Биокатализаторы на основе метилотрофных бактерий и выделенных из них ферментов как распознающие элементы амперометрических биосенсоров

На правах рукописи

КУЗНЕЦОВА ТАТЬЯНА АЛЕКСАНДРОВНА

БИОКАТАЛИЗАТОРЫ НА ОСНОВЕ МЕТИЛОТРОФНЫХ БАКТЕРИЙ

И ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ НИХ ФЕРМЕНТОВ КАК РАСПОЗНАЮЩИЕ

ЭЛЕМЕНТЫ АМПЕРОМЕТРИЧЕСКИХ БИОСЕНСОРОВ

03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата химических наук

МОСКВА -2013

Работа выполнена на кафедре химии естественно-научного факультета Тульского государственного университета и в лаборатории радиоактивных изо топов Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, г. Пущино кандидат химических наук, доцент Тульского

Научный руководитель:

государственного университета Понаморева Ольга Николаевна

Официальные оппоненты: кандидат химических наук, старший научный сотрудник лаборатории ком плексного катализа Института проблем хими ческой физики РАН Гвоздев Рудольф Иванович доктор биологических наук, заведующий лабораторией масс-спектрометрии Института биохимии и физиологии микроорга низмов им. Г.К. Скрябина РАН Зякун Анатолий Маркович Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Ведущая организация:

Защита диссертации состоится « 7 » октября 2013 г. в 16 ч.30 мин. часов на за седании Диссертационного Совета Д 212.120.01 при Московском государствен ном университете тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова (МИТХТ им. М.В. Ломоносова) по адресу 119571 Москва, пр. Вернадского, 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.В. Ломоно сова по адресу: 119571 Москва, пр. Вернадского, 86.

Автореферат разослан « 5 » сентября 2013 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат химических наук, старший научный сотрудник А.И. Лютик -2

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

* Актуальность темы исследования.

Аэробные метилобактерии, использующие метанол, и другие окисленные или замещенные производные метана в качестве источников углерода и энер гии, составляют особую физиологическую группу микроорганизмов, обладаю щих уникальной способностью строить клеточные компоненты из восстанов ленных С1-соединений (Троценко и др. 2010). Метилобактерии все более активно используются в промышленной биотехнологии, где одним из ключе вых факторов, определяющих стоимость продукта, является природа и цена ис точника углерода. Метанол, являясь доступным непищевым сырьем, служит источником углерода при культивировании продуцентов кормового белка, для биотехнологических процессов производства биоразлагаемых полимеров, био протектора – эктоина и других продуктов биосинтеза (Троценко и Торгонская 2012).

Для эффективного ведения биотехнологических процессов требуется по стоянный мониторинг потребления исходного субстрата и образования интер медиатов. В последнее десятилетие для непрерывного аналитического контроля биотехнологических процессов все более активно применяют биосенсоры (Решетилов 2005;

Bcker et al., 2011), которые характеризуются простотой, низ кой стоимостью, экспрессностью и высокой чувствительностью, в отличие от стандартных методов определения С1-соединений. Большинство биосенсоров основаны на электрохимическом типе детекции и содержат клетки или фермен ты в качестве биокатализатора (Su et al., 2011). Значительный прогресс в созда нии амперометрических биосенсоров стал возможен благодаря использованию в них медиаторов - соединений, способных к переносу электронов от активных центров ферментов на электрод. Медиаторы электронного транспорта могут взаимодействовать не только с выделенными ферментами in vitro, но и с внут риклеточными ферментами in vivo.

Ключевым фактором переноса электронов на электрод является мем бранная локализация дегидрогеназ, связанных с ферментами дыхательной цепи бактерий. Наиболее часто в качестве биокатализаторов в медиаторных биосен сорах используют уксуснокислые бактерии рода Gluconobacter, обладающие активностями основных ферментов катаболизма углеводов и спиртов – пирро лохинолинхинон (PQQ)-зависимых альдоз- и алкогольдегидрогеназ, взаимодей ствующих с медиаторами переноса электронов (Tka et al., 2009;

Инджгия с соавт., 2011). Перспективными биокатализаторами для разработки биосенсоров могут служить клетки метилобактерий, которые, подобно уксуснокислым бак териям, имеют периплазматическую локализацию PQQ- дегидрогеназ (Goodwin and Anthony 1995). Основным ферментом первичного С1-метаболизма у мети лотрофных прокариот является периплазматическая PQQ метанолдегидрогеназа (МДГ, КФ 1.1.2.7), катализирующая окисление метанола до формальдегида (ФА) и передающая электроны на специфический кислый _ *В руководстве работой и подготовке к защите принимал участие доктор биоло гических наук, профессор, зав. лабораторией ФГБУН ИБФМ им Г.К. Скрябина РАН Троценко Юрий Александрович.

-3 цитохром сL (Гвоздев c соавт., 2012). Кофактор PQQ, прочно связанный с апо ферментом, катализирует рН-зависимую двухэлектронную/протонную реак цию окисления метанола при относительно низких положительных потенциа лах, что выгодно отличает МДГ от НАД-зависимой алкогольдегидрогеназы (КФ 1.1.1.1). Важным преимуществом МДГ является независимость реакции от кислорода, в отличие от ФАД-алкогольоксидазы дрожжей (КФ 1.1.3.13) (Ikeda and Kano 2003;

Misra et al., 2012). Способность окислять токсичные одноугле родные соединения делает возможным использование этих бактерий в качестве биокатализаторов при создании амперометрических биоаналитических систем мониторинга уровня С1- соединений. Следует отметить, что взаимодействие ферментных систем метилобактерий in vivo с искусственными акцепторами электронов ранее практически не исследовалось.

Цель и задачи исследования. Цель данной работы – изучение биоката литических свойств клеток и ферментов аэробных метилобактерий как основы функционирования амперометрического медиаторного биосенсора для опреде ления содержания С1-соединений. Для достижения указанной цели в работе решались следующие задачи:

1. Определение основных физиологических параметров роста метилобакте рий как потенциальных биокатализаторов при разработке амперометри ческих биосенсоров.

2. Оценка биокаталитических свойств метилобактерий в условиях аэробно го окисления субстратов с помощью амперометрической биосенсорной системы на основе кислородного электрода.

3. Изучение биоэлектрохимического окисления метанола клетками метило бактерий в зависимости от фазы роста при использовании в качестве ме диаторов электронного транспорта редокс-соединений разных классов и определение их эффективности.

4. Определение аналитических и метрологических параметров амперомет рического медиаторного биосенсора при использовании клеток, цито плазматических и мембранных фракций метилобактерий в качестве био катализаторов.

5. Выделение, очистка и характеристика МДГ;

разработка на ее основе ам перометрического медиаторного биосенсора для количественного опре деления метанола.

Научная новизна.

Впервые показана возможность переноса электронов в биоэлектрохими ческих системах «метанол – клетки метилобактерий – медиаторы электронного транспорта – электрод» и определены индексы эффективности медиаторов 2,6 дихлорфенолиндофенола (ДХФИФ), ферроцена (ФЦ), 2,5-дибром-п бензохинона (ДББХ).

Выявлен эффект изменения субстратной специфичности при окислении спиртов различного строения, ФА и метановой кислоты клетками, цитоплазма тическими и мембранными фракциями метилобактерий в присутствии ФЦ.

Мембранные фракции Methylobacterium dichloromethanicum в данных условиях специфичны к ФА, что имеет существенное значение при создании селектив ных биосенсорных систем для анализа многокомпонентных смесей.

-4 Впервые очищена и охарактеризована МДГ Methylobacterium nodulans. Ус тановлено, что фермент является димером (м. м. нативного белка ~ 70 кДа), со стоящим из большой (60 кДа) и малой (6 кДа) субъединиц, PQQ– зависимым белком, с pI - 8,7 и константой Михаэлиса к метанолу KM = 70 мкМ. Фермент обладает высокой стабильностью при хранении.

