Н. Бочков
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор кафедры акушерства и гинекологии Российского государственного медицинского университета Р.И. Шалина кандидат биологических наук, вед. научный сотрудник лаборатории клеточной подвижности ФГУ Российский Кардиологический Научно-производственный Центр Росздрава. А.В. Воротников
Ведущая организация: Московский областной НИИ акушерства и гинекологии
Защита диссертации состоится «_»2007 года в часов на заседании Диссертационного совета Д 212.203.01 Российского университета дружбы народов по адресу: 119333, г. Москва, ул. Фотиевой, д.6.
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Российского университета дружбы народов (117198, г.Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.6) Автореферат разослан «_»_2007 года.
Ученый секретарь Диссертационного совета Доктор медицинских наук, профессор И.М. Ордиянц
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования.
Невынашивание беременности (НБ) является актуальной проблемой со временного акушерства. Частота этого осложнения остается стабильной и вы сокой в течение многих лет, составляя 15 - 30% от общего числа всех желанных беременностей.
По данным Коллегии Минздрава РФ за 2002 г. 50% самопроизвольных прерываний беременности происходит в 1 триместре, а 25% из них приходится на привычное невынашивание.
Невынашивание беременности (НБ) является одним из клинических при знаков, указывающих на возможность формирования первичной плацентарной недостаточности (ПН). По данным В.М. Сидельниковой и совт. (2002) частота формирования ПН при привычном НБ составляет от 50 до 80%. Плацентарная недостаточность (ПН) - патофизиологический феномен, состоящий из комплек са нарушений трофической, эндокринной и метаболических функций плаценты, ведущий к ее неспособности поддерживать полноценный обмен между орга низмом матери и плода. Основным звеном патогенеза ПН является нарушение плодово-плацентарного кровотока, приводящее к неадекватному обеспечению растущего плода кислородом и питательными веществами, а также гипоксии тканей плода и плаценты (Кулаков В.И. и соавт. 1999, Милованов А.П, и соавт.
2002, Сидельникова В.М. и соавт. 2002).
Наиболее частым клиническим маркером ПН является задержка роста плода (ЗРП). Многолетние наблюдения ряда авторов установили, что при формирова нии ПН и ЗРП происходит не только резкое увеличение перинатальной смерт ности, но и многочисленные изменения в организме ребенка, которые на про тяжении первых лет жизни являются причиной нарушений его физического и умственного развития, а также повышенной соматической и инфекционной за болеваемости в дальнейшей жизни (Вихляева Е.М. и соавт.1984;
Радзинский В.Е. и соавт. 2001). Терапия препаратами, улучшающими маточно плацентарный кровоток, проводимая, как правило, со II-го триместра беремен ности при выявлении УЗИ-критериев ЗРП, часто оказывается неэффективной, т.к. в основе таких изменений лежат уже сформировавшиеся нарушения сосу дистого русла плаценты. В связи с этим, актуальность приобретает изучение локальных молекулярных и клеточных механизмов, лежащих в основе развития ПН, для уточнения патогенетических механизмов ПН, поиска новых подходов к диагностике и терапии, а также разработке профилактических мероприятий для ее предотвращения.
Актуальным направлением в прогнозировании и профилактике ПН явля ется выявление генетической предрасположенности к НБ. Носительство тех или иных аллелей определенных генов может видоизменять течение биохими ческих процессов в организме матери и способствовать формированию ПН и НБ (Макацария А.Д. и соавт.,2001). В связи с тем, что нарушение плодово плацентарного кровотока, является одним из патогенетических механизмов, приводящих к развитию НБ и ПН, большой интерес представляет изучение ге нетических полиморфизмов в системе свертывания крови. На сегодняшний день известен ряд полиморфизмов, приводящих к гиперкоагуляции, наиболее изученными из которых являются полиморфизм C677T гена метилентетрагид рофолатредуктазы (MTHFR), Лейденская мутация V фактора, протромбина, PlA1/PlA2 гена гликопротеина IIIa (GPIIIa), 4G/5G ингибитора активатора плазминогена 1 типа (PAI-1). Носительство Лейденской мутации и G20210A гена протромбина по мнению большинства исследователей имеет четкую взаимосвязь с потерей беременности (Rey E et al, 2003), а данные о роли других полиморфизмов в патогенезе НБ остаются противоречивыми (Holmes ZR et al, 1999;
Unfried G et al, 2002;
O'Shaughnessy KM et al, 2003;
Podciechowski L et al, 2005;
Dossenbach-Glaninger A et al, 2003). В связи с этим вопрос о целесообраз ности проведения ДНК-диагностики тромбофилических полиморфизмов и проведения профилактической антикоагулянтной терапии у женщин с НБ ос тается открытым. Существует также ряд генетических полиморфизмов, кото рые приводят к гипокоагуляции. Одним из таких полиморфизмов является по лиморфизм R353Q VII фактора свертывания крови. Влияние данного поли морфизма активно изучалось в области кардиологии, где было показано его протективное влияние на формирование ИБС и ее осложнений (Girelli D et al, 2000;
Wu AH et al, 2001). В настоящее время отсутствуют данные, касающиеся влияния данного полиморфизма на формирование и течение акушерской пато логии.
Другим важным направлением в поиске новых подходов к терапии и профилактике ПН и НБ является изучение клеточно-молекулярных взаимодей ствий, происходящих в тканях эндометрия и плаценты, начиная с этапа инва зии бластоцисты и до момента развития родовой деятельности. Важную роль в поддержании гомеостаза в плаценте играют цитокины, факторы роста, белки межклеточной адгезии и других факторов, функционирующих в тесном взаи модействии друг с другом под контролем стероидных гормонов (Das C et al, 2002).
В основе правильного функционирования маточно-плацентарного крово тока лежат такие молекулярно-клеточные процессы, как ангиогенез и локаль ный гемостаз. При морфологическом исследовании ворсин в плацентах с ЗРП, было показано, что наиболее частым морфологическим проявлением ЗРП явля ется нарушение созревания терминальных ворсин, являющихся основным ме стом газообмена, то есть при данной патологии имеется нарушение процессов ангиогенеза в плаценте (Волощук И.Н. и соавт., 2001;
Kaufmann P. et al, 2004).
