Закономерности тепловой агрегации глобулярных олигомерных белков

На правах рукописи

ГОЛУБ Николай Викторович ЗАКОНОМЕРНОСТИ ТЕПЛОВОЙ АГРЕГАЦИИ ГЛОБУЛЯРНЫХ ОЛИГОМЕРНЫХ БЕЛКОВ 03.00.04 — биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 2008

Работа выполнена в лаборатории ферментных систем Института биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук

Научный консультант:

доктор биологических наук К.А. Маркосян

Официальные оппоненты:

профессор, доктор биологических наук С.С. Шишкин кандидат биологических наук Л.В. Белоусова

Ведущая организация:

ГОУП ВПО «Российский университет дружбы народов»

Защита состоится 11 декабря 2008 г. в 14 час. на заседании диссертационного совета Д 002.247.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук при институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071 Москва, Ленинский пр. 33, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071 Москва, Ленинский пр. 33, корп. 1.

Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук А.Ф. Орловский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Неблагоприятные условия в клетках (например, тепловой шок) могут приводить к разворачиванию и агрегации белков. Накопление агрегированных белков сопровождается образованием нерастворимых внутриклеточных структур. Проблему агрегации белков необходимо учитывать при решении биотехнологических задач, в частности, при ренатурации рекомбинантных белков в нативную форму из телец включения.

Содержание таких белков, как аспартатаминотрансфераза (L-аспартат-2 оксоглутаратаминотрасфераза, КФ 2.6.1.1, ААТ) и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (ГАФД;

КФ 1.2.1.12), в клетках животных очень высоко. ААТ, пиридоксальфосфат зависимый фермент, участвует в метаболизме азота в клетках, катализируя обратимый перенос аминогруппы с L-аспарагиновой кислоты на 2-кетоглутаровую кислоту с образованием щавелевоуксусной и L-глутаминовой кислот. Митохондриальная аспартатаминотрансфераза (мААТ) - димер с молекулярной массой 90 кДа, образованный двумя идентичными субъединицами. ГАФД, NAD+-зависимый фермент, катализирует один из ключевых этапов гликолиза: реакцию окислительного фосфорилирования глицеральдегид-3-фофата в 1,3-дифосфоглицерат. ГАФД - тетрамерный фермент с молекулярной массой 144 кДа, состоящий из идентичных субъединиц. Среди большого ряда алкогольдегидрогеназ (АДГ) наиболее широко распространены цинк-содержащие ферменты. Эта группа ферментов встречается в клетках прокариот и эукариот.

Алкогольдегидрогеназа I (АДГ I) из дрожжей Saccharomyces cerevisiae (алкоголь : NAD+ оксидоредуктаза, КФ 1.1.1.1) - тетрамерный фермент (150 кДа), состоящий из идентичных субъединиц, каждая из которых содержит по два иона Zn2+. Изучение механизмов агрегации этих белков, различающихся функцией, структурой, тканевой и внутриклеточной локализацией, представляется очень важным.

В ответ на стресс (тепловой, окислительный или токсический) в клетках прокариот и эукариот синтезируются белки теплового шока «heat shock proteins (Hsps)», играющие роль молекулярных шаперонов. Функции шаперонов состоят в том что они взаимодействуют с развернутыми полипептидными цепями, предотвращая их необратимую агрегацию, участвуют в фолдинге и сборке белков и предохраняют клетки от вызываемых стрессом повреждений. -Кристаллин, основной белок хрусталика глаза млекопитающих, являясь представителем семейства малых белков теплового шока (shsps), обладает антиагрегационной активностью, способен к образованию устойчивых растворимых комплексов с денатурированными белками и, таким образом, подавляет агрегацию развернутых форм белков. В работах Е.А. Хановой с соавторами (Khanova et al., 2005) и А.В. Меремьянина с соавторами (Meremyanin et al., 2008) показано, что подавление агрегации белков -кристаллином обусловлено переходом процесса агрегации из диффузионно-контролируемого режима в кинетический режим, для которого вероятность слипания сталкивающихся частиц меньше единицы. Это показано на примере подавления тепловой агрегации ГАФД и гликогенфосфорилазы b из скелетных мышц кролика и L-кристаллина. Представляло интерес выяснить, выполняется ли подобный механизм защитного действия -кристаллина для других белковых субстратов и насколько он общий.

GroEL, представитель семейства шаперонинов 60, в клетках участвует в фолдинге белков. Известно, что GroEL проявляет способность подавлять агрегацию белковых субстратов, однако, механизм защитного действия GroEL оставался невыясненным.

Поскольку способность взаимодействовать с развернутой формой белков проявляют шапероны различных классов, актуальным является проведение сравнительных исследований механизмов защитного действия различных шаперонов.

Цель работы. Целью настоящей работы является выявление кинетических закономерностей и механизма тепловой агрегации белков, приводящей к образованию аморфных агрегатов, в отсутствие и в присутствии шаперонов, взаимодействующих с развернутыми формами белков. В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:

1. изучить кинетику тепловой инактивации, денатурации и агрегации митохондриальной аспартатаминотрансферазы (мААТ) из сердца свиньи;

2. для получения более детальной информации о начальной стадии процесса тепловой агрегации белков подобрать условия агрегации глицеральдегид-3 фосфатдегидрогеназы (ГАФД) из скелетных мышц кролика, при которых возможна одновременная регистрация исходной (нативной) формы белка и белковых агрегатов;

3. с использованием в качестве белковых субстратов мААТ и ГАФД изучить влияние -кристаллина, представителя семейства малых белков теплового шока, и GroEL, представителя семейства шаперонинов 60, на тепловую агрегацию белков;

4. проверить наличие шапероноподобной активности у дрожжевой алкогольдегидрогеназы I с использованием тест-системы, основанной на агрегации УФ-облученного -кристаллина при 37 °С.

Научная новизна. На основании сопоставления процессов тепловой инактивации и денатурации мААТ сделан вывод о том, что инактивация фермента характеризуется более высокой скоростью по сравнению со скоростью денатурации белка. Это указывает на более высокую чувствительность активного центра фермента к денатурирующим воздействиям по сравнению с целой белковой глобулой. Установлено, что тепловая агрегация мААТ протекает в диффузионно-контролируемом режиме.

Подобраны условия агрегации глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, которые позволили доказать, что образование стартовых агрегатов из денатурированных молекул белка происходит по принципу «все-или-ничего», без образования интермедиатов.

