Идентификация модификаций белков крови ксенобиотиками методом матрично-активируемой лазерной десорбции/ионизации – масс-спектрометрии в ретроспективном токсикологическом анализе

На правах рукописи

ДУБРОВСКИЙ

Ярослав Александрович

Идентификация модификаций белков крови ксенобиотиками методом

матрично-активируемой лазерной десорбции/ионизации – масс-спектрометрии

в ретроспективном токсикологическом анализе

14.03.04 – токсикология

03.01.04 – биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2013

Работа выполнена в Федеральном государственном унитарном предприятии «Научно исследовательский институт гигиены, профпатологии и экологии человека» Феде рального медико-биологического агентства (ФГУП «НИИ ГПЭЧ» ФМБА России) и Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт аналитиче ского приборостроения Российской академии наук (ИАП РАН) Научные руководители:

кандидат биологических наук Бабаков Владимир Николаевич кандидат химических наук Подольская Екатерина Петровна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Кашуро Вадим Анатольевич Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт токсикологии Федерального медико-биологического агентства», заведующий лабораторией биохи мической токсикологии и фармакологии доктор медицинских наук Антонов Виктор Георгиевич Федеральное государственное казенное военное образовательное учреждение высше го профессионального образования Военно-медицинская академия имени С. М. Ки рова Министерства обороны Российской Федерации, доцент кафедры клинической биохимии и лабораторной диагностики

Ведущая организация:

Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессиональ ного образования «Санкт-Петербургский государственный университет»

Защита диссертации состоится «_» 2013 г. в _ часов на заседа нии диссертационного совета Д 208.030.01 при Федеральном государственном бюд жетном учреждении науки «Институт токсикологии Федерального медико биологического агентства», 192019, Санкт-Петербург, ул. Бехтерева,

С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке Федерально го государственного бюджетного учреждения науки «Институт токсикологии Феде рального медико-биологического агентства»

Автореферат разослан « » 2013 г

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор Луковникова Любовь Владимировна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования Белки и секретируемые пептиды могут приобретать различные посттрансляци онные модификации аминокислот в полипептидной цепи. В настоящее время описано большое количество посттрансляциионных модификаций белков и пептидов. Такие модификации, как фосфорилирование, гликозилирование, ацетилирование, как пра вило, имеют важное функциональное значение и влияют на биологические функции белков;

ряд других модификаций не имеют функционального значения. Кроме того, возможны посттрансляционные модификации секреторных белков в результате взаи модействия с чужеродными соединениями – ксенобиотиками. К которым относятся токсичные агенты и лекарственные средства.

Электро- и нуклеофильные химические соединения способны формировать ко валентные связи с белками, образуя аддукты (модификации, не имеющие общеприня того названия). В последнее время раздел биоорганической химии, который изучает такие модификации белков, получил собственное название – «аддуктомика». Большая часть опубликованных работ в этой области посвящена проблематике уничтожения химического оружия. В то же время, показана способность и ряда других ксенобио тиков формировать аддукты с белками.

Анализ биомедицинских проб позволяет по наличию определенных метаболи тов токсичных агентов в организме человека или животного судить о факте отравле ния. Мощный инструментарий современной аналитической химии, как правило, направлен на идентификацию самого ксенобиотика или его метаболитов, которые в течение нескольких дней выводятся из организма. Аддукты токсиканта с белками мо гут сохраняться на протяжении всего времени жизни белка в организме и их можно рассматривать как долгоживущие биомаркеры экспозиции.

Для практических целей представляется целесообразным рассмотрение процедуры анализа посттрансляционных модификаций основных белков крови сывороточного альбумина и гемоглобина, и сравнение с библиотекой модификаций белков высокоопасными соединениями и/или лекарственными средствами.

Выявление участка белка и идентификация аминокислотного остатка, участвующего в образовании аддукта, являются стабильным показателем, зависящим от третичной и четвертичной структуры белка, позволяющим установить факт воздействия.

Разработанная процедура анализа белков крови для обнаружения аддуктов позволит значительно расширить спектр определяемых соединений и увеличить срок выявления факта экспозиции в токсикологическом анализе.

На сегодняшний день наиболее удобными для решения подобных задач явля ются иммунохимические и масс-спектрометрические методы анализа. Иммунохими ческие методы требуют наличия специфичных антител, которые не всегда возможно получить и охарактеризовать. Масс-спектрометрия с мягкими методами ионизации является более универсальным методом биоорганического анализа. Следует отме тить, что в последние годы большинство работ по исследованию аддуктов ксенобио тиков с белками выполнены с помощью приборов, имеющих в качестве источников ионов «электроспрей». Данный класс приборов отличается высокими требованиями к анализируемым образцам. До сих пор в очень немногих исследованиях в области ана лиза аддуктов используется метод матрично-активируемой лазерной десорб ции/ионизации (МАЛДИ), хотя этот метод менее чувствителен к присутствию солей и других загрязняющих компонентов. МАЛДИ масс-спектрометрия является универ сальным методом анализа белковых гидролизатов и выявления посттрансляционных модификаций, обеспечивающим быстрое получение обширных данных о составе об разца.

Таким образом, разработка нового подхода, совмещающего в себе преимуще ства биоорганического, химико-токсикологического и масс-спектрометрического анализа аддуктов ксенобиотиков с белками представляется актуальной.

Связь темы диссертации с плановой тематикой научно-исследовательской работы учреждения Исследование выполнялось в соответствии с плановой тематикой научно исследовательских работ ФГУП «НИИ ГПЭЧ» ФМБА России в 2008 – 2012 гг.: темы НИР: «Исследование биохимических маркеров и разработка методов их определения у лиц, контактировавших с отравляющими веществами нервно-паралитического и кожно-нарывного действия», «Исследование биохимических маркеров и разработка методов их определения у лиц, контактировавших с отравляющими веществами нервно-паралитического действия. Экспериментальная разработка новых методиче ских подходов для идентификации биохимических маркеров острого воздействия отравляющих веществ нервно-паралитического действия» и «Экспериментальная разработка протеомных подходов для идентификации долгоживущих маркеров остро го и хронического отравления фосфорорганическими отравляющими веществами».

Цель исследования:

Разработка нового методического подхода для определения и идентификации ковалентных посттрансляционных модификаций белков крови алкилирующими (сер нистый иприт), ацетилирующими (ацетилсалициловая кислота) и фосфонилирующи ми (производные метилфосфоновой кислоты – зарин, зоман и вещество типа Vx (RVX, VR) ксенобиотиками методами хроматографии и МАЛДИ масс спектрометрии.

Задачи исследования:

- определить и идентифицировать сайты связывания ксенобиотиков с белками крови (гемоглобин и/или сывороточный альбумин) человека и крысы;

- продемонстрировать возможность выделения модифицированных пептидов из гидролизата белка методами хроматографии (обращенно-фазовая, металл-аффинная);

- разработать методики выделения модифицированных пептидов из гидролиза тов белков методом металл-аффинной хроматографии на сорбентах, содержащих ме таллы Ti (IV), Fe (III), Cu (II), in vitro;

- показать эффективность разработанного подхода на образцах крови, получен ных в ходе токсикологического эксперимента.

Научная новизна Выявлены и идентифицированы сайты связывания фосфорорганических отрав ляющих веществ (ФОВ) с сывороточным альбумином крысы (Y-411). Эксперимен тально показана возможность выделения модифицированных ФОВ пептидов из гид ролизата сывороточного альбумина человека и крысы с использованием металл аффинной хроматографии на сорбентах, содержащих оксид титана (IV) и хелатиро ванные ионы железа (III).

Впервые определены сайты связывания сернистого иприта с глобином крысы и человека (C-93, C-126 в бета-субъединице глобина крысы и E-27 в альфа-субъединице глобина крысы, и C-93 в бета-субъединице глобина человека). Инструментально вы явлены модифицированные триптические пептиды глобина и сывороточного альбу мина крысы, содержащие C-93 и C-34 соответственно, в эксперименте in vivo. Впер вые показана возможность выделения модифицированных сернистым ипритом пеп тидов из гидролизата глобина с использованием металл-аффинной хроматографии на сорбенте, содержащем ионы меди (II).

