Действие дельта-эндотоксина bacillus thuringiensis на перевиваемые культуры клеток
На правах рукописи
КАМЕНЕК ДМИТРИЙ ВАЛЕРЬЕВИЧ ДЕЙСТВИЕ ДЕЛЬТА-ЭНДОТОКСИНА BACILLUS THURINGIENSIS НА ПЕРЕВИВАЕМЫЕ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК Специальность 03.00.07 – микробиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Казань, 2009
Работа выполнена на кафедре общей и биологической химии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Ульяновский государственный университет
Научный консультант: доктор биологических наук, профессор, член-корр. АН Татарстана Ильинская Ольга Николаевна
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Алимова Фарида Кашифовна (зав.кафедрой биохимии Казанского государственного университета им. В.И.
Ульянова - Ленина,г. Казань).
доктор биологических наук, профессор Васильев Дмитрий Аркадьевич (зав.кафедрой микробиологии, вирусологии, эпизоотологии, ветеринарно санитарной экспертизы Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии)
Ведущая организация: ФГОУ ВПО Cаратовский государственный университет им.
Н.Г.Чернышевского
Защита диссертации состоится «_» 2009 года в часов на заседании диссертационного совета Д 212.081.08 при ГОУ Казанский государственный университет имени В.И. Ульянова-Ленина, по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлёвская, 18, аудитория 211.
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. Н.И.
Лобачевского Казанского государственного университета им. В.И. Ульянова
Автореферат разослан «_» 2009 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор З.И. Абрамова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы: Bacillus thuringiensis является широко распространенной в природе кристаллофорной спорообразующей бактерией.
Известны ее энтомопатогенные свойства и промышленные препараты на основе бактерии являются наиболее важными средствами биологического контроля численности насекомых во многих странах.
Известно, что основным действующим началом B. thuringiensis, ответственным за комплекс патологических проявлений в организме чувствительного насекомого, является дельта – эндотоксин, продуцируемый ею. Показана также антимикробная активность дельта-эндотоксинов B.thuringiensis для различных бактерий и микроскопических грибов (Юдина и Бурцева, 1997;
Климентова, 2001;
Тюльпинева, 2003;
Каменек и соавт., 2005). Отмечали кроме того селективное ингибирующее действие белков кристаллов subsp. thuringiensis на развитие опухолевых клеток млекопитающих, в том числе человека (Prasad & Shethna, 1976;
Ito et al., 2004). Эндотоксины предпочтительно убивали раковые клетки HeP, не оказывая влияния на развитие нормальных клеток. Все это дает основание предположить, что B. thuringiensis и её кристаллический дельта-эндотоксин являются важным универсальным высокоизбирательным природным регулятором численности самых различных организмов.
Создание и применение средств на основе дельта-эндотоксина позволило бы не только обеспечить максимальную эффективность и экологическую безвредность мероприятий по защите растений от вредных насекомых и фитопатогенных микроорганизмов, но и, возможно, решить целый ряд медицинских и ветеринарных проблем. Прежде всего, разработать препаративные формы, обладающие антимикробной и противораковой активностью и не токсичные для нормальных клеток. Их разработке должны предшествовать исследования, выполненные на культурах клеток.
В мировой литературе накоплен обширный материал, описывающий строение, состав, физико-химические свойства кристаллов. Установлено, что дельта-эндотоксины способны связываться с чувствительными рецепторами на цитоплазматических мембранах клеток кишечного эпителия, а затем проникать в них, формируя каналы-поры (Hodgman & Ellar, 1990;
Smith & Ellar, 1994). Изучены особенности механизма действия на насекомых, включая клеточные культуры. Отмечается нарушение транспорта ионов, активирование АТPаз, снижение синтеза АТФ на фоне усиления потребления кислорода, разобщение процессов окислительного фосфорилирования и дыхания (Heimpel, 1977;
Faust, 1984;
Aronson et al., 1986;
Gill et al., 1992;
Himeno et al., 1985;
Каменек, 1998). Проведены также исследования влияния на млекопитающих кристаллов белкового дельта-эндотоксина, которые подтвердили, что эти белки и продукты их расщепления не токсичны и не аллергенны для теплокровных организмов (Киль и Надыкта, 2002).