Модификация графито-пастовых электродов гидроксиапатитом (ГА) при водила к увеличению тока биоэлектрохимического окисления метанола иммо билизованной МДГ в присутствии ФЦ, не влияя на окислительно восстановительные свойства медиатора.

Практическая значимость.

Комплексный подход по оценке биокаталитических свойств метилобак терий с использованием методов, применяемых в биосенсорной области, а так же анализ и обобщение полученных результатов выявили способность метило бактерий участвовать в биоэлектрохимическом окислении С1-соединений в присутствии акцепторов электронов, что может быть использовано в качестве научной основы при разработке высокочувствительных и экспрессных электро химических биосенсоров для количественного определения метанола и ФА.

Разработан макет биосенсорного анализатора на основе графито пастового электрода с иммобилизованной МДГ Mb. nodulans и медиатора - ФЦ для определения концентрации метанола в культуральной среде метилобакте рий при ведении биотехнологических процессов. Полученные результаты под тверждают возможность применения действующего макета биосенсорного ана лизатора как прототипа опытных образцов приборов для серийного освоения и применения.

Результаты работы внедрены в учебный процесс – поставлена новая ла бораторная работа по курсам «Биосенсоры» и «Биотехнология защиты окру жающей среды» для студентов специальностей 020100 Химия и 240901 Био технология.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на VII Москов ском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы раз вития» (Москва, 19-22 марта 2013 г.) (диплом за III место, медаль конкурса);

Всероссийских конференциях с элементами научной школы для молодежи «Экотоксикология» (Тула, 2010, 2011 и 2012 гг. (диплом победителя конкурса));

Общероссийской студенческой научной конференции «Студенческий научный форум 2011» (15 – 20 февраля 2011 г.);

14-ой международной Пущинской шко ле-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 19- апреля 2010 г.);

VI Московском международном конгрессе «Биотехнология: со стояние и перспективы развития» (Москва, 21-25 марта 2011 г.) (диплом, медаль конкурса);

Всероссийской научно-практической конференции с международ ным участием «Биологический мониторинг природно-техногенных систем»

(Киров, 29-30 ноября 2011 г.), Всероссийской с международным участием шко ле-конференции молодых ученых «Биология будущего: традиции и новации»

(Екатеринбург, 1-5 октября 2012 г.), Международной научной конференции «Достижения и перспективы развития биотехнологии» (Саранск, МГУ им. Н.П.

Огарева, 3-5 октября 2012 г.).

-5 По теме диссертации опубликованы 4 статьи в журналах, входящих в Пе речень ведущих рецензируемых журналов и изданий ВАК и 12 сообщений в форме тезисов и материалов конференций.

Место проведения работы. Экспериментальная часть работы выполня лась на кафедрах Химии и Биотехнологии ЕНФ «ТулГУ», а также в лаборато рии радиоактивных изотопов ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН в рамках проектов ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России»

(2009-2013 г) (ГК № 02.740.11.0296, ГК № П551) и РФФИ (грант 11-04-97544 р_центр_а). Автор работы является победителем конкурса Программы «Участ ник молодежного научно-инновационного конкурса», реализуемой Фондом со действия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере в 2012 г. (г. Тула), госконтракт № 11419р/17125.

Благодарности. Автор благодарен коллективам кафедр химии и биотех нологии Тульского государственного университета и сотрудникам лаборатории радиоактивных изотопов ИБФМ РАН за неоценимую помощь в проведении ис следований и интерпретации результатов. Особую признательность автор вы ражает своим научным руководителям – к.х.н., проф. Алферову В.А., к.х.н., доц. Понаморевой О.Н. и д.б.н., проф. Троценко Ю.А.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введе ния, обзора литературы, экспериментальной части, анализа результатов иссле дований, выводов и списка использованной литературы. Работа изложена на 136 стр., содержит 61 рисунок и 23 таблицы. Список литературы включает источника, из них 30 на русском и 154 на английском языках.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении дана общая характеристика диссертационной работы, изло жены актуальность темы, научная новизна и практическая значимость работы, сформулированы цель и задачи исследования.

Глава 1. В первой главе диссертации проанализирована и обобщена на учно-техническая информация по теме исследования. В первой части обзора литературы изложены особенности биологии и метаболизма метилобактерий, их биотехнологический потенциал, описаны физиолого-биохимические свойст ва метилобактерий, которые служили объектами исследований. Вторая часть обзора литературы посвящена характеристике, структуре, механизму действия МДГ. В заключительной части обзора представлены сведения о физико химических преобразователях, используемых для разработки биосенсоров ам перометрического типа, в том числе на основе бактериальных клеток и PQQ зависимых дегидрогеназ.

Глава 2. Во второй главе подробно описаны материалы и методы иссле дования.

Бактериальные штаммы. В работе использовали штаммы аэробных метилобактерий Methylovorus mays ВКМ В-2221, Methylobacterium mesophili cum JCM 2829, Methylobacterium dichloromethanicum ДМ4, Methylobacterium nodulans ORS2060Т, любезно предоставленные д.б.н., в.н.с. Н.В. Дорониной (лаборатория радиоактивных изотопов ИБФМ РАН).

-6 Условия культивирования. Культуры выращивали на качалке (180 об/мин) при 29 С в колбах Эрленмейера с 200 мл среды “К”(Doronina, Braus-Stromeyer et al. 1995), содержащей (г/л): KH2PO4 - 2, (NH4)2SO4 - 2, NaCl – 0,5, MgSO4·7H2O – 0,025, FeSO4·7H2O – 0,002, рН 7,2. Метанол вносили в сте рильные среды до концентрации 0,5 % (по объему).

Газовая хроматография. Содержание метанола на разных фазах роста метилобактерий определяли методом газо-жидкостной хроматографии, описан ным в ГОСТ 30536-97 на хроматографе Кристалл 5000.2 СКБ «Хроматэк» (Рос сия). Условия проведения хроматографии: колонка DB-FFAP (США) 50 м0,32 мм0,50 мкм;

газ-носитель – гелий, сжатый в баллоне по ГОСТ 9293 74;

температура термостата – 75 °С, испарителя (инжектора) – 200 °С, детектора ионизации в пламени – 250 °С;

скорость потока газа-носителя — 0,144 дм3/ч.

Биосенсорные измерения. Окислительную активность метилобактерий в аэробных условиях регистрировали с помощью амперометрического био сенсора на основе кислородного электрода типа Кларка «Кронас» (Россия), на рабочей поверхности которого фиксировали клетки, иммобилизованные на стекловолокнистых бумажных фильтрах типа GF/A «Whatman» (Англия).

Медиаторный биосенсор представлял собой двухэлектродную систему, в которой электродом сравнения служил хлорсеребряный, а рабочим – графито пастовый электрод (площадь поверхности 7,1 мм2). Биоматериал (клетки, мем бранные и цитоплазматические фракции или фермент) наносили на поверх ность рабочего электрода и фиксировали диализной мембраной («Sigma», США, размер пор 14 кДа). Электрохимические измерения проводили с помо щью гальвано-потенциостата IPC-Micro 8.65 «Вольта» (Россия) в калий фосфатном буфере (КФБ) с добавлением 15 мМ NH4Cl при непрерывном пере мешивании на магнитной мешалке (300 об/мин). Диапазон регистрируемых то ков 1 нА – 10 мА;

за ответ сенсора принимали амплитуду изменения между на чальной и конечной величинами силы тока до и после введения субстрата в измерительную кювету.

В качестве биоматериала для электрода использовали клетки M. mays, Mb. dichloromethanicum и Mb. mesophilicum, собранные в фазе замедления рос та. Для получения ферментных фракций клетки разрушали на ультразвуковом генераторе УЗГ13-0,1/22 (Россия) с последующим дифференциальным центри фугированием (5000 g, 15 мин;

30000 g, 30 мин) на центрифуге Avanti J-30I «Beckman Coulter, Inc.» (США) при 4 °C, получая цитоплазматическую фрак цию и фракцию суммарных мембран.

