Действие дефензина -1 человека на трипомастиготы и амастиготы trypanosoma cruzi in vitro
На правах рукописи
Клещенко Юлия Евгеньевна Действие дефензина -1 человека на трипомастиготы и амастиготы Trypanosoma cruzi in vitro 03.02.03 – микробиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва - 2010
Работа выполнена на базовой кафедре микробиологии и вирусологии медицинского факультета Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Российский университет дружбы народов» и на кафедре микробиологии и иммунологии Медицинского колледжа имени Мехарри (г. Нэшвилл, Теннесси, США) Научные руководители:
Карпенко Людмила Петровна, кандидат биологических наук, доцент Виллалта Фернандо Ph.D., профессор
Официальные оппоненты:
Токмалаев Анатолий Карпович доктор медицинских наук, профессор Лауреат Государственной премии СССР, Градова Нина Борисовна доктор биологических наук, профессор
Ведущая организация: ГОУ ВПО «Российский Государственный медицинский университет им. Н.И. Пирогова»
Защита диссертации состоится « 16 » июня 2010 г. в 15.00 часов на заседании диссертационного совета Д212.203. при Российском университете дружбы народов по адресу:, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, дом 6.
С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке ГОУ ВПО «Российский университет дружбы народов» по адресу:
117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, дом 8.
Автореферат разослан «12» мая_ 2010 г.
Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук, доцент О.Б. Гигани
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы Trypanosoma cruzi – паразитический жгутиковый одноклеточный организм рода Trypanosoma, семейства Trypanosomatidae, отряда Kinetoplastida, класса Zooflagellata, типа Sarcomastigophora. T. cruzi является возбудителем американского трипаносомоза (болезнь Шагаса), распространенного преимущественно в Южной и Центральной Америке, где в некоторых очагах может поражать до 70-90% населения. Заражение человека происходит в основном трансмиссивно с участием клопов семейства Reduviidae (70 видов), но возможно также при гемотрансфузии, трансплацентарно или с молоком матери. В природе резервуарами T. cruzi выступают до 200 видов диких и домашних млекопитающих, поддерживающих естественные, в том числе, и синантропные очаги инфекции.
Местом паразитирования и размножения T. cruzi в организме позвоночного хозяина служат клетки мононуклеарных фагоцитов, мигрирующие в ткани различных органов. Наиболее часто и тяжело поражаются сердце, гладкая и скелетная мускулатура, а также нервная система.
Внутриклеточное размножение T. cruzi обеспечивает паразиту неуязвимость для циркулирующих в крови факторов защиты хозяина. Применяемые при болезни Шагаса в настоящее время лекарственные препараты - бензнидазол и нифуртимокс, эффективны лишь в острой фазе заболевания и не могут быть использованы при хронической его форме, обладая высокой токсичностью и приводя к ряду побочных эффектов. Названные терапевтические средства далеки от совершенства, чем и объясняется необходимость поиска новых подходов к созданию средств борьбы с данной протозойной инфекцией.
Одним из перспективных направлений исследований в этой области является изучение иммунитета и путей стимулирования иммунного ответа организма хозяина при болезни Шагаса. Особую группу эффекторных молекул системы врожденного иммунитета представляют дефензины – пептиды, которые характеризуются широким спектром антимикробной и антивирусной активности (Madison M.N., Kleshchenko Y.Y. et al., 2008).
До настоящего времени действие дефензинов на T. cruzi не изучалось.
Цель исследования Целью настоящего диссертационного исследования является изучение действия дефензина -1 человека на T. cruzi in vitro.
Задачи исследования В соответствии с поставленной целью сформулированы следующие задачи:
1. Изучить действие дефензина -1 человека на жизнеспособность трипомастигот и амастигот T. cruzi при вариациях дозы и времени инкубации двухкомпонентных систем в опытах in vitro.
2. Изучить инвазивную активность трипомастигот, предварительно подвергнутых действию дефензина -1 в опытах in vitro.
3. Установить ультраструктурные изменения, возникающие у T. cruzi под действием дефензина -1 человека.
Научная новизна работы Впервые показано, что дефензин -1 человека обладает трипаноцидной активностью по отношению к T. cruzi в опытах in vitro. Определены концентрационные и временные характеристики действия препарата.
Описаны поэтапные изменения клеточных структур, приводящие к гибели паразита. Охарактеризован механизм взаимодействия дефензина -1 и клеточной мембраны трипаносом с образованием пор и последующей перестройкой всех внутриклеточных мембран, сопровождающейся разрушением клеточных органелл, а также фрагментацией ДНК паразита.
Практическая значимость работы Дефензины представляют собой биополимеры животного происхождения. В результате исследований установлена токсичность дефензина -1 против T. cruzi, а также охарактеризован механизм токсичного действия. Получены оригинальные данные, раскрывающие физиологические механизмы резистентности макроорганизма к инфекции T. cruzi. Факт микробицидного действия дефензина -1 открывает возможности для поиска более эффективных терапевтических агентов при лечении болезни Шагаса.
Существует также проблема безопасности банков донорской крови, в которой могут оказаться патогенные трипомастиготы T. cruzi. Использование дефензина -1 в пределах физиологических концентраций может позволить элиминировать T. cruzi и устранить риск заражения этими паразитами при переливании донорской крови.
Основные положения, выносимые на защиту Дефензин -1 человека обладает трипаноцидной активностью против 1.
трипомастиготных и амастиготных форм T. cruzi. Степень микробицидного действия природного биополимера предопределена дозой и временем инкубации компонентов в двухмодульной системе.
Установлен молекулярный механизм трипаноцидного эффекта. Электронно 2.