Вышесказанное позволило определить цель и задачи исследования.
Цель настоящего исследования – охарактеризовать по морфологическим и биохимическим параметрам этапы действия дельта эндотоксина Bacillus thuringiensis subsp. sotto и выявить особенности механизма его действия на клетки перевиваемых линий HeLa, B16 и L1210.
Основные задачи
исследования:
1. Выявить общее цитопатическое действие дельта-эндотоксина и охарактеризовать силу его эффекта по отношению к клеткам перевиваемых линий HeLa, B16 и L1210.
2. Определить влияние дельта-эндотоксина на ионный гомеостаз клеточных линий, установив факт нарушения транспорта основных неорганических ионов (K+, Na+, Ca2+ и Mg2) вследствие изменения активности основного ионного транспортера - K+, Na+- АТФазы.
3. Установить возможность действия дельта-эндотоксина как агента, разобщающего дыхание и фосфорилирование в клетках перевиваемых культур 4. Проанализировать влияние дельта-эндотоксина на процесс гликолиза в клетках HeLa согласно показателям активности основных ферментов гликолиза – 3-фосфоглицерат дегидрогеназы и лактат дегидрогеназы.
5. Охарактеризовать ранние и поздние этапы действия дельта эндотоксина Bacillus thuringiensis subsp. sotto Научная новизна результатов исследований. Впервые проведено изучение влияния дельта-эндотоксина B. thuringiensis на клетки перевиваемых культур (HeLa, L1210, B16). Показано, что изученные культуры отличаются по чувствительности к токсину. Установлена прямо пропорциональная зависимость их чувствительности от времени контакта с токсином и его концентрации.
Показано, что действие дельта-эндотоксина на культуры раковых клеток, аналогично таковому для клеток кишечника и культур насекомых.
Установлено нарушение работы ион транспортирующей Mg2+-зависимой АТФазной системы, результатом которого является пассивный нерегулируемый приток ионов натрия и воды в клетку и, как следствие, вакуолизация мембранных структур. Показана первичность активирования фермента (в течение первых 10 мин) по отношению к изменению концентраций ионов, которое начиналось только через 10-15 мин.
Установлено, усиление клеточного дыхания в течение первых 10 минут воздействия дельта-эндотоксина на фоне резкого снижения синтеза АТР, которое, вероятно, связано с разобщением окислительного фосфорилирования и дыхания, приводящего к деэнергизации митохондрий и клеток в целом.
Установлено начальное усиление гликолиэа, очевидно связанное с необходимостью компенсации снижения синтеза АТР в ходе окислительного фосфорилирования, за счет аэробной, а при дальнейшей деэнергизации клетки, и снижении потребления кислорода анаэробной стадии гликолиза.
Это подтверждает динамика изменения активности 3-фосфорглицерат дегидрогеназы и лактат дегидрогеназы, ферментов катализирующих из ключевых стадий гликолитического процесса.
Установлено, что нарушение транспортных функций клеточных мембран и, вслед за этим, их целостности вызывает выход лактатдегидрогеназы во внеклеточную жидкость и значительное повышение содержания лактата в ней.
Практическая значимость работы. Полученные результаты могут быть использованы при разработке препаративных форм для лечения различных форм онкологических заболеваний человека и домашних животных, а так же при оценке безопасности применения эндотоксинсодержащих пестицидов. Полученные результаты могут быть использованы в учебном процессе как вносящие вклад в представления о механизмах действия бактериальных токсинов.
Положения, выносимые на защиту:
1. Цитопатический эффект дельта-эндотоксина B. thuringiensis subsp.
sottо связан с изменением структуры клеток (нарастающая вакуолизация с последующим разрушением), пропорционален его концентрации и времени контакта с клетками перевиваемых культур. Эффективность действия токсина различается по силе для разных клеточных линий: чувствительность клеток HeLa значительно выше, чем клеток B16 и L1210.