Очистка МДГ. Все стадии очистки фермента проводили при 4 °С. Клет ки ресуспендировали в 0,1 М Трис-HCl буфере (pH 7,5), содержащим лизоцим и ЭДТА, и разрушали на ультразвуковом дезинтеграторе «MSE» (Англия). Го могенат центрифугировали (18000 об./мин., 30 мин) и экстракт высаливали (NH4)2SO4, получая фракцию от 40 % до 60 % насыщения. Осадок растворяли в 10 мМ Трис-HCl буфере (pH 8,0) и обессоливали на колонке с Сефадексом G 25. Для удаления балластных белков и нуклеиновых кислот препарат пропуска ли через колонку с ДЭАЭ-сефарозой Fast Flow «GE Healthcare» (Швеция). В данным условиях МДГ на колонке не сорбировалась, поэтому препарат сразу наносили на колонку c ГА НА-Ultrogel «LKB» (Швеция), используя 10 мМ -7 Трис-HCl буфер (pH 8,0). Колонку промывали тремя объемами 0,2 М NaCl в 25 мМ КФБ (рН 7,0), и элюировали МДГ градиентом 0,025-0,25 М КФБ (рН 7,0). Активные фракции объединяли, концентрировали на ультрафильтрацион ной мембране YM10 «Amicon» (США). В заключение проводили катионооб менную ВЭЖХ на хроматографе LC-20 Prominence «Shimadzu» (Япония) на колонке (8 х 75 мм) Protein Pak Glass SP-5PW «Waters» (США), уравновешен ной 20 мМ буфером MЭС-NaOH (рН 5,5). МДГ элюировали линейным градиен том 0 – 0,25 М NaCl. Активные фракции объединяли, концентрировали и пере водили в 20 мМ КФБ (pH 7,0) ультрафильтрацией, как указано выше. Препарат хранили при -70 С.

Характеристика МДГ. Активность МДГ определяли спектрофотомет рически при 30 С с ФМС ДХФИФ в качестве акцепторов электронов по из вестной методике (Day and Anthony 1990) с незначительной модификацией ре акционной смеси. Реакцию инициировали ферментом, измеряя уменьшение поглощения при 600 нм ( = 1,9·104 М-1см-1) в течение 15-30 сек. За единицу ак тивности принимали количество МДГ, которое катализирует восстановление 1 мкмоль ДХФИФ в 1 мин.

Электрофорез проводили в градиенте (10-20 %) полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия (SDS) по методу Лэмли (Laemmli 1970). Гели окрашивали Кумасcи R250 «Serva» (Германия). Для ка либровки гелей использовали набор стандартных белков S8445 «Sigma – Al drich» (США).

Молекулярную массу (м.м.) нативного белка определяли гель фильтрацией на колонке Bio-Sil TSK 250 «Bio-Rad Laboratories Inc.» (США), откалиброванной с помощью стандартных белков MWGF200 S8445 «Sigma – Aldrich» (США). Элюирующий буфер – 0,1 М КФБ (рН 7,0). Скорость протока – 0,5 мл/мин. Белок определяли методом Брэдфорд, в качестве стандарта ис пользовали БСА.

Изоэлектрофокусирование проводили в ПААГ, используя амфолины рН 3,5 – 10 «LKB» (Швеция) по рекомендациям фирмы. Для калибровки геля ис пользовали набор стандартных белков 17-0471-01 «GE Healthcare» (Швеция).

Обработка результатов. Математическую обработку эксперименталь ных данных проводили с помощью компьютерной программы SigmaPlot 11.0 и Excel 2003.

Глава 3. В третьей главе приведены основные результаты работы и их обсуждение.

1.Сравнительная характеристика физиологических параметров роста ме тилобактерий.

В работе использовали бактерии родов - Methylobacterium и Methylovorus, реализующие различные пути первичного С1-метаболизма (сериновый – Methylobacterium;

рибулозомонофосфатный (РМФ) – Methylovorus), что может влиять на биокаталитические свойства этих бактерий и их ферментов, соответ ственно.

Кроме того, на рост метилобактерий в условиях периодического культи вирования оказывают воздействие такие факторы, как температура, степень аэрации, природа ростовых субстратов, их концентрация и др. На разных ста -8 диях роста метилобактерий функционируют различные ферментные системы, изменение которых оказывает заметное влияние на окислительную активность, и, следовательно, на биокаталитические свойства. В табл. 1 приведены основ ные физиологические параметры роста трех штаммов метилобактерий.

Таблица 1.Основные физиологические параметры роста метилобактерий.

M. mays Mb.mesophilicum Mb.dichloro Параметр ВКМ В-2221 methanicum ДМ JCM Максимальная удель 0,33±0,02 0,060±0,002 0,163±0, ная скорость роста, ч- 2,1±0,1 11,6±0,4 4,3±0, Время удвоения, ч Максимальная численность (1,5±0,2)·1010 (4,7±0,2)·1011 (1,0±0,2)· метилобактерий, КОЕ/мл 14±2 3,2±0,5 2,7±0, Выход биомассы, г/л Продуктивность по 0,23±0,03 0,021±0,004 0,039±0, биомассе, г/(л·ч) Метаболический 8,33·10-5 1,28·10-4 3,70·10- коэффициент, ч- Экономический 6,25 1,7 1, коэффициент Показано, что бактерии рода Methylobacterium уступают M. mays по ос новным параметрам. Так, максимальная удельная скорость роста M. mays ВКМ В-2221 вдвое больше таковой Mb. dichloromethanicum и в 5,5 раза, чем Mb.

mesophilicum. Как следствие, для M. mays характерно меньшее время удвоения (2,1 ч). Необходимо отметить, что бактерии рода Methylobacterium, реализую щие сериновый путь С1-ассимиляции, растут медленнее в данных условиях, чем бактерии рода Methylovorus с РМФ-путем. Как известно, РМФ-цикл более эрго номичен (Quayle 1980), что объясняет полученные результаты.

2. Потребление метанола в динамике роста метилобактерий.

Путь окисления метанола под действием ферментных систем метилобак терий последовательно через ФА и формиат до СО2 обеспечивает клетки энер гией и восстановительными эквивалентами. Причем первым ферментом, ката лизирующим окисление метанола до ФА, является PQQ-зависимая МДГ (КФ 1.1.2.7), характерная для большинства метилобактерий (Anthony 1982, 2004;

Williams et al., 2005). Следовательно, метаболическую активность бактерий в ходе их жизненного цикла можно оценивать по скорости потребления ростово го субстрата – метанола. Содержание метанола в культуральной жидкости на разных стадиях роста метилобактерий представлено на рис. 1.

-9 А540 нм [CH3OH], % об A540 нм [CH3OH], % об 1,4 2, 0,5 0, 1, 1, 1,0 0, 0, 0, 1, 0, 0, 0, 0,4 0,5 0, 0, Б 0, А 0,0 0, 0,0 0, 0 20 40 60 80 100 120 140 0 10 20 время, ч время, ч А 540 нм Рис. 1. Зависимость концентрации [CH3OH], % об.

1,6 0, метанола в культуральной среде 1, метилобактерий от времени куль 0, 1, тивирования: А) M. mays;

Б) Mb.

1,0 0, mesophilicum;

В) Mb. dichloro 0, methanicum.

0, 0, 0, 0, В 0, 0,0 0, 0 10 20 30 40 50 время, ч Наиболее активно метаболизирует метанол M. mays (скорость потребле ния метанола v = 0,018 % об.·ч-1), реализующий РМФ-путь. Более низкая ско рость усвоения метанола у бактерий с сериновым путем: Mb. mesophilicum (v = 0,003 % об.·ч-1) и Mb. dichloromethanicum (v = 0,009 % об.·ч-1) может быть обу словлена слабой активностью МДГ. Это согласуется с вышеизложенными ре зультатами определения ростовых параметров изучаемых штаммов.