микроскопические исследования показали характерную морфологию трипомастигот при воздействии дефензина -1 человека, а также позволили определить встраивание последнего в клеточную мембрану паразитического простейшего и образование мембранных пор. Ультраструктурные изменения и фрагментация ДНК, вызванные действием дефензина -1 человека, имеют общие черты с клеточным апоптозом.
Апробация работы Диссертация выполнена в соответствии с научным направлением базовой кафедры микробиологии и вирусологии медицинского факультета Российского университета дружбы народов и кафедры микробиологии и иммунологии Медицинского колледжа имени Мехарри (г. Нэшвилл, Теннесси, США). Результаты исследований и основные положения диссертации доложены и обсуждены на конференции кафедры микробиологии и вирусологии РУДН (2009, 20 ноября), на международной конференции «55th Annual Meeting of the American Society of Tropical Medicine and Hygiene» (Atlanta, GA., 12– ноября 2006 г.), на минисимпозиуме «Minisymposium Regulation of Mucosal Inflammatory Responses. Annual Meeting of the American Society of Investigative Pathologists, Experimental Biology» (Washington, DC, с 28 апреля по 2 мая 2007 г.), на научной конференции « 94th Annual Meeting of the American Association of Immunologists» (Miami Beach, Florida, 18- мая, 2007 г.), на международной конференции «56th Annual Meeting of the American Society of Tropical Medicine and Hygiene» (Philadelphia, Pennsylvania, 4-8 ноября 2007 г.), и на минисимпозиуме «Minisymposium Regulation of Mucosal Inflammatory Responses.
Annual Meeting of the American Society of Investigative Pathologists, Experimental Biology» (San Diego, California, 5-9 апреля 2008 г.) Публикации По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, 1 из них – в издании, входящем в рекомендованный ВАК список.
Объем и структура диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, экспериментальной части с обсуждением результатов, заключения, выводов и списка литературы (183 источника). Работа изложена на 97 страницах, содержит 16 рисунков. Список литературы содержит 183 работы:4 российских, зарубежных авторов.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Во всех экспериментах использовали трипомастиготные и амастиготные формы T. cruzi клона MMC 20A, полученного из штамма Tulahuen (Lima M.F., et al., 1989).
Чистую культуру трипомастигот выделяли из супернатанта культуры трансформированных миобластов крысы (Lima M.F. et al., 1989). Амастиготы были выделены по Villalta F. et al., 1998. Кровяные трипомастиготы получали из крови инфицированных мышей линии C57BL/6J (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME).
- В работе использовали дефензин человека с аминокислотной последовательностью полученный ACYCRIPACIAGERRYGTCIYQGRLWAFCC, синтетическим путем и очищенный с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) (Valore E.V., et al., 1992). Масспектрометрический анализ пептида показал единственный пик с отношением массы к заряду 3445,07 (m/z).
Контрольный образец со случайной последовательностью аминокислот дефензина (CACRPGCRIQYECRARLTAICIGYFAWYCG) был синтезирован с помощью программы RJE-SEQ, которая позволяет сформировать последовательности, не встречающиеся во всех известных белках (http://bioinformatics.ucd.ie/shields/redwards/).
Синтетические пептиды были получены в Genemed Synthesis (San Francisco, CA).
Для исследования действия от 3,7 µМ до 35 µМ дефензина -1 человека на жизнеспособность T. cruzi трипомастиготы или амастиготы (2x106/мл) инкубировали в культуральной среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM), с различными дозами пептида, а также дополнительно с ослиными антителами к дефензину -1 или контрольной неспецифической сывороткой (MBL International Corp., Woburn, MA) в течение 1 часа при 37 С. В контрольных экспериментах паразитов инкубировали или с контрольным образцом или только в культуральной среде в таких же условиях.
Количество убитых трипомастигот или амастигот определяли под микроскопом (Villalta F.
et al., 1998), используя следующую формулу: % убитых трипаносом = [1 – (число живых паразитов после инкубации/число живых паразитов в культуральной среде)]x100. Каждый эксперимент был выполнен в трипликате, а также воспроизведен три раза.
Для изучения действия дефензина -1 на трипомастиготы, выделенные из крови инфицированных мышей (3 x 106/мл в цитрате натрия - 1,5% ), инкубировали с 25 µМ дефензина -1 или без него в течение 24 час. при 4 С. Эксперименты были выполнены раза в трипликате для каждого условия.
Для исследований взаимодействия дефензина -1 человека с клеточной мембраной трипомастигот последние предварительно инкубировали с карбонил-цианид-m-хлор фенилгидразоном (КЦ) (Shafet W.M., et al., 1998), вызывающим деполяризацию мембран.
Трипомастиготы обрабатывали 10 µМ КЦ (Sigma, St. Louis, MO) в течение 15 мин., отмывали в культуральной среде, а затем инкубировали с 20 µМ дефензина -1 в течение 1 часа при 37 С. Контрольную культуру подвергали действию дефензина -1 без обработки КЦ. Дополнительные контрольные эксперименты включали в себя инкубацию -1, трипомастигот с 20 контрольного пептида или дефензина который µМ предварительно обработали либо сывороткой к дефензину, либо неспецифической сывороткой. Трипомастиготы также инкубировали только с 10 µМ КЦ или в культуральной среде в течение 1 час. при 37 С. Эксперименты были выполнены раза в трипликате для каждого условия.
