Генетики и цитологии национальной академии наук беларуси удк 577.21: 632.3.01 валентович леонид николаевич молекулярно-биологическая характеристика dsp-оперона фитопатогенных бактерий erwinia carotovo

ГОСУДАРСТВЕННОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И ЦИТОЛОГИИ НАЦИОНАЛЬНОЙ АКАДЕМИИ НАУК БЕЛАРУСИ» УДК 577.21: 632.3.01 ВАЛЕНТОВИЧ Леонид Николаевич МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА DSP-ОПЕРОНА ФИТОПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ ERWINIA CAROTOVORA Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.26 – молекулярная генетика Минск – 2010 Работа выполнена на кафедре молекулярной биологии Белорусского государственного университета Научный руководитель: Николайчик Евгений Артурович, кандидат биологических наук, доцент кафедры молекулярной биологии Белорусского государственного университета.

Официальные оппоненты: Картель Николай Александрович, доктор биологических наук, профессор, академик НАН Беларуси, заведующий лабораторией молекулярной генетики ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси».

Белясова Наталья Александровна, кандидат биологических наук, доцент кафедры биотехнологии и биоэкологии УО «Белорусский государственный технологический университет».

Оппонирующая организация: ГНУ «Институт биофизики и клеточной инженерии НАН Беларуси» Защита состоится « 4 » марта 2010 г. в 14 часов на заседании совета по защите диссертаций Д 01.31.01 при ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси» по адресу: 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27.

Тел. 284-19-45, факс (017) 284-19-17, e-mail: [email protected] С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси».

Автореферат разослан «_» _ 2010 г.

Ученый секретарь совета по защите диссертаций, кандидат биологических наук Н.И. Дубовец ВВЕДЕНИЕ Erwinia carotovora (Eca) – фитопатогенный микроорганизм, широко распространенный в умеренной климатической зоне, который вызывает заболевание «черная ножка» у различных сортов картофеля, чем наносит значительный ущерб сельскому хозяйству.

Специфичность данного патогена является с одной стороны следствием наличия у Eca определенного набора экзоферментов, секретируемых для разрушения клеточных стенок и срединных пластинок растительных тканей, а с другой стороны – работой бактериальной системы секреции третьего типа (ССТТ).

ССТТ имеется у многих грамотрицательных патогенов животных и растений. С ее помощью бактерии транслоцируют «эффекторные» белки непосредственно в цитоплазму клеток хозяина или секретируют «хелперные» белки во внешнюю среду как вспомогательные компоненты транслокации. Роль эффекторов сводится к блокированию части сигнальных каскадов либо нарушению транскрипции в клетке хозяина, связанной с ответом на внедрение патогена. Имеется еще одна часть системы, которая служит промежуточным звеном между «эффекторными» и «хелперными» белками – это секреторные шапероны, предполагаемой функцией которых является доставка субстрата секреции к белкам секреторного аппарата в компетентном для секреции состоянии, а также регуляция работы систем секреции.

У фитопатогенов ССТТ кодируется генами hrp (hypersensitive response and pathogenicity) и hrc (hrp conserved), которые вовлечены и в развитие заболевания, и в индукцию защитных реакций растения.

Среди эрвиний наиболее изучена ССТТ у E. amylovora – некрогенного фитопатогена, вызывающего заболевание «бактериальный ожог плодовых».

Для этой бактерии описано два эффекторных белка – DspE/A, болезнеспецифический белок, взаимодействующий с растительными рецепторными киназами и ингибирующий защиту растения, и EopB – белок, играющий роль в вирулентности при инфекции яблонь. В 1994 году было показано наличие hrp-генов у E. chrysanthemi, немного позднее и у E.

carotovora subsp. carotovora был идентифицирован ген hrpN, и показана его роль в индукции реакции гиперчувствительности (РГ) на растениях табака.

Дальнейшее изучение hrp-кластера Erwinia spp. подтвердило важную роль ССТТ в инфекционном процессе. Однако до сих пор, несмотря на значительные достижения в изучении работы ССТТ, остается много неясного в общей системе взаимодействия «патоген-хозяин», что мешает разработке научно обоснованных мер борьбы с патогенами.

Выяснение роли белков – субстратов ССТТ и их шаперонов в патогенезе необходимо для разработки препаратов биологической защиты растений от фитопатогенов, действие которых основано на индукции системной устойчивости и создания устойчивых трансгенных растений. Изучение ССТТ открывает перспективы для создания продуцентов, секретирующих биотехнологически ценные гетерологичные белки.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Связь работы с крупными научными программами (проектами) и темами. Данная работа осуществлялись в рамках следующих научных программ и тем:

1. «Осуществление молекулярного клонирования, сиквенирования и анализ области hrp-hrc генов бактерий Erwinia carotovora, отвечающих за взаимодействие с растениями для выявления аvr-генов», 2002-2006 г.г., (№ ГР 20023726, задание 17.12 ГП «Разработка и использование генно-инженерных биотехнологий в интересах сельского хозяйства и медицины»).

2. «Роль хелперных компонентов системы секреции III типа фитопатогенных бактерий Erwinia carotovora в транслокации белков вирулентности в клетки растений», 2005-2007 г.г., (№ ГР 20052344, договор с БРФФИ Б05-238).

3. «Идентификация R-генов растений и исследование их взаимодействия с Avr-белками фитопатогенов», 2006-2010 г.г., (№ ГР 20063192, задание ГКПНИ «Биологическая инженерия и биобезопасность» ).

Тематика работы соответствует следующим разделам приоритетных направлений фундаментальных и прикладных научных исследований в Республике Беларусь на 2006-2010 годы: 3.8. «геномика растений и животных, исследование генетических, физиологических и биохимических механизмов формирования их продуктивности и устойчивости», 3.10. «молекулярная биология, биофизика регуляторных процессов и протеомика» постановления Совета Министров Республике Беларусь №512 от 10.05.2005.

Цель и задачи исследования. Целью диссертационной работы являлась идентификация генов эффекторных белков ССТТ бактерий Eca, контролирующих взаимодействие фитопатогена с растением-хозяином, а также определение роли секреторных шаперонов в работе системы секреции III типа.

Для достижения этой цели были поставлены и решались следующие задачи:

- произвести поиск генов у бактерий Eca, кодирующих эффекторные белки ССТТ;

- проанализировать фенотипические проявления мутаций в генах Eca, кодирующих эффекторные белки ССТТ;

- клонировать и определить нуклеотидную последовательность генов эффекторных белков ССТТ бактерий Eca;

- изучить влияние секреторных шаперонов на стабильность и секрецию эффекторов ССТТ бактерий Eca.

Объектом исследования служили бактерии Erwinia carotovora – фитопатогенные микроорганизмы, вызывающие заболевание «черная ножка» картофеля. Предмет исследования – механизм взаимодействия бактерий Eca с растениями на уровне эффекторных молекул, а также функции секреторных шаперонов ССТТ.

Положения, выносимые на защиту.

- Геном бактерий Erwinia carotovora 3-2 содержит эффекторный локус, состоящий из дивергентно транскрибируемых оперонов dspEF и hrpWshcW.