2. Действие дельта-эндотоксина характеризуется нарушением транспорта ионов K+, Na+, Ca2+ и Mg2+ через цитоплазматическую мембрану клеток, которому предшествует значительная (до 6,8 раз) активация Mg2+ зависимой K+, Na+- АТФазы.
3. Дельта-эндотоксин угнетает синтез АТФ на фоне активации дыхания, действуя на культуры клеток аналогично разобщителям процессов окислительного фосфорилирования и дыхания.
4. Проявлением действия дельта-эндотоксина является интенсификация гликолиза в клетках HeLa на начальном этапе и активация 3-фосфоглицерат дегидрогеназы с последующим ее угнетением, сменяемым активацией характерного для анаэробного режима гликолиза фермента – лактат дегидрогеназы.
5. Разрушению клеток под действием дельта-эндотоксина предшествует, деэнергизация митохондрий, снижение потребления кислорода, активациея анаэробного пути гликолиза, нарушение целостности мембран и выход лактат дегидрогеназы во внеклеточную среду.
Апробация работы. Основные результаты исследований докладывались на симпозиуме с международным участием «Актуальные проблемы адаптации к природным и экосоциальным условиям среды» (Ульяновск, 2002), XIII Международной научной конференции «Ферменты микроорганизмов: структура, функции, применение» (Казань, 2005);
Всероссийской школе-семинаре молодых ученых и специалистов по актуальным проблемам «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2004 - 2006);
Всероссийской конференции молодых ученых и специалистов (Москва, МГУ, 2007);
Регионального научного семинара Министерства образования РФ « Геоэкологические проблемы Среднего Поволжья» (Ульяновск, 2008), Международной научно-практической конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (Казань, 2008), межкафедральных семинарах экологического факультета Института медицины, экологии и физической культуры Ульяновского госуниверситета (2003 – 2008).
Публикации результатов исследований. Основные положения опубликованы в 14 работах.
Объем диссертационной работы. Диссертационная работа изложена на 131 странице компьютерного набора, включает 12 таблиц и 12 рисунков.
Диссертация состоит из введения, 3 глав, включающих обзор литературы, материалов и методов исследований результаты исследований и их обсуждение с учетом существующих в литературе данных, заключения, выводов и списка литературы. Список цитируемой литературы содержит источников, в том числе 91 на русском языке.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ В соответствии с поставленной задачей нами были изучено действие дельта-эндотоксинов различных штаммов B. thuringiensis subsp. galleriae, alesti, kurstaki, thuringiensis, sotto, dendrolimus, (Cry IA класса), на клетки HeLa, L1210, B16 и SCLd-135.
Кристаллы растворяли 0,04 М NaOH, затем рН снижали до 7, осторожным титрованием 0,1 М HCl. Кристаллы предварительно отделяли от спор в двухфазной системе: хлороформ – водный раствор Na2SO4 (Cooksey, 1968). Разделение полипептидов проводили методом хроматографии на колонке Sephadex-G-200 размером 2,5410 см. Уровень белка определяли по методике. Для дальнейшей работы собирали фракции с Мr выше 60000 Д.
Очистку дельта-эндотоксинов завершали микрофильтрацией через бактериальные фильтры, которая являлась одновременно и стерилизацией.
Для световой микроскопии препараты фиксировали в фиксаторе Карнуа и окрашивали кристаллическим фиолетовым (Пирс, 1962).
Содержание неорганического фосфата определяли по методу Самнера (1989).
Концентрацию ионов измеряли с помощью атомно-адсорбционного спектрофотометра марки С-115. Поглощение кислорода изучали микроманометрическим методом (Travers et al., 1976).
Активность ферментов определяли спектрофотометрически после экстракции 0,1 М фосфатным буфером, рН 7,3 (лактат дегидрогеназа) или 0,1М карбонатным буфером, рН 9,8 (3-фосфоглицерат дегидрогеназа) при 4°C в течение 30 мин (Клунова и Банников, 1980). Активность Mg2+ зависимой АТФазы устанавливали по выделению неорганического фосфата (Фн) из АТФ в результате реакции ферментативного гидролиза (Писарева, 1968).