Проведено сравнение механизмов подавления агрегации белков -кристаллином и GroEL — белками, относящимися к различным классам шаперонов. Установлено, что -кристаллин и GroEL препятствуют агрегации белков (мААТ и ГАФД) путем изменения кинетики агрегации из диффузионно-контролируемого режима в режим агрегации, характеризующийся вероятностью слипания частиц при столкновении, меньшей, чем единица.

Показано, что необычная кинетика тепловой агрегации алкогольдегидрогеназы I, проявляющаяся в экспоненциальной зависимости гидродинамического радиуса белковых агрегатов от времени, объясняется наличием шапероноподобной активности у нативного фермента.

Практическое значение работы. Понимание механизма агрегации белков позволяет предложить количественные методы оценки скорости агрегации, которые могут быть использованы для отбора агентов, эффективно подавляющих агрегацию белков.

Понимание механизма защитного действия шаперонов различных классов может служить основой для поиска антиагрегационных агентов, которые, подобно шаперонам, будут оказывать защитное действие путем уменьшения вероятности слипания сталкивающихся частиц. Агенты подобного рода могут найти применение при решении биотехнологических задач и при создании препаратов медицинского назначения.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на ХIII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов— 2006» (Москва, 2006), III Международном симпозиуме "Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии" (Дубна, 2007), 2-ой Международной конференции по проблемам стресса (Будапешт, Венгрия, 2007), на конкурсе аспирантов Института биохимии им. А.Н. Баха РАН на соискание стипендии имени члена корреспондента РАН В.Л. Кретовича (Москва, 2008). Присужден грант в области естественных и гуманитарных наук по программе «Лучшие аспиранты РАН» (Москва, 2008).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ (5 статей в рецензируемых журналах, 2 статьи в сборниках трудов и тезисы сообщений на 3-х конференциях).

Объем и структура работы. Работа изложена на _страницах, содержит рисунков и таблиц. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глав), описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения (глав), выводов и списка цитируемой литературы (_источников).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ААТ из митохондрий сердца свиньи была любезно предоставлена к.б.н.

М.В. Шолухом (научно-исследовательская лаборатория биохимии обмена веществ биологического факультета Белорусского государственного университета), ГАФД из мышц кролика была любезно предоставлена к.б.н. Р.А. Асриянц (отдел биохимии животной клетки Научно-исследовательского института физико-химической биологии им.

А.Н. Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова).

Лиофилизованный препарат дрожжевой АДГ I («Sigma», США), содержащий по данным дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) примесь термолабильной формы фермента, прогревали при 52 °C в течение 13 мин. При повторном сканировании прогретого образца на кривой теплопоглощения ДСК получали один пик. Кристаллины (- и L-) из хрусталиков глаза телят были любезно предоставлены к.б.н. К.О. Мурановым (лаборатория физико-химических основ биорегуляции Института биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН). GroEL был любезно предоставлен проф. В.И. Муронцом (отдел биохимии животной клетки Научно-исследовательского института физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского государственного университета им. М.В.

Ломоносова). Степень чистоты белков, используемых в работе, анализировали методом электрофореза в ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия.

Калориметрические исследования проводили в лаборатории молекулярной организации биологических структур совместно с к.б.н. С.Ю. Клейменовым (Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН) и к.б.н. В.Н. Орловым (Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова) на дифференциальном адиабатическом сканирующем микрокалориметре «ДАСМ-4М» (Биоприбор, Россия) при постоянном избыточном давлении 2,2 атм. со скоростью нагревания 1 К/мин.

Обратимость теплового перехода проверяли путем сравнения остаточной теплоемкости при повторном прогреве образца.

Кинетику агрегации белков изучали методом динамического светорассеяния.

Измерения проводили на установке Photocor Complex (Photocor Instruments Inc., США) с He-Ne лазером (Coherent, USA, Model 31-2082, 632,8 нм, 10 мВ) в качестве источника света. Температуру образцов поддерживали при помощи PID temperature controller в пределах ±0,1 °C. Автокорреляционные функции измеряли при помощи Photocor-FC в режиме multiple-tau с использованием 288 каналов и логарифмической шкалой времени.

Обработку автокорреляционных функций и расчёт размеров гидродинамического радиуса Rh проводили при помощи программы DynaLS (Alango, Израиль).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Тепловая инактивация, денатурация и агрегация мААТ Тепловую денатурацию митохондриальной аспартатаминотрансферазы (мААТ) изучали методом ДСК. Растворы белка нагревали с постоянной скоростью 1 К/мин в ex температурном интервале от 10 до 90 °С. Зависимости избыточной теплоемкости ( Cp ) от температуры, полученные при различных концентрациях белка, представлены на рис. 1.

Положение максимума (Тmax) остается неизменным при варьировании концентрации мААТ от 0,2 до 3,2 мг/мл. Это указывает на то, что кинетическая схема процесса C p (кДж/моль * К) C p (кДж/моль * К) денатурации не содержит кинетически значимой стадии обратимой диссоциации ex димера мААТ на мономеры (Любарев и 200 60 70 др., 2000;

Lubarev et al., 2001).

Температура (°С) ex На рис. 2 представлены темпера турные зависимости избыточной теплое 40 50 60 70 мкости, полученные при различных Температура (°С) Рис. 1. Тепловая денатурация мААТ (10 мМ Na- скоростях сканирования (v = 0,25;

0,5;

1,0 и ex фосфатный буфер, pH 7,5). Зависимости Cp от 2,0 К/мин). Положение максимума температуры, полученные при различных концентрациях фермента: 0,2 (1), 1,0 (2) и 3,2 мг/мл профилей ДСК сдвигается от 69,7 до (3). Скорость сканирования 1 К/мин. Вставка — температурный профиль при концентрации мААТ 3,2 73,1 °С при повышении скорости мг/мл. Точки — экспериментальные данные;

сплош ная кривая рассчитана при помощи системы сканирования от 0,25 до 2,0 К/мин.

уравнений (2).