- Продукт гена dspE бактерий Erwinia carotovora 3-2 – Avr-белок, являющийся основным индуктором реакции гиперчувствительности у растений семейства пасленовых при их контакте с вирулентными бактериями Erwinia carotovora 3-2.

- Белок DspF бактерий Erwinia carotovora 3-2 является DspE специфичным шапероном, выполняющим регуляторную функцию в процессе секреции эффекторных белков.

Личный вклад соискателя. Основная часть материалов, лежащих в основе данной работы, получена лично автором на кафедре молекулярной биологии, некоторые экспериментальные данные получены совместно с научным руководителем.

Автор выражает благодарность всем, кто оказывал содействие при выполнении работы: заведующему кафедрой молекулярной биологии БГУ, д.б.н. Евтушенкову А. Н. за разностороннюю помощь в выполнении работы;

доценту кафедры микробиологии БГУ, к.б.н. Мямину В. Е. за методическую помощь в молекулярно-биологической части исследований, а также за критические замечания при прочтении диссертации;

старшему преподавателю кафедры биохимии БГУ, к.б.н. Губич О. И. за трудоемкие и опасные измерения количества цАМФ радиоиммунологическим методом;

аспиранту Кардиффского университета Голику А. З. за спонсорскую помощь;

Ph.D. Овчинниковой Т. В.

за помощь в постановках опытов при изучении транслокации химерных белков;

доценту кафедры молекулярной биологии, к.б.н. Лагоненко А. Л. за обсуждение результатов.

Апробация результатов диссертации. Результаты диссертации апробированы на Международной научно-практической конференции "Перспективы и проблемы развития биотехнологии в рамках единого экономического пространства стран содружества" (Нарочь, 2005);

Международной конференции "Фитопатогенные бактерии. Фитонцидология.

Аллелопатия" (Киев, 2005);

Международной научной конференции "Современные проблемы генетики" (Минск, 2005);

II международном симпозиуме "Сигнальные системы клеток растений: роль в адаптации и иммунитете" (Казань, 2006);

Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics, dedicated to 120th anniversary of M.I.

Vavilov (Kyiv, 2007).

Опубликованность результатов диссертации. По теме диссертации опубликовано 20 научных работ, из них 7 статей в научных журналах, соответствующих пункту 18 Положения о присуждении ученых степеней и присвоении ученых званий в Республике Беларусь (общее количество авторских листов составляет 3,9), материалов или тезисов докладов выступлений на конференциях – 13.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, общей характеристики работы, трех глав, заключения, списка использованных источников и двух приложений. Полный объем диссертации составляет страниц, таблиц – 6, рисунков – 32. Список цитируемой литературы включает 132 библиографических источника.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследований В работе использованы штаммы-производные бактерий E. carotovora 3- (прототроф, Rifr): JN42 (3-2 Rifr, Cmr (Tn9)), TA5 (JN42 hrpL:: Sp/Sm), HW (JN42 hrpW::Sp/Sm), JN501 (JN42 hrpJ::Sp/Sm) из коллекции кафедры молекулярной биологии БГУ;

сконструированные штаммы E. carotovora VKE (JN42 dspE::pJP5603), VKEF (JN42 dspE::pJP5603, dspF::Sp/Sm). В работе также использовали бактерии E. coli BW19851 и XL1-Blue. Бактерии выращивали в жидкой и на агаризованной среде LB, на среде Миллера A с нормальной (18 мМ) или лимитированной (5 мМ) концентрацией азота.

Выделение плазмидной и хромосомной ДНК, операции с ДНК, трансформацию и электропорацию бактерий плазмидной ДНК, полимеразную цепную реакцию, электрофорез в агарозном геле ДНК и в акриламидном геле белков, иммуноблоттинг проводили согласно стандартным методикам [Ausubel, F.M. et al., 2003]. Рестрикция, лигирование, дефосфорилирование ДНК, а также достраивание липких концов ДНК проводились согласно протоколам фирм производителей (New England Biolabs, MBI Fermentas).

Секвенирование участков ДНК проводили методом терминации цепи по Сэнгеру [Sanger, Nicklen, and Coulson, 1977] в термоциклической реакции с наборами реактивов ALFexpress AutoRead Sequencing Kit (Amersham Pharmacia Biotech) или CycleReader™ Auto DNA Sequencing Kit (MBI Fermentas), следуя протоколам фирм производителей. Для анализа продуктов реакции использовали автоматический ДНК-анализатор ALFexpress II (Amersham Pharmacia Biotech) с соответствующим программным обеспечением (ALFwin 2.11).

Дальний вестерн-блоттинг проводился согласно методике, описанной Randy A. Hall (2004).

Исследование реакции гиперчувствительности проводили на растениях табака (Nicotiana tabacum), перца (Capsicum annuum), петунии (Petunia hybrida), баклажанов (Solanum melongena), томатов (Solanum lycopersicum) и бобов (Vicia faba) согласно методике, описанной в статье [Николайчик и др., 2005].

Определение активности аденилатциклазы в растительных тканях проводилось согласно методике, описанной в статье [Николайчик и др., 2005].

Поиск в нуклеотидных и белковых базах данных NCBI осуществлялся с помощью программ из пакета BLAST 2.2.20. Функциональный анализ белков осуществлялся с помощью программы InterProScan (Version 4.4). Поиск промоторных последовательностей для основного сигма-фактора осуществлялся с помощью программы BPROM (Softberry Inc.). Анализ субклеточной локализации белков проводился с помощью программы ProtComp Version 8.0 (Softberry Inc.). Поиск терминаторных структур в нуклеотидных последовательностях осуществлялся с помощью программы FindTerm Version 2.8 (Softberry Inc.). Для предсказания вторичной структуры белка использовалась программа GOR4. Выравнивание нуклеотидных последовательностей проводили с помощью алгоритма Нидельмана-Вунша [Needleman and Wunsch, 1970], реализованного в программе ApE 1.16.

Статистическая обработка результатов экспериментов проводилась с помощью программного обеспечения Microsoft Excel.

Молекулярная организация dsp-оперона Erwinia carotovora С целью изучения молекулярной организации dsp-оперона было клонировано несколько соответствующих перекрывающихся фрагментов хромосомной ДНК Eca, а также произведено определение их нуклеотидной последовательности. При клонировании были применены следующие подходы:

– амплификация методом ПЦР с помощью специально рассчитанных праймеров фрагментов хромосомной ДНК Eca JN42 и клонирование их в векторе pUC18/19.

– рестрикция хромосомной ДНК из штаммов Eca (HW1, VKE), содержащей генетические маркеры (Sp/Sm, kan (pJP5603)) вблизи dsp-оперона или непосредственно в нем, лигирование фрагментов в pUC18/19 (или pK18, pBluescript II KS), и последующий отбор клонов с плазмидами, несущими маркерные гены. В дальнейшем был осуществлен ряд субклонирований, позволивший получить более десятка плазмид с фрагментами кластера и секвенировать исследуемую область (hrp-dsp-кластер) хромосомной ДНК протяженностью около 8,5 т.н.п. (рисунок 1).