Определены сайты связывания ацетилсалициловой кислоты (АСК) с глобином человека и крысы (K-17, K -41, K-57, K-91 в альфа-субъединице глобина человека и K-18, K-96, K-133 в бета-субъединице глобина человека;

K-17, K-57, K-91, K-140 в альфа-субъединице глобина крысы и K-17, K-77 в бета-субъединице глобина крысы).

Методом МАЛДИ масс-спектрометрии впервые идентифицированы ацетилированные K-17 и K-57 в бета-цепи глобина, выделенного из крови человека в модельном экспе рименте после инкубации с АСК в концентрации 100 мкг/мл.

Реализация работы Полученные в ходе диссертационного исследования результаты используются в научно-исследовательской работе отдела токсикологии ФГУП «НИИ ГПЭЧ» ФМБА России. Результаты работы реализованы в методических рекомендациях «Методы определения алкилированных аддуктов сернистого иприта с белками крови» № 41- от 26.10.2011.

Практическая значимость Предложенный способ пробоподготовки с использованием металл-аффинной хроматографии для выделения модифицированных пептидов из гидролизата белков крови (сывороточный альбумин и гемоглобин) с последующим масс спектрометрическим анализом может быть использован для разработки методов диа гностики интоксикации ксенобиотиками алкилирующего, ацетилирующего и фосфо нилирующего действий.

Положения, выносимые на защиту:

1. Твердофазная экстракция и металл-аффинная хроматография являются пер спективными методами, для выделения модифицированных пептидов, позволяющими увеличить чувствительность и надежность токсикологического анализа.

2. Сернистый иприт алкилирует сывороточный альбумин и гемоглобин челове ка и крысы in vitro и in vivo предпочтительно по свободным тиоловым группам остат ков цистеинов. Алкилированные сернистым ипритом аддукты сывороточного альбу мина и гемоглобина являются долгоживущими биомаркерами интоксикации.

3. Фосфорорганические отравляющие вещества способны образовывать кова лентные аддукты с остатками тирозина сывороточного альбумина. Основным сайтом связывания для ОВ G-типа является Y-411, в то время как для ОВ V-типа более реак ционноспособным является Y-150. Фосфонилированный сывороточный альбумин – перспективный долгоживущий биомаркер экспозиции.

4. Модификацию белков крови лекарственными средствами (на примере аце тилсалициловой кислоты) можно идентифицировать с помощью МАЛДИ масс спектрометрии.

Апробация работы Результаты исследований, проведенных в рамках настоящей работы, нашли от ражение в докладах на: IV российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 23– июня 2009);

Всероссийской научно-практической конференции «Химическая без опасность Российской Федерации в современных условиях» (Санкт-Петербург, 27– мая 2010);

10th international symposium on protection against chemical and biological warfare agents (Стокгольм, 8–11 июля 2010);

Первой международной научно практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лаборатор ной и клинической медицине» (Москва, 17–19 ноября 2010);

V российском симпози уме «Белки и пептиды» (Петрозаводск, 8–12 августа 2011);

II международной научно практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лаборатор ной и клинической медицине: геномика, протеомика, биоинформатика» (Новоси бирск, 14–17 ноября 2011);

Семинаре «Успехи современной масс-спектрометрии»

(Санкт-Петербург, 12 мая 2011);

11th International Meeting on Cholinesterases (Казань, 4–9 июня 2012);

Всероссийском симпозиуме «Медико-биологические аспекты обес печения химической безопасности Российской Федерации» (Санкт-Петербург, февраля 2012);

11th international symposium on protection against chemical and biological warfare agents (Стокгольм, 3–5 июня 2013);

38th Federation of European Biochemical Societies Congress «Mechanisms in Biology» (Санкт-Петербург, 6–11 июля 2013).

Личное участие автора Автор принимал участие в планировании, и выполнении исследований, прово дил регистрацию масс-спектров и принимал участие в анализе, обобщении и оформ лении полученных данных.

Публикации По теме диссертации опубликовано 19 печатных работ, в том числе 6 статей в научных рецензируемых журналах и 1 методические рекомендации.

Структура и объем работы Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения и списка литературы, изложена на 121 страницах и включает 47 рисунков, 9 таблиц и 113 наименований списка используемой литературы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Для достижения цели и решения поставленных задач проведены эксперимен тальные исследования in vitro и in vivo с использованием токсикологических и физи ко-химических методов.

Получение стандартных образцов Инкубирование альбумина с RVX проводили в течение 24 часов при 37°С, концентрация белка 1 мг/мл, концентрация отравляющего вещества (ОВ) 100 мкг/мл.

Инкубирование альбумина с зарином и зоманом проводили в течение 24 ча сов при 37°С, концентрация альбумина составляла 1 мг/мл и 40 мг/мл. Концентрации ОВ составляла 10 нг/мл, 100 нг/мл, 1 мкг/мл, 10 мкг/мл, 100 мкг/мл.

Инкубирование альбумина с сернистым ипритом (СИ) проводили в течение 24 часов при 37°С, концентрация белка 1 мг/мл, концентрация ОВ 100 мкг/мл.

Инкубирование глобина с СИ проводили в течение 24 часов при 37°С, концен трация белка 1 мг/мл, концентрация ОВ 10 мкг/мл, 50 мкг/мл и 100 мкг/мл.

Инкубирование глобина с АСК проводили в течение 24 часов при 37°С, кон центрация белка 1 мг/мл, концентрация ксенобиотика 100 мкг/мл.

Обязательной стадией пробоподготовки после инкубирования была очистка от избытка ксенобиотика путем преципитации белков ацетонитрилом на холоду с после дующим перерастворением образцов в 50 мМ водном растворе бикарбоната аммония.

Инкубирование плазмы крови с фосфонилирующими агентами проводили в течение 24 часов при 37°С. Концентрации ОВ составляла 10 нг/мл, 100 нг/мл, мкг/мл, 10 мкг/мл, 100 мкг/мл.

Инкубирование крови с ацетилсалициловой кислотой проводили в течение часов при 37°С, концентрация АСК составила 100 мкг/мл.

Токсикологический эксперимент проводили совместно с Н.Г. Войтенко и Н.В Гончаровым. Крыс экспонировали сернистым ипритом п/к на уровне 0,1 ЛД50 ( мг/кг). Отбор образцов крови проводили до 7 суток после отравления. Экспонирова ние крыс зоманом проводили в дозе 2х0,4 ЛД50 (80 мкг/кг). Отбор образцов крови проводили до 14 суток после отравления. Анализ и пробоподготовку полученных об разцов крови автор проводил лично.

Работа выполнена с соблюдением правил гуманного отношения к животным в соответствии с требованиями «Международных рекомендаций по проведению меди ко-биологических исследований с использованием животных» (ВОЗ, 1985).

Подготовка образцов для масс-спектрометрического анализа Получение суммарного белка плазмы или сыворотки крови. Из пробы отби рали в микропробирку аликвоту 100 мкл, разбавляли в три раза 50 мМ раствором NH4HCO3 и добавляли тройной объем холодного ацетонитрила, содержащего 5% ук сусной кислоты (УК). После этого раствор центрифугировали 10 минут при 10000 g, супернатант удаляли, а осадок промывали 3 раза холодным 5% раствором УК в аце тонитриле. Для проведения дальнейших исследований осажденные белки перераство ряли в 50 мМ растворе бикарбоната аммония.