Ультраструктурные изменения трипомастигот под действием дефензина -1, а также мембранные поры, образуемые последним у трипомастигот, T. cruzi (107/мл) исследовали с помощью сканирующего электронного микроскопа Hitachi-2700 (СЭМ), негативного контраста (нкСЭМ), негативного контраста с использованием антител с коллоидным золотом (н-иммуноголд-ЭМ) и трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ) на установке Philips CM-12. Кроме того, иммуноголд-ЭМ метод применяли для анализа локализации дефензина -1 внутри трипаносомной клетки.
(107/мл) Для сканирующей электронной микроскопии трипомастиготы инкубировали в течение 1 часа с дефензином -1 в различных концентрациях (3,7;
5 и µМ), 20 µМ контрольного пептида или 20 µМ дефензина -1, обработанного специфичными к нему антителами (IgG) или неспецифической сывороткой в течение час. Материал обрабатывали по стандартной методике (Villalta F., et al., 1984) с постфиксацией в OsO4, золото-палладиевым раствором и исследовали с помощью сканирующего электронного микроскопа Hitachi 2700.
Для негативной контрастной-ЭМ-окраски трипомастиготы (107/мл) инкубировали с 3,7 µМ дефензина -1 или 3,7 µМ контрольного пептида в течение 1 часа, образцы окрашивали фосфорновольфрамовой кислотой (Horne R.W., Bangham A.D., et al., 1963) и анализировали под электронным микроскопом Philips CM-12.
Для нк-иммуноголд-ЭМ трипомастиготы (107/мл) инкубировали с 3,7 µМ дефензина -1 и обрабатывали, как для нк-ЭМ. Образцы также инкубировали с антителами к дефензину -1 или неспецифической сывороткой, разведенными в солевом растворе с 1 % эмбриональной телячьей сывороткой, антителами обезьян против козлиных IgG, конъюгированными с 12-нм частицами коллоидного золота (Amersham Biosciences, NJ), которые также растворили в солевом растворе с 1 % эмбриональной телячьей сывороткой. Далее образцы докрашивали фосфорновольфрамовой кислотой и исследовали под электронным микроскопом Philips CM-12.
Для анализа мембранных пор, образуемых под действием дефензина -1 в мембранах трипомастигот, измеряли диаметр 320 пор в 3 независимых экспериментах.
Для трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ) трипомастиготы (107/мл) инкубировали с 15 µМ дефензина -1, а также 15 µМ контрольного пептида, 15 µМ дефензина -1, предварительно обработанного антителами к дефензину -1 или неспецифической сывороткой, либо только в культуральной среде в течение разных промежутков времени: от 15 мин. до 1 часа при 37С. Образцы были зафиксированы в 2,5% глутаровом альдегиде с постфиксацией в оксиде осмия OsO4 и заключены в смолу Спаррса. Ультратонкие срезы изучали под микроскопом Philips CM-12 как описано ранее (Villalta F., et al., 1984).
В случае иммуноголд-ТЭМ трипомастиготы (107/мл) инкубировали с 10 µМ дефензина -1 в течение 15 мин. и 1 часа, затем образцы были заключены в акриловую смолу (Villalta F., et al., 1984). Ультратонкие срезы трипомастигот, обработанных дефензином -1, инкубировали с антителами к последнему или неспецифической сывороткой, после чего места связывания визуализировали вторыми антителами, конъюгированными с частицами коллоидного золота (Villalta F., et al., 1984). Срезы докрашивали 0,25% фосфоровольфрамовой кислотой и анализировали, как описано для трансмиссионной электронной микроскопии.
Для мониторинга фрагментации ДНК T. cruzi был использован метод, основанный на специфичном встраивании биотинилированных нуклетидов dUTP в концевые участки фрагментов ДНК (TUNEL-анализ). Данный прием широко используется для определения клеточной смерти in situ (Roche Diagnostics Inc., Indianapolis, IN) (Madison M.N., et al., 2007). Трипомастиготы T. cruzi (106/мл) инкубировали с 10 µМ дефензина -1 в течение мин. при 37С в культуральной среде DMEM без фенола красного (Invitrogen Inc., CA). В качестве контроля использовали T. cruzi, которые инкубировали либо с дефензином -1, обработанным антителами к последнему (IgG), либо только в культуральной среде. Для позитивного контроля клетки обрабатывали экзонуклеазой (ДНКазой), очищенной из бычьей поджелудочной железы (Promega, Madison, WI). TUNEL-анализ проводили под флюоресцентным микроскопом Nikon (Kleshchenko Y.Y., et al., 2004), а также с помощью FACS-цитометрии (Heibein J.A. et al., 1999).
Определяли также изменения электрического потенциала цитоплазматической мембраны (p) трипомастигот под действием дефензина -1 с помощью 5 nM DiBAC (бис-(1,3 дибутилбарбитуровая кислота)-триметин-оксонол, Molecular Probes, США) в соответствии с ранее описанными рекомендациями производителя (Piacenza L., 2007;
Для контроля использовали уже описанный выше набор Piacenza L., 2001).
экспериментов. Позитивным контролем служила сыворотка человека.
20%-ная Деполяризацию анализировали проточной цитометрией.
Для изучения способности дефензина -1 ингибировать инвазию трипомастигот T.