В связи с этим, перспективным направлением поиска терапевтических мише ней и подходов к профилактике ПН имеет изучение изменений в экспрессии факторов ангиогенеза, а также белков, регулирующих локальный гемостаз и воспалительный ответ. Особое место в формировании ЗРП и ПН имеет нару шение экспрессии в плаценте факторов роста, необходимых для правильного развития плода. По данным литературы на рост плода могут оказывать влияние инсулиноподобные факторы роста (Guidice et al, 1995), а также лептин (Laird SM et al, 2001). Между данными группами факторов существуют регуляторные взаимодействия, а изменения экспрессии тех или иных групп факторов может приводить к нарушению регуляции процессов ангиогенеза или локального ге мостаза и играть важную роль в формировании ПН.
Многофакторный характер этиологии и патогенеза ПН и ЗРП с одной стороны, и недостаточность и противоречивость данных о роли отдельных факторов в их развитии, с другой, определяют необходимость углубленного изучения наиболее значимых факторов коагуляции, роста, ангиогенеза и ме диаторов воспаления. Данные исследования являются принципиально важны ми для рационализации лечебно-профилактических мероприятий при НБ и ПН.
Цель исследования.
Целью исследования явилась комплексная оценка молекулярно генетических маркеров НБ и ПН: факторов коагуляции, ангиогенеза, медиато ров воспаления и факторов роста для совершенствования подходов к диагно стике, терапии и прогнозированию репродуктивных потерь и гипотрофии пло да.
Задачи исследования.
1. Изучить частоту встречаемости полиморфных аллелей 677T MTHFR, 1691A фактора V, PlA2 GPIIIa, 353Q VII фактора свертывания крови в группе женщин с угрозой прерывания беременности и контрольной груп пе популяционной выборки. Провести оценку относительного риска фор мирования симптомокомплекса НБ при носительстве полиморфных алле лей генов MTHFR, VII фактора и GP IIIa и их сочетаний у женщин с уг розой прерывания беременности.
2. Изучить уровень экспрессии генов регуляции ангиогенеза (PlGF, PDGFA, PDGFB, FGF-2, ANGPT-1, ANG, TSP), коагуляции и фибринолиза (TF, uPA, uPA-R, PAI-1) в плацентах у женщин с ЗРП.
3. Изучить уровень экспрессии генов медиаторов воспаления (MCP-1, ICAM, COX-2, MIP-1a, MIP-1b, TGF-b, IL-8, MIF, RANTES, HO-1) в пла центах у женщин с ЗРП.
4. Изучить уровень экспрессии генов ростовых факторов IGF-1, IGF-2 и леп тина в плацентах у женщин с ЗРП.
Научная новизна.
1. Впервые определены группы риска развития НБ, обусловленного генети ческой предрасположенностью среди женщин с угрозой прерывания бе ременности.
2. Впервые выявлена протективная роль полиморфизма R353Q VII фактора свертывания крови при НБ, а также установлена прогностическая значи мость сочетаний генотипов C677T MTHFR, PlA1/PlA2 GPIIIa и R353Q VII фактора свертывания крови для оценки риска потери беременности.
3. Впервые получена комплексная количественная оценка уровня экспрес сии генов регуляции ангиогенеза (PlGF, PDGFA, PDGFB, FGF-2, VEGF, ANGPT-1, ANG, TSP), коагуляции и фибринолиза (uPA, uPA-R, PAI-1, TF), медиаторов воспаления (MCP-1, ICAM, COX-2, MIP-1a, MIP-1b, TGF-b, IL-8, MIF, RANTES, HO-1), факторов роста (лептина, IGF-1, IGF 2) в плацентах у женщин с ЗРП и первичной ПН, а также физиологиче ским течением беременности.
Практическая значимость Полученные данные по частотам полиморфизмов С677T MTHFR, PlA1/PlA2 GPIIIa и R353Q VII фактора свертывания крови позволили выде лить среди женщин с НБ группу риска с генетической предрасположенностью к НБ, связанной с изменениями в системе свертывания крови. Таким образом, определен контингент женщин с НБ, которым необходимо проводить геноти пирование на тромбофилические полиморфизмы. Наибольшее диагностиче ское и прогностическое значение имеет выявление 2-х и более неблагоприят ных генетических факторов, что может свидетельствовать о целесообразности проведения у таких женщин терапии антикоагулянтами на различных этапах беременности в соответствии с результатами исследования системы гемостаза.
Сравнительная оценка уровня экспрессии генов основных регуляторных белков в плацентах женщин с первичной ПН и ЗРП позволило выявить марке ры функциональной недостаточности плаценты. Такими маркерами явились:
фермент гемоксигеназа (HO-1), белки, вовлеченные в процесс регуляции ан гиогенеза – VEGF, FGF-2, PDGFB, Angpt-1, MCP-1, а также лептин, важный регулятор обмена веществ. Полученные данные позволяют рекомендовать те рапию, направленную на усиление маточно-плацентарного кровотока на ран них сроках беременности, которая будет способствовать правильному созрева нию сосудов плаценты и ее нормальному функционированию в более поздние сроки.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Генетические факторы оказывают наиболее выраженное влияние на фор мирование симптомокомплекса невынашивания беременности у женщин с повторными выкидышами при отсутствии других факторов риска невы нашивания беременности.
2. Наличие аллелей 677Т MTHFR и PlA1GP IIIa в гомозиготном состоянии является фактором риска формирования неблагоприятных исходов бере менности;
гетерозиготный генотип R353Q VII фактора свертывания крови оказывает протективное действие на течение беременности при угрозе не вынашивания. Сочетание генотипов Т677Т MTHFR и PlA1/PlA1 GP IIIa при отсутствии протективного генотипа R353Q VII фактора связано с максимальным риском потери беременности. Наличие полиморфизма – 675 4G/5G гена PAI-1 не связано с развитием симптомокомплекса невы нашивания беременности.