Рисунок 1 – Генетическая карта секвенированного локуса хромосомы Eca Идентичность полученной нуклеотидной последовательности составила 85% (7203 н.п. из 8426 н.п.) по сравнению с последовательностью Erwinia carotovora subsp. atroseptica SCRI1043, что позволило использовать ранее аннотированную последовательность шотландского штамма как шаблон для реконструкции hrp-dsp-кластера Eca JN42. Данный кластер имеет содержание G-C пар, равное 55%, – это существенно выше, чем в среднем по геному Eca SCRI1043 (50,97%), что указывает на возможное расположение hrp-dsp кластера в пределах «острова патогенности» [Hacker and Kaper, 2000].

В дальнейшем в пределах полученной нуклеотидной последовательности был проведен поиск возможных кодирующих рамок считывания, что позволило выявить 5 предполагаемых открытых рамок считывания (ОРС). Данные рамки считывания были сопоставлены с аннотированными локусами штамма SCRI1043 и названы так же, как и соответствующие им гомологи – Eca2109, Eca2110, Eca2111 (shcW), hrpW, dspE, dspF, Eca2115.

Перед ОРС Eca2111 есть промоторные последовательности -10 и -35 для основного сигма-фактора 70 и последовательность Шайн-Дальгарно, однако старт-кодон (ATG) ОРС Eca2111 следует непосредственно за стоп-кодоном гена hrpW, что подразумевает возможность сопряженной трансляции с промотора, предшествующего гену hrpW. На расстоянии 28 н.п. после стоп кодона ОРС Eca2111 (TAA) локализуется последовательность -независимого терминатора. ОРС Eca2111 кодирует небольшой белок (107 а. о.) со следующими расчетными характеристиками: молекулярная масса – 12,102 кДa, pI 6,39.

Ген hrpW находится под контролем сигма-фактора HrpL, о чем свидетельствует наличие характерных промоторных последовательностей -10 и -35 (GGAACC и TCACTTA). Последовательность Шайн-Дальгарно также присутствует. Ген hrpW кодирует белок (490 а. о.) со следующими расчетными характеристиками: молекулярная масса – 47,4995 кДa, pI 4,53.

Ген dspE находится под контролем сигма-фактора HrpL, о чем свидетельствует наличие характерных промоторных последовательностей -10 и -35. Ген dspE кодирует белок (1627 а. о.) со следующими расчетными характеристиками: молекулярная масса – 173,409 кДa, pI 6,3. Идентичность аминокислотной последовательности в сравнении со штаммом Eca SCRI составляет 89% – 1444 а. о. из 1618 а. о. (идентичность нуклеотидной последовательности 85% – 4240 из 4935 н.п.). Белок DspE имеет наибольшее сходство с белком DspE из Erwinia chrysanthemi 3937 (1625 а. о.;

идентичность 41% (703 из 1676 а. о.)).

Перед кодирующей последовательностью гена dspF у Eca не удалось найти никакой промоторной последовательности, но есть последовательность Шайн-Дальгарно (AGGAG), что свидетельствует в пользу сопряженной экспрессии генов dspE и dspF, осуществляемой с общего промотора, расположенного перед dspE. Ген dspF кодирует белок (140 а. о.) со следующими расчетными характеристиками: молекулярная масса – 15,55 кДa, pI 5,75. Идентичность аминокислотной последовательности в сравнении со штаммом Eca SCRI1043 составляет 87% – 122 из 140 а. о. (нуклеотидной последовательности – 84%, 358 из 426 н.п.). Белок DspF имеет наибольшее сходство с белком DspF из Erwinia pyrifoliae (EMBL: AAS45451;

139 а. о.;

идентичность 46% (60 из 130 а. о.)), а также с DspB из Erwinia amylovora (EMBL: CAA74157;

139 а. о.;

идентичность 45% (61 из 133 а. о.)). Большинство найденных белков аннотированы в базах данных как «шаперон ССТТ».

Характеристика белка DspE Erwinia carotovora Для анализа роли DspE бактерий Eca в индукции РГ на растениях семейства Solanaceae был сконструирован инсерционный мутант по кодирующему этот белок гену (штамм VKE).

Инокуляция суспензий клеток штамма Eca дикого типа в листья многих растений, не являющихся для этих бактерий хозяевами, приводит к развитию реакции гиперчувствительности. Штамм Eca 3-2, производными которого являются все использованные в этой работе штаммы Erwinia, дает очень четкие симптомы РГ на листьях растений семейства пасленовых уже через несколько часов после инокуляции. Штамм же VKE, мутантный по гену dspE, оказался практически полностью лишенным этой способности (рисунок 2). И только при использовании суспензий высокой плотности симптомы РГ были заметны через сутки после заражения (рисунок 2 А-B).

Также наблюдается некоторая видоспецифичность: РГ на листьях перца при инокуляции суспензии штамма VKE все же развивается, но примерно на сутки позже по сравнению со штаммом дикого типа. Такой эффект инактивации гена dspE свидетельствует в пользу того, что его продукт является основным (но, скорее всего, не единственным) индуктором РГ при контакте бактерий Eca с растениями табака. В то же время на растениях бобов отличия РГ-индуцирующей способности мутантных бактерий от таковой клеток штамма дикого типа были выявлены только в очень узком диапазоне концентраций клеточных суспензий: снижение интенсивности РГ, индуцированной штаммом VKE, было отмечено в нескольких экспериментах при использовании концентраций клеточных суспензий 109 клеток в 1 мл, тогда как при использовании суспензий с плотностью 3108 клеток в 1 мл РГ не развивалась вообще, а при плотности 3109 клеток в 1 мл РГ индуцировалась одинаково успешно как штаммом дикого типа, так и его dspE-мутантом, из чего можно заключить, что бактерии Eca синтезируют как минимум еще один индуктор РГ.

То, что dspE нужен для индукции РГ бактериями Eca у одних растений и не нужен у других, свидетельствует в пользу того, что этот ген кодирует белок авирулентности.

Плотность суспензий бактерий при инокуляции в листья Petunia x hybrida – 109 клеток/мл, Capsicum annuum – 7,4108 клеток/мл, Solanum melongena – 7,4108 клеток/мл, Vicia faba – 1,54109 клеток/мл и Nicotiana tabacum – 109 клеток/мл (А);

6,6109 клеток/мл (В).

Фотографии сделаны через 24 часа после инокуляции в листья.

Рисунок 2 – Индукция реакции гиперчувствительности суспензиями клеток штаммов Erwinia carotovora JN42 и VKE На следующем этапе была изучена способность химерных белков DspE FLAG индуцировать РГ без участия ССТТ. Для проверки были использованы клетки E. coli XL1-Blue с плазмидами pVL40FS (кодирует DspE1-164-FLAG), pVL40FM (DspE1-1069-FLAG), pVL40FF (DspE1-1630-FLAG), pLA15 (HrpW – положительный контроль) и pFLAG-CTC (исходный вектор – отрицательный контроль), которые синтезировали перечисленные белки при индукции IPTG.

Экстракт белков, полученный после разрушения клеток ультразвуком, инокулировался в листья Nicotiana tabacum. Результаты оценивались через часа после инокуляции (рисунок 3).

РГ вызывает только экстракт, содержащий белок HrpW (рисунок 3 E), который является харпином («хелперным» белком) и, по-видимому, детектируется растением в межклеточном пространстве. Из литературных данных известно [Block et al., 2008], что Avr-белки вызывают РГ только при попадании в цитоплазму растительной клетки, а для транслокации им необходима функционирующая ССТТ. Белок DspE, содержащийся в клеточном лизате, лишен такой возможности, поэтому можно предположить, что РГ индуцируется только при транслокации DspE в цитоплазму клеток растения.