сruzi в клетки использовали клеточную культуру HeLa, являющуюся хорошей моделью для изучения инфекции T. cruzi in vitro (Schenkman S. et al., 1992). Трипомастиготы инкубировали с 3,7 µМ дефензина -1, что эквивалентно его концентрации в крови человека, с 3,7 µМ контрольного пептида и только в культуральной среде с 3,7 µМ дефензина -1, предварительно инкубированного с антителами к нему или же с неспецифической сывороткой. Клетки паразитов отмывали в культуральной среде DMEM, добавляли к монослойным клеткам HeLa в пропорции 10 паразитов на 1 клетку и инкубировали 2 часа (Nde P.N., et al., 2006). Несвязавшиеся c клетками HeLa паразиты были отмыты DMEM, зафиксированы в метаноле и окрашены по Гимза и с помощью ДНК-специфичного красителя 4’,6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) (Madison M.N., et al., 2007). Число паразитов на каждые 200 клеток HeLa подсчитывали под люминесцентным микроскопом. Число паразитов внутри клеток получали вычитанием количества окрашенных DAPI трипомастигот из общего количества связанных паразитов для 200 клеток HeLa. Увеличение числа паразитов внутри клеток через 24, 48 и 72 часа после инфекции определяли под микроскопом на препаратах, окрашенных по Гимза (Nde P.N., et al., 2006, Simmons K.J., 2006).
Для нейтрализации активности дефензина -1 были использованы козьи антитела (0,1 – 1 мг/мл), выделенные аффинной хроматографией (дефензин--1-агароза) из сыворотки крови иммунизированного животного (каталожный номер #LS-C54238, Life Span Biosciences, США). Неспецифичные антитела были получены фракционированием иммуноглобулинов из сыворотки нормального животного того же вида (каталожный номер INIG-IG, Innovative Research, США).
Результаты представляют собой среднее из трех независимых экспериментов, выполненных в трипликате с использованием одинаковых методик.
Статистический анализ полученных данных выполняли с помощью компьютерной программы Graphpad Prism. Отличия считались значимыми при P 0,05 по критерию Стьюдента. Результаты выражены как средние + стандартное отклонение.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 1. Действие дефензина -1 человека на жизнеспособность трипомастиготных и амастиготных форм T. cruzi in vitro 1.1. Действие дефензина -1 человека на трипомастиготные и амастиготные формы T. cruzi in vitro в культуральной среде Показано, что дефензин -1 человека обладает трипаноцидным действием на трипомастиготные формы полученные из супернатанта культуры T. cruzi, трансформированных миобластов крыс. Эффект является дозозависимым и подчиняется кинетике насыщения. Минимальная концентрация пептида, при которой наблюдалось разрушительное действие препарата, составляла 3,7 – 5,0 µM. Максимальную летальную дозу для трипомастигот в зоне насыщения составляли 30,0 µM (рис. 1, а). Антитела, специфичные к дефензину -1 человека, инактивировали его после предварительной инкубации, неспецифическая сыворотка не влияла на активность дефензина -1.
Инкубация трипомастигот с контрольным пептидом не влияла на жизнеспособность трипаносом (рис. 1, а).
а б 100 % гибели амастигот % гибели трипомастигот 75 50 25 0 3,7 5 10 15 20 25 30 35 3,7 5 10 15 20 25 30 Дефензин -1 (µM) Дефензин -1 (µM) Дефензин -1 + антитела к нему (IgG) Дефензин - Дефензин -1 + неспецифические антитела (IgG) Контрольный пептид Только культуральная среда Рис.1. Действие дефензина -1 в разных концентрациях на жизнеспособность трипомастигот (а) и амастигот (б) Дефензин -1 человека вызывал также гибель амастигот T. cruzi, причем его действие зависело от дозы препарата, а специфическая сыворотка против дефензина - нейтрализовала этот эффект. Амастиготы оказались более чувствительными к действию дефензина в концентрациях от 3,7 до 10 µM. Контрольный пептид не оказывал влияния на выживаемость амастигот (рис. 1, б).
1.2. Действие дефензина -1 человека на трипомастигот T. cruzi in vitro в крови мыши Дефензин -1 человека в концентрации 25 µМ и инкубации в течение 24 час. при 4 С также губительно действует на трипомастиготы в крови мышей in vitro. Установлено, что в этих условиях (они соответствуют условиям хранения донорских образцов в банках крови) под действием -1 дефензина -1 погибает 35%±1,8% паразитов. Контрольный пептид не действовал на трипаносомы.
2. Действие дефензина -1 человека на ультраструктуру T. сruzi 2.1. Ультраструктурные изменения мембран трипомастигот T. cruzi под действием дефензина - Экспериментально установлено, что КЦ, реагент, деполяризующий клеточную мембрану, исключал трипаноцидное действие дефензина -1 человека на трипомастиготы T. сruzi (рис. 2). Это можно объяснить тем, что деполяризованные мембраны одноклеточного паразита не могут взаимодействовать с дефензином -1, что позволяет предполагать прямое летальное действие этого препарата на клеточные мембраны T. сruzi.
Соответственно, предварительная инкубация трипомастигот с 10 µM КЦ, после которой следовала инкубация с дефензином -1, ингибировала действие последнего. Инкубация трипомастигот только с деполяризующим агентом КЦ не влияла на их жизнеспособность 100 % клеток оставались живыми (рис. 2). Как и в предыдущих экспериментах специфичные антитела нейтрализовали эффект дефензина -1, неспецифическая сыворотка не обладала такой способностью. Эти экспериментальные данные стали -1 на основой для дальнейшего исследования механизма действия дефензина ультраструктурном уровне.
Как показали сканирующая электронная микроскопия (СЭМ), нк-электронная микроскопия, нк-иммуноголд-электронная микроскопия и трансмиссионная электронная микроскопия (ТЭМ) T. cruzi, в контроле клеточные мембраны трипомастигот имели типичную структуру. Мембраны оставались интактными также при инкубации клеток с контрольным пептидом. При действии на T. cruzi 3,7 µM и 5 µM дефензина -1 в течение 1 часа наблюдалась дезорганизация клеточных мембран трипомастигот - выпячивания, прерывистость, разрывы. Эти эффекты были нивелированы в образцах, обработанных дефензином -1, который предварительно инкубировали со специфичными к нему антителами.