Полученные данные свидетельствуют о том, что для разработки биосен соров каталитического типа в качестве биорецепторного элемента перспектив на культура M. mays. Однако для дальнейшего изучения биокаталитических свойств метилобактерий использовали триаду штаммов, поскольку представля лось логичным получить сравнительную характеристику бактерий с разными путями С1-метаболизма для применения в качестве биораспознающего элемен та биосенсора.

3. Спектр окисляемых субстратов клетками метилобактерий в аэробных условиях.

Для определения спектра окисляемых органических соединений клетками метилобактерий оценивали их дыхательную активность по отношению к раз личным субстратам с помощью амперометрической биосенсорной системы на основе кислородного электрода Кларка. В качестве субстратов использовали спирты, амины, галометаны, глюкозу, т.к. известно, что метилобактерии спо собны окислять эти субстраты, наряду с некоторыми другими соединениями - 10 (нитропроизводные, амиды и сложные эфиры карбоновых кислот и др.) (Троценко с соавт., 2010).

Принцип работы такого биосенсора заключается в окислении клетками органических соединений, добавляемых в измерительную ячейку. В результате возрастает дыхательная активность клеток, а концентрация кислорода в при электродном пространстве снижается, что регистрируется электродом Кларка.

Сила тока пропорциональна концентрации кислорода в исследуемом образце.

На монитор выводится графическое отображение изменения силы тока во вре мени. По полученному отклику вычисляли ответ сенсора как максимальную скорость изменения силы тока от времени. Регистрируемое изменение концен трации кислорода позволяет судить о дыхательной активности клеток на по верхности электрода и, следовательно, о концентрации окисляемых соединений (Понаморева с соавт., 2010). Скорости окисления различных субстратов, опре деленные посредством амперометрической биосенсорной системы с метило бактериями в качестве биокатализаторов, представлены на рис.2.

Mb. dichloromethanicum Mb. mesophilicum M. mays ответ сенсора, нА/с трихлорметан 1,2,3-пропанотриол дихлорметан пропанол- пропанол- бутанол- бутанол- диэтиламин нитрометан этанол формальдегид 2-метилпропанол- 3-метилбутанол- глюкоза бензиловый спирт этилацетат ацетамид метанол циклогексанол метановая кислота Рис.2. Профиль субстратной специфичности клеток метилобактерий в аэробных условиях, полученный с помощью амперометрического биосенсора на основе электрода Кларка.

Так, наибольшие ответы сенсоров на основе трех штаммов метилобакте рий получены на метанол, этанол, ФА, пропанол-1, бутанол-1, муравьиную ки слоту и изоамиловый спирт, что связано с активностью мембранной МДГ. Из вестно, что МДГ, не являясь узкоспецифичным ферментом, кроме метанола, может окислять ФА и другие первичные спирты (С1–С5), но слабо взаимодейст - 11 вует с их вторичными и третичными изомерами (Гвоздев с соавт., 2012). Ак тивность фермента снижалась с увеличением длины углеродной цепи субстра та. Значительный ответ биосенсора на ФА также может быть обусловлен высо кой активностью формальдегиддегидрогеназы (ФАДГ) – фермента пути прямого окисления ФА.

Ответ биосенсора c клетками M. mays на бензиловый спирт составил 58 % относительно метанола, что косвенно согласуется с данными, о том, что МДГ некоторых метилобактерий может окислять ароматические спирты, хотя суб стратная специфичность относительно метанола составляет 45 - 60 % (Mountfort 1990).

Низкую окислительную активность клеток наблюдали по отношению к галогенпроизводным алканов, нитрометану, а также к первичным и третичным аминам. Как известно, Mb. dichloromethanicum участвует в окислительной дест рукции галометанов, однако для этого необходимо индуцировать ферментные системы, катализирующие превращения галометанов, при чем способность окислять метанол у таких бактерий снижается (Liesinger and Braus-Stromeyer 1995).

В целом, M. mays характеризуется достаточно высокими значениями окислительной активности по отношению практически ко всем исследуемым субстратам, что может быть связано с более высокими активностями фермен тов. Так, удельная активность МДГ в экстрактах M. mays составляла 0,58 Е/мг белка, а для Mb. nodulans - 0,27 Е/мг белка.

4. Биоэлектрохимическое окисление метанола метилобактериями в присутствии ферроцена.

В клетках метилобактерий метанол окисляется до ФА под действием фермента PQQ-МДГ, передавая электроны на специфический кислый цитохром сL. Напротив, известно, что in vitro МДГ проявляет активность с искусственны ми акцепторами электронов, такими как феназинмето- /этосульфат (Ghosh and Quayle 1979;

Гвоздев и др. 2012). Эффективный перенос электронов от фермен та in vivo на электрод возможен при использовании природных или синтетиче ских соединений, способных диффундировать через клеточную мембрану и взаимодействовать с восстановленными сайтами бактерий. Для изучения био электрохимического окисления метанола метилобактериями на разных стадиях роста использовали ФЦ, который широко применяется в качестве медиатора при разработке электрохимических биосенсоров на основе клеток и ферментов, представляя собой высоко обратимую окислительно-восстановительную систе му (Чигринова с соавт.,. 2007;

2008).

Процесс окисления метанола мембранной МДГ в присутствии ФЦ мо жет быть представлен следующим образом:

Анод (подается потенциал 250 мВ относительно хлорсеребряного элек трода сравнения):

СН3ОН + PQQ-МДГ HСОН + PQQH2-МДГ PQQH2-МДГ + 2[Fе(С5Н5)2]+ PQQ-МДГ + 2 Fe(C5H5)2 + 2H+ Fe(C5H5)2 - 1e- [Fе(С5Н5)2]+ - 12 - AgCl + e Ag + Cl Катод:

Активные центры ферментов способны взаимодействовать с ферроцений ионом, восстанавливая его до ферроцена. При наложенном на рабочий электрод потенциале ФЦ окисляется до ферроцений иона и вступает в новый цикл взаи модействий.

Эффективность окисления метанола метилобактериями в присуствии ФЦ изучали электрохимическим методом с помощью амперометрической биосен сорной системы, сравнивая величины отклика сенсора на одну и ту же концен трацию субстрата. Рабочим электродом в этой системе служил графито пастовый электрод, содержащий в составе пасты ФЦ, а на поверхности – клетки метилобактерий, собранные на разных стадиях роста.

ответ сенсора, ответ сенсора, А540нм А540нм % от макс.

% от макс. 100 2, 1, 1 3 4 1, 2, 1, 1,2 1, 1,0 1 2 3 4 5 1, 0, 0,6 0, 0, 0,2 0, Б 0,0 A 0 0 10 20 30 40 50 0 50 100 150 время, ч время, ч Рис. 4. Зависимость окислительной ответ сенсора, А540нм активности метилобактерий: А) Me % от макс.

1, thylovorus mays, Б) Methylobacterium 1,6 mesophilicum, В) Methylobacterium di chloromethanicum (ответ сенсора,% 1, от максимального) и оптической 1, плотности A540нм от времени культи 1,0 1 2 3 4 5 вирования;

0,8 1 – лаг – фаза, 2 – фаза ускорения роста, 0, 3 – экспоненциальная фаза, 4 – фаза 0, замедления, 5 – стационарная фаза.

0,2 В 0,0 0 20 40 60 80 100 время, ч Как видно на рис. 4, три штамма метилобактерий проявляли максималь ную активность в экспоненциальной фазе роста, когда уровни и активность ферментов в клетках наибольшие, в то время как, в логарифмической и стацио нарной фазах роста окислительная активность низкая. Напротив, M. mays ха рактеризуется повышенной окислительной активностью к метанолу практиче ски на всех стадиях роста. Эти факты согласуются с результатами изучения метаболической активности метилобактерий по скорости потребления метано ла.