Выделение сывороточного альбумина из плазмы крови проводили с помо щью аффинных сорбентов Aurum, Affi-Gel Blue Gel (Bio-Rad) и Cibacron Blue 3GA Agarose, Type 3000-CL (Sigma-Aldrich), с использованием спиновых колонок. В ко лонку вносили 500 мкл раствора, содержащего сорбент, и промывали 2 раза раство ром буфера для связывания по 1 мл (фосфатный буфер, pH 7,0), затем центрифугиро вали до высыхания сорбента. В микропробирке смешивали 60 мкл сыворотки и мкл буфера для связывания. 200 мкл разбавленной сыворотки наносили на сорбент, инкубировали в течение 15 минут на качающейся платформе и центрифугировали сек при 10000 g. Для полного удаления не связавшихся компонентов образца, сорбент трижды промывали 100 мкл буфера для связывания и центрифугировали 15 сек при 10000 g. Элюцию проводили путем внесения в колонку 100 мкл 6 М мочевины с по следующей инкубацией 10 мин на качающейся платформе и центрифугированием ( сек при 10000 g).

Выделение гемоглобина из эритроцитов проводили из цельной крови с анти коагулянтом (20 мМ Na2EDTA). Кровь крысы получали при декапитации лаборатор ных животных. Кровь от здоровых доноров получали венепункцией в вакуумную си стему BD Vacutainer для получения K3EDTA плазмы. Образцы центрифугировали в течение 15 мин при 1200 g, плазму удаляли, а полученный осадок форменных элемен тов три раза промывали физиологическим раствором. К промытой клеточной массе добавляли равный объем дистиллированной воды для получения гемолизата. К алик воте гемолизата при перемешивании добавляли шестикратный объем 50 мМ HCl в изопропиловом спирте, центрифугировали в течение 15 мин при 3000 g. Супернатант отделяли и приливали к нему четырехкратный объем этилацетата. Центрифугировали в течение 15 мин при 3000 g, затем осадок, содержащий гидрохлорид глобина, про мывали чистым этилацетатом. Остатки растворителя удаляли с помощью лиофильной сушки.

Ферментативный гидролиз сывороточного альбумина проводили с предва рительными стадиями восстановления дисульфидных связей в присутствии дитиотреитола (10 мМ раствор ДТТ в 100 мМ NH4HCO3 до конечного соотношения белок:ДТТ 1:15, инкубация при 56°С в течение 45 мин) и с защитой – SH группы йо дацетамидом (20 мМ раствор ICH2CONH2 в 100 мМ NH4HCO3 до конечного соотно шения белок:йодацетамид 1:30, инкубация в темноте при комнатной температуре в течение 40 мин). При поиске аддуктов сывороточного альбумина с сернистым ипри том эти стадии не использовали. При исследовании образования аддуктов сывороточ ного альбумина с ипритом и RVX, ферментативный гидролиз проводили в присут ствии трипсина для масс-спектрометрических исследований (proteomics grade). К рас твору белка на холоду добавляли раствор трипсина (0,1 мг/мл) в 100 мМ NH4HCO3 в две стадии через 3 часа инкубации при 37°С до конечного молярного соотношения белок:трипсин 50:1. Суммарное время инкубации 6 часов. При анализе продуктов взаимодействия с зоманом и зарином для гидролиза белка использовали пепсин, экс перимент проводили в условиях восстановления дисульфидных связей и защитой –SH групп по методике описанной выше, после чего раствором HCl доводили pH до 2.

Раствор пепсина (1 мг/мл в 10 мМ HCl) добавляли к раствору белка по той же схеме до конечного молярного соотношения белок:пепсин 20:1.

Ферментативный гидролиз глобина проводили в присутствии трипсина без восстановления дисульфидных связей и защиты –SH группы по той же методике, что и в случае сывороточного альбумина.

Твердофазная экстракция пептидов в ступенчатом градиенте ацетонит рила из пептического гидролизата сывороточного альбумина. Разделение проводили на картридже для твердофазной экстракции с Supelco Empore C-18-SD. Образцы пеп тических гидролизатов сывороточного альбумина человека и триптических гидроли затов сывороточного альбумина крысы, содержащие пептиды, модифицированные остатком зомана, разбавляли в 5 раз раствором 0,1% водным раствором трифторукск ной кислоты (ТФУ) и наносили на картридж. Элюирование проводили в режиме сту пенчатого градиента (5-60%) ацетонитрила с шагом 5%.

Металл-аффинную хроматографию на сорбенте ZipTipMC с хелатирован ными ионами меди (II) использовали для выделения из триптического гидролизата глобина пептидов, модифицированных остатком сернистого иприта. Хелатирующую фазу обрабатывали 200 мМ раствором сульфата меди, промывали 0,1% трифторук сусной кислоты (ТФУ), после чего наносили образец. Элюирование проводили в ре жиме ступенчатого градиента pH: 0,1% ТФУ, 400 мМ раствор гидроксида аммония в воде, 0,5% раствор пиперидина в воде.

Металл-аффинную хроматографию на сорбенте, содержащем ионы желе за (III) PHOS-Select Iron Affinity Gel применяли для обогащения образца пептидами, фосфонилированными остатком RVX. Сорбент помещали в спиновую колонку, про мывали 0,1% ТФУ, затем наносили образец и проводили элюцию в ступенчатом гра диенте: 0,1% ТФУ (стадия удаления неспецифично сорбированных компонентов), мМ аммонийбикарбонатный буфер, 400 мМ водный раствор аммиака, 0,5% раствор пиперидина в воде.

Металл-аффинную хроматографию на сорбенте, содержащем ионы ти тана (IV) Supel-Tips Ti применяли для обогащения образца фосфонилированными пептидами (модифицированных остатком RVX, зарина и зомана). Микроколонку, со держащую сорбент, промывали 400 мМ водным раствором аммиака, наносили обра зец и промывали раствором аммиака. Элюирование проводили 60% раствором ацето нитрила в 0,1% ТФУ.

Масс-спектрометрический анализ Нанесение образцов на масс-спектрометрическую мишень проводили в двух режимах: без предварительного обессоливания и с использованием микроколонок ZipTipC18 или Supel-Tips С18 для обессоливания образцов. В первом случае на по верхности мишени смешивали 0,5 мкл 5-10% раствора матрицы (CHCA или DHB в зависимости от прибора) и 0,5 мкл образца. Во втором случае на микроколонку, по следовательно промытую ацетонитрилом и 0,1% ТФУ в воде, наносили образец и элюировали на мишень раствором матрицы в 60% ацетонитриле с 0,1% ТФУ. Образ цы, нанесенные на мишень, высушивали на воздухе до образования кристаллов.

Масс-спектрометрический анализ гидролизатов сывороточного альбумина человека, модифицированного остатком RVX, а также сывороточного альбуми на и глобина, модифицированных остатком СИ, проводили с помощью времяпро летного масс-спектрометра Ultraflex (Bruker Daltonics, Германия), оснащенного УФ лазером (337 нм), в режиме детектирования положительных ионов с использованием рефлектрона. Ионы детектировали в диапазоне m/z от 700 до 4000 Да. В качестве внутреннего стандарта использовали пики автолиза трипсина (MH+ 842,508;

1045,563;

2211,093 Да), которые при обработке удалялись из масс-листов. Масс-спектры, полу ченные с использованием Ultraflex, обрабатывали с использованием программы Flex Analysis 2.4 (Bruker Daltonics, Германия).

Масс-спектрометрический анализ гидролизатов сывороточного альбумина, модифицированного остатками ФОВ, глобина человека и крысы, содержащих остатки иприта и АСК, а также гидролизат сывороточного альбумина крысы, полученного в токсикологическом эксперименте (in vivo, зоман), проводили с по мощью времяпролетного масс-спектрометра Axima Performance с источником МАЛ ДИ, оснащенного УФ-лазером (337 нм), в режиме детектирования положительных ионов. Ионы детектировали в диапазоне m/z от 800 до 5000 Да. Масс-спектры реги стрировали при помощи программы Launchpad 2.8.4 MALDI-MS Shimadzu Biotech (Shimadzu, Япония). Калибровку проводили по масс-спектру смеси пептидов: ангио тензин 2 (МН+ 1046,542 Да), ангиотензин 1 (МН+ 2296,685 Да), N-ацетил ренин (МН+ 1800,943 Да), адренокортикотропный гормон (1-17) (МН+ 2093,086 Да). Обработку спектров, полученных при помощи масс-спектрометра MALDI-TOF Axima Perfor mance, проводили в программе Launchpad 2.8.4 MALDI-MS Shimadzu Biotech (Shimadzu, Япония).