Температурные профили избыточной 600 теплоемкости проанализированы в C p (кДж/моль*К) предположении, что денатурация белка протекает как необратимая реакция первого порядка:

ex N kden D (1), где N и D — нативный и денатурированный белок, соответственно, и kden — константа 60 65 70 Температура (°C) скорости денатурации. Для описания ex Рис. 2. Количественный анализ зависимостей Cp при ex концентрации мААТ 1,5 мг/мл, полученных при зависимости от температуры Cp различных скоростях сканирования: (1) 0,25, (2) 0,5, (3) 1,0 и (4) 2,0 К/мин. Точки — экспериментальные использовали систему уравнений (Kurganov данные;

сплошные кривые рассчитаны по уравнениям параметров: et al., 1997;

Lyubarev et al., 1999):

(2) и (3) при значениях Eaden = 516,6 кДж/моль и T1den = 346,44 К. d nat kden nat dT = v А, (2) C ex = Q kden nat 0. p t v где nat — доля нативного белка, kden — -0. ln(A/A 0) константа скорости денатурации, T — -0. абсолютная температура, v — скорость повышения температуры, Qt — общая тепло -0. та денатурации. Предполагается, что 0 10 20 зависимость kden от температуры Б 0 подчиняется уравнению Аррениуса:

Eaden 5 den мин-1, = exp (3) k den T T -2 R 1 ln(A/A 0) где Eaden — энергия активации для процесса -4 T1den денатурации, — абсолютная температура, при которой kden = 1 мин-1, R — - универсальная газовая постоянная.

0 10 20 t (мин) Как видно из рис. 2, экспери Рис. 3. Влияние температуры на кинетику инактивации мААТ (0,1 мг/мл). Зависимости ментальные данные удовлетворительно относительной ферментативной активности мААТ полулогарифмических описываются теоретическими уравнениями, (A/A0) от времени в координатах, полученные при различных температурах инкубации: (1) 50, (2) 57,5, (3) 61, (4) 65, что указывает на выполнимость (5) 68, (6) 72 и (7) 77 °С.

кинетической схемы N D.

kden На рис. 3 представлена кинетика тепловой инактивации мААТ при различных температурах. Падение относительной ферментативной активности А/А0 оказывается линейным в координатах {ln(А/А0);

время} (А0 и А — начальное и текущее значение ферментативной активности). Это указывает на то, что кинетика инактивации подчиняется экспоненциальному закону: A/A0 = exp(–kint), где kin — константа скорости инактивации.

Зависимость константы kin от температуры описывается уравнением Аррениуса:

Eain in мин-1, kin = exp (4) T T R 1 где Eain – энергия активации для процесса инактивации, T1in - температура, при которой kin = 1 мин-1 (прямая 1 на рис. 4). Параметры Eain и T1in определены равными 405,4 ± 1,5 кДж/моль и 345,99 ± 0,02 К соответственно. Пунктирная линия (2) на этом рисунке соответствует зависимости lnkden от 1/Т, рассчитанной по данным ДСК. Как видно из рисунка, во всем изученном интервале температур (от 57,5 до 77 °С) константа скорости инактивации превышает константу скорости денатурации.

ln kin (1);

ln kden (2) Величина отношения kin/kden с ростом - температуры снижается от значения 28, - при 57,5 °С до значения 1,3 при 77 °С.

- Таким образом, инактивация мААТ - происходит быстрее, чем полное - разворачивание белковой молекулы, что 2.85 2.90 2.95 3. согласуется с гипотезой Ch.-L. Tsou (Цоу, ( ) 10 3 K T 1998;

Tsou, 1998) относительно более Рис. 4. Сопоставление констант скорости тепловой высокой чувствительности активного инактивации и денатурации мААТ. Зависимости констант скорости инактивации kin (1) и денатурации центра фермента к воздействию kden (2) от температуры в координатах Аррениуса.

Точки на прямой 1 — экспериментальные значения денатурирующих факторов по сравнению с kin. Размерность kin и kden — мин-1.

целой белковой глобулой.

Для объяснения расхождений между скоростями инактивации и денатурации мААТ предложена следующая схема:

(5).

В этой схеме Ea, Ein и Eden — активная, инактивированная и денатурированная формы мААТ, соответственно. Предполагается, что инактивация фермента обусловлена локальными структурными изменениями в области активного центра. При этом конформация белковой глобулы остается практически неизменной. Предполагается также, что изменение энтальпии при переходе из активной в инактивированную форму близко к нулю, в то время как энергия активации для реакции E a Ein достаточно высока.

В рамках данных предположений конформации Ea и Ein сходны, поэтому их разворачивание протекает с одной и той же скоростью. Если прослеживать процесс денатурации, схема (5) эквивалентна одностадийной модели (см. схему (1)). Таким образом, предложенная модель инактивации-денатурации мААТ объясняет более высокую скорость инактивации по сравнению со скоростью денатурации.

Рис. 5 демонстрирует повышение den 0.000 0.005 0.010 0.015 0. А интенсивности светорассеяния (I) в ходе I (фотоотсчет/т) тепловой агрегации мААТ в зависимости от времени инкубации белка при различных температурах. Повышение концентрации белка в интервале от 0,05 до 800 t (мин) 0 200 400 0,4 гм/мл приводит к повышению скорости den 0.000 0.015 0.030 0. Б роста интенсивности светорассеяния I (фотоотсчет/т) (кривые 1-4 на рис. 5А-В). При длительных 200000 временах инкубации происходит снижение интенсивности светорассеяния, обусловленное преципитацией белковых 500 t (мин) 0 100 200 300 агрегатов.

den 0.00 0.04 0.08 0. В Интересен тот факт, что восходящая I (фотоотсчет/т) часть кривой зависимости интенсивности светорассеяния (I) от времени (до момента начала преципитации) подчиняется экспоненциальному закону (Kurganov, 250 t (мин) 0 50 100 150 Рис. 5. Тепловая агрегация мААТ (10 мМ Na- 2002):

фосфатный буфер, pH 7.5) Зависимости I = I lim [1 exp( kIt )], (6) интенсивности светорассеяния от времени при 55 °С (А), 57,5 °C (Б) и 60 °C (B). Концентрации белка: 0, (1), 0,1 (2), 0,2 (3) и 0,4 (4) мг/мл. Сплошные линии — где Ilim — предельное значение I при t, экспериментальные данные;

пунктирные линии k — константа скорости первого порядка.

рассчитаны по уравнению (6);

горизональные I пунктирные линии соответствуют значению Ilim. Применимость данного уравнения для анализа показана на примере кинетических кривых агрегации мААТ, полученных при концентрации фермента 0,4 мг/мл (пунктирные кривые на рис. 5А-В).