3. При первичной ПН и ЗРП в плаценте происходит активация экспрессии факторов, активирующих процессы ангиогенеза VEGF, FGF-2, PDGF, Angpt-1, MCP-1, повышение экспрессии гена PAI-1, снижение экспрессии гена HO-1 и лептина.
Апробация работы, внедрение результатов работы в практику Основные положения и результаты исследования представлены и обсуж дены на Международном молодежном медицинском конгрессе «Санкт Петербургские научные чтения» - (Санкт-Петербург, 2005), Международной Пироговской студенческой научной конференции (Москва, 2006), Московской Международной конференции «Биотехнология и медицина» (Москва, 2006), Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых уче ных Ломоносов-2006 (Москва, 2006), Европейском Конгрессе по репродук тивной иммунологии (Грац, Австрия, 2006), Европейской студенческой конфе ренции будущих врачей и молодых ученых (Берлин, Германия, 2006), Итого вой научной студенческой конференции с международным участием «Татья нин день» (Москва, 2007), Международном конгрессе по репродуктивной им мунологии (Опатия, Хорватия, 2007), 14-й Международной студенческой кон ференции по исследованиям в медицине (Гронинген, Голландия), Летней шко ле Европейской организации по изучению имплантации эмбрионов (EMBIC) (Йена, Германия, 2007), на апробационной комиссии МГУ им. Ломоносова февраля 2007 года.
На основании данных, полученных в диссертации, подан патент «При менение ДНК-диагностики на наличие полиморфизма R353Q в гене фактора VII свертывания крови для оценки предрасположенности к развитию привыч ного невынашивания беременности и способ оценки предрасположенности к этому заболеванию путем анализа полиморфизмов C677T гена MTHFR и R353Q гена фактора VII» Предложенный алгоритм по выявлению генетической предрасположен ности у женщин с НБ используется в отделении патологии беременности № клиники Акушерства и гинекологии ММА им. Сеченова По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ.
Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, 4-х глав, выводов, практических ре комендаций и указателя литературы. Работа изложена на 160 страницах маши нописного текста, иллюстрированного 40 рисунками и 30 таблицами. Указа тель литературы включает в себя 254 источника отечественной и зарубежной литературы.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы.
Объекты исследования:
Для решения поставленных задач, нами были обследованы 132 пациент ки, из них 110 пациенток с клиникой угрожающего выкидыша, 10 пациенток с ЗРП и угрозой прерывания беременности и 12 пациенток с физиологическим течением беременности, а также 340 доноров российской популяции. Исследо вание состояло из 2-х частей: 1) Анализ влияния некоторых генетических фак торов на формирование НБ и первичной ПН;
2) Оценка изменений экспрессии генов факторов ангиогенеза, фибринолиза, медиаторов воспаления и ростовых факторов при первичной ПН и ЗРП.
1. Анализ генетических полиморфизмов.
В данной части работы был проведен анализ диагностической и прогно стической значимости выявления генетической предрасположенности к пер вичной плацентарной недостаточности и НБ. В качестве генетических марке ров были выбраны полиморфизмы генов факторов, оказывающих влияние на процессы коагуляции и тем самым способствующих формированию первичной плацентарной недостаточности: MTHFR (C677T), GP IIIa (PlA1/PlA2), фактора Лейден, VII фактора свертывания крови (R353Q), PAI-I (4G/5G). ДНК диагностика была проведена в следующих группах:
1 группа – 110 женщин с клиническими признаками угрозы прерывания беременности на ранних сроках (до 16 недель).
Критерии включения: Наличие клинических признаков угрозы прерывания бе ременности: кровянистые выделения из половых путей, тянущие боли внизу живота.
Критерии исключения: Наличие хромосомной патологии, антифосфолипидный синдром, Rh-конфликт, анатомические аномалии репродуктивных органов Всем пациенткам 1 группы выдавалась анкета-опросник, где были отра жены следующие критерии: наследственность по соматической и гинекологи ческой патологии, сопутствующая соматическая и гинекологическая патоло гия, особенности менструальной функции, особенности генеративной функ ции, проводимая терапия.
Ретроспективно проводился опрос женщин для выяснения исхода теку щей беременности.
2 группа – контрольная по отношению к 1-й группе – 340 доноров рос сийской популяции. Данная группа была выбрана для определения частот ис следуемых полиморфизмов в популяции. У всех обследуемых 1 и 2 групп про изводился забор венозной крови.
Последующий анализ производился по следующей схеме:
1. Выделение ДНК 2. Постановка полимеразной цепной реакции с рестрикцией и аллель специфичной ПЦР на полиморфизмы генов MTHFR (C677T), GP IIIa (PlA1/PlA2), FVL, VII фактора свертывания крови (R353Q), PAI-I (4G/5G).
3. Анализ ПЦР-фрагментов путем электрофореза в агарозном геле 4. Статистическая обработка результатов по критерию Фишера и -2 с ис пользованием статистического пакета Statistica 6.0.
2. Анализ экспрессии генов.
Во 2-й части работы была проведена оценка молекулярных изменений, происходящих в плаценте при формировании первичной плацентарной недос таточности. В качестве критерия плацентарной недостаточности был выбран синдром задержки роста плода (ЗРП), который сформировался после эпизода угрозы прерывания беременности на ранних сроках. Наличие угрозы прерыва ния беременности на ранних сроках дало возможность охарактеризовать имевшуюся у этих женщин плацентарную недостаточность как первичную, т.к уже на ранних сроках имелись признаки неблагополучного состояния форми рующейся плаценты. В плацентах женщин с ЗРП и контрольной группы был проанализирован уровень экспрессии генов факторов, ответственных за проте кание в плаценте таких основополагающих процессов, как ангиогенез, фибри нолиз, иммунный ответ, рост и дифференцировка клеток. Для этого были вы браны следующие группы женщин:
3 группа - женщины с угрозой прерывания данной беременности на ран них сроках, у которых беременность была сохранена, но осложнилась ПН и гипотрофией плода и была завершена родами путем операции кесарева сечения - 10 человек Критерии включения: угроза прерывания беременности до 16 недель, своевременные роды в сроке 38-40 недель путем операции кесарева сечения, вес новорожденных2800г, МРП (массо-ростовой показатель) новорожденных Критерии исключения: хромосомные аномалии и пороки развития у но ворожденных, выраженная экстрагенитальная патология у матери (сахарный диабет, пороки сердца, заболевания щитовидной железы, аутоиммунные забо левания и т.д.), рост матери менее 160 см 4 группа – контрольная к 3-й группе - женщины с физиологическим те чением беременности и рождением детей с массой тела в пределах нормальных значений- 2800-3800г- 12 женщин.