Масс-спектрометрический анализ образцов, содержащих гидролизат сыво роточного альбумина и глобина крысы, полученных в токсикологическом экспе рименте (in vivo, сернистый иприт), проводили с помощью ион-циклотронного масс спектрометра FT-MS Varian 902-MS со сверхпроводящим магнитом 9,4 Тесла, ис пользуя источник ионизации МАЛДИ. Десорбцию и ионизацию пробы осуществляли с помощью третьей гармоники (355 нм) Nd:YAG лазера. Ионы детектировали в диа пазоне m/z от 350 до 4500. Масс-спектры регистрировали при помощи программы Omega (Varian, США). В качестве внутреннего стандарта использовали пики автолиза трипсина (MH+ 842,508;

1045,563;

2211,093 Да), которые при обработке удаляли из масс-листов. Обработку спектров, полученных при помощи масс-спектрометра Varian, проводили в программе FTDocViewer (Varian, США).

Анализ данных Расчет точной моноизотопной массы и форму изотопного распределения для пептидов с нестандартными модификациями рассчитывали при помощи про граммы MassPro (ИАП РАН, Россия).

Идентификацию белков и пептидов проводили в базе данных SwissProt с по мощью стационарного программного комплекса MASCOT (Matrix Science, Велико британия) и интернет-версии программы MS-Tag (University of California, США, prospector.ucsf.edu), при этом использовали следующие параметры поиска: точность определения массы родительского иона – 200 ppm, точность определения массы фрагментов – 1000 ppm, возможные модификации – обработка йодацетамидом, в слу чае поиска аддуктов зомана – изменение массы на 162,08 Да, зарина – на 120,19 Да RVX – 134,05 Да, СИ – 104,03 Да;

а также соответствующая пробе таксономика (че ловек или крыса). В случае АСК устанавливали модификацию «ацетилирование ли зина». Также, при обработке спектров вручную вели поиск сигналов, имеющих раз ницу масс, соответствующую фрагментации остатка агента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Выявление и идентификация фосфонилированных аддуктов сыворо точного альбумина человека и крысы Фосфорорганические соединения (ФОС) способны образовывать ковалентные аддукты с сывороточным альбумином человека. Ранее были определены аддукты остатка RVX с сывороточным альбумином человека по Y-150 (Radilov et. al., 2009). В результате взаимодействия RVX с тирозином происходит фосфонилирование послед него и увеличение массы белка (пептида) на 134,05 Да. Позднее было показано, что основным сайтом связывания для ОВ G-типа является Y-411, в то время как для ОВ V-типа модифицирование данного тирозина происходит только при высоких концен трациях, более реакционноспособным является Y-150 (John et. al., 2010).

Для обнаружения фосфонилированных пептидов из сыворотки крови человека, проинкубированной с RVX, был выделен сывороточный альбумин с помощью сор бента на основе триазиновых красителей Cibacron Blue и проведен ферментативный гидролиз в присутствии трипсина. В масс-спектрах гидролизата были обнаружены два сигнала с массами 1876,94 и 2033,01 Да. С использованием тандемной масс спектрометрии были получены фрагментные спектры, в которых были обнаружены дочерние ионы, характерные для пептидов с аминокислотными последовательностя ми HPYFYRVXAPELLFFAK (рис. 1) и RHPYFYRVXAPELLFFAK, соответственно. Выяв ленные пептиды входят в состав сывороточного альбумина человека, и присоедине ние RVX происходит по Y-150.

Рисунок 1. Фрагментный масс-спектр пептида HPYFYRVXAPELLFFAK Пептид с МН+ 1876,94 Да, который образуется в результате полного гидролиза альбумина в присутствии трипсина, дает малоинтенсивный сигнал в масс-спектре.

Более интенсивным является сигнал пептида с МН+ 2033,01 Да, который соответству ет пептиду с одним недоразрывом в полипептидной цепи. Пептид YGDTK фосфони лированный по Y-411 с помощью метода МАЛДИ масс-спектрометрии обнаружить не удалось.

Как было продемонстрировано, металл-аффинная хроматография на сорбенте PHOS-Select Iron Affinity Gel, содержащем ионы Fe (III), может быть успешно приме нена для выделения и обогащения аддуктов альбумина с ФОС на примере параоксона (Гладилович и др., 2010). Нашей следующей задачей стала апробация этой методики для выделения фрагментов сывороточного альбумина, модифицированных RVX.

В результате в масс-спектрах после проведения металл-аффинной хроматогра фии в элюате 0,5 % водного раствора пиперидина удалось обнаружить идентифици рованные ранее пептиды с МН+ 1876,94 и 2033,01 Да.

Для выделения фосфопептидов из гидролизата альбумина, модифицированного RVX, также использовали сорбент, содержащий Ti (IV) на колонках Supel-Tips Ti. В масс-спектрах после элюирования 0,5 % пиперидином также удалось обнаружить мо дифицированные пептиды (рис. 2).

Таким образом, в нашей работе была показана возможность использования сорбентов, содержащих ионы Fe (III) и Ti (IV), для обогащения пептидов сывороточ ного альбумина, модифицированных RVX. Оба сорбента дают сопоставимые резуль таты, в то же время, Supel-Tips Ti больше подходит для пробоподготовки, предше ствующей МАЛДИ масс-спектрометрическому анализу. Во-первых, сорбент доста точно устойчив к растворителям, и, в отличие от геля, не претерпевает изменений при элюировании раствором пиперидина. Во-вторых, микроколонки просты в использо вании, нет необходимости самостоятельно готовить колонку. Сорбцию, промывку и элюирование можно проводить пипетированием растворов в микропробирке. В третьих, техническое решение микроколонок позволяет работать с объемами образ цов не превышающими 1-2 мкл. И, наконец, элюирование образца можно проводить непосредственно на масс-спектрометрическую мишень.

Рисунок 2. Масс-спектры фракций триптического гидролизата сывороточного альбумина че ловека после проведения металл-аффинной хроматографии на сорбенте, содержащем Fe(III).

А – проскок, Б – 0,1% ТФА в воде, В – 100 мМ NH4HCO3, Г – 400 мМ NH4ОН, Д – 0,5% пи перидином. Во вкладке – увеличенный фрагмент масс-спектра Д (диапазон m/z 1850- Да) Этот подход был апробирован на аддуктах сывороточного альбумина человека с ОВ G-типа, а именно зоманом и зарином. В результате взаимодействия зомана с сы вороточным альбумином человека происходит фосфонилирование белка по Y-411, в результате происходит увеличение массы белка на 162,08 Да и 120,19 Да, соответ ственно. В связи с тем, что триптический фрагмент сывороточного альбумина, со держащий Y-411, обладает слишком малой массой для успешного определения мето дом МАЛДИ масс-спектрометрии, для проведения ферментативного гидролиза был использован пепсин.

В масс-спектрах пептического гидролизата сывороточного альбумина, инкуби рованного с зоманом, были обнаружены три сигнала отсутствующие в контроле. Да лее с использованием тандемной масс-спектрометрии были получены фрагментные спектры, в которых удалось обнаружить дочерние ионы характерные для пептидов с аминокислотными последовательностями: МН+ 1992,11 Да LVRYGDTKKVPQVSTPTL, МН+ 1680,79 Да LVRYGDTKKVPQVSTPT, МН+ 1567,84 Да VRYGDTKKVPQVSTPT. Так же было доказано, что эти пептиды входят в состав сывороточного альбумина и при соединение остатка зомана происходит по Y-411. Следует отметить, что при проведе нии МС-МС анализа с использованием фрагментации CID на времяпролетном масс спектрометре Axima Performance наиболее интенсивные сигналы образуются в ре зультате полного отщепления остатка зомана (162 Да) и деалкилирования остатка зо мана (84 Да). Разница 78 Да соответствует остатку метилфосфоновой кислоты (рис.