A – pFLAG-CTC – отрицательный контроль;

B – pVL40FS (DspE1-164-FLAG);

C – pVL40FM (DspE1-1069-FLAG);

D – pVL40FF (DspE1-1621-FLAG);

E – pLA15 (HrpW) – положительный контроль.

Рисунок 3 – Индукция реакции гиперчувствительности экстрактами белков E. coli XL1-Blue с плазмидами pFLAG-CTC, pVL40FS, pVL40FM, pVL40FF и pLA Возможность транслокации DspE в клетки растений была исследована с использованием аденилатциклазной репортерной технологии [Sory and Cornelis, 1994] с помощью плазмид, кодирующих гибридные гены субстратов ССТТ, модифицированных добавлением с 3'-конца кодонов 2-406 гена циклолизина Bordetella pertussis. О транслокации химерных белков в клетки растений в этих экспериментах свидетельствовало значительное повышение концентрации цАМФ в листьях растений, инокулированных суспензиями штаммов Eca с соответствующими плазмидами, и сохранение базального уровня цАМФ при использовании для инокуляции клеток бактерий с инактивированной ССТТ или с функциональной ССТТ, но с несекретируемыми вариантами аденилатциклазы. Концентрация цАМФ в образцах инокулированных тканей растений определялась высокочувствительным радиоиммунным методом, разработанным ранее на кафедре биохимии Белгосуниверситета [Губич, О.И. и Шолух, М.В. 2003].

Для изучения факта и динамики процесса транслокации была построена кривая относительного накопления цАМФ в тканях листа N. tabacum, инокулированного суспензией клеток Еса с плазмидой pZH416 (кодирующей химерный эффектор DspE1-145-Cya), в зависимости от времени, прошедшего после инокуляции. В качестве отрицательного контроля использовали дефектный по ССТТ штамм JN501, несущий ту же плазмиду. Через равные промежутки времени (2 часа) собирались образцы растительной ткани и исследовались на содержание цАМФ. Как видно из рисунка 4, в первые часы после инокуляции наблюдается незначительное увеличение относительного содержания цАМФ в тканях листа, что, помимо очевидной временной задержки, определяемой временем транспорта эффектора и скоростью синтеза цАМФ, может быть также связано с необходимостью активации ССТТ. Далее происходит резкое увеличение количества цАМФ, которое достигает максимума через 8 часов после инокуляции, а затем начинается постепенное снижение количества цАМФ, скорее всего связанное с массовой гибелью клеток растения в это время.

Концентрация цАМФ в клетках табака Для каждой временной точки приведены средние уровни цАМФ из трех измерений со стандартными ошибками.

пмоль/мкг белка С целью минимизации РГ в 8 эксперименте использовались суспензии плотностью 5108 кл/мл, 6 инокулировались верхние полноразмерные листья трех четырехмесячных растений табака, инокулированные растения выдерживали на рассеянном свету.

0 2 4 6 Время после инокуляции, ч Рисунок 4 – Кинетика накопления цАМФ в тканях листа N. tabacum, инокулированного суспензиями клеток штаммов Еса JN42 ( ) и JN ( ) с плазмидой pZH416 (DspE-CyaA) В контрольных инокуляциях листьев N. tabacum суспензиями клеток штамма Еса JN501 (у которого ССТТ инактивирована) с плазмидой pZH416, кодирующей транслоцируемый гибридный белок, увеличения содержания цАМФ в инокулированных растительных тканях с течением времени не происходит, что свидетельствует в пользу того, что накопление цАМФ в тканях растений идет именно за счет функционирования ССТТ.

Таким образом удалось установить, что бактерии Eca осуществляют транспорт химерного белка DspE1-145-Cya непосредственно в клетки Nicotiana tabacum с помощью системы секреции III типа, что подтверждает наличие работающего сигнала транслокации ССТТ в последовательности DspE.

Характеристика белка DspF Erwinia carotovora Одной из функций секреторных шаперонов, ранее предложенной для DspF E. amylovora, является контроль стабильности их субстратов [Gaudriault, Paulin and Barny, 2002]. В связи с этим была проверена стабильность различных меченых FLAG-эпитопом производных DspE в клетках бактерий с DspF и лишенных этого белка.

Введение в клетки Eca JN42 эффективных векторов экспрессии с клонированными в них производными гена dspE позволяло получить (рисунок 5) сверхэкспрессию соответствующих белковых продуктов.

Поскольку в этих клетках сохранялся исходный уровень синтеза секреторного шаперона, вряд ли можно говорить о том, что функция DspF сводится к поддержанию стабильности DspE. Такой вывод подтверждается также данными о стабильности использованных нами вариантов DspE-FLAG в клетках E. coli и Eca VKEF (мутант по генам dspE и dspF), вообще лишенных DspF (рисунок 5).

1 2 3 4 5 6 7 Химеры DspE1-1069-FLAG и HrpW-FLAG, экспрессированные в клетках Eca, выращенных в условиях дерепрессии генов ССТТ (минимальная среда А с лимитом по источнику азота).

Дорожки: 1. VKEF [pVL40FM] (DspE1-1069-FLAG) – клетки;

2. VKEF [pVL40FM] (DspE1-1069-FLAG) – супернатант;

3. VKEF [pLA15] (HrpW-FLAG) – супернатант;

4. JN [pVL40FM] (DspE1-1069-FLAG) – супернатант;

5. JN42 [pLA15] (HrpW-FLAG) – супернатант;

6. VKEF [pLA15] (HrpW-FLAG) – клетки;

7. JN42 [pVL40FM] (DspE1-1069-FLAG) – клетки;

8. JN42 [pLA15] (HrpW-FLAG) – клетки.

Во всех случаях tac-промотор индуцирован 0,2 мМ IPTG. Детекция осуществлялась с помощью моноклональных анти-FLAG антител. Очистка белка из культуральной среды осуществлялась с помощью концентраторов "Vivaspin 2".

Рисунок 5 – Иммуноблоттинг химерных субстратов ССТТ Проверка участия DspF в транспорте DspE за пределы бактериальной клетки была проведена in vivo. Штамм VKEF (мутант по генам dspE и dspF), так же как и VKE (мутант по гену dspE), оказался практически полностью лишенным способности вызывать РГ (рисунок 6). И только при использовании суспензий высокой плотности незначительные симптомы РГ были заметны через сутки после заражения.

Поскольку у бактерий штамма VKEF ген dspE инактивирован, функциональная копия этого гена была введена в клетки штамма VKEF в составе плазмиды pVL40FF. Представленные на рисунке 7 данные показывают, что плазмида pVL40FF успешно восстанавливает РГ-индуцирующую способность у двойного мутанта с инактивированными генами dspE и dspF.

Поскольку для индукции РГ бактериями Eca необходима доставка DspE в клетки растений, эти данные четко свидетельствуют о том, что для транслокации DspE бактериями Eca в клетки растений белок DspF не требуется.