% живых T. cruzi survival * * К Д Д+КЦ КЦ Д+АД Д+К Ср К - контрольный пептид Д - дефензин -1 человека Д+КЦ – дефензин -1 человека + карбонил цианид m хлор-фенилгидразон (КЦ) КЦ – карбонил цианид m хлор-фенилгидразон (КЦ) Д+АД - дефензин -1 человека + антитела (IgG) к нему Д+К - дефензин -1 + неспецифические антитела (IgG) Ср – культуральная среда Рис. 2. Чувствительность трипомастигот T. сruzi к летальным дозам дефензина -1 в присутствии или отсутствии карбонил-цианид-m-хлор-фенилгидразон (КЦ), контрольного пептида, специфичных и неспецифических антител.
Использование более высоких концентраций дефензина -1 (20 µM) для инкубации с трипомастиготами в течение 1 час. приводило к полному разрушению клетки паразита и отслоению жгутика от тела клетки.
Установили также, что дефензин -1 вызывает деполяризацию цитоплазматической мембраны трипомастигот.
Факт изменения клеточной мембраны трипаносом под действием дефензина -1 и его способность формировать поры в мембранах послужили основанием для дальнейшего изучения состояния ультраструктур трипаносомной клетки, обработанной дефензином 1, для чего использовали нк-ЭМ - стандартной методики исследования мембранных пор (Bouley R., Breton S., et al., 2000).
дефензина -1 у 2.2. Формирование мембранных пор под действием трипомастигот T. cruzi Б Т В MЖ 1 µm A 1 µm Г Рис. 3. Образование пор у трипомастигот T. cruzi под действием дефензина -1. А –формирование пор вдоль мембраны жгутика: МЖ – мембрана жгутика;
Т – тело клетки паразита. Бар = 100 нм;
Б - две поры диаметром 46 нм в ундулирующей мембране;
В – слияние пор;
Г - пора диаметром 92 нм. Бары рисунков Б, В, Г = 25 нм.
Нк-ЭМ - анализ трипомастигот T. cruzi, обработанных дефензином -1, выявил образование мембранных пор (рис. 3). Дефензин -1 образует поры преимущественно в области жгутика и прилегающих участков мембраны, как показано на рис. 3 А. На более светлом участке электронограммы хорошо видны поры разного размера. На рис. 3 Б показаны поры при большем увеличении, способные сливаться друг с другом (рис. 3 В) и формировать поры еще большего диаметра (рис. 3 В, Г).
Характер встраивания дефензина -1 в клеточную мембрану трипомастигот изучили методом нк-иммуноголд ЭМ. Результаты экспериментов представлены на рисунке 4. Показано, что дефензин -1 встроен в мембрану трипомастигот в виде концентрических паттернов, приводящих в конечном счете к образованию пор или каналов.
* A Г * Частота пор (%) A’ * * 20 * * * 1010 * * * * * * * * A’’ 0 * 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Б Б”’ Б’ Б’’ Диаметр пор (нм) Д В Рис. 4. Встраивание дефензина -1 в мембрану трипомастигот с образованием концентрических фигур (А):
А’- встраивание дефензина -1 в мембрану через 15 мин. взаимодействия с клеткой;
А”- мембрана трипомастиготы после действия к дефензина -1, обработанного антителами к нему;
Б – связывание дефензина -1 с мембранами трипаносом после взаимодействия пептида, обработанного неспецифической сывороткой: Б’, Б’’, Б’’’ - участки связывания различного диаметра через 15 мин взаимодействия;
В мембранные поры через 30 мин. взаимодействия;
Д - через 1 час взаимодействия. Бары = 0,1 мкм. Г - частота встречаемости пор различного диаметра под действием дефензина -1 в дозе 3,7 µM в течение 1 часа: 1 - 3. мкм, 2 - 6.0 мкм, 3 - 10-19 мкм, 4 - 20-29 мкм, 5 - 30-39 мкм;
6 - 40-49 мкм, 7 - 50-59 мкм, 8 - 60-69 мкм, 9 70-79 мкм;
10 - 90-190 мкм.
Статистически значимые отличия обнаружены между группами, маркированными двумя звездочками, а также между группами с 2 и 1 звездочкой (P0,05).
Негативное контрастирование трипомастигот, обработанных козьими антителами к - дефензину с последующей инкубацией с антикозьими антителами, конъюгированными с коллоидным золотом, позволило обнаружить концентрические паттерны дефензина -1, встроенного в клеточную мембрану. Отсутствие окрашивания в контроле свидетельствует о его специфичности (рис. 4 А’’). Данные, представленные на рис. 4 Б, показывают концентрический или круговой характер взаимного расположения дефензина -1 в мембране. Эти круги, образующиеся уже через 15 мин. после начала инкубации, могут иметь различный диаметр в зависимости от времени действия дефензина (панели Б’, Б’’ Б’’’). Соответственно, поры на панели Б’ имеют диаметр 56, нм, на панели Б’’ – 142,0 нм, на панели Б’’’ 126,0 нм. На рис. 4 В показаны промежуточные поры после 30 мин. инкубации с дефензином -1. Рис. 4 Д иллюстрирует более поздние поры, образующиеся после 1 часа инкубации. На рис. 4 Г суммировано распределение частот встречаемости пор различного диаметра после 1 часа экспозиции с дефензином -1. Самые высокие частоты встречаемости определены для пор с диаметром 10-39 нм (75%), более низкая встречаемость у пор с диаметром 3-6, 40-190 нм (25%).