- 13 Исходя из полученных результатов, для дальнейшего изучения взаимо действия ферментных систем метилобактерий с искусственными акцепторами электронов использовали клетки, собранные в экспоненциальной фазе роста.

6. Эффективность медиаторов электронного транспорта в процессе биоэлектрохимического окисления метанола клетками метилобактерий.

Для определения возможности применения редокс-соединений разных классов (ферроцены, хиноны, индофенолы) в качестве медиаторов в биосенсо рах на основе клеток метилобактерий изучали биоэлектрохимическое окисле ние метанола в присутствии медиаторов электронного транспорта: ФЦ, ДББХ и ДХФИФ. Использовали ранее предложенную модель, где окисление субстрата суспендированными (Ikeda et al., 1996) или иммобилизованными (Babkina et al., 2006) клетками бактерий в присутствии медиаторов переноса электронов рас сматривается как бисубстратная ферментативная реакция, протекающая по ме ханизму «пинг-понг». Мы предположили, что окисление метанола при исполь зовании в качестве биокатализатора клеток метилобактерий будет протекать по аналогичной схеме, в которой первым субстратом является метанол, а вторым – медиатор.

k1 k (1);

Р + Eв S + Eок ES k- k3 k Мок + Ев ЕМ Мв + Еок (2), k- где S и P – субстрат и продукт;

Moк и Mв – окисленная и восстановленная форма медиатора в клетке соответственно;

Eoк и Eв – фермент, локализованный на мембране бактериальной клетки в окисленной и восстановленной форме, соот ветственно;

k1, k-1, k2, k3, k-3 и k4 – константы скоростей соответствующих ста дий реакции.

Общее уравнение для силы тока биоэлектрохимического окисления мета нола ферментными системами бактерий, основанное на механизме «пинг понг», имеет вид:

I max = n F k кат [ E ] (4), I max I= (3), 1+ K S [S ] + K M [M ] где KS и KM – эффективные константы Михаэлиса для субстрата и медиатора, учитывающие распределение субстрата и медиатора между компонентами клетки и раствором, соответственно;

[E]–концентрация ферментов in vivo на единицу площади поверхности электро да.

Исходя из предложенной модели, процесс биоэлектрохимического окис ления субстрата ферментными системами бактерий можно охарактеризовать тремя параметрами: максимальной силой тока Imax, эффективными константами Михаэлиса для этанола и медиатора KS и KM:

k k k +k k +k k k кат = 2 4 (5), k K S= 1 2 (6), K M= 3 4 (7), k 2+ k 4 k 2 + k 4 k 1K S, p k 2 + k 4 k 3 K М, p - 14 где KS,p и KM,p – константы распределения субстрата и медиатора, соответст венно, между внутренней средой клетки и внешним раствором.

Параметры окисления метанола в присутствии медиаторов электронного транспорта можно рассчитать, используя уравнения типа Михаэлиса-Ментен (8) - (9), полученные из уравнения (3) при условии избытка медиатора или суб страта в системе:

I max KS I= 1 избыток субстрата при 1 + K M [M ] (8) [S ] I max KM I= 1 избыток медиатора при (9) 1 + K S [S ] [M ] Значения силы тока при варьировании исходной концентрации метанола (в условиях избытка медиаторов) и концентрации медиаторов (в условиях из бытка метанола) при использовании в качестве биокатализатора клеток M. mays представлены на рис. 5.

ответ сенсора, нА Б ответ сенсора, нА A 1400 ДББХ ФЦ 800 ДХФИФ 600 ДХФИФ 400 ДББХ 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1, [ДББХ/ФЦ], ммоль/г 200 ФЦ 0 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1, [ДХФИФ], мМ 0 2 4 6 8 10 12 [CH3OH], мМ Рис.5. Зависимость ответов биосенсора с электродом на основе клеток M.

mays от концентрации а) метанола в условиях избытка медиаторов или б) медиаторов в условиях избытка метанола.

Аналогичные зависимости были получены для медиаторных электродов на основе клеток Мb. mesophilicum. Эти зависимости имели гиперболический вид и были аппроксимированы по уравнениям (8) и (9). Параметры биоэлектро химического окисления метанола: максимальная сила тока Imax, эффективные константы Михаэлиса для метанола KS и для медиатора KM представлены в таб лицах 2 и 3.

- 15 Таблица 2. Параметры биоэлектрохимического окисления метанола клетками M. mays в присутствии медиаторов электронного транспорта.

Imax, мкА Imax/Кs Imax/КM Медиа- Кs, мМ КM, мМ Условия тор метанол 2,40±0,05 0,030±0,001 80± 6,25 мМ ДХФИФ ДХФИФ 2,0±0,1 0,5±0,1 4,0± 0,25 мМ метанол 1,21±0,02 0,036±0,002 34± 6,25 мМ ФЦ ФЦ 0,74±0,02 0,33±0,02 2,2±0, 0,54 мМ/г метанол 2,8±0,1 0,025±0,004 110± 6,25 мМ ДББХ ДББХ 1,3±0,1 1,8±0,2 0,7±0, 0,13 мМ/г Таблица 3. Параметры биоэлектрохимического окисления метанола клетками Мb. mesophilicum в присутствии медиаторов электронного транспорта.

Imax, мкА Imax/Кs’ Imax/К’M Кs’, мМ К’M, мМ Медиатор Условия метанол 0,05±0,01 0,11±0,01 0,5±0, 6,25 мМ ДХФИФ 0,55±0, ДХФИФ 0,47±0,03 0,9±0, 0,25 мМ метанол 0,22±0,01 0,044±0,003 5,0±0, 6,25 мМ ФЦ 0,81±0, ФЦ 0,15±0,01 0,18±0, 0,54 мМ/г метанол 0,46±0,03 0,017±0,004 27± 6,25 мМ ДББХ 0,32±0, ДББХ 0,27±0,02 0,9±0, 0,13 мМ/г Из уравнений (4-7) следует, что отношение Imax/KS характеризует бимоле кулярное взаимодействие фермента с метанолом и не зависит от используемого медиатора (10), а отношение Imax/KM характеризует взаимодействие медиатора с ферментом и дает индекс эффективности медиатора электронного транспорта (11).

- 16 I max n F [ E ] K S, p k 1k 2 I max n F [ E ] K М, p k 3 k = = (10) (k 1+ k 2 ) (k 3+ k 4 ) KS KM (11) Сравнительный анализ индексов эффективности медиаторов электронно го транспорта в биосенсорах на основе метилобактерий с ранее полученными рядами эффективности для подобных сенсоров на основе Gluconobacter oxydans (табл. 4) выявил, что ДББХ способен взаимодействовать с ферментными систе мами бактерий in vivo лучше других медиаторов.

Таблица 4. Индексы эффективности медиаторов электронного транспорта для бактериальных систем.

Медиатор ДХФИФ ФЦ ДББХ Биокатализатор M. mays 80±1 34±1 110± Мb. mesophilicum 0,5±0,3 5,0±0,1 27± Gluconobacter oxydans* 3,3±0,8 120±20 370± * - литературные данные (Babkina et al., 2006) При выборе медиатора электронного транспорта для дальнейшего изуче ния биокаталитических свойств метилобактерий и разработки макета биосенсо ра необходимо учитывать стабильность работы электродов. Данный параметр определяется операционной стабильностью биосенсоров, характеризующей ус тойчивость ответа сенсора на одну и ту же концентрацию субстрата при прове дении большого числа последовательных измерений. Показано, что наилучшей стабильностью обладают сенсоры на основе клеток M. mays и Мb. mesophilicum при использовании медиатора ФЦ, который был выбран для дальнейшего изу чения биокаталитических свойств ферментов метилобактерий.

6. Окисление субстратов клетками и ферментными фракциями метилобактерий в присутствии ферроцена.