Достоверность всех полученных результатов оценивали методами математической статистики с помощью электронных таблиц Microsoft Excel.
2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 2.1. Цитопатическая активность дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis Согласно данным литературы, оптимальными концентрациями, позволяющими выявить различия в действии токсина, являются 5-15 мкг/мл.
Нами была выбрана минимальная из указанных концентрация, заведомо не приводящая к полному разрушению клеток. Инкубацию в присутствие токсина осуществляли в течение 60 мин.
Как показали результаты, растворы дельта-эндотоксинов B.
thuringiensis subsp. galleriae, alesti, kurstaki, thuringiensis, sotto, dendrolimus в концентрации 5 мкг/мл оказывают воздействие на клетки HeLa, L1210, B16 и SCLd-135. При этом существенных различий в способности токсинов различного происхождения разрушать клетки не было отмечено. В результате для дальнейших исследований была выбрана культура, обладающая максимальной продукцией дельта-эндотоксина.
Количественный анализ способности штаммов продуцировать дельта эндотоксин показал, что в наибольшей степени она выражена у штаммов sotto 617 (129,7 мг/г сухой массы культуры).
Количество разрушенных клеток, % dendrolimus alesti 204 galleriae 69- sotto 617 kurstaki Z-52 thompsoni 502 (IV1) (III1) 6 (V1) (IV2) (III2) (XII) Штаммы Bacillus thuringiensis В 16 L 1210 He La LCLd- Рис. 1. Цитопатическое действие различных концентраций дельта-эндотоксинов B.
thuringiensis subsp. sotto Сравнение цитопатической активности дельта-эндотоксина на изучаемые культуры показало, что наблюдается выраженная зависимость ее от концентрации токсина (рис. 1). Концентрация 20 мкг/мл не оказывала действия на клетки меланомы мышей – В 16 и лимфоидной лейкемии кроликов – L 1210 и приводила к разрушению 17 – 20% клеток рака шейки матки человека – НеLa и клетки кишечного эпителия непарного шелкопряда - SCLd-135.
Концентрация 100 мкг/мл вызывала разрушение несколько более половины клеток В16 и L1210 (57 и 69%, соответственно) и большей части клеток НеLa и SCLd-135 (90 – 95%, соответственно) Полное разрушение клеток первых двух культур наблюдали только в случае действия 200 мкг/мл токсина.
Полученные данные показывают не только выраженную зависимость цитопатического эффекта от концентрации дельта-эндотоксина, но и существенные различия в чувствительности изучаемых культур к нему.
На рисунках 2 и 3 представлены результаты изучения влияния продолжительности времени инкубации на цитопатическое действие дельта эндотоксина в двух концентрациях: 50 и 100 мкг/мл. При действии эндотоксина в концентрации 50 мкг/мл (рис. 2) разрушение клеток L начиналось через 10 мин (3,2%) и через 120 мин достигало максимальной величины в 64,6%. В случае В16 разрушение 12,5% отмечено через 15 мин.
Для НеLa и SCLd-135 отмечен значительный цитопатический эффект уже после 5 мин инкубации с токсином (17,0 и 18,1%, соответственно). Через мин оказались разрушенными 86,6 и 84,0% клеток, соответственно.
Количество разрушенных клеток, % 5 10 15 30 60 90 Время инкубации, мин L 1210 B 16 SCLd-135 HeLa Рис. 2. Влияние времени инкубации на цитопатическое действие дельта эндотоксина B. thuringiensis subsp. sotto (концентрация 50 мкг/мл) Действие дельта-эндотоксина в концентрации 100 мкг/мл приводило к более значительному цитолитическому действию (рис. 3). Уже в первые мин во всех изученных образцах отмечено наличие разрушенных клеток, достигавшее 8,6% для L 1210;
5,0 для В 16;
27, 5 для SCLd-135 и 27,1 для НеLa. Через 30 мин количество лизированных клеток составило 57,0;
69,1;
90,9 и 94,9%, соответственно. Через 60 мин клетки SCLd-135 и НеLa оказались полностью разрушены, и случае В16 аналогичный эффект наблюдали только через 120 мин. Для клеток L 1210 через 120 мин инкубации отмечено 91,2% разрушенных клеток.