У женщин групп 3 и 4 получали образцы ткани плаценты с децидуальной и трофобластической сторон, не затрагивая соединительнотканные перегород ки и крупные сосуды.
Дальнейший анализ образцов проходил по следующей схеме:
1. Выделение тотальной РНК 2. Постановка обратной транскрипции.
3. Анализ экспрессии изучаемых генов путем определения концентрации кДНК на приборе Real-time ПЦР c использованием интеркалирующего красителя SYBR-green методом относительного количественного анализа (Сt):
• PlGF, FGF, PDGFA, PDGFB, VEGF, ANG, ANGPT, TSP, участвующих в регуляции процессов ангиогенеза;
• Регуляторов фибринолиза: uPA, uPA-R, PAI- • Медиаторов воспаления и иммунного ответа: MCP-1, ICAM, COX-2, MIP-1a, MIP-1b, TF, TGF-b, IL-8, MIF, RANTES.
• HO-1 – белка, участвующего в антиоксидантной защите ткани • лептина, IGF-I, IGF-II, факторов роста плода и плаценты.
4. Данные обрабатывали статистически по непараметрическому критерию Mann-Whitney с использованием статистического пакета Statistica 6.0.
КЛИНИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ОБСЛЕДОВАННЫХ ЖЕНЩИН Средний возраст пациенток обследованных групп составил 29,8 ± 4,7 у пациенток 1-й группы, у пациенток 3-й и 4-й группы 25,7±3,2 и 27,7 ± 4,6 соот ветственно. Данные статистически не различаются, т.е. женщины всех групп были сопоставимы по возрасту. Около половины женщин 1-й и 4-й групп со ставили возрастную группу 27-35 лет, подавляющее большинство женщин 3-й группы (80%) были моложе 27 лет. Среднее значение ИМТ соответствовало нормальным значениям;
достоверных отличий в этих показателях между жен щинами во всех группах не было. Структура сопутствующей соматической па тологии у всех обследованных женщин существенно не отличалась. Следует отметить высокую заболеваемость ОРВИ у пациенток 1 группы, частота кото рой (60%) была достоверно выше, чем у женщин остальных групп.
Среди обследованных женщин средний возраст менархе соответствовал популяционным и не имел различий во всех группах. Длительность менстру ального цикла, а также продолжительность менструаций также были сопоста вимы у женщин всех групп и соответствовали физиологическим параметрам. В то же время частота нарушений менструального цикла у женщин 1 и 3 групп наблюдалась в 1,5-2 раза чаще, чем у женщин 4-й группы.
Структура гинекологической заболеваемости обследованных женщин разнообразна, однако наибольший удельный вес занимают воспалительные гинекологические заболевания, суммарная частота которых была существенно выше у пациенток 1 группы и составила 65,5%.
Характеристика генеративной функции женщин 1 группы представлена в табл.1.
Таблица Характеристика генеративной функции женщин 1 группы Анамнестические дан- Настоящая беремен ные ность Параметр n=110 % n=110 % Своевременные роды 61 55,5 83 75, • из них кесарево сечение 15 24, Преждевременные роды 11 10 6 5, • из них кесарево сечение 3 27,3 0 0, Внематочная беременность 9 8,2 0 0, Искусственный аборт 49 44,5 0 0, Самопроизвольные выкидыши 66 60 8 7, до 12 недель 59 53,6 8 7, 13-21 неделя 5 4,6 0 22-24 недели 2 1,8 0 Неразвивающаяся беремен- 35 31,8 3 2, ность ЗРП 24 21,8 15 13, Как следует из представленных в табл.1 данных, у большинства женщин 1 группы (60%) в анамнезе отмечались случаи самопроизвольных выкидышей и замершей беременности, т.е. данный эпизод невынашивания был повторным.
За время госпитализации в отделении патологии беременности женщины по лучали своевременную комплексную патогенетически обоснованную терапию.
Своевременное адекватное лечение угрозы выкидыша в I триместре позволило большинству наблюдавшихся женщин (75,4%) доносить беременность до сро ка физиологического родоразрешения.
Средние значения массы новорожденных и массо-ростового показателя (МРП) у женщин обследуемых групп представлены в табл. 2.
Таблица Средние значения массы новорожденных и МРП у женщин изучаемых групп группы Масса плода, г МРП 1 группа 3100± 253 62,1± 2, 2374 ± 398 * 51,2 ± 6,5 * 3 группа 3491 ± 228 66,7 ± 4 группа *P0, Как следует из представленных в табл.2 данных, у женщин 3-й группы наблюдается достоверное снижение массы тела новорожденных и МРП по сравнению с аналогичными показателями у женщин 1-й и 4-й групп (p0,001), что позволяет рассматривать женщин 4-й группы, как контрольную группу для 3-й группы женщин.
Приведенная нами клиническая характеристика всех обследованных женщин, составивших исследуемые группы, подчеркивает их сопоставимость по основным параметрам (возрасту, социальному положению, условиям труда и быта, соматической и гинекологической заболеваемости, паритету и т.п.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Анализ генетических полиморфизмов.