3). Для идентификации аддуктов использовали переходы 199219081830;

168115971519;

156814841406.

Рисунок 3. Фрагментные масс-спектры пептических пептидов сывороточного альбумина че ловека, модифицированных зоманом: 1 – VRYGDTKKVPQVSTPT;

2 – LVRYGDTKKVPQVST;

3 – LVRYGDTKKVPQVSTPTL. Спектры получены на МАЛДИ масс-спектрометре Shimadzu Axima Performance в режиме CID фрагментации. На спектрах указаны среднеизотопные (усредненные) массы Метод металл-аффинной хроматографии на микроколонках Supel-Tips Ti апро бировали на пептическом гидролизате сывороточного альбумина человека, модифи цированного остатком зомана. Для элюирования фосфонилированных пептидов с сорбента использовали 0,1% ТФУ в 60% растворе ацетонитрила. При понижении концентрации ОВ в инкубационной смеси, наиболее интенсивные сигналы после про ведения металл-аффинной хроматографии дают примесные пептиды, способные к не специфической сорбции. Для снижения количества мешающих пептидов сорбцию проводили из 400 мМ водного раствора аммиака. Присутствие фермента и больших протеолитических фрагментов белка негативно сказывается на проведении хромато графического разделения, поэтому перед проведением микроколоночной экстракции преципитировали высокомолекулярные компоненты охлажденным ацетонитрилом.

Предложенная методика с использованием металл-аффинной хроматографии и МАЛДИ масс-спектрометрической детекции была опробована на сывороточном аль бумине крысы инкубированном с ОВ in vitro.

При проведении ферментативного гидролиза сывороточного альбумина крысы в присутствии трипсина образуется пептид с одним недоразрывом (одним пропущен ным разрывом) в полипептидной цепи, содержащий Y-411 с подходящей массой для детектирования на МАЛДИ масс-спектрометрах. Поэтому в качестве фермента ис пользовали не только пепсин, но и трипсин. В результате нам удалось детектировать несколько сигналов. Каждый сигнал был проанализирован с использованием тандем ной масс-спектрометрии, и каждому сигналу был соотнесен фосфонилированный пептид. Сигналу с МН+ 2122,08 Да соответствует пептид с аминокислотной последо вательностью YGDTQKAPQVSTPTLVEAAR (триптический гидролизат), а МН+ 1539,79 Да – пептид с аминокислотной последовательностью VRYGDTQKAPQVST (пептический гидролизат). Используемый в работе пепсин обладал дополнительной неспецифической активностью по гидролизу пептидной связи треонин-лейцин и лей цин-валин. Оба идентифицированных пептида удалось обнаружить в элюате 60% ацетонитрила с 0,1% ТФУ после проведения металл-аффинной хроматографии на микроколоноках Supel-Tips Ti.

Эксперимент по определению аддуктов сывороточного альбумина с зарином проводился по аналогичной схеме. В результате обработки масс-спектров образцов пептического гидролизата альбумина человека, инкубированного с зарином, были выявлены два сигнала, которые отсутствовали в контроле. Для восстановления ами нокислотных последовательностей был проведен тандемный масс + спектрометрический анализ, и было установлено, что сигналу с МН 1525,83 Да соот ветствует пептид VRYGBTKKVPQVST, а что сигналу с МН+ 1638,79 Да соответствует пептид LVRYGBTKKVPQVST. Так же было доказано, что эти пептиды входят в со став сывороточного альбумина и присоединение остатка зомана происходит по Y 411.

В пептическом гидролизате сывороточного альбумина крысы, инкубированно го с зарином, был идентифицирован только один фосфонилированный пептид с МН+ 1497,82 Да и аминокислотной последовательностью VRYGBTQKAPQVST.

При проведении МС-МС анализа с использованием фрагментации CID на вре мяпролетном масс-спектрометре Axima Performance наиболее интенсивные сигналы образуются в результате полного отщепления остатка зарина (120 Да) и деалкилиро вания остатка зарина (42 Да). Для идентификации пептидов сывороточного альбуми на, фосфонилированных зарином, в дальнейшем использовали переходы 163915961518;

152614831405 Да.

Все фосфонилированные зарином пептиды удалось обнаружить в элюате 60% ацетонитрила с 0,1% ТФУ после проведения металл-аффинной хроматографии на микроколонках Supel-Tips Ti.

Таким образом, была показана возможность использования сорбентов, содер жащих ионы Fe (III) и Ti (IV), для обогащения пептидов сывороточного альбумина, модифицированных ФОВ. Аминокислотные последовательности и молекулярные массы обнаруженных и идентифицированных пептидов представлены в таблице 1.

Этот подход был использован для выделения аддуктов альбумина с зоманом из образцов сыворотки крови крыс, полученных в токсикологическом эксперименте.

Крыс экспонировали зоманом в дозе 2х0,4ЛД50. Отбор образцов цельной крови про водили вплоть до 14 суток после отравления. Выделение белков и ферментативный гидролиз проводили по ранее описанной методике.

Таблица 1. Выявленные пептиды сывороточного альбумина, модифицированные ФОС Масса пептида (Да) Аминокислотная последо- Фермент (для Сайт фосфо ФОС вательность пептида гидролиза) нилирования МН+ теор МН+ эксп Человек RVX 2033,05 2033,01 трипсин Y- RHPYFYRVXAPELLFFAK RVX 1876,94 1876,94 трипсин Y- HPYFYRVXAPELLFFAK зоман 1992,17 1992,11 пепсин Y- LVRYGDTKKVPQVSTPTL зоман 1680,98 1680,79 пепсин Y- LVRYGDTKKVPQVST зоман 1567,90 1567,84 пепсин Y- VRYGDTKKVPQVST 1638,93 1638, зарин пепсин Y- LVRYGBTKKVPQVST 1525,85 1525, зарин пепсин Y- VRYGBTKKVPQVST Крыса зоман 2122,13 2122,08 трипсин Y- YGDTQKAPQVSTPTLVEAAR зоман 1539,83 1539,79 пепсин Y- VRYGDTQKAPQVST зарин 1497,78 1497,82 пепсин Y- VRYGBTQKAPQVST Для максимального снижения количества мешающих компонентов, гидролизат фракционировали на патроне для твердофазной экстракции C-18 со ступенчатым элюированием в градиенте ацетонитрила (от 5% до 60% с шагом 5%). Фосфонилиро ванный пептид удалось детектировать во фракции, полученной при элюировании 20% ацетонитрилом с патрона С-18 с последующей металл-аффинной хроматографией на микроколонке Supel-Tips Ti. Сигнал модифицированного зоманом пептида детекти ровали в образцах плазмы крови крыс до 14 суток после отравления.

В результате проделанной работы была показана эффективность использования комбинации металл-аффинной хроматографии с МАЛДИ масс-спектрометрическим детектированием для выявления фосфонилированных аддуктов с сывороточным аль бумином в ретроспективном токсикологическом анализе.

Выявление и идентификация алкилированных аддуктов белков крови человека и крысы Белки крови способны образовывать аддукты не только с фосфорорганически ми соединениями, но и с алкилирующими ксенобиотиками. Сернистый иприт (СИ, HD) способен образовывать аддукты с сывороточным альбумином человека по C-34, в результате происходит увеличение массы белка на 104,03 Да. Чувствительный ме тод определения цистеинового аддукта остатка СИ с альбумином был разработан на основе ферментативного гидролиза белка проназой с последующим ВЭЖХ-МС-МС анализом образующегося трипептида CHDPF (Noort et. al., 1999).