Количество разрушенных клеток, % 20 40 80 100 150 Концентрация эндотоксина, мкг/мл L 1210 B 16 SCLd-135 HeLa Рис. 3. Влияние времени инкубации на цитопатическое действие дельта эндотоксина B. thuringiensis subsp. sotto (концентрация, 100 мкг/мл) Таким образом, полученные результаты указывают на способность дельта-эндотоксинов B. thuringiensis subsp. sotto, штамм 617 оказывать цитолитическое действие на клетки исследованных культур. При этом отмечена выраженная прямо пропорциональная зависимость оказываемого эффекта от концентрации дельта-эндотоксина. Цитотоксическое действие было тем более значительным, чем продолжительнее была инкубация.
Следует отметить, что изученные культуры различаются по степени чувствительности к данному токсину: для SCLd-135 и НеLa ее можно характеризовать как высокую, тогда как для L 1210;
и В16 – среднюю. Для сравнения была использована культура клеток кишечного эпителия непарного шелкопряда – SCLd-135, высокая чувствительность которой к токсину subsp. galleriae была отмечена ранее (Каменек, 1989).
2.2. Микроскопическое изучение действия дельта-эндотоксина на клеточные культуры В ходе исследования, проведенного на клетках культуры НеLa, было установлено, что первые изменения клеток по сравнению с нормой наблюдались уже через одну минуту после начала инкубации с раствором дельта-эндотоксина (рис. 4.2). Клетки начинали вакуолизироваться через этот промежуток времени, при чем степень вакуолизации возрастала с увеличением продолжительности инкубации и была пропорциональна концентрации дельта-эндотоксина. Так, если при использовании концентрации 100 мкг/мл через 1 мин было вакуолизировано до 90% всех клеток и появились первые разрушенные, то при 50 мкг/мл до 50%.
Рис. 4. Действие дельта-эндотоксина на культуру клеток HeLa: 1 – нормальные клетки (контроль), 2 – вакуолизация через 1 мин инкубации (100 мкг/мл), 3 – вакуолизация и признаки разрушения клеток через 15 мин, 4 – разрушение клеток (через 30 мин инкубации при концентрации 100мкг/мл или через 2 ч – 50 мкг/мл), световая микроскопия, увеличение в 400 раз.
Через 15 мин во всех сериях опытов вакуолизация достигала 100 %, и размеры клеток значительно увеличились (рис. 4.3). В это же время нарастают признаки разрушения клеток. Через 30 мин инкубации с токсином в концентрации 100 мкг/мл не обнаруживается ни одной целой клетки (рис.
4.4).
На представленных микрографиях видно, что кроме появления большого числа вакуолей, наблюдаются и такие признаки нарушения структуры клеток, как истончение клеточной мембраны и зернистость ядер.
В контроле, где клетки инкубировались в том же растворе, что и в опытах, только в отсутствие дельта-эндотоксина, каких-либо изменений в структуре клеток обнаружено не было (рис. 4.1).
Столь значительная вакуолизация клеток вероятнее всего является следствием нарушения активного транспорта ионов и, прежде всего, натрия, концентрация которого в норме во внутриклеточной среде должна быть ниже, чем во внеклеточной.
2.3. Действие дельта-эндотоксина на содержание ионов в клетках Для получения более полной картины действия дельта-эндотоксина было проведено изучение концентраций ионов в различные моменты времени. Данные, представленные на рисунках 4 и 5, показывают, что, начиная с 15 минут после добавления токсина, значительно изменялась концентрация всех определяемых ионов в клетках HeLa. Наибольшие отклонения от нормы наблюдали в концентрации ионов Na+, причем степень повышения уровня зависела от количества токсина.