В соответствии с поставленными задачами, для исследования взаимосвя зи генетических полиморфизмов V фактора, MTHFR, GPIIIa, VII фактора, PAI 1 и НБ, нами было обследовано 110 женщин с клиническими признаками угро зы прерывания беременности (1 группа) и 340 доноров (2-я группа, контроль ная) для выявления популяционных частот исследуемых полиморфизмов.
Частоты аллелей в группе 2 (доноры) не отличались от рассчитанных на основе закона Харди-Вайнберга (p=0.98), что свидетельствовало о возможно сти использования частот генотипов, полученных в группе доноров, как зна чений популяционных частот.
На основе анамнестических данных и ретроспективной оценки исходов настоящей беременности среди 110 пациенток 1 группы были выделены сле дующие подгруппы:
• Женщины с наличием воспалительных гинекологических заболеваний, как наиболее распространенного в данной группе фактора риска невына шивания беременности - 72 пациентки;
• Женщины без сопутствующей воспалительной гинекологической патоло гии - 38 пациенток;
• Женщины без неблагоприятных исходов беременности, которым удалось сохранить данную беременность и родить здорового ребенка, и которые не имели выкидышей/замершей беременности в анамнезе – 32 пациентки;
• Женщины с наличием неблагоприятных исходов в анамнезе. В эту группу вошли женщины, у которых либо настоящая беременность, либо преды дущие завершились самопроизвольными выкидышами либо имелась не развивающаяся беременность- 78 пациенток.
В вышеуказанных подгруппах женщин был проведен анализ частот изу чаемых полиморфизмов C677T MTHFR, PlA1/A2 GPIIIa, 4G/5G PAI-1.
Частоты генотипов полиморфизма C677T MTHFR в подгруппах женщин с наличием и отсутствием воспалительных заболеваний представлены в табл.3.
Таблица 3.
Частоты генотипов C677T MTHFR у женщин с наличием и отсутствием воспалитель ных заболеваний и в популяции ( P0,05) Всего MTHFR C/С MTHFR C/T MTHFR T/T n 14 16 7 Нет воспалит.
заболеваний 37,84% 43,24% % 100% 18,92% Есть воспа- n 36 27 8 лит. заболе % 50,70% 38,03% 11,27% 100% вания Всего 50 43 15 n 166 143 31 Популяц. 48,8% 42,1% 9,1% 100% % Как следует из представленных в табл.3 данных, в подгруппе женщин с отсутствием сопутствующих воспалительных гинекологических заболеваний частота генотипа MTHFR T/T (18,9%) превышала этот показатель в подгруппе женщин с воспалительными гинекологическими заболеваниями (11,2%, p=0,1) и в популяции (9%, p0,05). Таким образом, при отсутствии воспалительного фактора, носительство гомозиготного генотипа 677ТТ является неблагопри ятным для формирования симптомокомплекса НБ.
Частоты генотипов полиморфизма R353Q VII фактора свертывания кро ви в подгруппах женщин с наличием и отсутствием воспалительных гинеколо гических заболеваний представлены в табл.4.
Таблица 4.
Частоты генотипов R353Q VII фактора у женщин с наличием и отсутствием воспали тельных гинекологических заболеваний и в популяции ( P0,05) VII фактор VII фактор VII фактор Всего R/R R/Q Q/Q n Нет воспалит. 35 2 0 5,41% заболеваний % 94,6% 0,0% 100% Есть воспалит. n 54 15 2 заболевания 76,06% 21,13% 2,82% 100% % Всего 89 17 2 n 257 75 8 Популяц.
75,6% 22,0% 2,4% 100% % Как следует из представленных в табл.4 данных, частота генотипа VII R/Q в подгруппе женщин с отсутствием сопутствующих воспалительных гине кологических заболеваний была ниже (5,4%), чем в группе с воспалительными гинекологическими заболеваниями (21,1%, p0,05) и в популяции (22%, p0,05). В связи с этим, можно предположить, что гетерозиготное носительст во R353Q VII фактора оказывает протективное влияние на формирование угро зы выкидыша.
Отличий по частотам полиморфизмов PlA1/A2 GPIIIa и 4G/5G PAI-1 у женщин с угрозой прерывания беременности без сопутствующей воспалитель ной гинекологической патологии найдено не было.
Таким образом, при исключении воспалительной патологии женской ре продуктивной сферы, как основного фактора риска формирования угрозы пре рывания беременности, нам удалось выявить взаимосвязь между генотипами T677T MTHFR и R353R VII фактора и формированием данной патологии. Так, генотип Т677Т MTHFR проявлял себя, как неблагоприятный фактор, способст вующий прерыванию беременности, в то время как генотип R353Q, напротив, оказывал протективное влияние на течение беременности.
Анализ частот генотипов изучаемых полиморфизмов был проведен у женщин с наличием неблагоприятных исходов беременности (выкидыши, не развивающаяся беременность) по сравнению с 32 женщинами, у которых не было потери беременности в анамнезе и которым удалось доносить данную бе ременность, несмотря на эпизод угрозы выкидыша в 1 триместре. Данные по частотам генотипов сравнивали с популяционной частотой. Также была про ведена оценка частоты неблагоприятных исходов беременности в зависимости от генотипа исследуемых полиморфизмов, а также их комбинаций.
Частоты генотипов полиморфизма C677T MTHFR у женщин с наличием неблагоприятных исходов беременности и у пациенток с угрозой прерывания беременности без потерь беременности представлены в табл.5.
Таблица Частоты генотипов полиморфизма C677T MTHFR у женщин с неблагоприятными исхо дами беременности и без потерь беременности и в популяции ( P0,05) Всего MTHFR C/С MTHFR C/T MTHFR T/T n 18 13 1 Не было неблагоприятных исходов беременности 56,25% 40,63% 3,13% % 100% n Были неблагоприятные 34 30 14 исходы беременности 43,59% 38,46% % 100% 17,95% Всего 52 43 15 n 166 143 31 Популяция 48,8% 42,1% 9,1% % 100% Как следует из представленных в табл.5 данных, в группе женщин с на личием неблагоприятных исходов беременности частота генотипа MTHFR T/T была выше (17.9%), чем в группе пациенток без репродуктивных потерь (3%, OR=5,67, p0,05) и в популяции (9%, OR=1,9;
p=0,3).