2.3. Изменения внутриклеточной ультраструктуры трипомастигот T. cruzi под действием дефензина - Изучение трипомастигот с помощью ТЭМ показало, что при обработке - трипомастигот дефензина наблюдались изменения ультраструктур 15 µM пропорционально с увеличением времени инкубации.
Как видно на рис. 5 В, после 15 мин. инкубации с дефензином наряду с изменениями плазматической мембраны (прерывистость, потеря участков - обозначены стрелками) происходило разрушение подмембранных микротрубочек (обозначено концами стрелок), набухание митохондрии и изменения митохондриальных мембран (показаны звездочкой) в сравнении с нормальными трипомастиготами, которые инкубировали в клеточной среде (рис. 5 В’). В жгутиковой мембране появлялось больше электронно-плотных участков (показаны концами стрелок на рис. 5 Г) в сравнении с контролем (рис. 5 Г’).
Инкубация трипомастигот с 15 µM контрольным пептидом не оказывала никакого действия на паразита (рис. 5 А). Антитела к дефензину -1 полностью нейтрализовали разрушительный эффект (рис. 5 Б). На рис. 5 Д видны цитоплазматические вакуоли, образовавшиеся после 30 мин. инкубации с 15 µM дефензином -1, отсутствующие при инкубации трипаносом без последнего (рис. 5 Д’). Некоторые вакуоли располагались очень близко друг к другу (показаны звездочками на рис. 5 Д). Через 45 мин. экспозиции с дефензином -1 все вакуоли сливались и формировали одну большую вакуоль (рис. 5 Е), таких вакуолей в контроле не было (рис. 5 Е’). После 1 часа инкубации трипаносомные клетки разрушались и не содержали различимых клеточных органелл (рис. 5 Ж) в отличие от нормальной клеточной структуры (рис. 5 Ж’).
Рис. 5. Ультраструктурные изменения трипомастигот T. сruzi под действием дефензина -1. А трипомастигота после инкубации с 15 µМ контрольного пептида в течение 1 часа;
Б - трипомастигота после инкубации с 15 µМ дефензина -1, предварительно обработанного специфичными антителами в течение часа;
В - трипомастигота после инкубации с 15 µМ дефензина -1 в течение 15 мин. (клеточная мембрана деструктурирована, набухшая митохондрия -*). Стрелки указывают на участки с отсутствующей клеточной мембраной, концами стрелок обозначены мембранные микротрубочки. В’ – митохондрия и микротрубочки трипомастиготы в культуральной среде (контроль): концами стрелок обозначены мембранные микротрубочки, * - нормальные митохондриальные мембраны;
Г - нарушение жгутиковой мембраны (концы стрелок указывают на деструктурированные участки мембраны). Г’ – жгутик трипомастигот в культуральной среде. Д - цитоплазматические вакуоли после 30 мин. инкубации с дефензином -1 (указаны звездочками). Д’ - цитоплазма трипомастиготы в контроле (в культуральной среде). Е декомпартментализация внутриклеточных мембран после 45 мин. инкубации с дефензином -1. Е’ трипомастигота в контроле. Ж - разрушение трипомастиготы через 1 час после инкубации с дефензином - (Е – жгутик). Ж’- трипомастиготы в нормальных условиях. Бары в панелях А, Б, Е, Е’, Ж, Ж’ = 0,5 мкм;
бары в панелях В, В’, Г, Г’, Д, Д’ = 0,1 мкм.
2.4. Распределение дефензина -1 в клетках трипомастигот T. cruzi Для изучения распределения дефензина -1 в трипаносомной клетке использовали иммуноголд ТЭМ.
Результаты, представленные на рис. 6 показали, что дефензин -1 появляется в цитоплазме паразитарной клетки и в ее органеллах на ранних стадиях экспозиции и обнаруживается там уже через 15 мин. воздействия, когда разрушительный эффект еще мало различим, но появляются поры в цитоплазматических мембранах трипомастигот.
Внутри клеток дефензин -1 обнаруживался в цитоплазме, ядре, и кинетопласте через и 60 мин. инкубации (рис. 6 А, Б, В, Г), что соответствовало степени его трипаноцидного эффекта.
A Б В kДНК кДНК Я Я K Г Рис. 6. Распределение дефензина -1 в клетках трипомастигот T. сruzi: А - диффузное распределение µM дефензина -1 по всей цитоплазме через 15 мин. воздействия (стрелкой указана кДНК, Я – ядро;
бар = 500нм). Б - локализации дефензина -1 в местах деструктивных изменений цитоплазмы через 30 мин.
воздействия (бар = 100нм). Г – дефензин -1 в кинетопласте через 30 мин. экспозиции (К – кинетопласт;
бар = 250нм). В - дефензин -1 в клетке через 1 час экспозиции, клетка значительно повреждена (стрелкой указан кинетопласт, Я – ядро;
бар = 500нм).
3. Действие дефензина -1 на ДНК трипомастигот T. сruzi Как показал TUNEL-анализ, дефензин -1 человека в концентрации 10 µM индуцирует разрушение ДНК трипомастигот T. сruzi. Через 5 мин. экспозиции ДНК подвергается фрагментации, что видно из графика проточной цитометрии (FACS) на рис.
7 А. В качестве позитивного контроля использовали экзогенную ДНКазу, которая также фрагментировала ДНК (рис. 7 А).