Концентрация ионов, мкмоль х 10^5 клеток исходная 5 10 15 30 60 Время после обработки, мин K+ Na+ Ca2+ Mg2+ Рис. 4. Влияние дельта-эндотоксина (50 мкг/мл) на концентрацию ионов в клетках HeLa Максимальное увеличение составляло 203% через 30 мин для мкг/мл токсина и 182% через 1 ч для 50 мкг/мл. Существенно снижалась концентрация ионов K+, достигая 61% от исходного значения через 30 мин для 100 мкг/мл и 60% через 1 ч для 50 мкг/мл.
Для Mg2+ отмечено снижение до 78% через 30 мин для 100 мкг/мл и 71% через 1 ч для 50 мкг/мл, соответственно. Концентрация ионов Ca2+, наоборот, повышалась через тот же период времени до 130 и 136%, соответственно.
Изменение концентраций ионов, хотя и менее значительное, отмечено и в случае менее чувствительных к дельта-эндотоксину культур и Максимальное увеличение концентрации ионов Na+ при использовании мкг/мл токсина составляло через 1 час 179% для L1210 и 167% для В16.
Существенно снижалась концентрация ионов K+, достигая 76 и 72%, соответственно, от исходного значения через 30 мин. Для Mg2+ отмечено снижение до 78 и 83% через 30 мин. Концентрация ионов Ca2+, наоборот, повышалась через тот же период времени до 130% в обоих случаях.
Поддержание постоянства концентраций ионов Ca2+ и Mg2+ чрезвычайно важно из-за высокой их биологической активности. Ca2+ в основном находится в органеллах – митохондриях, эндоплазматическом ретикулуме, кальцисомах, а не в цитозоле.
Концентрация ионов, мкмоль х 10^5 исходная 5 10 15 Время после обработки, мин K+ Na+ Ca2+ Mg2+ Рис. 5. Влияние дельта-эндотоксина (100 мкг/мл) на концентрацию ионов в клетках культуры HeLa Полученные результаты согласуются с ранее приведенными по вакуолизации клеток. В период (от 15 мин и далее) происходит нарастание вакуолизации, связанной с нарушением транспорта ионов через цитоплазматическую мембрану, и в первую очередь это относится к ионам Na+, транспорт которого неразрывно связан с транспортом воды.
Результаты, представленные на рисунке 6, показывают значительное активирование K+, Na+-АТРазы культур клеток L1210 и HeLa. Активирование начиналось уже через 1 мин после добавления токсина и составляло 47 и 59%, соответственно. Максимальных значений активность фермента достигала через 15 мин и составляла 638 и 213%, соответственно.
0, Активность, мкг Фн· мг-1 белка · ч- 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, исходная 1 5 10 15 30 60 Время после обработки, мин L1210 HeLa Рис. 6. Влияние дельта-эндотоксина B. thuringiensis (50 мкг/мл) на Mg2+ зависимую K+, Na+-АТФазу культур клеток Изменение активности данного фермента наблюдается как при нарушении целостности мембраны, так и при действии веществ, разобщающих процессы дыхания и окислительного фосфорилирования.
Поскольку активность фермента характеризует его способность гидролизовать субстрат (АТФ), и известно, что эта способность резко повышается как в условиях разобщения окислительного фосфорилирования и дыхания, так и при нарушении целостности мембраны, активирование данной ферментной системы фактически отражает степень деэнергизации клетки. Торможение транспортной функции приводит к накоплению промежуточных продуктов реакции: АДФ и Фн, что и регистрируется в наших экспериментах, как усиление гидролитической активности АТФазы.
Было показано, что способность гидролизовать АТФ не является свойством самого эндотоксина катализировать гидролиз АТФ с высвобождением фосфата. Он также не может являться поставщиком свободного (неорганического) фосфата в реакционную среду.
2.4. Действие дельта-эндотоксина на дыхательную активность и синтез АТФ в клетках Нами было выполнено изучение влияния дельта-эндотоксина на дыхание и окислительное фосфорилирование в клетках наиболее чувствительной культуры HeLa.