Аддукты сывороточного альбумина с ксенобиотиками можно обнаружить в те чение 3–4 недель после их образования. Вторым легкодоступным белком крови после сывороточного альбумина является гемоглобин, который можно выделить из эритро цитов. Аддукт сохраняется на всем протяжении жизни эритроцитов. N-концевой ва лин, алкилированный сернистым ипритом, возможно обнаружить методом ГХ-МС через 94 дня после отравления (Benschtop et. al., 2000). С использованием МАЛДИ масс-спектрометрии опубликована только одна работа по определению аддуктов СИ, в которой был продемонстрирован сдвиг масс молекул цельного глобина при инкуба ции с СИ (Price et. al., 2000).

Для обнаружения алкилированных пептидов был проведен ферментативный гидролиз сывороточного альбумина человека и крысы в присутствии трипсина. В масс-спектрах гидролизатов были обнаружены несколько сигналов, отсутствующих в гидролизатах контрольных белков. С помощью тандемной масс-спектрометрии были восстановлены аминокислотные последовательности обнаруженных пептидов ALVLIAFAQYLQQCHDPFEDHVK (МН+ 2537,31 Да) и CHDPYEEHIK (МН+ 1122, Да). Было подтверждено, что эти пептиды входят в состав сывороточного альбумина человека и крысы соответственно, а присоединение остатка сернистого иприта в обо их случаях происходит по C-34. Таким образом, впервые была показана возможность использования МАЛДИ масс-спектрометрии для обнаружения и достоверной иден тификации аддуктов СИ с сывороточным альбумином.

Следующим этапом работы стали выявление и идентификация триптических пептидов, модифицированных сернистым ипритом, с использованием МАЛДИ масс спектрометрии. На первом этапе были получены спектры цельных белков в линейном режиме (рис. 4) и было показано, что при высоких концентрациях СИ алкилирование происходит по нескольким сайтам.

Рисунок 4. Масс-спектры полноразмерных альфа – и бета – субъединиц глобина крысы: А контроль, Б – белок, инкубированный с ипритом В масс-спектрах триптического гидролизата были обнаружены три сигнала и с помощью тандемной масс-спектрометрии было установлено, что сигналу с МН+ 1444,62 Да соответствует пептид EFTPCHDAQAAFQK, сигналу с МН+ 1561,66 Да пеп МН+ тид GTFAHLSELHCHDDK и сигналу с 1676,78 Да пептид IGGHGGEYGEHDEALQR. На рис. 5 представлен фрагментный масс-спектр пептида с МН+ 1444,62 Да, разница между дочерними ионами b4 и b5 соответствует массе остатка цистеина, алкилированного сернистым ипритом. Таким образом, была под тверждена принадлежность выявленных пептидов глобину крысы, а также установле но, что алкилирование бета-субъединицы происходит по C-93 и -126, а альфа субъединицы по E-27. В масс-спектрах триптического гидролизата глобина человека, инкубированного с СИ, удалось обнаружить только один сигнал с МН+ 2633,32 Да. С применением тандемной масс-спектрометрии была восстановлена аминокислотная последовательность пептида GTFATLSELHCHDDKLHVDPENFR, и показано, что ал килирование происходит по C-93 в бета-субъединице. Аминокислотные последова тельности и молекулярные массы обнаруженных и идентифицированных аддуктов представлены в таблице 2.

Рисунок 5. Фрагментный масс-спектр пептида EFTPCAQAAFQK, модифицированного сер нистым ипритом по С-126, входящего в состав субъединицы бета глобина крысы (представ ленные в программе Sequence Viewer 2.0) В образцах плазмы крови крыс, однократно экспонированных 0,1 ЛД50 СИ ( мг/кг, п/к), был обнаружен сигнал ранее идентифицированного пептида CHDPYEEHIK с МН+ 1122,64 Да вплоть до 7 суток после отравления. Однако сигнал обладал низкой интенсивностью и был получен исключительно с помощью высокочувствительного масс-спектрометра Varian 902-MS. В гидролизате глобина крысы, выделенного из эритроцитов, в масс-спектрах был найден только один из трех описанных пептидов (МН+ 1444,65 Да). При этом указанный сигнал был обнаружен в масс-спектрах, полу ченных не только с помощью ион-циклотронного масс-спектрометра, но и с помощью прибора Axima Perfomance, обладающего меньшей чувствительностью и разрешаю щей способностью.

Таблица 2. Пептиды выявленные в триптических гидролизатах, модифицированные сернистым ипритом Масса пептида (Да) Аминокислотная последова- Сайт Белок МН+ теор МН+ эксп тельность пептида алкилирования Глобин крысы, субъ 1444,65 1444,62 С- EFTPCHDAQAAFQK единица бета Глобин крысы, субъ 1561,7 1561,66 С- GTFAHLSELHCHDDK единица бета Глобин крысы, субъ 1676,76 1676,78 E- IGGHGGEYGEHDEALQR единица альфа Сывороточный альбу 1122,5 1122,6 С- CHDPYEEHIK мин крысы Глобин человека, 2633,25 2633,3 C- GTFATLSELHCHDDKLHVDPENFR субъединица бета Сывороточный альбу 2537,29 2537,31 С- ALVLIAFAQYLQQCHDPFEDHVK мин человека На сегодняшний день не существует методики, которая бы позволила специ фично выделить из сложных биологических образцов пептиды, модифицированные остатками СИ. Поэтому, как и в экспериментах с ФОВ, нами была предпринята по пытка выделения и обогащения алкилированных аддуктов с помощью металл аффинной хроматографии. Остаток СИ после гидролиза аддукта содержит полярную гидроксильную группу и атом серы. Была выдвинута гипотеза о возможности пепти дов, модифицированных сернистым ипритом, образовывать устойчивые комплексы на сорбентах с хелатированными ионами Cu (II). Таким образом, для повышения чув ствительности метода идентификации пептидных аддуктов c СИ в триптических гид ролизатах был применен метод металл-аффинной хроматографии на сорбенте, содер жащим ионы Cu (II).

В масс-спектрах гидролизата глобина, инкубированного с сернистым ипритом, при конечной концентрации последнего 60 мкМ наблюдаются все три сигнала алки лированных пептидов. При понижении концентрации ОВ в среде инкубации в два ра за в масс-спектре выявляется только один сигнал с массой MH+ 1444,68 Да, два дру гих сигнала отсутствуют. При конечной концентрации СИ 3 мкМ из спектра пропа дают все три сигнала, принадлежащие модифицированным пептидам. Таким образом, минимальная концентрация, при которой удалось обнаружить алкилированные пеп тиды в гидролизате глобина крысы без дополнительного обогащения, составила мкМ СИ.

После использования металл-аффинной хроматографии на микроколонке Zip Tip MC, содержащей ионы Cu (II), удалось детектировать сигнал с массой MH+ 1444,68 Да в гидролизате глобина, инкубированного с 3 мкМ СИ. Хроматографиче ское разделение проводили в ступенчатом градиенте, результаты представлены на ри сунке 6. Пептид с массой MH+ 1444,63 Да элюируется 0,4 М водным раствором амми ака. С помощью МС-МС-анализа было установлено, что соответствующий сигнал действительно принадлежит пептиду с последовательностью EFTPCHDAQAAFQK, входящему в состав бета-субъединицы глобина крысы, и алкилирование пептида происходит по остатку С-126.

Таким образом, была показана принципиальная возможность применения ме талл-аффинной хроматографии для специфичной сорбции алкилированных аддуктов сернистого иприта с глобином.

Рисунок 6. Фрагменты масс-спектров гидролизата глобина, инкубированного с СИ (3 мкМ), после проведения металл-аффинной хроматографии на микроколонке Zip-Tip MC, содержа щей ионы Cu (II), при ступенчатом элюировании растворами 0,5% пиперидина (А), 400 мМ гидроксида аммония (Б), 0,1%TFA (В), мертвый объем (Г) Выявление и идентификация ацетилированных аддуктов глобинов человека и крысы Ацетилсалициловая кислота (АСК) имеет широкое распространение в качестве лекарственного средства, и отмечены случаи передозировок при его применении, вплоть до смертельных отравлений. Выявление ацетилированных остатков лизина сывороточного альбумина и гемоглобина может быть дополнением при токсикологи ческом анализе острых отравлений ацетилсалициловой кислотой.