На первый взгляд, ход расчетных кривых, описываемых экспоненциальным уравнением, соответствует процессу агрегации, протекающему в условиях отсутствия преципитации. В этом случае значение Ilim должно соответствовать полному переходу белка в агрегированное состояние. Поскольку процесс тепловой денатурации протекает как необратимая мономолекулярная реакция, количество денатурированного белка может быть рассчитано в соответствии со следующим уравнением: den = 1 – exp (-kdent), где kden — константа скорости денатурации. Для расчета значения kden при различных температурах использовано уравнение Аррениуса в следующей форме:

E den - kden = exp a den мин, (7) T R T где Eaden — энергия активации, T1den — температура, при которой константа скорости kden равна 1 мин-1 и R — универсальная газовая постоянная. Значения параметров Eaden и T1den приняты равными 516,6 ± 0,7 кДж моль-1 и 346,44 ± 0,01 К соответственно (10 мМ Na-фосфатный буфер, pH 7,5). Значения kden при 55 °С (А), 57,5 °С (Б) and 60 °С (В) рассчитаны по уравнению (7) и составляли 2,710-5, 1,210-4 и 5,110-4 мин-1, соответственно. Верхняя шкала на рис. 5А-В показывает долю денатурированного белка (den) в ходе денатурации мААТ при соответствующих температурах. Для характеристики скорости прироста светорассеяния, предлагается использовать параметр t0,99 (t0,99 — значения времени, при котором интенсивность светорассеяния достигает уровня I/I = 0,99). Значения параметра t0,99 зависимости интенсивности светорассеяния от времени рассчитаны по уравнению (4) при 55 °С (А), 57,5 °C (Б) и 60 °С (В) и получились равными 660, 860 и 245 мин, соответственно. Эти значения t0.99 соответствовали следующим значениям den: 0,018, 0,097 и 0,117. Таким образом, прекращение прироста интенсивности светорассеяния имеет место при временах, когда количество денатурированного белка не достигает даже 10%. Специальными опытами показано, что количество агрегированного белка (agg), рассчитанное на основании измерения оптической плотности растворов белка после 30-минутного центрифугирования при 20 000g, совпадает с количеством денатурированного белка (agg = den).

Измерение гидродинамического радиуса (Rh) белковых агрегатов, образующихся в ходе тепловой агрегации мААТ, позволило объяснить причину преципитации агрегатов при низких значениях степени денатурации. Обработка данных динамического светорас сеяния показала, что распределение белковых агрегатов по размерам в ходе тепловой 0.6 агрегации мААТ остается Относительная интенсивность унимодальным, причем с увеличением 23 времени инкубации пик распределения 0. сдвигается в область больших значений Rh. На рис. 6 показано типичное 0. распределение белковых агрегатов мААТ по размерам при различных временах 0.0 инкубации при 60 °С.

2 3 10 10 10 Rh (нм) На рис. 7 представлена Рис. 6. Типичное распределение белковых агрегатов мААТ (0,2 мг/мл) по размерам при различных зависимость величины гидроди временах инкубации при 60 °С.

намического радиуса агрегатов от времени для агрегации мААТ при 60 °С.

2000 4 Аналогичные зависимости были получены при температурах 55 и 57,5 °С.

R h (нм) 1 Как видно на рисунке, процесс агрегации сопровождается монотонным 500 Rh, который достигает увеличением значений ~2000 нм. При достижении этих 0 50 100 150 значений Rh начинается преципитация.

t (мин) Для характеристики ширины Рис. 7. Зависимость гидродинамического радиуса белковых агрегатов от времени при агрегации мААТ при 60 °С. Концентрации белка: 0,05 (1), 0,1 (2), 0,2 распределения белковых агрегатов по (3) и 0,4 (4) мг/мл.

размерам был рассчитан индекс полидисперсности (PI). На рис. 8 показан 0. типичный характер изменений величины 0. PI с течением времени при агрегации 0.3 мААТ (0,2 мг/мл) при 60 °С. Начальное PI повышение значения PI сменяется его 0. экспоненциальным снижением.

0. Предельное значение PI при t было 0.0 0,14 ± 0,01.

рассчитано равным 0 50 100 150 значение PI Полученное низкое t (мин) Рис. 8. Изменение индекса полидисперсности (PI) во характерно для агрегации коллоидных времени в процессе агрегации мААТ (0,2 мг/мл) при частиц, протекающей в диффузионно 60 °C.

контролируемом режиме (Weitz, 1985).

Перед тем как анализировать зависимость Rh(t), нами были построены графики соотношения между величинами I и Rh (рис. 9). Начальные участки таких графиков линейны и описываются уравнением:

50000 I = I2(Rh – Rh,0), (8) 4 3 где Rh,0 — гидродинамический радиус I (фотоотсчет/с) стартовых агрегатов, I2 — константа. Rh, соответствует отрезку, отсекаемому на оси 20000 абсцисс линейной зависимостью I (Rh).

Значения параметров I2 и Rh,0 рассчитаны при различных концентрациях мААТ и 0 200 400 600 800 различных температурах инкубации Rh (нм) (таблица 1). Как следует из полученных Рис. 9. Соотношение между интенсивностью светорассеяния и величиной гидродинамического данных, изменение температуры или радиуса белковых агрегатов для агрегации мААТ при 60 °С. Концентрации белка: 0,05 (1), 0,1 (2), 0,2 (3) и концентрации белка не приводит к 0,4 (4) мг/мл.

Rh,0, заметным изменениям величины среднее значение которой составляет 78,5 ± 1,0 нм.

Зная значение Rh,0, мы провели анализ начальных участков зависимостей Rh(t).

Значения параметра 1/t2R, характеризующие скорость агрегации, приведены в таблице 1.

1/t2R растет с увеличением температуры или концентрации белка.

При значениях времени выше определенной величины (t t*) зависимость Rh(t) подчиняется степенной функции Rh = Rh 1+ K 2 ( t t * ) 1/ df * (9) * со значением фрактальной размерности агрегатов df, близкой к 1,8 (значения t*, Rh и df даны в таблице 1). Такой характер зависимости Rh от времени указывает на то, что агрегация мААТ протекает в режиме, при котором вероятность слипания частиц при столкновении равна единице (diffusion-limited cluster-cluster aggregation, DLCA), то есть скорость агрегации ограничивается лишь диффузией частиц (Markossian et al., 2006;

Khanova et al., 2007;

Meremyanin et al., 2008;

).