A – VKE (1,8109 клеток/мл), B – VKE (5,5109 клеток/мл), C – VKEF (1,8109 клеток/мл), D – VKEF (5,5109 клеток/мл) Зона РГ выглядит темным пятном, так как фотография была сделана на черном фоне.

Рисунок 6 – Проявление реакции гиперчувствительности в листьях N.

tabacum после инъекций суспензий клеток штаммов Eca A – JN42 [pFLAG-CTC] (1,8109 клеток/мл);

B – VKE [pFLAG-CTC] (1,8109 клеток/мл) C – VKE [pVL40FF] (1,8109 клеток/мл);

D – VKEF [pFLAG-CTC] (1,8109 клеток/мл) E – VKEF [pVL40FF] (1,8109 клеток/мл) Рисунок 7 – Проявление реакции гиперчувствительности в листьях N. tabacum после инъекций суспензий клеток штаммов Eca Введение плазмиды, кодирующей белок DspF (pVL41), в клетки штамма Eca JN42 полностью блокировало его способность индуцировать РГ у растений N. tabacum, тогда как присутствие в клетках этого штамма исходного вектора pZH449 не препятствовало индукции РГ (рисунок 8). Эффект от введения плазмиды pVL41 оказался даже большим, чем от инактивации гена dspE (рисунки 6 B и 8).

A – JN42 [pZH449] (1,4109 клеток/мл) B – JN42 [pVL41] (5,5109 клеток/мл) Проявление Рисунок 8 – реакции гиперчувствительности в листьях N. tabacum после инъекций суспензий клеток штаммов Eca Как показано ранее в этой работе, DspE является основным, но не единственным, продуцируемым бактериями Eca индуктором РГ, поскольку при использовании более высокой плотности суспензий клетки dspE-мутанта этих бактерий по-прежнему вызывали РГ (рисунок 7). Более значительное ослабление РГ-индуцирующей способности у штамма Eca с плазмидой pVL может свидетельствовать о том, что дополнительные копии гена dspF блокируют транслокацию в клетки растений не только основного эффектора DspE, но и минорных эффекторных белков. Альтернативным объяснением могло бы быть влияние dspF на экспрессию генов эффекторов, однако никакой разницы внутриклеточной концентрации по крайней мере одного из них (DspE) в клетках Eca с различным количеством DspF с помощью иммуноблоттинга зафиксировать не удалось. Данные, представленные на рисунке 5, показывают, например, одинаковую концентрацию DspE1-1069-FLAG в клетках штамма дикого типа и dspF-мутанта.

Количественная оценка эффекта дополнительных копий гена dspF на транслокацию эффекторов в клетки растений была получена с использованием аденилатциклазного репортера (рисунок 9).

Клетки Eca JN42 содержали плазмиду, кодирующую химерный эффектор DspE1-145-Cya (pZH416) или AvrPto-Cya цАМФ, пМоль/мкг белка (pZH432), совместно с еще одной плазмидой, кодирующей белок DspF (pVL41) или вектором pZH449, на основе которого pZH создана pVL41. В качестве 6 (вектор) контроля использованы не pVL (DspF) продуцирующие дополнительной аденилатциклазы клетки Eca JN с плазмидой pUC18 (исходным вектором для создания pZH416 и pZH432). Приведены средние значения четырех измерений с pZH416 pZH432 pUC 95%-ным доверительным (контроль) (DspE-Cya) (AvrPto-Cya) интервалом.

Рисунок 9 – Влияние сверхэкспрессии белка DspF на транслокацию в клетки N. tabacum химерных эффекторов DspE-Cya и AvrPto-Cya из клеток штамма Eca JN С этой целью использовались химеры с карбоксиконцевым аденилатциклазным доменом (Cya) хорошо изученного эффектора ССТТ – AvrPto бактерий Pseudomonas syringae [Ronald et al., 1992], и нативного эффектора DspE штамма Eca. Из этих двух эффекторов секреторный шаперон DspB описан только для последнего у родственной бактерии E. amylovora [Gaudriault et al., 1997]. Введение в клетки Eca, продуцирующие химерные эффекторы, плазмиды с геном dspF полностью блокировало транслокацию DspE-Cya и приблизительно в шесть раз снизило эффективность транслокации AvrPto-Cya.

Эти данные подтверждают, что эффект дополнительных копий гена dspF на индукцию РГ клетками Eca действительно связан с нарушением транслокации эффекторов в клетки растений.

По литературным данным [Parsot, Hamiaux, and Page, 2003] шаперон ССТТ способен взаимодействовать, как правило, только с одним эффектором, реже несколькими. Так как на момент проведения исследования найден только один эффектор для Eca, была сделана попытка обнаружить взаимодействие DspE с DspF. Для этого был применен метод дальнего вестерн-блоттинга.

Результаты, представленные на рисунке 10, свидетельствуют о том, что первых 164 а. о. достаточно для взаимодействия белка DspE с DspF. Эти данные хорошо согласуются с информацией из литературных источников о наличии сайтов связывания секреторных шаперонов вблизи N-конца эффекторного белка [Hueck, 1998;

Ghosh, 2004].

Белки из клеточных лизатов E. coli разделялись в 16% ПААГ, затем осуществлялся перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану, с последующими стадиями обработки:

белком DspE1-164 или DspE1-1069, мышиными анти-FLAG антителами, антителами против мышиных антител, мечеными пероксидазой хрена.

А - Обработка клеточным лизатом с экспрессированным белком DspE1-164-FLAG 1 – Клеточный лизат E. coli XL1-Blue с экспрессированным химерным белком DspE1-164-FLAG.

2 – Клеточный лизат E. coli XL1-Blue для контроля неспецифического взаимодействия.

3, 4 – Клеточные лизаты E. coli XL1 Blue [pVL41] (экспрессирует DspF) различной концентрации (1х, 2х).

B - Обработка клеточным лизатом с экспрессированным белком DspE1-1069-FLAG 1,2 – Клеточные лизаты E. coli XL1-Blue [pVL41] (экспрессирует DspF) различной концентрации (1х, 2х).

3, 4 – Клеточные лизаты E. coli XL1-Blue для контроля неспецифического взаимодействия.

5 – Клеточный лизат E. coli XL1-Blue с экспрессированным химерным белком DspE1-164-FLAG Рисунок 10 – Результат дальнего вестерн-блоттинга белков ССТТ Объединяя в одно целое все полученные экспериментальные данные, можно утверждать, что роль белка DspF бактерий Eca не соответствует высказанным в литературе предположениям и гипотезам о необходимости секреторных шаперонов для обеспечения стабильности эффекторов или для их доставки в клетки растений. С другой стороны, полное блокирование дополнительными копиями гена dspF транслокации DspE в клетки растений и существенное снижение эффективности транслокации белка AvrPto-Cya свидетельствует об участии белка DspF в регуляции ССТТ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Основные научные результаты диссертации 1. В геноме бактерий Erwinia carotovora нами выявлен эффекторный локус, состоящий из дивергентно транскрибируемых оперонов dspEF и hrpWshcW. Каждый оперон содержит протяженный ген потенциального эффектора, за которым следует небольшой ген, продукт которого является специфичным для этого эффектора шапероном [7, 9, 11].