Нами высказано предположение, что использование разрушенных клеток метилобактерий в качестве биокатализаторов увеличит доступность соответст вующих ферментов для медиатора ФЦ. Клетки, выращенные до экспоненци альной фазы роста, разрушали ультразвуком и подвергали дифференциальному центрифугированию. Учитывая, что дегидрогеназы метилобактерий имеют ци топлазматическую и мембранную локализацию, в дальнейших исследованиях использовали цитоплазматическую фракцию и фракцию суммарных мембран в качестве биокатализаторов в сравнении с интактными клетками.

Для изучения специфичности биокатализаторов оценивали величину от кликов сенсора на одну и ту же концентрацию субстрата. Результаты биоэлек трохимического окисления субстратов клетками и ферментными фракциями метилобактерий представлены на рис. 6-8.

- 17 ответ сенсора, нА ответ сенсора, нА Рис. 6. Профиль субстратной специфичности клеток метилобактерий Рис. 7. Профиль субстратной специфичности цитоплазматических Метанол Метанол Этанол Этанол фракций метилобактерий в присутствии ФЦ.

Пропанол- Пропанол- Пропанол- Пропанол- 1,2,3-Пропантриол 1,2,3-Пропантриол Бутанол- Бутанол- Бутанол- в присутствии ФЦ.

Бутанол- 2-Метилпропанол- 2-Метилпропанол- 3-Метилбутанол- 3-Метилбутанол- - 18 Циклогексанол Циклогексанол Бензиловый спирт Бензиловый спирт Формальдегид Формальдегид Метановая кислота Метановая кислота Ацетамид Ацетамид Mb. dichloromethanicum Mb. mesophilicum M. mays Этилацетат Этилацетат Mb. dichloromethanicum Mb. mesophilicum M. mays Этиламин Этиламин Диэтиламин Диэтиламин Дихлорметан Дихлорметан Трихлорметан Трихлорметан Нитрометан Нитрометан Глюкоза Глюкоза M. mays 1600 Mb. mesophilicum Mb. dichloromethanicum ответ сенсора, нА Метанол Пропанол- Пропанол- 2-Метилпропанол- Этанол 1,2,3-Пропантриол Циклогексанол Формальдегид Метановая кислота Глюкоза Бутанол- Бутанол- 3-Метилбутанол- Рис. 8. Профиль субстратной специфичности мембранных фракций метилобактерий в присутствии ФЦ.

Высокие ответы сенсоров на ФА, как уже упоминалось, обусловлены ак тивностью цитоплазматической ФАДГ или неспецифическим окислением МДГ гидратированной формы ФА (гемдиола). В целом, M. mays характеризуется по вышенными значениями окислительной активности по отношению ко всем субстратам. Однако, если сравнить ответы сенсора на основе клеток M. mays и видов рода Methylobacterium на муравьиную кислоту можно увидеть следую щую закономерность: относительный ответ сенсора на основе M. mays состав ляет около 50 % от максимального ответа (ФА), тогда как для представителей рода Methylobacterium он сопоставим с максимальными ответами. Известно, что НАД-зависимая формиатдегидрогеназа, катализирующая окисление мета новой кислоты, имеет низкий уровень активности или вообще отсутствует у метилобактерий с РМФ-циклом (Доронина с соавт., 2000), что согласуется с выявленной закономерностью. Примечательно, что профили субстратной спе цифичности клеток метилобактерий, полученные посредством биоэлектрохи мического окисления субстратов в присутствии ФЦ (рис. 6) и в условиях аэроб ного окисления (рис. 2) коррелируют.

Значительное снижение ответов сенсора на основе мембранных и цито плазматических фракций метилобактерий на метанол и другие спирты, по срав нению с ответами сенсора на основе клеток, можно объяснить низким содержа нием активатора МДГ – ионов аммония. Известно, что NH4+ необходим для проявления активности МДГ с искусственными акцепторами электронов in vi tro (Reddy and Bruice 2004), но не всегда в присутствии цитохрома (Anthony 1992). Измерения проводили в КФБ при физиологическом значении pH 7,5, то гда как активной формой является аммиак, для которого необходимо более ще лочное значение (pH 8-9). Резонно предположить, что при использовании в ка - 19 честве биокатализатора интактных клеток бактерий активность МДГ сохраня ется даже при низкой концентрации активатора.

Следует отметить, что разрушение клеток M. mays приводило к значи тельному ингибированию каталитической активности как в экстрактах, так и в мембранных фракциях, свидетельствуя о низкой стабильности фермента в дан ных условиях. При этом цитоплазматические фракции Mb. mesophilicum и Mb.

dichloromethanicum в присутствии ФЦ характеризовались значительным увели чением специфичности к ФА.

Поскольку избирательность биосенсорного анализа определяется специ фичностью биоматериала, использование мембранной фракции Mb. dichloro methanicum обеспечивает селективный анализ уровня ФА.

8. Очистка и характеристика МДГ Methylobacterium nodulans.

Для очистки и характеристики фермента использовали два штамма мети лобактерий с разными путями первичного С1-метаболизма: M. mays и Mb. nodu lans. Однако предварительные эксперименты показали, что активность МДГ в экстрактах M. mays через 5 сут хранения снизилась на 90 %, что указывало на низкую стабильность фермента и необходимость подбора стабилизаторов белка для дальнейших исследований. В то же время, мониторинг активности МДГ в экстрактах Mb. nodulans после хранении при 4 и -20 С выявил незначительное снижение активности, поэтому для очистки фермента была выбрана именно эта культура.

Одностадийная очистка МДГ Mb. nodulans катионообменной хромато графией, в отличие от фермента из Methylobacterium extorquens AM1 (Liu et al., 2006), не привела к получению гомогенного препарата. Поэтому для очистки использовали многостадийную процедуру, включающую ионообменную хро матографию на анионите ДЭАЭ-сефарозе, хроматографию на геле ГА, катио нообменную хроматографию и ультрафильтрацию. Бесклеточный экстракт предварительно фракционировали сульфатом аммония благодаря чему, несмот ря на потери, достигалась очистка в 6 раз. После заключительной катионооб менной ВЭЖХ и концентрирования степень очистки фермента составила 18,2 с удельной активностью 3,9 Е/мг белка. Результаты очистки МДГ представлены в табл. 5.

Таблица 5. Очистка МДГ из Methylobacterium nodulans.

Уд. актив- Белок, Общ. ак- Общий Выход, Степень Стадия очистки ность, Е/мг мг/мл тивность, Е белок, мг очистки % 0,21 11,1 227,0 1080 100 Экстракт 1,23 23,3 107,3 87,4 47 5, 40-60% (NH4)2SO 2,53 1,0 77,2 30,5 34 12, ДЭАЭ-сефароза 3,68 0,34 72,4 19,7 32 17, НА-Ultrogel 3,78 0,75 62,5 14,3 28 Ультрафильтрация 3,82 1,38 52,7 13,8 23 18, ВЭЖХ на SP-5PW Молекулярная масса и субъединицы МДГ. Используя данную схему очистки, был получен электрофоретически гомогенный препарат МДГ (рис.9).

Денатурирующий SDS-ПААГ - электрофорез очищенного белка выявил при - 20 сутствие большой и малой субъединиц с м. м. 60,5 кДа и 6,5 кДа соответствен но, что совпадает со значениями, рассчитанными на основании транслирован ных нуклеотидных последовательностей генов mxaF большой (62548 Да) и ма лой mxaI субъединиц (5838 Да) МДГ (Refseq/GenBank NC_011894/ CP001349).

М.м. нативного белка, определенная методом гель-фильтрации, составляет око ло 70 кДа, что соответствует гетеродимеру (), при этом белковый пик на хроматограмме соответствовал пику активности МДГ. Ранее аналогичным ме тодом (Duine and Jongejan 1989) было показано существование мономерной формы МДГ у некоторых метанотрофов, хотя для большинства позднее доказа на 22 структура.