Частота неблагоприятных исходов у носителей генотипа Т677Т состави ла 93% по сравнению с генотипами СТ (70%, OR=1,3) и СС (65,3%;
OR=1,4).
Таким образом, нам удалось выявить взаимосвязь гомозиготного носительства TT MTHFR с формированием неблагоприятных исходов беременности.
Частоты генотипов полиморфизма R353Q VII фактора у женщин с нали чием неблагоприятных исходов беременности и у пациенток с угрозой преры вания без потерь беременности представлены в табл. 6.
Таблица 6.
Частоты генотипов полиморфизма R353Q VII фактора у женщин с неблагоприятными исходами беременности и у женщин без потерь беременности ( P0,05) VII фактор VII фактор VII фактор Всего R/R R/Q Q/Q n 21 11 0 Не было неблагоприятных исходов беременности 65,63% 34,38% 0,00% % 100% n Были неблагоприятные исхо- 70 6 2 7,69% ды беременности 89,74% 2,56% % 100% Всего 91 17 2 n 257 75 8 Популяция 75,6% 22,0% 2,4% % 100% Как следует из представленных в табл. 6 данных, частота генотипа R353Q VII фактора у женщин с наличием неблагоприятных исходов была ниже (7,7%), чем в группе остальных пациенток (34,4%, OR=4,5;
p0,05) и в попу ляции (22%, p=0,24).
Частота неблагоприятных исходов беременности у женщин с генотипом RQ была ниже (35,3%), чем у женщин с генотипом RR (77%, OR=2,2, p0,01).
Таким образом, было выявлено протективное влияние генотипа R353Q VII фактора при формировании угрозы прерывания беременности.
Частоты генотипов полиморфизма PlA1/A2 GP IIIa у женщин с наличием неблагоприятных исходов беременности и у пациенток с угрозой прерывания беременности без потерь беременности представлены в табл.7.
Таблица 7.
Частоты генотипов полиморфизма PlA1/A2 GP IIIa у женщин с неблагоприятными ис ходами беременности и у женщин без потерь беременности ( P0,05) GP IIIa GP IIIa GP IIIa Всего PlA1/PlA1 PlA1/PlA2 PlA2/PlA n 18 14 0 Не было неблагоприятных исходов беременности % 56,25% 43,75% 0,00% 100% n Были неблагоприятные ис- 61 15 2 ходы беременности 19,23% 2,56% % 100% 78,21% Всего 79 29 2 n 237 97 6 Популяция 69,7% 28,6% 1,7% % 100% Как следует из представленных в табл. 7 данных, наблюдалось достовер ное повышение частоты генотипа PlA1/A1 GP IIIa у женщин с неблагоприят ными исходами в анамнезе (77%) по сравнению с группой остальных пациен ток (58%), p0,05.
Частота неблагоприятных исходов беременности в группе женщин с ге нотипом PlA1/PlA1 была выше (77,2%), чем в группе женщин с генотипом PlA1/PlA2 (51,7% OR=1,5, p0,05). Из-за малочисленности носителей генотипа PlA2/PlA2 (2 человека), мы не анализировали эти данные.
Таким образом, в результате проведенного исследования была проде монстрирована взаимосвязь между гомозиготным генотипом PlA1/PlA1 GPIIIa и формированием неблагоприятных исходов беременности.
Отличий по частоте неблагоприятных исходов в зависимости от генотипа PAI-1 4G/5G у женщин с неблагоприятными исходами беременности и женщин без репродуктивных потерь найдено не было.
Основываясь на полученных данных о взаимосвязи неблагоприятных ис ходов беременности и генотипов T/T MTHFR и PlA1/A1 GPIIIa и протективном эффекте генотипа RQ VII фактора, были выделены следующие пары благопри ятных и неблагоприятных для вынашивания беременности сочетаний геноти пов. В группах женщин с данными сочетаниями генотипов был проведен ана лиз частоты неблагоприятных исходов беременности. Данные по частотам не благоприятных исходов при благоприятных и неблагоприятных для вынаши вания беременности сочетаниях генотипов представлены в табл.8.
Таблица 8.
Распределение частот и относительный риск неблагоприятных исходов у женщин с бла гоприятными и неблагоприятными для вынашивания беременности сочетаниями ге нотипов MTHFR, VII фактора и GPIIIa.
Благоприятное Частота не- Неблагоприятное Частота неблаго Относит.
сочетание гено- благоприят- сочетание гено- приятных P риск типов ных типов исходов исходов MTHFR TT-/ MTHFR TT+/ 31% 92% 2,97 p0, VII RQ+ VII RQ GP IIIa PlA1A1- GP IIIa PlA1A1+/ 25% 81,4% 3,26 p0, /VII RQ+ VII RQ MTHFR TT-/ MTHFR TT+/ GP IIIa PlA1A1- 33% GP IIIa PlA1A1+/ 92,3% 2,8 p0, /VII RQ+ VII RQ Как следует из представленных в табл.8 данных, можно отметить, что при неблагоприятном сочетании 2-3-х генотипов, относительный риск форми рования невынашивания беременности повышается в 3 раза, тогда как при неблагоприятном генетическом факторе относительный риск составлял всего лишь 1,3-2,2.
Анализ экспрессии генов.
При изучении уровня экспрессии генов факторов регуляции ангиогенеза, с трофобластической стороны плацент с ЗРП по сравнению с нормальными на блюдалось повышение экспрессии PDGFB (p=0,008), FGF (p=0,025), VEGF (p=0,007), ANGPT (p=0,04). Наблюдалась также тенденция к повышению экс прессии ANG, однако эти данные не были достоверными (p=0,11). Мы не на шли различий в экспрессии PlGF, PDGFA. В то же время с трофобластической стороны плацент с ЗРП также отмечалось снижение экспрессии TSP (p=0,025) (рис.1 ).