Таблица 1. Параметры уравнений (4), (8), (9), использованных для описания кинетики агрегации мААТ ( мМ Na-фосфатный буфер, pH 7,5) I210-3 (1/t2R) Темпера- (мAAT) Rh,0 (нм) t* (мин) Rh* (нм) df 102 (мин-1) тура (°C) (мг/мл) ((фотоотсчет/с)/ нм) 0,94 ± 0,02 79,2 ± 0,9 5,2 ± 0,1 1,88 ± 0, 55 0,05 100 2,0 ± 0,1 76,2 ± 1,2 4,8 ± 0,1 1,86 ± 0, 55 0,1 100 4,9 ± 0,2 71,3 ± 1,4 8,1 ± 0,2 1,85 ± 0, 55 0,2 60 7,9 ± 0,2 72,6 ± 1,3 11,2 ± 0,3 1,84 ± 0, 55 0,4 30 4,9 ± 0,2 85,9 ± 1,4 9,8 ± 0,2 1,76 ± 0, 57,5 0,05 55 6,7 ± 0,1 81,9 ± 1,0 8,9 ± 0,2 1,81 ± 0, 57,5 0,1 50 11,1 ± 0,1 84,4 ± 0,6 13,3 ± 0,3 1,87 ± 0, 57,5 0,2 40 17,9 ± 0,5 72,6 ± 1,1 12,7 ± 0,2 1,80 ± 0, 57,5 0,4 40 76,9 ± 0,8 20 ± 1 1,84 ± 0, 3,1 ± 0,1 15 60 0, 3,7 ± 0,2 81,0 ± 1,4 24 ± 1 1,84 ± 0, 60 0,1 15 5,4 ± 0,2 75,9 ± 0,7 32 ± 2 1,80 ± 0, 60 0,2 15 9,7 ± 0,2 83,8 ± 0,9 50 ± 3 1,81 ± 0, 60 0,4 15 2. Влияние кристаллина на тепловую агрегацию мААТ кристаллина В настоящей работе исследовано влияние (олигомерного, полидисперсного белка с молекулярной массой 660-940 кДа) на тепловую агрегацию мААТ. На рис. 10 показаны зависимости интенсивности светорассеяния от времени для агрегации мААТ (0,2 мг/мл) в присутствии кристаллина. Прирост интенсивности светорассеяния при агрегации в присутствии кристаллина снижается. Практически полное подавление агрегации мААТ наблюдается при концентрации 300000 кристаллина, равной 0,4 мг/мл (рис. 10, I (фотоотсчет/с) кривая 5).

Анализ распределения агрегатов мААТ по величине гидродинамического 100000 радиуса показал, что в присутствии 500 кристаллина при длительных временах 0 100 200 300 t (мин) инкубации унимодальное распределение Рис. 10. Подавление агрегации мААТ переходит в бимодальное. Типичный пример -кристаллином. Зависимости интенсивности светорассеяния от времени для агрегации мААТ (0, такого распределения агрегатов мААТ мг/мл) при 60 °С. Концентрации -кристаллина: 0 (1), 0,1 (2), 0,15 (3), 0,2 (4) и 0,4 (5) мг/мл. (0,2 мг/мл, 60 °С) представлен на рис. 11.

На рис. 12 представлены зависимости величины гидродинамического радиуса от времени при агрегации мААТ в присутствии различных концентраций кристаллина (60 °С). Характерной особенностью этих А зависимостей является то, что их начальные 0. участки описываются экспоненциальной 0. функцией:

0. ln 2 ( t t0 ), (10) Rh = Rh,0 exp t2R 0. где Rh,0 — размер стартовых агрегатов, t0 — 0.0 длительность лаг-периода и t2R — интервал 2 3 Б 10 10 10 0. времени, на протяжении которого величина Rh удваивается.

0. Для определения величины Rh,0 были 0. использованы графики соотношения между Относительная интенсивность интенсивностью светорассеяния и величиной 0. гидродинамического радиуса белковых 0.0 агрегатов. Начальные участки этих графиков 2 3 В 10 10 10 0. линейны, и длина отрезка, отсекаемого на оси абсцисс прямой линией, определяет 0. величину Rh,0. Гидродинамический радиус 0. первичных агрегатов (Rh,0), значительно меньше в том случае, когда агрегация 0. протекает в присутствии кристаллина 0.0 Г 2 3 10 10 10 10 (таблица 2). При использовании 0. кристаллина в концентрациях 0.3 0,1-0,4 мг/мл величины Rh,0 практически одинаковы и их среднее значение составляет 0. 17,7 ± 1,3 нм.

0. Зная величину Rh,0, мы провели анализ зависимостей величины гидродинамического 0.0 1 2 3 10 10 10 радиуса от времени для агрегации мААТ в Rh (нм) Рис. 11. Распределение частиц мААТ (0,2мг/мл) по кристаллина присутствии в величине гидродинамического радиуса в присутствии -кристаллина (0,2 мг/мл). Времена концентрациях 0,1, 0,15 и 0,2 мг/мл. Как инкубации: 100 (А), 200 (Б), 300 (В) и 350 (Г) мин.

видно из рисунка 10А-В, начальные участки зависимостей Rh от времени удовлетворительно описываются уравнением (10). Результаты расчетов представлены в таблице 2.

Величина t0, характеризующая длительность лаг-периода процесса агрегации, увеличивается с ростом концентрации кристаллина. Значения параметра 1/t2R, полученные при различных концентрациях кристаллина, свидетельствуют о том, что скорость агрегации в присутствии кристаллина снижается.

Таблица 2. Параметры уравнений (8) и (10), используемых для описания кинетики тепловой агрегации мААТ (0,2 мг/мл) при 60 °С в присутствии кристаллина I2 10-3 (1/t2R) Rh,0 (нм) t0 (мин) tcrit (мин) Концентрация (мин-1) кристаллина [(фотоотсчет/с)/нм] (мг/мл) 42,6 ± 0,4 16,4 ± 0,1 57,5 ± 1,1 1,00 ± 0, 0,1 15,5 ± 0,3 19,7 ± 0,2 66,1 ± 1,4 0,89 ± 0, 0,15 6,5 ± 0,1 17,1 ± 0,2 93,0 ± 4,0 0,07 ± 0, 0,2 19,4 ± 0, 0,4 — — — — Следует отметить, что при концентрации кристаллина, равной 0,4 мг/мл, размер частиц в системе остается постоянным (Rh = 19,4 ± 0,1 нм), по крайней мере, в течение 1200 мин (рис. 12Г).