Рис.9. SDS-ПААГ электрофорез МДГ на раз ных стадиях очистки. 1 – гомогенат, 2 – 40-60 % (NH4)2SO4, 3 – ДЭАЭ сефароза, 4 - НА-Ultrogel и ультрафильтрация, 5,6 – SP 5PW, М – маркеры.

pI. Изоэлектрическая точка МДГ равна 8,7, как и у большинства ранее изученных МДГ грамотрицательных бак терий.

Кофактор МДГ. В спектре поглощения МДГ Mb. nodulans наблюдали максимум при 350 нм и ши рокое плечо абсорбции до 410 нм. Такой спектр идентичен спектрам «классиче ских» PQQ-МДГ метилобактерий и свидетельствует о присутствии в белке вос становленной формы PQQ. Именно в таком виде находится данная простетическая группа в чистых препаратах изученных ранее МДГ(Frank and Duine 1990;

Richardson and Anthony 1992).

Стабильность МДГ. Фермент Mb. nodulans характеризуется относи тельно высокой стабильностью при хранении в отсутствии метанола нежели ранее изученные МДГ. Очищенный препарат в 20 мМ КФБ (рН 7,0) при 4 оС терял приблизительно 20 % активности за неделю и 40 % при - 20 оС в месяц.

Интересно, что при -70 оС активность МДГ не изменялась в течение двух меся цев. В отличие от большинства МДГ, фермент Mb. nodulans стабилен в широ ком диапазоне рН даже в отсутствии стабилизаторов, таких как цианид и мета нол. МДГ Mb. nodulans в 0,1 М КФБ (рН 6,0) сохраняла активность в течение 20 мин при 50 оС, тогда как при 60 оС потеря активности составляла 35 %.

Зависимость активности МДГ от pH. Максимальную активность фермент проявлял в диапазоне рН 9,0 – 10,0. Выше рН 10 активность не уда лось измерить из-за неустойчивости ФМС и ДХФИФ. Оптимум рН находился в щелочной области при рН 9 и выше, что характерно для всех изученных ранее МДГ в системах с искусственными акцепторами электронов.

Зависимость активности МДГ от температуры. Активность МДГ в 0,1 М трис-HCl буфере (рН 9,0) в стандартной реакционной смеси линейно воз - 21 растала с увеличением температуры от 20 до 50 оС. При более высоких темпе ратурах получить достоверные значения активности не удалось из-за нефер ментативных реакций ФМС и ДХФИФ.

Активаторы МДГ. Аналогично другим PQQ–МДГ, активность МДГ Mb.

nodulans c искусственными акцепторами электронов in vitro зависела от при сутствия активатора – NH4+. В отсутствии NH4Cl реакции с метанолом и эндо генным субстратом не наблюдали. Половина максимальной скорости достига лась при концентрации NH4Cl 1,2 ± 0,3 мМ, когда акцептором являлся ФМС.

Кроме NH4Cl, слабым активирующим действием обладал метиламин.

Субстратная специфичность МДГ. Подобно другим PQQ – МДГ, ис следуемый фермент проявлял широкую субстратную специфичность относи тельно первичных спиртов, но не окислял вторичные и бензиловый спирты, при этом обладал наибольшим сродством к метанолу (KM = 70 мкМ). В целом, с увеличением длины углеродной цепи первичных спиртов, возрастало кажущее ся значение КМ фермента, тогда как Vmax изменялась незначительно. Субстра тами также являются ФА и ацетальдегид, которые, как известно, при высоких концентрациях ингибируют МДГ. Примечательно, что ФМС оказался более эффективным акцептором электронов, чем ФЭС.

Итак, высокая стабильность и сродство к метанолу дают основания счи тать МДГ Mb. nodulans перспективным ферментом для создания амперометри ческого биосенсора. Очищенный препарат МДГ был иммобилизован на по верхности графито-пастового электрода, содержавшего медиатор электронного транспорта – ФЦ. Для улучшения адсорбции гидрофильного фермента на по верхности гидрофобного электрода в графитовую пасту добавляли ГА. При этом увеличивался ответ биосенсора и улучшалась операционная стабильность электрода. Введение в графитовую пасту ГА так же расширило рН-оптимум ак тивности МДГ, иммобилизованной на поверхности электрода. Благодаря этому удалось проводить измерения практически без потери чувствительности при рН 9.

9. Сравнительный анализ характеристик медиаторных биосенсоров.

В работе были определены параметры биосенсоров на основе всех типов изучаемых биокатализаторов, из которых выбраны наиболее перспективные (таблица 6).

Селективность. При изучении субстратной специфичности всех типов биокатализаторов показано, что максимальные ответы сенсоров получены на метанол, его гомологи (С1-С5) и ФА, причем биосенсор на основе мембранных фракций Mb. dichloromethanicum оказался селективным по отношению к ФА.

Чувствительность. На коэффициент чувствительности может влиять доступность ферментов и их активность. Коэффициенты чувствительности для сенсоров с ферментными фракциями Mb. dichloromethanicum в качестве биока тализаторов превосходят значение коэффициента чувствительности клеточного сенсора, что объясняется лучшей доступностью активных центров ферментов для субстрата и медиатора. Уместно отметить, что высокое значение коэффи циента чувствительности к ФА сенсора на основе цитоплазматической фракции согласуется с локализацией ФАДГ в цитозоле. Биосенсор на основе очищенно го препарата МДГ обладал наилучшим коэффициентом чувствительности, од - 22 нако уменьшение рабочего диапазона за счет снижения верхней границы опре деляемых концентраций не всегда удобно, т.к. требуется дополнительное раз ведение образца.

Таблица 6. Характеристики медиаторных биосенсоров на основе кле ток, ферментных фракций и МДГ метилобактерий.

Цитоплазмати- Мембранная Клетки ческая фракция фракция Mb. МДГ Параметр M. mays Mb. dichloro- dichloromethani- Mb. nodulans methanicum cum 21±1 3000± Коэффициент чувстви 42±2 25± тельности, нА/мМ 980±90* 7200±300* 0,14 0, Предел обнаружения, 0,06 0, мМ 0,03* 0,0045* Верхняя граница линей- 8± 1,5±0, ного диапазона опреде 0,33±0,02 7,9±0,4 7,0±0, ляемых концентраций 0,49±0,03* * (KM), мМ Операционная стабиль 4,2 6,6 7,3 7, ность, (n=15), % Стабильность, потеря 90 33 63 активности за 10 сут, % Примечание: анализируемое вещество – ФА, *- метанол.

Стабильность. Изучение операционной стабильности показало, что сен соры на основе всех типов биокатализаторов имели стабильные отклики на рас твор метанола (относительное стандартное отклонение для 15 последователь ных измерений в пределах 8 %).

Установлено, что наилучшим показателем долговременной стабильности биокатализатора характеризовался МДГ-сенсор, который сохранял высокие от веты в течение максимального периода времени. Выше отмечалось, что МДГ Mb. nodulans обладает достаточной устойчивостью при хранении, а присутст вие добавки ГА в графитовой пасте может дополнительно стабилизировать фермент, тем самым улучшая этот показатель биосенсора.

Экспрессность. Временные затраты метода, которые в первую очередь определяются длительностью единичного измерения, зависят от концентрации субстрата и типа биокатализатора. Установлено, что время единичного измере ния с учетом регенерации электрода для всех типов изучаемых биокатализато ров не превышало 10 мин.

Таким образом, клетки, ферментные фракции и МДГ метилобактерий мо гут служить эффективными биокатализаторами амперометрических медиатор ных биосенсоров для определения концентраций метанола и ФА. Использова ние ферментных фракций бактерий рода Methylobacterium позволило повысить селективность и чувствительность биосенсора к ФА. Применение модифициро ванных ГА и ФЦ графито-пастовых электродов на основе очищенной МДГ Mb.

nodulans обеспечивало высокие токи биоэлектрохимического окисления мета нола и увеличение стабильности биосенсора.

- 23 ВЫВОДЫ Определены физиологические параметры роста трех штаммов аэробных 1.