2. Структура локуса свидетельствует о тесной координации экспрессии генов в каждом опероне. Транскрипция генов локуса может инициироваться с расположенных перед первым геном каждого оперона HrpL зависимых промоторов (внутренние промоторы не детектируются) [7].

3. Инактивация гена dspE лишает бактерии Erwinia carotovora способности индуцировать реакцию гиперчувствительности у ряда растений семейства пасленовых (Nicotiana tabacum, Capsicum annuum, Petunia hybrida, Solanum melongena), причем введение в клетки dspE-мутанта плазмид, экспрессирующих DspE, восстанавливает эту способность [1, 2, 18].

4. Препарат эффекторного белка DspE, в отличие от препарата харпина HrpW, не способен индуцировать реакцию гиперчувствительности при инъекции в листья растений Nicotiana tabacum. Бактерии Erwinia carotovora осуществляют транспорт химерного белка DspE1-145-Cya непосредственно в клетки Nicotiana tabacum с помощью системы секреции III типа, что подтверждает наличие работающего сигнала транслокации (для системы секреции III типа) в N-концевой последовательности DspE. Следовательно, DspE является типичным эффекторным белком, впервые охарактеризованным для Erwinia carotovora [1, 3, 5, 10, 14].

5. Впервые доказано, что белок DspF является DspE-специфичным шапероном, выполняющим регуляторную функцию в процессе секреции. Белок DspF способен специфически взаимодействовать c белком DspE, причем сайт связывания DspF расположен в пределах первых 164 аминокислотных остатков белка DspE, что характерно для взаимодействия секреторных шаперонов ССТТ со своими субстратами. Тем не менее, инактивация гена dspF не влияет на транспорт DspE в клетки растений [4, 6].

6. При экспрессии химерных белков DspE-FLAG различного размера в клетках E. coli и Erwinia carotovora их количество не зависит от присутствия белка DspF [4, 6, 20].

Транслокация белка DspE1-145-Cya отсутствует, а транслокация 7.

белка AvrPto-Cya снижена из клеток Erwinia carotovora, несущих низкокопийную плазмиду с геном dspF, что говорит об участии белка DspF в регуляции аппарата секреции III типа [4, 6, 20].

Рекомендации по практическому использованию результатов Практическая значимость полученных результатов определяется следующими параметрами:

1. Штаммы и плазмиды, сконструированные в ходе настоящей работы, способны существенно облегчить дальнейшие исследования ССТТ. В частности, штамм VKE с функциональной ССТТ, но с инактивированным геном dspE неспособен индуцировать реакцию гиперчувствительности и может быть использован для поиска новых avr-генов других бактерий. Плазмиды, кодирующие химерные производные DspE (c FLAG-эпитопом или аденилатциклазным доменом), можно использовать в качестве репортеров при исследованиях механизмов секреции и транслокации белков посредством ССТТ.

2. Полученный штамм Eca VKE в паре со штаммом JN42 пригоден для идентификации R-генов растений для их последующего введения в геном хозяйственно ценных растений с целью придания им устойчивости к фитопатогенам.

3. Идентификация у бактерий Erwinia carotovora 3-2 истинного индуктора РГ – белка DspE – дает возможность провести целенаправленный скрининг протеома растений семейства пасленовых на соответствующие R-белки (определяющие резистентность), взаимодействующие с белком DspE [15, 19].

Гены, кодирующие идентифицированные R-белки, а также dspE и dspF (кодирует DspE-специфический шаперон DspF) могут быть в дальнейшем использованы для создания трансгенных растений, резистентных к различным патогенам.

Полученные результаты расширяют существующие представления о функциях секреторных шаперонов системы секреции III типа фитопатогенных бактерий и вносят существенный вклад в формирование представлений о секреции эффекторных молекул посредством ССТТ. Данная информация используется при чтении лекций по курсам «Регуляция метаболизма» и «Фитопатогенные бактерии» студентам биологических специальностей БГУ.

Методическая часть диссертационной работы уже нашла применение на кафедре молекулярной биологии биологического факультета БГУ при проведении лабораторных занятий по спецкурсам и спецпрактикуму [акт внедрения в учебный процесс от 20.04.2009 г.].

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Публикации, соответствующие пункту 18 «Положения о присуждении ученых степеней и присвоении ученых званий в Республике Беларусь» 1. Белок DspE транслоцируется фитопатогенными бактериями Erwinia carotovora subsp. atroseptica в клетки Nicotiana tabacum и является необходимым для индукции реакции гиперчувствительности / Е.А. Николайчик, Т.В. Овчинникова, Л.Н. Валентович, О.И. Губич, М.В.

Шолух, А.Н. Евтушенков // Доклады НАН Беларуси – 2005. – Т. 49, № 5. – C. 81-85.

2. Молекулярные механизмы взаимодействия фитопатогенных бактерий Erwinia с растениями / Е.А. Николайчик, А.Л. Лагоненко, Л.Н. Валентович, И.И. Лешкович, Т.В. Овчинникова, О.К. Присяжненко, Н.Г. Доружинская, И.М. Лиморова, А.Н. Евтушенков // Вестник БГУ. Серия 2 – 2006. – №3. – C. 60-64.

3. Сравнительная характеристика харпинов HrpN бактерий Erwinia carotovora и Erwinia amylovora / Е.А Николайчик, А.Л. Лагоненко, Л.Н. Валентович, О.К. Присяжненко, А.Н. Евтушенков // Доклады НАН Беларуси. – 2007. – Т. 51, №3. – С. 81-85.

4. Валентович, Л.Н. Влияние дополнительных копий гена dspF Erwinia carotovora subsp. atroseptica на транслокацию белков DspE-Cya и AvrPto-Cya в клетки растений и развитие реакции гиперчувствительности / Л.Н. Валентович, О.И. Губич, Е.А. Николайчик // Труды Белорус. гос. ун-та.

Серия: Физиологические биохимические и молекулярные основы функционирования биосистем. – 2008. – T. 2. – С. 190-199.

5. Анализ роли внеклеточных компонентов системы секреции III типа Erwinia carotovora supsp. atroseptica в транслокации белковых факторов вирулентности бактерий в клетки растений / Е.А. Николайчик, Т.В. Овчинникова, А.З. Голик, А.Л. Лагоненко, Л.Н. Валентович, О.И. Губич, М.В. Шолух, А.Н. Евтушенков. // Труды Белорус. гос. ун-та. Серия:

Физиологические биохимические и молекулярные основы функционирования биосистем. – 2008. – Т. 2, – С. 200-213.

6. Валентович, Л.Н. Роль белка DspF Erwinia carotovora supsp. atroseptica в работе системы секреции III типа / Л.Н. Валентович, О.И Губич., Е.А Николайчик // Доклады НАН Беларуси. – 2008. – Т. 52, №5. – С. 79-83.

7. Валентович, Л.Н. Клонирование, секвенирование и генетическая аннотация hrp-dsp-кластера фитопатогенных бактерий Erwinia carotovora subsp. atroseptica / Л.Н. Валентович, А.Н. Евтушенков, Е.А. Николайчик // Труды Белорус. гос. ун-та. Серия: Физиологические биохимические и молекулярные основы функционирования биосистем. – 2009. – Т. 4, Часть 1. – С. 186-196.