Б А 90 1500 R h(нм) 1000 30 0 100 200 500 0 100 0 200 400 0 200 400 В 2000 Г 1500 R h(нм) 0 200 0 0 200 400 600 800 0 300 600 900 t (мин) t (мин) Рис. 12. Зависимости величины гидродинамического радиуса белковых агрегатов от времени для агрегации мААТ при 60 °С в присутствии -кристаллина. Концентрации -кристаллина: 0,1 (А), 0,15 (Б), 0,2 (В) и 0, (Г) мг/мл. На вставках показаны начальные участки зависимостей Rh от t. Сплошные линии на вставках к рисункам А, Б и В рассчитаны при помощи уравнения (10).

Экспоненциальный характер зависимости величины гидродинамического радиуса от времени при агрегации мААТ в присутствии кристаллина означает, что агрегация протекает в режиме, при котором вероятность слипания частиц меньше единицы (reaction-limited cluster-cluster aggregation, RLCA). Таким образом, кристаллин защищает мААТ от агрегации вследствие уменьшения вероятности слипания частиц, образующихся в процессе агрегации. Полученный результат согласуется с выводами о механизме защитного действия кристаллина, сделанными ранее исследователями, изучавшими тепловую агрегацию L-кристаллина (Khanova et al., 2005), ГАФД (Khanova et al., 2006) и гликогенфосфорилазы b (Meremyanin et al., 2008) в присутствии кристаллина.

3. Изучение стадии образования стартовых агрегатов на примере тепловой агрегации ГАФД Для того чтобы более подробно охарактеризовать начальную стадию тепловой агрегации белков, а именно стадию образования стартовых агрегатов, мы подобрали условия для агрегации ГАФД, при которых одновременно регистрируются исходная (нативная) форма белка и белковые агрегаты: 10 мМ Na-фосфатный буфер, pH 7,5;

45 °С;

ГАФД 1 и 3 мг/мл.

На рис. 13 представлена зависимость интенсивности светорассеяния (I) от времени для процесса тепловой агрегации ГАФД (1 и 2 мг/мл) при 45 °С. Длительность лаг периода, обозначенная нами как параметр t2, для каждой зависимости I от времени представлена в таблице 3.

Уменьшение скорости агрегации при увеличении концентрации ГАФД от 1 до мг/мл оказалось неожиданным. Это факт можно объяснить следующим образом. Методом ДСК показано, что термостабильность ГАФД повышается с ростом концентрации I (фотоотсчет/с) белка в интервале от 0,5 до 3,0 мг/мл 2 (Markossian et al., 2006). Таким образом, более низкую скорость тепловой агрегации ГАФД при концентрации 3 мг/мл, в сравнении с концентрацией 1 мг/мл, можно 0 10 20 объяснить замедлением первой стадии t (мин) Рис. 13. Кинетика тепловой агрегации ГАФД при агрегации белка — стадии диссоциации 45 °С (10 мМ Na-фосфатный буфер, pH 7,5).

Зависимости интенсивности светорассеяния, белковой молекулы.

полученные при концентрации белка 1 (1) и 3 (2) мг/мл.

Таблица 3. Кинетические параметры тепловой агрегации ГАФД при 45 °С (ГАФД) (мг/мл) Rh,0 (нм) t1 (мин) t2 (мин) t3 (мин) 97 ± 2 5,3 ±0,3 4,0 ± 0,3 8,0 ± 0, 1, 95 ± 2 3,3 ±0,3 4,5 ± 0,3 17,0 ± 0, 3, А 0.35 На рис. 14 показано распределение частиц по размерам при разных времена 0. инкубации ГАФД (1 мг/мл) при 45 °С. При 0. малых временах инкубации распределение 0.14 представлено одним пиком, соответствующим нативной форме ГАФД 0. (рис. 14А, t = 3 мин). Среднее значение 0. 1 10 100 1000 гидродинамического радиуса этого пика Б 0. Относительная интенсивность составляет 5,4 ± 0,3 нм. В ходе агрегации 0. появляется еще один пик, соответствующий агрегированному 0. состоянию белка, который со временем 0. начинает смещаться в сторону увеличения 0. Rh (рис. 14Б-В).

0.00 На рис. 15 представлены 1 10 100 В 0. зависимости величины гидроди намического радиуса белковых агрегатов, 0. образующихся в процессе тепловой 0. агрегации ГАФД (1 и 3 мг/мл), от времени.

0. Стартовые агрегаты появляются при t = 5, 0.07 и t = 3,3 мин, соответственно, при концентрациях ГАФД 1 и 3 мг/мл 0. 1 10 100 Rh (нм) (параметр t1 в таблице 3). Размер стартовых Рис. 14. Распределение частиц ГАФД (1 мг/мл) по агрегатов равен 97 ± 2 и 95 ± 2 нм при величине гидродинамического радиуса. Времена инкубации: 3 (А), 5,5 (Б) и 17 (В) мин. концентрациях ГАФД, соответственно, 1 и 3 мг/мл. В таблице 3 имеется также параметр t3 — момент времени, при котором гидродинамический радиус стартовых агрегатов начинает расти. Для концентраций ГАФД 1 и 3 мг/мл значение параметра t3 равно 8,0 ± 0,3 и 17,0 ± 0,3 мин, соответственно. Таким образом, повышение интенсивности светорассеяния в интервале значений времени от t2 = 4,0 мин до t3 = 8,0 мин при концентрации ГАФД 1 мг/мл и в интервале от t2 = 4,5 мин до t3 = 17,0 мин при концентрации ГАФД 3 мг/мл происходит исключительно вследствие накопления стартовых агрегатов без изменения их размера.

Таким образом, изучение процесса агрегации ГАФД при 45 °С показало, что образование стартовых агрегатов на первом этапе агрегации происходит по принципу «все или ничего», без образования интермедиатов.

A 400 Б 300 R h (нм) 200 100 0 0 5 10 15 0 10 t (мин) t (мин) Рис. 15. Зависимость величины гидродинамического радиуса для исходной ГАФД ( • ) и белковых агрегатов ( ) от времени для агрегации ГАФД при 45 °С. Концентрация ГАФД: 1 (А) и 3 (Б) мг/мл.

4. Влияние GroEL на тепловую агрегацию ГАФД Представляло интерес выяснить, каков механизм подавления агрегации шаперонами, не относящимися к семейству малых белков теплового шока. В качестве такого шаперона нами был выбран GroEL, относящийся к классу шаперонинов 60. GroEL состоит из 14 идентичных 57 кДа–субъединиц, образующих два гептамерных кольца с большой полостью в центре (Braig et al., 1994), (Bukau and Horwich, 1998). Способность GroEL подавлять агрегацию белковых субстратов продемонстрирована в работах Holl Neugebauer et al. (1991), Martin et al. (1992), Mendoza et al. (1992), Hartman et al. (1993), Marchenkov et al. (2006).