PDGFB. Трофобластическая часть FGF. Трофобластическая часть 0, 0, * * 0,06 0, относительные единицы относительные единицы 0,05 0, p = 0,0076 p = 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0,01 0, 0, ЗРП контроль контроль NT VT ЗРП а. б.
VEGF. Трофобластическая часть Angpt-1. Трофобластическая часть 0,0050 0, * 0, относительные единицы относительные единицы p = 0, p = 0, 0,0005 0, * 0, 5E-5 7E- 3,5E- 5E- 7E- 3,5E- контроль ЗРП NT VT NT VT контроль ЗРП в. г.
TSP. Трофобластическая часть 2, p = 0, относительные единицы 0, * 0, Рис.1 Количественная оценка уровня экс 0, прессии генов ангиогенеза в трофобласти 0, ческой части плацент у женщин с ЗРП и 0, контрольной группе: а) PDGFB, б) FGF-2, 0, в) VEGF, г) Angpt-1, д) TSP.
0, 0, контроль NT VT ЗРП д.
Мы не обнаружили изменений в экспрессии PlGF, PDGFA, ангиогенина. По видимому, изменения экспрессии данных факторов не являются характерными для ЗРП.
При изучении уровня экспрессии генов регуляции фибринолиза, у жен щин с ЗРП мы наблюдали повышение экспрессии PAI-1 (p=0,0017) (рис.2).
PAI. Децидуальная часть Рис.2 Количественная оценка уровня экс 1, * 1, прессии PAI-1 в децидуальной части пла относительные единицы 0, цент женщин с ЗРП и контрольной группе.
p = 0, 0, 0, 0, контроль ЗРП ND VD При изучении уровня экспрессии генов факторов, участвующих в воспа лительном ответе с децидуальной и трофобластической сторон плацент женщин с ЗРП наблюдалось достоверное повышение экспрессии MCP-1 (p=0,014), а с трофобластической стороны - снижение экспрессии HO-1 (p=0,021) (рис.3).
MCP-1. Децидуальная часть MCP-1. Трофобластическая часть 0, 0, p = 0,0147 p = 0, относительные единицы относительные единицы 0, 0, * * 0, 0, * 0, 0, 0, 0, 0, 0, 7,5E- ЗРП ЗРП контроль контроль ND VD NT VT а.
HO-1. Трофобластическая часть 0, Рис.3 Количественная оценка уровня экс относительные единицы p = 0, * прессии генов факторов регуляции воспали 0, тельного ответа в плацентах женщин с ЗРП и физиологическим течением беременности:
а) MCP-1, б) HO- 0, 0, контроль NT VT ЗРП б.
При изучении экспрессии генов инсулиноподобных факторов роста и лептина с децидуальной стороны плацент у женщин с ЗРП мы наблюдали сни жение экспрессии лептина (p=0,003), а также тенденцию к снижению экспрес сии IGF-II (p=0,22). Не было найдено различий в экспрессии IGF-I (рис.4).
Лептин. Децидуальная часть Рис.4 Количественная оценка 5, уровня экспрессии гена лептина в p = 0, относительные единицы плацентах с ЗРП и контрольной * 0, группе.
0, 0, 0, контроль ЗРП ND VD Выводы:
Наличие аллелей 677Т MTHFR и PlA1GP IIIa в гомозиготном состоянии 1.
является фактором риска формирования невынашивания беременности, то гда как гетерозиготный генотип R353Q VII фактора свертывания крови ока зывает протективное влияние на течение беременности.
ДНК-диагностику для выявления генетической предрасположенности к 2.
невынашиванию беременности и плацентарной недостаточности целесооб разно проводить в группах женщин с повторными случаями невынашивания беременности и/или при отсутствии других факторов риска формирования данной патологии.
Сочетание нескольких неблагоприятных вариантов в генах коагуляции 3.
имеет наибольшее значение для формирования невынашивания беременно сти.
В плацентах женщин с задержкой роста плода и первичной плацентар 4.
ной недостаточностью наблюдается снижение экспрессии HO-1, что может является косвенным свидетельством гипоксии ткани и показателем наруше ния антиоксидантной защиты плаценты.
Первичная плацентарная недостаточность характеризуется изменениями 5.
экспрессии генов факторов, регуляции ангиогенеза (повышение экспрессии VEGF, PDGFB, FGF-2, Angpt-1, снижение экспрессии TSP-1, повышение экспрессии MCP-1), фибринолиза (повышение экспрессии PAI-1), факторов роста (снижение экспрессии генов лептина и IGF-II). Изменения экспрессии изученных генов могут рассматриваться в качестве молекулярных маркеров формирования первичной плацентарной недостаточности и задержки роста плода.
Практические рекомендации.
1. Женщины с угрозой прерывания беременности, имеющие НБ в анамнезе или при спорадических случаях с неустановленной этиологией подлежат проведению у них ДНК-диагностики наследственной предраспо ложенности к НБ по выявлению полиморфизмов MTHFR C677T, VII фак тора R353Q, GPIIIa PlA1/A2. Такое проведение ДНК-диагностики позволит уточнить патогенез и выбрать адекватную тактику лечения для улучшения прогноза и исхода беременности.
2. Патогенетически обоснованным является применение препаратов с антиоксидантным действием у женщин с первичной плацентарной недос таточностью. У женщин с высоким риском формирования первичной ПН необходимо применять препараты, улучшающих кровоток на более ранних этапах беременности (1 триместр) для правильного становления маточно плацентарного кровотока, тогда как во 2-3-м триместре такая терапия мо жет оказаться неэффективной.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Никитина Л.А., Черепнина А.Л. Экспрессия генов факторов – регуля 1.
торов ангиогенеза и фибринолиза в плаценте женщин с хронической пла центарной недостаточностью// Международный молодежный медицин ский конгресс «Санкт-Петербургские научные чтения»: Тез. докл. - С-Пб., 2005. – С. Никитина Л.А. Частота полиморфизма С677Т метилентетрагидрофо 2.