Материалы конференций 8. Constructing of transgenic tobacco plants, carrying genes of type three secretion system effectors of Erwinia carotovora subsp. atroseptica / O.K. Prisyazhnenko, A.L. Lagonenko, L.N. Valentovich, E.A. Nikolaichik, A.N. Evtushenkov // III Moscow International Congress «Biotechnology: state of the art and prospects of development»: congress proceedings, Moscow, 14-18 march 2005 / Government of Moscow, etc. – Moscow, 2005. – P. 287-288.

9. Валентович, Л.Н. Изучение гена dspE у Erwinia carotovora subsp.

atroseptica / Л.Н. Валентович, Е.А. Николайчик, А.Н. Евтушенков // Перспективы и проблемы развития биотехнологии в рамках единого экономического пространства стран содружества: материалы междунар. науч. практ. конф., Минск – Нарочь, 25-28 мая 2005 г. / Белорус. гос. ун-т, ГКНТ РБ, Фед. Агент. по науке и инновациям Российской Федерации, НАН Беларуси и др.;

под ред. А.Н. Евтушенкова. – Минск, 2005. – C. 30-31.

10. Исследование транслокации в клетки растений белков AvrPto и DspE посредством системы секреции III типа бактерии Erwinia carotovora subsp.

atroseptica / Е.Г. Ярахнович, Т.В. Овчинникова, О.И. Губич, Л.Н. Валентович, М.В. Шолух, А.Н. Евтушенков, Е.А. Николайчик // Перспективы и проблемы развития биотехнологии в рамках единого экономического пространства стран содружества: материалы междунар. науч.-практ. конф., Минск – Нарочь, 25- мая 2005 г. / Белорус. гос. ун-т, ГКНТ РБ, Фед. Агент. по науке и инновациям Российской Федерации, НАН Беларуси и др.;

под ред. А.Н. Евтушенкова. – Минск, 2005. – C. 30-31.

11. Валентович, Л.Н. Клонирование гена dspE у Erwinia carotovora subsp.

atroseptica / Л.Н. Валентович, Е.А. Николайчик, А.Н Евтушенков. // Молекулярная и прикладная генетика: научн. труды / ИГиЦ НАН Беларуси;

под ред. Н.А. Картеля. – Минск, 2005. – Т. 1. – С. 73.

12. Транспорт белков посредством системы секреции III типа бактерии Erwinia carotovora subsp. atroseptica: функции HrpN, HrpW и HrpJ. / Е.А Николайчик, Т.В. Овчинникова, Л.Н. Валентович, А.Л. Лагоненко, Е.Г.

Ярахнович, О.И. Губич, М.В. Шолух, А.Н. Евтушенков // Молекулярная и прикладная генетика: научн. труды / ИГиЦ НАН Беларуси;

под ред. Н.А.

Картеля. – Минск, 2005. – Т. 1. – С. 104.

13. Перспективы использования бактериальных индукторов реакции гиперчувствительности в качестве средств защиты растений / А.Н. Евтушенков, А.Л. Лагоненко, Л.Н. Валентович, А.М. Ходосовская, В.Г. Иванюк, Г.К. Журомский, Е.А. Николайчик // Фитосанитарное оздоровление экосистем:

материалы второго всероссийского съезда по защите растений, Санкт Петербург, 5-10 декабря 2005 г. / Мин. сель. хоз. РФ, Российская академия сель хоз. Наук и др.;

редкол.: В.А. Павлюшин [и др.]. – Санкт-Петербург, 2005. – Т.1.

– С. 433-435.

14. Валентович, Л.Н. DspE – основной белок авирулентности Erwinia carotovora subsp. atroseptica / Л.Н. Валентович, Е.А. Николайчик, А.Н. Евтушенков // Физиология микроорганизмов в природных и экспериментальных системах: материалы междунар. конф., Москва, 16-19 мая 2006 г. / Московский гос. ун-т., Российский фонд фундаментальных исследований – Москва, 2006. – C.16.

15. Валентович, Л.Н.. Идентификация R-белков Nicotiana tabacum и перспективы их дальнейшего использования в качестве средств защиты растений / Л.Н. Валентович, Е.А. Николайчик, А.Н. Евтушенков // От классических методов генетики и селекции к ДНК-технологиям: материалы Межд. науч. конф., посвящ. 95-летию со дня рождения академика Н.В. Турбина, Гомель, 2-5 октября 2007 г. / ИГиЦ НАН Беларуси, Ин-т леса НАН Беларуси, Бел. общ-во генетиков и селекционеров;

редкол.: А.В.

Кильчевский [и др.]. – Минск, 2007. – С. 16.

16. Система секреции III типа бактерий Erwinia carotovora: молекулярная генетика специфического взаимодействия бактериального патогена с растением / Е.А. Николайчик, Л.Н. Валентович, А.Л. Лагоненко, О.К. Присяжненко, А.Н. Евтушенков // От классических методов генетики и селекции к ДНК технологиям: материалы Межд. науч. конф., посвящ. 95-летию со дня рождения академика Н.В. Турбина, Гомель, 2-5 октября 2007 г. / ИГиЦ НАН Беларуси, Ин-т леса НАН Беларуси, Бел. общ-во генетиков и селекционеров;

редкол.: А.В.

Кильчевский [и др.]. – Минск, 2007. – С. 163.

Тезисы докладов 17. Получение конструкций, пригодных для переноса hrpJ и hrpW в растительный геном / О.К. Присяжненко, Л.Н. Валентович, А.Л. Лагоненко, Е.А. Николайчик, А.Н. Евтушенков // Биотехнология микробов: тезисы Всероссийского симпозиума, Москва, 20-23 октября 2004 г. / Московский гос.

ун-т., Российский фонд фундаментальных исследований, Российское микробиол. общ-во;

редкол.: А.И. Нетрусов [и др.]. – Москва, 2004. – C.75.

18. Валентович, Л.Н. Роль гена dspE бактерий Erwinia carotovora в индукции реакции гиперчувствительности на различных растениях / Л.Н. Валентович, А.Н. Евтушенков, Е.А. Николайчик // Фитопатогенные бактерии. Фитонцидология. Аллелопатия: тезисы докл. междунар. конф., Киев, 4-6 октября 2005 г. / НАН Украины, Ин-т микробиологии и вирусологии НАН Украины и др.;

редкол.: В.С. Подгорский [и др.]. – Киев, 2005. – C. 45.

19. Поиск белков Nicotiana tabacum, взаимодействующих с Avr-белком DspE фитопатогенных бактерий Erwinia carotovora / Л.Н. Валентович, Е.А. Николайчик, И.И. Лешкович, А.Н. Евтушенков. // Сигнальные системы клеток растений: роль в адаптации и иммунитете: тезисы докл. II междунар.

симп., Казань, 27-30 июня 2006 г. /отдел. биол. наук РАН, Казанский научный центр РАН, и др.;

редкол.: И.Ю. Карпилова [и др.]. – Казань, 2006. – С.153.

20. Valentovich L.N. The involvement of DspF chaperone in control of DspE protein stability and its transport via the type III secretion system of Erwinia carotovora / L.N. Valentovich, Y.A. Nikolaichik // Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics, dedicated to 120th anniversary of M.I. Vavilov;

Abstract

of the conference, Kyiv, September 20-22, 2007. / IMBG NASU;

edit.: I.O. Tykhonkova [et al.]. – Kyiv, 2007. – P. 46.