А Позитивные клетки Интенсивность флюоресценции Б ДНКаза Дефензин Культуральная среда Дефензин + антитела Рис. 7. TUNEL-анализ. Фрагментация ДНК трипомастигот T. сruzi, обработанных дефензином -1. А анализ позитивных клеток проточной цитометрией (FACS);
Б - флюоресцентная микроскопия трипомастигот.
a - трипомастиготы после обработки ДНКазой (контроль);
b - трипомастиготы после инкубации с дефензином -1;
с - трипомастиготы при инкубации в культуральной среде;
d - трипомастиготы после инкубации с дефензином -1, обработанным нейтрализующими антителами.
-1, Дефензин обработанный специфичными антителами, не вызывал фрагментации ДНК, а неспецифические антитела также не влияли на его активность. В культуральной среде, содержащиеся сами по себе трипомастиготы также не образовывали фрагментированной ДНК А). Под люминесцентным микроскопом (рис. флуоресцирующие фрагменты ДНК были обнаружены как в ядре, так и в кинетопласте (рис. 7 Б, панель б). Обработка трипомастигот ДНКазой (позитивный контроль), вызывала сходную фрагментацию ДНК ядра и кинетопласта паразитов (рис. 7 Б, панель а). При просмотре трипомастигот в клеточной среде без дефензина (рис. 7 Б, панель с) или с дефензином -1, обработанным нейтрализующими специфичными антителами (рис. 7 Б, панель д) флюоресценции не наблюдалось, что свидетельствует об отсутствии фрагментации ДНК или неспецифичности эффекта.
Приведенные результаты показали, что дефензин -1 индуцирует фрагментацию ДНК у 94% + 2% трипонасом, что соответствует эффекту экзогенной ДНКазы. Данные демонстрируют, способность дефензина -1 выступать индуктором фрагментации ДНК ядра и кинетопласта T. cruzi.
4. Действие дефензина -1 на инвазивную активность T. сruzi A Б % инфицированных клеток количество T. сruzi на клеток HeLa 0 2 2 Время (ч) Время (ч) Культ. среда Дефензин + антитела (IgG) Контрольный Дефензин + неспецифич. IgG пептид Дефензин Рис. 8. Влияние преинкубации трипомастигот T. сruzi на их инвазивную способность: А - снижение числа трипомастигот на 200 культивируемых опухолевых клеток HeLa при преинкубации паразитов с 3,7 µM дефензина -1 по сравнению с контролями;
Б – Снижение доли инфицированных культивируемых опухолевых клеток HeLa после преинкубации трипомастигот с 3,7 µM дефензина -1 по сравнению с контролями.
Поскольку в предыдущих экспериментах было обнаружено, что сублетальные дозы дефензина -1 вызывают изменения клеточной мембраны трипаносом, мы исследовали влияние дефензина -1 на способность трипомастигот проникать в культивируемые эукариотические клетки варианта HeLa.
Для изучения свойства ингибировать инфекцию трипомастиготы T. сruzi преинкубировались с сублетальными дозами дефензина -1 (3,7 µM), после чего паразиты добавлялись к монослою культуры клеток HeLa.
Было установлено, что обработка трипомастигот дефензином -1 значительно снижает связывание паразитов с клеткой-хозяином и проникновение в нее через 2, 24, 48 и 72 часа после заражения клеточной культуры, о чем свидетельствует снижение доли инфицированных клеток по сравнению с контролями с 60% до 10%. Это также подтверждается достоверно меньшим количеством трипаносом в трансформированных клетках и их замедленным размножением в те же промежутки эксперимента (рис. 8 А, Б).
Данный эффект нивелировался только антителами к дефензину -1.
В работе впервые исследована активность дефензина -1 человека против трипомастиготной и амастиготной форм T. сruzi. Установлено, что механизм этого действия связан с образованием мембранных пор и фрагментацией геномной ДНК паразита, что приводит к его гибели. Были обнаружены нарушения внутриклеточных органелл. Сублетальная доза дефензина -1 человека вызывала снижение инвазивной способности трипомастигот. Таким образом, показано, что дефензин -1 человека обладает трипаноцидными свойствами и является важным компонентом неспецифической защиты клеток хозяина от заражения T. cruzi.
Рядом авторов показано, что дефензины проявляют активность против широкого спектра микроорганизмов – вирусов, бактерий, грибов (Lehrer R.I., 1993). Относительно трипаносом, выявлено действие дефензина -1 мышей на проциклические формы Trypanosoma brucei и против кровяных форм возбудителей африканского трипаносомоза (McGwire B.S., 2003). Чувствительность к дефензину -1 была описана также для Giardia lamblia (Aley S.B., Zimmerman M., et al., 1994). Однако механизмы этого действия не исследовались.
Современные модели механизма взаимодействия дефензинов с мембранами основаны на использовании липидных бислоев как модели изучения электростатических отношений между катионными группами дефензинов и анионными фосфолипидными группами (Ganz T., 2003, Lourenzoni M.R., 2007). Эти исследования позволяют предполагать, что дефензины абсорбируются на поверхности мембраны и пересекают синтетическую мембрану как мономеры или димеры в зависимости от заряда и электростатического потенциала, а разрушение целостности мембраны может происходить в результате образования пор.
Результаты данной работы показали, что трипаноцидная активность дефензина - полностью ингибирована цианид – m- хлор-фенилгидразоном (КЦ), что поддерживает эту гипотезу. Эффект деполяризации мембраны КЦ и инактивации дефензина -1 говорит о том, что активность последнего инициируется на плазматической мембране трипомастигот.
Нарушения мембран, а также фрагментация ДНК (Deschesnes R.G., Huot J., et al., 2001), а в более современных публикациях – образование пор, являются признаками апоптоза (Sugiyama T., Kobayashi M., et al., 2004, Zhang C., Xu Y., et al., 1998).