латредуктазы у женщин с невынашиванием беременности // 1 Междуна родная (X Всероссийская) Пироговская студенческая научная медицин ская конференция: Тез. докл. – М., 2006 – С.228-229.
Никитина Л.А. Генетические и транскрипционные механизмы пла 3.
центарной недостаточности // Московская Международная конференция «Биотехнология и медицина»: Тез. докл. – М., 2006. – С.65.
Садекова О.Н., Никитина Л.А. Роль генетической предрасположенно 4.
сти в развитии невынашивания беременности// XIII Международная кон ференция «Ломоносов-2006»: Тез. докл. – М., 2006. – С. Садекова О.Н., Никитина Л.А. Роль генетической предрасположенно 5.
сти в развитии невынашивания беременности// Вестник молодых ученых «Ломоносов». Выпуск III. М.: Макс Пресс, 2006. —С. 374-382.
Никитина Л.А., Демидова Е.М., Радзинский В.Е., Демидов Б.С., Са 6.
моходская Л.М., Роль матриксных белков, цитокинов и факторов ангио генеза маточно-плацентарного комплекса в регуляции имплантации и плацентации // Вестник РУДН. – 2006. - №4(36). – С.131- 7. Nikitina LA, Cherepnina AL, Neizhko ES, Panina OB, Bochkov VN. Se lective up-regulation of monocyte chemotactic protein – 1 gene expression in placentas from intrauterine growth restriction pregnancies. American Journal of Reproductive Immunology. 2006. - Vol. 56 (1). - P. 51-52.
8. Sadekova O.N., Nikitina L.A., Azarova O.Yu., Demidova E.M., Bochkov V.N., Samokhodskaya L.M.Association of gene polymorphisms C677T MTHFR and R353Q VII coagulation factor with adverse pregnancy outcomes// European Journal of Medical Research. – 2006. - Vol. 11, suppl. II. - P. Е.М. Демидова, Б.С. Демидов, Л.А. Никитина, Т.Н. Рашидов, Е.В.
9.
Сысолятина. Клеточно-молекулярные взаимодействия в эндометрии. Роль в генезе потерь беременности.// Научно-практическая конференция «Но вые медицинские технологии в поликлинической практике»: Тез. докл. – М., 2006. – С. Садекова О.Н., Никитина Л.А. Взаимосвязь полиморфизмов С677Т 10.
MTHFR и R353Q гена VII фактора с развитием привычного невынашива ния беременности// Итоговая научная студенческая конференция с меж дународным участием «Татьянин день»: Тез. докл. – М., 2007. – С.12.
Никитина Л.А., Демидова Е.М., Радзинский В.Е., Демидов Б.С., Са 11.
моходская Л.М. Молекулярные взаимодействия в регуляции процессов имплантации и плацентации //Акушерство и гинекология. – 2007. - №3. – C. 5-10.
Никитина Л.А., Абдуллаев С.М., Садекова О.Н., Азарова О.Ю., Боч 12.
ков В.Н., Демидова Е.М., Самоходская Л.М. Генетические аспекты невы нашивания беременности // Молекулярный полиморфизм человека. – 2007. - Т.2 – М.: РУДН. – С. 459-483.
13. Nikitina LA, Lukanova EA, Buchulaeva NA, Cherepnina AL, Neizhko ES, Panina OB, Bochkov VN, Voloschuk IN. Abnormal villous tree development in intrauterine growth restriction is accompanied by increased VEGF expression // American Journal of Reproductive Immunology. – 2007. - Vol. 57 (6). - P. 444.
14. O.N. Sadekova, L.A. Nikitina, O.Yu. Azarova, E.M. Demidova, V.N.
Bochkov, L.M. Samokhodskaya. Adverse pregnancy outcomes: a redictive role of gene polymorphisms C677T MTHFR and R353Q VII coagulation factor. // Abstract-book of 14th International Student Congress of Medical Sciences. 2007. - Groeningen, Netherlands. - P.157.
15. Nikitina LA, Sadekova O.N., Rashidov T.N, Voloschuk IN, Bochkov VN, Demidova EM, Samokhodskaya LM, Tkachuk VA. Recurrent early pregnancy loss endometrium is accompanied by decreased VEGF and increased PlGF gene expression //
Abstract
book of 3d EMBIC Summer School.-2007. - Jena, Germany. – p.11.
«Молекулярно-генетические маркеры невынашивания беременности и плацентарной недостаточности» Никитина Людмила Александровна (Россия) Работа посвящена изучению роли ряда генетических и молекулярных факторов в патогенезе невынашивания беременности и первичной плацентар ной недостаточности. Проанализирована прогностическая значимость проведе ния ДНК-диагностики на наличие полиморфизмов факторов, оказывающих влияние на процессы свертывания крови (С677T MTHFR, G1691A V фактора, PlA1/PlA2 GPIIIa, R353Q VII фактора) у женщин с невынашиванием беременно сти.
Получены новые данные об изменениях экспрессии генов ангиогенных, ростовых факторов, воспалительных цитокинов при первичной плацентарной недостаточности и задержке роста плода. Обсуждаются молекулярные меха низмы патогенеза плацентарной недостаточности и задержки роста плода и воз можные подходы к лечению и профилактике данной патологии.
Molecular-genetic markers of precnancy loss and placental insufficiency.
Liudmila A. Nikitina (Russia) The aim of the work was to evaluate the role of some genetic and molecular factors in pathogenesis of pregnancy loss and primary placental insufficiency. The prognostic significance of DNA-diagnostics of С677T MTHFR, G1691A V factor, PlA1/PlA2 GPIIIa, R353Q VII factor gene polymorphisms in pregnancy loss was analyzed. These factors are involved in blood coagulation proceses.
New data, concerning changes in gene expression pattern of angiogenic, growth factors and inflammatory cytokines were observed. Molecular mechanisms of placen tal insufficiency and fetal growth restriction pathogenesis and potential therapy and prevention methods are discussed.