Содержание салицилатов в плазме крови человека при обычных терапевтиче ских дозах АСК отмечается на уровне 30-100 мкг/мл;

при высоких дозах – 50- мкг/мл и при острых отравлениях – 700-1400 мкг/мл (Baselt, 2008). Очищенный гло бин инкубировали с АСК в концентрации 100 мкг/мл. Для исследования ацетилиро вания гемоглобина, белок был выделен из эритроцитов человека и крысы, при этом описанная в экспериментальной части методика его выделения предполагает удале ние гема. Таким образом, в изучаемом образце содержались несвязанные между со бой альфа- и бета-субъединицы глобина. Процедура была одинаковой для выделения глобина крысы и человека. Молекула гемоглобина из двух альфа- и двух бета субъединиц содержит 44 остатка лизинов – потенциальных сайтов модифицирования.

При рассмотрении масс-спектров цельного белка были обнаружены сигналы, сме щенные в область больших масс по сравнению с контрольными образцами, как для альфа-, так и для бета-субъединиц глобина, кроме того, практически пропадают сиг налы, соответствующие субъединицам глобина, не модифицированным АСК. В масс спектрах триптических гидролизатов модифицированных белков был обнаружен ряд сигналов отсутствующих в контрольных образцах. Каждый из обнаруженных пепти дов был проанализирован методом тандемной масс-спектрометрии. В результате для глобина крысы были обнаружены 4 сайта ацетилирования в альфа- и 2 сайта в бета субъединице. Для глобина человека 4 сайта ацетилирования в альфа- и 3 сайта в бета субъединице. Все идентифицированные ацетилированые пептиды представлены в таблице 3.

Следующим этапом работы было проведение поиска ранее идентифицирован ных ацетилированных пептидов гемоглобина человека после обработки цельной кро ви раствором АСК. Донорскую цельную кровь с антикоагулянтом (K3EDTA) инкуби ровали с АСК в конечной концентрации последней 100 мкг/мл. В случае с гемоглоби ном человека были обнаружены два сигнала, принадлежащие ацетилированным триптическим пептидам, причем оба пептида входят в состав альфа-субъединицы глобина. Это пептид AAWGKАсVGAHAGEYGAEALER, содержащий ацетилирова ный K-17, и пептид TYFPHFDLSHGSAQVKАсGHGK, содержащий ацетилированный K-57. Таким образом, АСК способна проникать через мембрану эритроцитов и моди фицировать глобин.

Для идентификации пептидов были использованы программные комплексы MASCOT MS/MS Ions Search и MS-Tag. Все идентифицированные пептиды находи лись на первом месте в списке с максимальным показателем Score. Спектры дополни тельно проверяли и восстанавливали аминокислотную последовательность каждого пептида вручную.

Таблица 3. Обнаруженные и идентифицированные ацетилированные триптичекие пептиды глобина человека и крысы Масса пептида (Да) Аминокислотная Сайт Субъединица МН+ теор МН+ эксп последовательность пептида ацетилирования глобина Крыса 1613,87 1613,89 K- FLASVSTVLTSKАcYR 2171,12 2171,19 K- TYFSHIDVSPGSAQVKАcAHGK альфа 2202,96 2202,85 K- NCWGKАcIGGHGGEYGEEALQR 2608,33 2608,33 K- AADHVEDLPGALSTLSDLHAHKАcLR 1852,99 1852,8 K- VINAFNDGLKАcHLDNLK бета 2237,12 2236,89 K- AAVNGLWGKАcVNPDDVGGEALGR Человек 2085,00 2085,00 K- AAWGKАcVGAHAGEYGAEALER 2255,09 2255,19 K- TYFPHFDLSHGSAQVKАcGHGK альфа 2928,43 2928,47 K- MFLSFPTTKАcTYFPHFDLSHGSAQVK VADALTNAVAHVDDMPNALSA 3307,67 3307,74 K- LSDLHAHKАcLR 2270,16 2270,15 K- SAVTALWGKАcVNVDEVGGEALGR 2551,35 2551,29 K-133 бета EFTPPVQAAYQKАcVVAGVANALAH 2571,21 2571,21 K- GTFATLSELHCDKАcLHVDPENFR ЗАКЛЮЧЕНИЕ Описанные подходы позволят значительно усилить доказательную базу и надежность ретроспективного токсикологического анализа при отравлении различ ными ксенобиотиками.

В отношении идентификации ФОВ Организация по запрещению химического оружия (ОЗХО) рекомендует определение в биопробах как их свободных метаболи тов, так и аддуктов с белками. Ковалентные аддукты белков крови с другими опас ными химикатами, например цианидами (Fasco et. al., 2007), являются долгоживущи ми и надежными биомаркерами интоксикации, а разработка методов идентификации нестандартных посттрансляционных модификаций белков крови является актуальным направлением в ретроспективном анализе факта интоксикации.

ВЫВОДЫ 1. Масс-спектрометрический анализ модификаций сывороточного альбумина и гемоглобина, как основных белков крови, является перспективным подходом для ре троспективного токсикологического анализа.

2. Сернистый иприт модифицирует сывороточный альбумин человека и крысы по C-34. Глобин крысы алкилируется по E-27 в альфа-субъединице и C-93, C-126 в бета-субъединице, и глобин человека по С-93 в бета-субъединице. Аддукты сернисто го иприта с сывороточным альбумином и гемоглобином были выявлены до 7 суток после интоксикации. Метод металл-аффинной хроматографии на ионах Cu(II) позво ляет концентрировать алкилированные пептиды глобина крысы.

3. Фосфорорганические вещества фосфонилируют сывороточный альбумин че ловека и крысы по Y-411 для зомана и зарина, и Y-150 для вещества типа Vx (RVX, VR). Аддукт сывороточного альбумина крысы с зоманом выявляли в плазме крови экспонированных дозой 2Х0,4 ЛД50 животных до 14 суток после интоксикации, ис пользуя комбинацию методов твердофазной экстракции, металл-аффинной хромато графии на сорбентах содержащих Ti(IV) и МАЛДИ масс-спектрометрии.

4. Ацетилсалициловая кислота приводит к ацетилированию остатков лизина сы вороточного альбумина и гемоглобина человека и крысы. При инкубации цельной крови человека с ацетилсалициловой кислотой в концентрации 100 мкг/мл определя ются ацетилированные лизины: K-17 и K-57 в бета-субъединице глобина человека.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Краснов, И. А. Идентификация алкилированного аддукта сывороточно го альбумина человека методами масс-спектрометрии / И. А. Краснов, Н. В. Гон чаров, В. Н. Бабаков, Л. М. Глашкина, Е. Е. Ермолаева, Я. А. Дубровский, Д. С.

Прокофьева, Н. Г. Войтенко, Т. И. Смолихина, Н. Б. Поляков, А. С. Радилов, Е.

П. Подольская, Н. В. Краснов. Идентификация алкилированного аддукта сыво роточного альбумина человека методами масс-спектрометрии // Научное прибо ростроение. – 2008. – т. 18. – № 4. – С. 46-53.

2. Бабаков, В. Н.. Использование масс-спектрометрии с методом ионизации MALDI при поиске биомаркеров интоксикаций высокоопасными отравляющими ве ществами / В. Н. Бабаков, Е. П. Подольская, Н. В. Гончаров, И. А. Краснов, Л. М.

Глашкина, Я. А. Дубровский, Е. Е. Ермолаева, Д. С. Прокофьева, Н. Г. Войтенко, А.

С. Радилов, Н. В. Краснов, В. Р. Рембовский // V российский симпозиум «Белки и пептиды». – Казань, 2009. – С.78.

3. Дубровский, Я. А. Идентификация алкилированных аддуктов глобина крысы методами масс-спектрометрии / Я. А. Дубровский, Е. П. Подольская, Н. Г.

Войтенко, И. А. Краснов, В. Д. Гладилович, В. Н. Бабаков, Н. В. Гончаров, Н. В.