РЭЗЮМЭ Валянтовiч Леанiд Мiкалаевiч Малекулярна-біялагічная характарыстыка dsp-аперона фiтапатагенных бактэрый Erwinia carotovora Ключавыя словы: Erwinia, фiтапатагенныя бактэрыi, сістэма сакрэцыі III тыпу, эфектарныя бялки, шапероны, рэакцыя гiперадчувальнасці.

Мэта працы: ідэнтыфікацыя генаў эфектарных бялкоў сістэмы сакрэцыі III тыпу бактэрый Erwinia carotovora, кантралюючых узаемадзеянне фiтапатагена з раслінай-гаспадаром, а таксама вызначэнне ролі сакраторных шаперонаў у працы сістэмы сакрэцыі III тыпу.

Метады даследавання: малекулярна-біялагічныя, біяхімічныя, фітапаталагічныя, мікрабіялагічныя.

Выкарыстаная апаратура: ДНК-аналiзатар, амплiфiкатар, электрапаратар, сiстэмы электрафарэзу, гель-дакументавання i iнш.

Атрыманыя вынiкi i iх навiзна. Упершыню ахарактарызаваны эфектарны локус сістэмы сакрэцыі III тыпу бактэрый Erwinia carotovora 3-2 – выяўлена, што ён складаецца з дывергентна транскрыбаваных аперонаў dspEF і hrpWshcW. Высветлены асаблівасці механізму ўзаемадзеяння раслін з фітапатагеннымі бактэрыямі – паказана, што прадукт гена dspE бактэрый Erwinia carotovora з'яўляецца Avr-бялком, які транслакуецца ў клеткі Nicotiana tabacum за дапамогай сістэмы сакрэцыі III тыпу і адыгрывае асноўную ролю ў індукцыі рэакцыі гiперадчувальнасцi ў раслін сямейства паслёнавых пры іх кантакце з вiрулентнымi бактэрыямі Erwinia carotovora. Таксама ўпершыню прадэманстравана, што бялок DspF Erwinia carotovora з'яўляецца сакраторным шаперонам, які ўзаемадзейнічае з эфектарным бялком DspE і выконвае рэгулятарную функцыю ў працэсе сакрэцыі.

Рэкамендацыi па выкарыстанню: Атрыманы штам VKE прыдатны для тэставання раслін на наяўнасць R-генаў, важных для селекцыйнага працэсу.

Ідэнтыфікацыя Avr-бялку Erwinia carotovora дазваляе правесці мэтанакіраваны скрынінг пратэома раслін сямейства паслёнавых на адпаведныя ахоўныя R бялкі, якія ўзаемадзейнічаюць з бялком DspE. Гены, што кадуюць ідэнтыфікаваныя R-бялкі, а таксама ген dspF, кадуючы DspE-спецыфічны шаперон DspF, могуць быць у далейшым выкарыстаны для стварэння трансгенных раслін, устойлівых супраць шэрагу патагенаў.

Галiна ўжывання: фітапаталогія, генетыка мікраарганізмаў, генетычная інжынерыя раслін, ахова раслін.

РЕЗЮМЕ Валентович Леонид Николаевич Молекулярно-биологическая характеристика dsp-оперона фитопатогенных бактерий Erwinia carotovora Ключевые слова: Erwinia, фитопатогенные бактерии, система секреции III типа, эффекторные белки, шапероны, реакция гиперчувствительности.

Цель работы: идентификация генов эффекторных белков ССТТ бактерий Erwinia carotovora, контролирующих взаимодействие фитопатогена с растением-хозяином, а также определение роли секреторных шаперонов в работе системы секреции III типа Методы исследования: молекулярно-биологические, биохимические, фитопатологические, микробиологические.

Использованная аппаратура: ДНК-анализатор, амплификатор, электропоратор, системы электрофореза и гель-документирования и др.

Полученные результаты и их новизна. Впервые охарактеризован эффекторный локус системы секреции III типа бактерий Erwinia carotovora 3- – установлено, что он состоит из дивергентно транскрибируемых оперонов dspEF и hrpWshcW. Раскрыты особенности механизма взаимодействия растений с фитопатогеными бактериями – показано, что продукт гена dspE бактерий Erwinia carotovora является Avr-белком, который транслоцируется в клетки Nicotiana tabacum с помощью системы секреции III типа и играет основную роль в индукции реакции гиперчувствительности у растений семейства пасленовых при их контакте с вирулентными бактериями Erwinia carotovora.

Также впервые показано, что белок DspF Erwinia carotovora является секреторным шапероном, который взаимодействует с эффекторным белком DspE и выполняет регуляторную функцию в процессе секреции.

Рекомендации по использованию: Полученный штамм VKE пригоден для тестирования растений на наличие R-генов, которые важны для селекционного процесса. Идентификация Avr-белка Erwinia carotovora позволяет провести целенаправленный скрининг протеома растений семейства пасленовых на соответствующие защитные R-белки, взаимодействующие с белком DspE. Гены, кодирующие идентифицированные R-белки, а также ген dspF, кодирующий DspE-специфический шаперон DspF, могут быть в дальнейшем использованы для создания трансгенных растений, резистентных к различным патогенам.

Область применения: фитопатология, генетика микроорганизмов, генетическая инженерия растений, защита растений.

SUMMARY Leonid N. Valentovich Molecular biological characterisation of the dsp operon of phytopathogenic bacterium Erwinia carotovora Keywords: Erwinia, phytopathogenic bacteria, type III secretion system, effector proteins, chaperones, hypersensitivity reaction.

Aim of the work: Identify the genes encoding effector proteins of the type III secretion system of Erwinia carotovora bacterium that control interaction of this phytopathogen with host plants;

define the role of secretion chaperones of type III secretion system.

Methods of research: molecular, biochemical, phytopathological, microbiological.

Equipment: DNA Analysis System, PCR Thermal Cycler, Electroporator, electrophoresis and gel documentation systems, etc.

Results and their novelty. For the first time effector locus of the type III secretion system of Erwinia carotovora strain 3-2 has been described. It consists of divergently transcribed operons dspEF and hrpWshcW. The mechanism of interaction between plants and phytopathogenic bacteria has been refined – it has been shown that the product of the dspE gene of Erwinia carotovora is an Avr-protein, which is translocated into Nicotiana tabacum cells via the type III secretion system and plays a major role in the induction of the hypersensitivity reaction in plants of the Solanaceae family upon the contact with virulent Erwinia carotovora bacteria. Also for the first time it has been shown that the DspF protein of Erwinia carotovora is a secretory chaperone which interacts with effector protein DspE and performs regulatory function in the process of secretion.

Application of the results: The resulting strain VKE is suitable for testing plants for the presence of R genes that are important for the selection process.

Identification of Avr-protein from Erwinia carotovora enables targeted screening of the proteome of plants in the Solanaceae family for the corresponding protective R proteins that interact with the protein DspE. The genes encoding such R proteins, as well as the dspF gene encoding the DspE-specific chaperone, can further be utilised for creation of transgenic plants resistant to various pathogens.

Application field: phytopathology, bacterial genetics, plant genetic engineering, crop protection.