Для изучения механизма защитного действия GroEL нами была изучена агрегация ГАФД при 45 °С в присутствии различных концентраций GroEL. Как видно на рис. 16, 400000 добавление GroEL приводит к I (фотоотсчет/с) 3 уменьшению начального прироста интенсивности светорассеяния. На рис. 1 представлены зависимости гидродинамического радиуса Rh от времени для тепловой агрегации ГАФД 0 100 200 t (нм) (0,4 мг/мл) при концентрациях GroEL, Рис. 16. Подавление тепловой агрегации ГАФД шапероном GroEL (10 мМ Na-фосфатный буфер, равных 0,15, 0,3, 0,6 и 1,2 мг/мл.

pH 7,5). Зависимости интенсивности светорассеяния Характерная особенность этих от времени для процесса агрегации ГАФД (0, мг/мл) при 45 °С в присутствии GroEL в концентра зависимостей заключается в том, что циях: 0 (1), 0,15 (2), 0,3 (3), 0,6 (4) и 1,2 (5) мг/мл.

величина Rh остается постоянной в течение длительного времени. Расчеты показали, что среднее значение Rh,0 (52,5, 58,7, 57,1 и 61,9 нм при концентрациях GroEL 0,15, 0,3, 0,6 и 1,2 мг/мл, соответственно) очень близко к таковому в отсутствие GroEL (Rh,0 = 65,5 нм).

При временах выше t3 (таблица 5) повышение значения Rh с течением времени описывается экспоненциальной функцией. Сплошные кривые на рис. 17А-Г рассчитаны по уравнению (10). Уменьшение значения 1/t2R с повышением концентрации GroEL указывает на снижение скорости агрегации.

Таблица 5. Параметры Rh,0, t3 и 1/t2R для зависимостей Rh от времени, полученные для агрегации ГАФД (0, мг/мл), при 45 °С в отсутствие и в присутствии GroEL 1/t2R (мин-1) Концентрация Rh,0 (нм) t3 (мин) GroEL (мг/мл) 0 65,5 ± 1,3 4,5 ± 0,2 0,526 ± 0, 0,15 52,5 ± 1,9 7,7 ± 0,4 0,217 ± 0, 0,3 58,7 ± 2,3 12,3 ± 1,3 0,132 ± 0, 0,6 57,1 ± 1,3 49,2 ± 1,5 0,069 ± 0, 1,2 61,9 ± 1,5 99,5 ± 4,3 0,015 ± 0, A 800 Б 600 R h (нм) 400 200 0 0 20 40 60 0 20 40 60 В 1800 Г R h (нм) 0 0 50 100 150 200 0 100 200 t (нм) t (нм) Рис. 17. Зависимости величины гидродинамического радиуса белковых агрегатов от времени для агрегации ГАФД при 45 °С в присутствии GroEL. Концентрации GroEL: 0,15 (А), 0,3 (Б), 0,6 (В) и 0,12 (Г) мг/мл.

Сплошные кривые проведены по уравнению (10).

Известно, что тепловая агрегация ГАФД протекает в диффузионно контролируемом режиме (Markossian et al., 2006). Тот факт, что начальные участки зависимостей гидродинамического радиуса от времени для агрегации ГАФД в присутствии GroEL описываются экспоненциальным уравнением, указывает на индуцированный шапероном переход процесса агрегации из диффузионно контролируемого режима в кинетический режим, при котором вероятность слипания сталкивающихся частиц становится меньше единицы. Таким образом, механизмы защитного действия кристаллина и GroEL сходны и заключаются в снижении вероятности слипания частиц при столкновении. В то же время можно отметить следующие различия в характере взаимодействия кристаллина и GroEL с развернутыми формами ГАФД. Взаимодействие кристаллина с денатурированной ГАФД блокирует образование стартовых агрегатов (Markossian et al., 2006). Что касается GroEL, то, как показывают полученные нами данные, его взаимодействие с развернутой молекулой ГАФД не препятствует образованию стартовых агрегатов. Тем не менее, встраивание GroEL в стартовые агрегаты снижает вероятность их слипания. Можно полагать, что кристаллин и GroEL взаимодействуют с разными участками развернутой молекулы ГАФД.

5. Доказательство наличия шапероноподобной активности у дрожжевой алкогольдегидрогеназы I Кинетика агрегации дрожжевой АДГ I, изученная методом динамического светорассеяния, отличается от кинетики агрегации других белков. Особенности кинетики агрегации АДГ I таковы: начальные участки зависимости Rh белковых агрегатов от времени подчиняются экспоненциальному закону, и наблюдается расщепление популяции агрегатов на два компонента при достаточно больших временах инкубации (Markossian et al., 2006). Подобная кинетика агрегации характерна для агрегации белков в присутствии шаперонов (например, кристаллина). Нами высказано предположение, что АДГ I может защищать себя при тепловой агрегации, то есть обладает шапероноподобной активностью.

В качестве тест-системы при проверке шапероноподобной активности АДГ I была использована агрегация УФ-облученного L-кристаллина. Агрегация УФ-облученного L-кристаллина (0,2 мг/мл) протекает с достаточно высокой скоростью при 37 °С (рис. 18, кривая 1). АДГ I (1 мг/мл) при 37 °С не агрегирует (рис. 18, кривая 2). Кривая 3 (рис. 18) соответствует агрегации УФ-облученного L-кристаллина (0,2 мг/мл) в присутствии АДГ I (1 мг/мл).

250000 Из анализа представленных данных становится очевидным, что АДГ I I (фотоотсчет/с) подавляет агрегацию УФ-облученного L-кристаллина. Это доказывает, что нативная молекула АДГ I обладает 50000 шапероноподобной активностью.

Известно, что пептид 0 40 80 -YSGVCHTDLHAWHGDWPLPVK (40– t (мин) 60)-, аналогичный участку 40- Рис. 18. Влияние АДГ I на агрегацию УФ облученного L-кристаллина (100 мМ NaCl, 50 мМ аминокислотной последовательности Na-фосфатный буфер, pH 7,4). Зависимости интенсивности светорассеяния от времени.

АДГ I, обладает способностью подавлять Концентрация белков: 0,2 мг/мл УФ-облученного L-кристаллина (1), 1 мг/мл АДГ I (2) и смесь УФ- агрегацию белковых субстратов облученный L-кристаллин 0,2 мг/мл + АДГ I (Bhattacharyya, 2003). Можно полагать, что 1 мг/мл (3).