Краснов // Научное приборостроение. – 2010. – т. 20. – № 4. – С. 77-83.

4. Дубровский, Я. А. Взаимодействие глобина крысы и человека с ацетил салициловой кислотой in vitro: масс-спектрометрическая идентификация ацети лированных лизинов / Я. А. Дубровский, В. Д. Гладилович, Е. П. Подольская, В.

Н. Бабаков, Н. В. Гончаров, Н. В. Краснов // Научное приборостроение. – 2010. – т. 20. – № 4. – С. 71-76.

5. Гладилович, В. Д. Идентификация пептидов сывороточного альбумина модифицированных фосфорорганическими соединениями с применением мето дов хроматографии и масс-спектрометрии / В. Д. Гладилович, И. А. Краснов, Е.

П. Подольская, Я. А. Дубровский, Н. Г. Войтенко, С. В. Фиронов, В. Н. Бабаков, Н. В. Гончаров, Н. В. Краснов // Научное приборостроение. – 2010. – т. 20. – № 4. – С. 84-92.

6. Дубровский, Я. А. Ацетилирование глобина ацетилсалициловой кислотой / Я. А. Дубровский, В. Н. Бабаков, Е. П. Подольская, Н. В. Гончаров // Химическая без опасность Российской Федерации в современных условиях/ под общ. ред В.Р. Рем бовского и А.С. Радилова, - СПб.: Фолиант, 2010. – С. 75.

7. Babakov, V. Comparative analysis of methods for retrospective detection of sulfur mustard metabolites and its protein adducts in rats / V. Babakov, N. Voytenko, O. Orlova, Ya. Dubrovsky, I. Krasnov, E. Podolskaya, N. Koryagina, E. Savelieva, A. Radilov, N.

Goncharov // Proceedings 10th international symposium on protection against chemical and biological warfare agents. – Stockholm, 2010. - Статья по материалам конференции.

8. Краснов, И. А. Идентификация алкилированных аддуктов сывороточного альбумина и гемоглобина методами масс-спектрометрии / И. А. Краснов, Н. В. Гон чаров, В. Н. Бабаков, Л. М. Глашкина, Е. Е. Ермолаева, Я. А. Дубровский, Д. С. Про кофьева, Н. Г. Войтенко, А. С. Радилов, Е. П. Подольская, Н. В. Краснов // Химиче ская безопасность Российской Федерации в современных условиях/ под общ. ред В.Р.

Рембовского и А.С. Радилова, - СПб.: Фолиант, 2010. – С. 87.

9. Краснов, И. А. Идентификация пептидов альбумина, модифицированных фосфорорганическими соединениями, с применением методов хроматографии и масс спектрометрии / И. А. Краснов, В. Д. Гладилович, Я. А. Дубровский, В. Н. Бабаков, Е.

П. Подольская // Химическая безопасность Российской Федерации в современных условиях/ под общ. ред В.Р. Рембовского и А.С. Радилова, - СПб.: Фолиант, 2010. – С.

86.

10. Подольская, Е. П. Использование методов фосфопротеомики при анализе ковалентных аддуктов белков крови с фосфорорганическими соединениями / Е. П.

Подольская, В. Д. Гладилович, И. А. Краснов, Я. А. Дубровский, В. И. Шмурак, Н. Г.

Войтенко, С. В. Фиронов, В. Н. Бабаков, Н. В. Гончаров // Первая международная научно-практическая конференция «Постгеномные методы анализа в биологии, лабо раторной и клинической медицине». – Москва, 2010. – С. 55.

11. Дубровский, Я.А. Применение металл-аффинной хроматографии для выде ления алкилированных аддуктов гемоглобина крысы / Я.А. Дубровский, В. Д. Глади лович, И. А. Краснов, Е. П. Подольская, Е. А. Мурашко, В. Н. Бабаков, Н. В. Гончаров // V российский симпозиум «Белки и пептиды». - Петрозаводск, 2011. – С.78.

12. Методы определения алкилированных аддуктов сернистого иприта с белками крови / Методические рекомендации № 41-11 от 26.10.2011.

13. Дубровский, Я. А. Применение металл-аффинной хроматографии для выделения алкилированных аддуктов гемоглобина крысы / Я. А. Дубровский, В.

Д. Гладилович, И. А. Краснов, Е. П. Подольская, Е. А. Мурашко, В. Н. Бабаков // Биоорганическая химия. – 2012. – т. 38. – № 1. – С. 52-57.

14. Шрейнер, Е. В. Идентификация сайтов ацетилирования гемоглобинов крысы и человека при их взаимодействии с ацетилсалициловой кислотой / Е. В.

Шрейнер, Е. А. Мурашко, Я. А. Дубровский, Н. В. Краснов, Е. П. Подольская, В.

Н. Бабаков // Биоорганическая химия. - 2012. – т. 38. – № 2. – С. 149-155.

15. Дубровский Я. А., Идентификация сайтов ацетилирования гемоглобина че ловека при взаимодействии с ацетилсалициловой кислотой / Я. А. Дубровский, Е. В.

Шрейнер, Е. А. Мурашко, Е. П. Подольская, В. Н. Бабаков // Медико-биологические аспекты обеспечения химической безопасности Российской Федерации. – Санкт Петербург, 2012. – С.86.

16. Murashko, E.A. Phosphoproteomics approach for detection of butyrylcholinester ase adducts with organophosphorous nerve agents by maldi mass spectrometry / E.A. Mu rashko, Ya.A. Dubrovsky, V.I. Shmurak, A.D. Nadeev, E.P. Podolskaya, V.N. Babakov // 11th International Meeting on Cholinesterases. – Казань, 2012. – С.78.

17. Dubrovskii, Ya. A. Enrichment of sulfur mustard alkylated rat hemoglobin adducts using metal-affinity chromatography / Ya. A. Dubrovskii, V. D. Gladilovich, I. A. Krasnov, E. P. Podilskaya, E. A. Murashko, V. N. Babakov // Proceedings 11th international sympo sium on protection against chemical and biological warfare agents. – Stockholm, 2013. – P.

18. Murashko, E. A. Phosphoproteomics approach for enrichment and detection of al bumin adducts with organophosphorous nerve agents by MALDI mass spectrometry / E. A.

Murashko, V. D. Gladilovich, Ya. A. Dubrovskii, E. P. Podilskaya, V. N. Babakov // Pro ceedings 11th international symposium on protection against chemical and biological war fare agents. – Stockholm, 2013. – P. 131.

19. Lockridge, O. Reaction of tyrosinyl, histidinyl and lysinyl residues with OP / O.

Lockridge, B. Li, W. Jiang, M. Liyasova, L.M. Schopfer, F. Nachon, P. Masson, E. A. Mu rashko, Ya. A. Dubrovskii, E. P. Podolskaya, V. N. Babakov //Proceedings of 38th FEBS Congress. St. Petersburg, 2013. / FEBS Journal. – V. 280. – 2013. Suppl. 1. – P. 163-164.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АСК – ацетилсалициловая кислота ВЭЖХ-МС-МС - жидкостная хроматография в сочетании с тандемной масс-спектрометрией ГХ-МС – газовая хроматография в сочетании с масс-спектрометрией ЛД – летальная доза МАЛДИ – матрично-активируемой лазерной десорбции/ионизации МС-МС – тандемная масс-спектрометрия ОВ – отравляющее вещество СИ (HD) – сернистый иприт ТФУ – трифторуксусная кислота УК – уксусная кислота ФОВ – фосфорорганические отравляющие вещества ФОС – фосфорорганические соединения CHCA – -циано-4-гидроксикоричная кислота CID – фрагментация вызванная соударением DHB – 2,5-Дигидроксибензойная кислота GB – зарин GD – зоман RVX, VR – вещество типа Vx Подписано в печать 28.08.2013 Формат 60х90/ Бумага офсетная. Усл. печ. л. 1, Тираж 100 экз. Заказ Отпечатано в типографии «Адмирал»

199178, Санкт-Петербург, В.О., 7-я линия, д. 84 А