Показанные факты образования пор, нарушений мембран и фрагментации ядерной ДНК и ДНК кинетопласта в трипаносомах под воздействием дефензина -1 дают основание предположить, что он индуцирует апоптоз в трипомастиготах T. сruzi, приводя тем самым к их клеточной смерти. Наши наблюдения за появлением дефензина -1 в кинетопласте и в ядре подтверждают гипотезу об индукции фрагментации ДНК в ядре и кинетопласте при проникновении в них дефензина -1 человека.
Чувствительность трипомастиготных форм T. сruzi, характерных для кровяного русла, к дефензину -1 человека может послужить основой для новых подходов к поиску средств профилактики и лечения болезни Шагаса. Трипаноцидный эффект дефензина - in vitro предполагает возможность использования его также для нейтрализации T. cruzi в образцах готовой продукции, хранящихся в банках крови.
ВЫВОДЫ 1. Дефензин -1 человека обладает трипаноцидными свойствами против трипомастиготных и амастиготных форм T. cruzi in vitro.
2. Дефензин -1 вызывает образование пор и нарушения в клеточных мембранах T. cruzi.
3. Действие дефензина -1 приводит к нарушениям внутриклеточных ультраструктур и гибели трипомастигот T. cruzi.
4. Дефензин -1 вызывает фрагментацию ДНК ядра и кинетопласта трипомастигот T.
cruzi.
5. Дефензин -1 ограничивает инвазивные свойства T. cruzi.
СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Kleshchenko Y.Y., Madison M.N., Simmons K.N., Nde P.N., Lima M.F., and Villalta F. 2006.
Trypanosoma cruzi regulates TLR9 to mediate an increase of defensin -1 expression and secretion to kill invasive trypanosomes. Journal of Immunology 176: S67.
Kleshchenko Y.Y., Madison M.N., Nde P.N., Simmons K.N., Lima M.F., and Villalta F. 2006.
Defensin -1 expression is up-regulated in human cells in response to early Trypanosoma cruzi infection as a trypocidal mechanism to decrease cellular infection. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 75: A689.
Madison M.N. *, Kleshchenko Y.Y. *, Nde P.N., Simmons K.J., Lima M.F., and Villalta F.
2007. Human defensin -1 causes Trypanosoma cruzi membrane pore formation and induces DNA fragmentation, which leads to trypanosome destruction. Infection and Immunity. 75:
4780-4791. (*equal contributors).
Madison M.N., Kleshchenko Y.Y., Nde P.N., Simmons K.J., Lima M.F., and Villalta F. 2007.
Defensin -1 is upregulated in human cells in response to early Trypanosoma cruzi infection as an apoptotic trypanocidal mechanism. FASEB Journal. 21:250.10.
Madison M.N., Kleshchenko Y.Y., Nde P.N., Simmons K.J., Lima M.F., and Villalta F. 2007.
Defensin -1 expression is up-regulated in human cells in response to early Trypanosoma cruzi infection as an innate immune mechanism to decrease cellular infection via membrane pore formation leading to apoptosis. Journal of Immunology. Vol.178: S51.6.
Madison M.N., Kleshchenko Y.Y., Nde P.N., Simmons K.J., Lima M.F., and Villalta F. 2008.
Human defensin -1 causes Trypanosoma cruzi membrane pore formation and induces DNA fragmentation, which leads to trypanosome destruction. FASEB Journal. 22: 674.1.
Клещенко Ю.Е., Карпенко Л.П., Виллалта Ф.В. 2010. Действие дефензина -1 человека на трипомастиготы Trypanosoma cruzi in vitro. БЭБМ, 6:
Kleshchenko Yulia Yevgenievna The action of Human Defensin a-1 on Trypanosoma cruzi trypomastigotes and amastigotes in vitro Here we show that human defensin a-1 displays a trypanocidal role against Trypanosoma cruzi, the causative agent of Chagas’ disease. The mechanism of human defensin a-1 toxicity on T. cruzi is mediated by membrane pore formation leading to apoptosis. Exposure of defensin a- to infective trypomastigote forms of T. cruzi significantly reduced parasite viability. Electron microscopic analysis of trypomastigotes upon short exposure to defensin a-1 revealed pore formation in the cellular and flagellar membranes, membrane disorganization, cytoplasmic vacuolization and membrane blebbing, a hallmark of apoptosis. Defensin a-1 rapidly induced DNA degradation in the trypanosome. Thus, human defensin a -1 is an innate immune molecule that causes severe toxicity to T. cruzi and plays an important role in reducing cellular infection.
Клещенко Юлия Евгеньевна Действие дефензина a-1 человека на трипомастиготы и амастиготы Trypanosoma cruzi in vitro В работе представлены исследования по действию дефензина a-1 человека на T.
сruzi in vitro. Показано, что трипаноцидный эффект пептида связан с образованием мембранных пор, нарушениями цитоплазматической мембраны и внутриклеточных органелл, а также фрагментацией геномной ДНК паразита. В экспериментах на клетках HeLa показано, что дефензин a-1 ограничивает инвазивную способность трипомастигот.
Таким образом, установлено, что дефензин a-1 человека является важным компонентом неспецифической защиты клеток хозяина от заражения T. cruzi. Чувствительность кровяных трипомастиготных форм T. сruzi к дефензину a-1 человека может послужить основой для новых подходов к поиску средств профилактики и лечения американского трипаносомоза и предполагает возможность использования его также для нейтрализации T. cruzi в образцах готовой продукции, хранящихся в банках крови.