именно фрагмент 40-60 обеспечивает наличие шапероноподобной активности АДГ I.

Анализ кинетики агрегации белков методом динамического светорассеяния позволяет оценить размеры образующихся белковых агрегатов и проследить за тем, как меняется характер распределения белковых агрегатов по размеру по ходу процесса агрегации. На основании полученных данных можно судить о механизме агрегации белков, о механизме защитного действия шаперонов, а также высказать предположение о наличии внутримолекулярного шаперона в исследуемой молекуле белка.

Результаты исследований тепловой агрегации белков, выполненных в настоящей работе, согласуются с идеей о том, что начальной стадией агрегации является стадия образования стартовых агрегатов, включающих сотни молекул денатурированного белка.

Дальнейшее слипание стартовых агрегатов протекает в диффузионно-контролируемом режиме, при котором вероятность слипания частиц при столкновении равна единице. В рамках этой концепции защитное действие шаперона интерпретируется как результат уменьшения вероятности слипания стартовых агрегатов при включении в их состав шаперона.

ВЫВОДЫ 1. Тепловая инактивация митохондриальной аспартатаминотрансферазы (мААТ) из сердца свиньи происходит быстрее, чем разворачивание белковой молекулы, что согласуется с гипотезой Ch.-L. Tsou о более высокой чувствительности активного центра к денатурирующим воздействиям по сравнению с белковой глобулой.

Предложена кинетическая модель, объясняющая расхождение между скоростями инактивации и денатурации мААТ. Показано, что доля агрегированного белка совпадает с долей денатурированного белка. Установлено, что тепловая агрегация аспартатаминотрансферазы протекает в диффузионно-контролируемом режиме.

2. На основании изучения кинетики тепловой агрегации глицеральдегид-3 фосфатдегидрогеназы (ГАФД) из скелетных мышц кролика методом динамического светорассеяния получены доказательства того, что начальная стадия тепловой агрегации белков — стадия образования стартовых агрегатов из денатурированных молекул белка — протекает по принципу «все или ничего», без образования интермедиатов.

3. Показано, что механизмы подавления тепловой агрегации белков -кристаллином и GroEL сходны и заключаются в том, что в обоих случаях шаперон индуцирует переход процесса агрегации из диффузионно-контролируемого режима в кинетический режим, при котором вероятность слипания частиц при столкновении становится меньше единицы.

4. Установлено наличие шапероноподобной активности у дрожжевой алкогольдегидрогеназы I. Подобная активность позволяет объяснить необычную кинетику тепловой агрегации алкогольдегидрогеназы I, характерную для агрегации белков в присутствии шаперонов и проявляющуюся в экспоненциальном характере зависимости гидродинамического радиуса белковых агрегатов от времени.

Работа выполнена при финансовой поддержке грантами РФФИ, Программы «Молекулярная и клеточная биология» Президиума РАН и международного фонда INTAS.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых журналах:

1. Голуб Н.В., Маркосян К.А., Шолух М.В., Касилович Н.В., Клейменов С.Ю., Левицкий Д.И., Курганов Б.И. «Тепловая инактивация и денатурация митохондриальной аспартатаминотрансферазы» Доклады Академии Наук, 2007, т. 415, №5, C. 1-3.

2. Khanova H.A., Markossian K.A., Kleimenov S.Yu., Levitsky D.I., Chebotareva N.A., Asryants R.A., Muronetz, V.I., Saso L., Yudin I.K., Muranov K.O., Golub N.V., Ostrovsky M.A., Kurganov B.I. «Effect of -crystallin on thermal denaturation and aggregation of rabbit muscle glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase» Biophysical Chemistry, 2007, v. 125, p. 521–531.

3. Golub N.V., Meremyanin A.V., Markossian K.A., Eronina T.B., Chebotareva N.A., Asryants R.A., Muronetz V.K., Kurganov B.I. «Evidence for the formation of start aggregates as an initial stage of protein aggregation» FEBS Letters, 2007, v. 581, p. 4223–4227.

4. Golub N.V., Markossian K.A., Kasilovich N.V., Sholukh M.V., Orlov N.V., Kurganov B.I.

«Thermal inactivation, denaturation and aggregation of mitochondrial aspartate aminotransferase» Biophysical Chemistry, 2008, v. 135, p. 125–131.

5. Markossian K.A., Golub N.V., Khanova H.A, Levitsky D.I., Poliansky N.B., Muranov K.O., Kurganov B.I. «Mechanism of thermal aggregation of yeast alcohol dehydrogenase. I Role of intramolecular chaperone» Biochimica et Biophysica Acta, 2008, V. 1784, p. 1286–1293.

Статьи в сборниках:

1. Голуб Н.В., Маркосян К.А., Шолух М.В., Касилович Н.В., Клейменов С.Ю., Левицкий Д.И., Курганов Б.И. «Кинетика тепловой инактивации и денатурации митохондриальной аспартатаминотрансферазы» Труды III международного симпозиума под эгидой ЮНЕСКО «Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии».

Дубна, 2007, с. 128-131.

2. Маркосян К.А., Ханова Е.А., Муранов К.О., Островский М.А., Голуб Н.В., Асриянц Р.А., Муронец В.И., Касилович Н.В., Шолух М.В., Юдин Ю.К., Курганов Б.И.

«Механизм подавления агрегации белков -кристаллином» Труды III международного симпозиума под эгидой ЮНЕСКО «Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии», 2007, с. 165-168.

Тезисы докладов:

1. Голуб Н.В. «Механизм тепловой агрегации аспартатаминотрансферазы» XIII Международной конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2006». Тезисы докладов. Москва, 2006, с. 59-60.

2. Golub N.V., Markossian K.A. «Effect of alpha-crystallin on thermal denaturation and aggregation of mitochondrial aspartate aminotransferase» Abstracts of the 2nd World Conference of Stress. Budapest, Hungary, 2007, p. 24.

3. Маркосян К.А., Голуб Н.В., Курганов Б.И. «Механизм агрегации белков, содержащих внутримолекулярный шаперон» IV Съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. Тезисы докладов. Новосибирск, 2008, с. 170.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ мААТ — митохондриальная аспартатаминотрансфераза АДГ — алкогольдегидрогеназа ГАФД — глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа ДСК — дифференциальная сканирующая микрокалориметрия DLCA — diffusion-limited cluster-cluster aggregation RLCA — reaction limited cluster-cluster aggregation