метилобактерий как перспективных биокатализаторов амперометриче ских биосенсоров. Наиболее эффективным деструктором метанола являет ся Methylovorus mays, который характеризуется максимальными показате лями: удельной скорости роста - 0,33±0,02 ч-1;

выхода биомассы - 14±2 г/л;

метаболическим и экономическим коэффициентами - 8,33·10-5 и 6,25, соот ветственно, а также скоростью потребления метанола v = 0,018 % об.·ч-1.

Установлено, что исследуемые метилобактерии проявляют максимальную 2.

биоэлектрохимическую активность в фазе экспоненциального роста в при сутствии ферроцена как медиатора электронного транспорта. Максималь ные ответы медиаторных сенсоров на основе метилобактерий получены на формальдегид (112 %), метанол (100 %) и его гомологи: этанол, пропанол 1, бутанол-1 – 88 %, 78 %, 77 %, соответственно, что согласуется с данны ми окисления субстратов в аэробных условиях.

Впервые показано, что искусственные акцепторы электронов – ферроцен 3.

(ФЦ), 2,6-дихлорфенолиндофенол (ДХФИФ) и 2,5-дибром-п-бензохинон (ДББХ), могут функционировать в биоэлектрохимических системах «мета нол – метилобактерии – медиатор – электрод». Определены ряды эффек тивности медиаторов переноса электронов: для биосенсоров на основе M.

mays – ФЦДХФИФДББХ, и Methylobacterium mesophilicum – ДХФИФ ФЦ ДББХ.

Выявлено, что биосенсор на основе клеток M. mays обладал хорошей опе 4.

рационной стабильностью (Sr = 4,2 %, P = 0,95, n = 15);

биосенсор на осно ве мембранных фракций Mb. dichloromethanicum обеспечивал селективное определение формальдегида, тогда как биосенсор на основе МДГ Mb.

nodulans имел наилучшие показатели чувствительности к метанолу (7200±300 нА/мМ) и долговременной стабильности (потеря активности за 10 сут не превышала 12 %).

Метанолдегидрогеназа Mb. nodulans впервые очищена до электрофорети 5.

чески гомогенного состояния и охарактеризована. М. м. нативного белка ~ 70 кДа, состоит из большой (60 кДа) и малой (6 кДа) субъединиц, pI - 8,7, рН – оптимум активности в пределах 9-10, обладает наибольшем сродст вом к метанолу (KM = 70 мкМ) и высокой стабильностью. Иммобилизован ный фермент использовали для амперометрической детекции метанола в линейном диапазоне от 0,0135 до 0,5 мМ, с пределом обнаружения – 4,5 мкМ.

- 24 Основное содержание диссертации изложено в следующих публика циях:

Статьи в реферируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ:

1. Кузнецова Т.А., Бесчастный А.П., Понаморева О.Н., Троценко Ю.А.

Очистка и свойства метанолдегидрогеназы ризосферного фитосимби онта Methylobacterium nodulans // Прикл. биохим. микробиол. – 2012. – Т. 48 (№ 6). – С. 606-611.

2. Кузнецова Т.А., Понаморева О.Н., Решетников А.С., Горячева А.А.

Биоэлектрокаталитическое окисление формальдегида метилобакте риями Methylobacterium dichloromethanicum ДМ4 в присутствии ме диатора электронного транспорта – ферроцена. // Известия ТулГУ. Ес тественные науки. Тула: Изд-во ТулГУ.- Вып. 1. – 2012. – C. 236-245.

3. Кузнецова Т.А., Понаморева О.Н., Алферов В.А. Эффективность био электрокаталитического окисления метанола клетками метилотроф ных бактерий в присутствии медиаторов электронного транспорта // Известия ТулГУ. Естественные науки. – Тула: Изд-во ТулГУ.- Вып. 1.

– 2013. – C. 222-232.

4. Кузнецова Т.А., Бесчастный А.П., Алферов С.В., Троценко Ю.А.

Свойства модифицированных амперометрических биосенсоров на ос нове метанолдегидрогеназы и клеток Methylobacterium nodulans // Прикл. биохим. микробиол. – 2013. – Т. 49 (№ 6). – С. 613-618.

Тезисы докладов:

1. Кузнецова Т.А. Амперометрический биосенсор на основе PQQ метанолдегидрогеназы Methylobacterium nodulans для детекции мета нола. Материалы VII Московского Международного Конгресса «Био технология: Состояние и Перспективы Развития» 19-22 Марта 2013 г.

М.: ЗАО «Экспо-биохим-технологии», РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2013 – с. 23-24.

2. Kuznetsova T.A. Amperometric detection of methanol and formaldehyde with biosensor based on methylobacteria biocatalysts. Materily IX mez inrodn vdecko - praktick konference «Aktuln vymoenosti vdy – 2013». - Dl 16. Biologick vdy. Ekologie. Zempis a geologie.

Zvrolkastv: Praha. Publishing House «Education and Science» s.r.o – 32-33 stran.

3. Кузнецова Т.А. Биокатализаторы на основе метилотрофных бактерий и выделенных из них ферментов как распознающие элементы амперо метрических биосенсоров. Биология будущего: традиции и новации:

Материалы II Всероссийской с международным участием школы конференции молодых ученых. Екатеринбург, 1-5 октября, 2012 г. – Екатеринбург: Изд-во Урал. ун-та, 2012. – с. 112- 4. Кузнецова Т.А. Амперометрический биосенсор с биокатализаторами на основе метилобактерий для мониторинга с1-соединений. Материа лы междунар. науч. конф. «Достижения и перспективы развития био - 25 технологии» (Саранск, МГУ им. Н.П. Огарева, 3-5 октября 2012 г.) – Саранск: Типография ООО «Мордовия – Экспо», 2012. – с. 27- 5. Ершова О.Е., Кузнецова Т.А. Изучение окислительной активности метилотрофных бактерий. Научно-теоретический журнал «Успехи Со временного Естествознания» № 8, 2011 – с. 36-37.

6. Кузнецова Т.А., Доронина Н.В., Понаморева О.Н. Аэробные метило трофные бактерии как биораспознающие элементы биосенсоров. Ма териалы VI Московского международного конгресса «Биотехнолигия:

состояние и перспективы развития» - Москва, 2011 – Часть 2, с.43-44.

7. Кузнецова Т.А., Ершова О.Е. Биокатализаторы на основе биопрепара тов метилотрофных бактерий. Материалы Всероссийской конферен ции с элементами научной школы для молодежи «Экотоксикология 2011» – Тула – 2011 – С. 8. Кузнецова Т.А., Чибисов В.А. Изучение особенностей окисления суб стратов целыми клетками метилотрофных бактерий в аэробных усло виях. Материалы Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи «Экотоксикология-2011» – Тула, 2011 – С. 9. Кузнецова Т.А., Чибисов В.А. Окисление субстратов целыми клетка ми метилотрофных бактерий в аэробных условиях. Материалы Все российской научно-практической конференции с международным уча стием «Биологический мониторинг природно-техногенных систем». Киров, 2011. - Ч.2, стр. 140.

10.Кузнецова Т.А., Алферов В.А. Метилотрофные бактерии как перспек тивные биокатализаторы в биораспознающих элементах биосенсоров.

14-ая международная Пущинская школа-конференция молодых уче ных «Биология – наука XXI века». - Пущино, 2010. - Сборник тезисов.

Том 1, с. 264.

11.Кузнецова Т.А. Биокаталитические свойства метилотрофных бакте рий Methylovorus mays и Methylobacterium mesophilicum в присутствии медиаторов электронного транспорта. Материалы Всероссийской кон ференции с элементами научной школы для молодежи «Экотоксико логия-2010» – Тула – 2010 – С. 12.Ершова О.Е., Акатова Е.В., Кузнецова Т.А. Определение окислитель ной активности метилотрофных бактерий Methylovorus mays KYK и Methylobacterium mesophilicum JCM 2829 в зависимости от фаз роста.

Материалы Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи «Экотоксикология-2010» – Тула – 2010 – С. - 26