Полученные данные (рис. 7) демонстрируют стимулирование поглощения кислорода клетками HeLa на 74% через 1 мин инкубации с токсином в концентрации 150 мкг/мл. Далее следовало быстрое снижение дыхательной активности до величины ниже контрольной (67%).
При концентрации токсина 100 мкг/мл начальное стимулирование дыхания на 51% далее снижалось, достигая к 5 мин 38%. Очевидно, что при концентрациях, превышающих 150 мкг/мл, поглощение О2 усиливается в более ранние периоды, что мы не можем зарегистрировать, используя имеющиеся в распоряжении методики.
Интенсивность дыхания, % от исх.
0 50 100 150 Концентрация дельта-эндотоксина, мг/мл 1 мин 5 мин Рис. 7. Действие дельта-эндотоксина на потребление кислорода клетками При небольшой концентрации токсина 50 мкг/мл нами зарегистрирован незначительно нарастающий во времени эффект 4 и 15 % через 1 и 5 мин, соответственно. В случае 20 мкг/мл вообще не удалось зарегистрировать эффекта.
Полученные данные указывают на зависимость действия дельта эндотоксина от его концентрации и времени воздействия на респираторную активность клеток. При этом, чем больше концентрация токсина, тем раньше наблюдается начальное стимулирование и последующее угнетение потребления клетками кислорода.
Был проведен анализ временной последовательности описанных выше явлений, с целью дальнейшей конкретизации механизма. Для этого были выбраны две концентрации эндотоксина (100 и 50 мкг/мл), которые вызывают умеренный разобщающий эффект, а, следовательно, позволяют охватить более значительный промежуток времени при наблюдении эффекта.
Параллельно измеряли уровень продукции АТФ и рассчитывали коэффициент фосфорилирования (Р/О). Известно, что в дышащих митохондриях скорость переноса электронов в дыхательной цепи, а следовательно, и скорость синтеза АТФ, определяется в первую очередь относительными концентрациями АДФ, АТФ и Фн (неорганического фосфата) в окружающей среде, а не концентрациями субстратов дыхания, например, пирувата. тем выше, чем выше концентрация АДФ и Фн и ниже – АТФ. Это явление носит название дыхательного (акцепторного) контроля.
Математически это выражается отношением Р/О, где Р представляет концентрацию АДФ. В условиях эксперимента на интактных митохондриях при постоянстве начальных концентраций АДФ и Фн в окружающей среде убыль концентрации АДФ пропорциональна приросту Фн, что и будет являться мерой скорости синтеза АТФ в митохондрии.
Эффект начального стимулирования поглощения кислорода в течение первых 10 мин воздействия дельта-эндотоксина утрачивается к 15 мин его воздействия (рис. 8). При этом как стимулирование, так и угнетение потребления кислорода митохондриями пропорциональны концентрации токсина.
Интенсивность дыхания, % от исх.
1 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Время, мин 100 мкг/мл 50 мкг/мл Рис. 8. Изменение потребления кислорода клетками под действием дельта эндотоксина Начальное стимулирование под действием концентрации 100 мкг/мл составляет через 1 мин около 51 % от исходной, тогда как 50 мкг/мл стимулирования не вызывала. Скорость же снижения поглощения кислорода более значительна в случае концентрации 100 мкг/мл по сравнению с 50. Так, уже через 10 мин воздействия она практически возвращается к норме, тогда как для 50 мкг/мл остается на 6 % выше нормы. В конечный момент эксперимента (60 мин) эти значения составляют 4 и 48 % от контроля, соответственно. Уровень поглощения О2 митохондриями в норме, при этом составлял 15-16 мкМ/106 клеток в 1 мин.
Уже в первую минуту воздействия эндотоксина происходит резкое снижение потребления АДФ и Фн, а, следовательно, и синтеза АТФ (рис. 9).
Так концентрация 100 мкг/мл снижает этот показатель почти в 5,4, а мкг/мл – в 2,9 раз.
Синтез АТФ, % от нормы 1 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Время, мин 100 мкг/мл 50 мкг/мл Рис. 9. Влияние дельта-эндотоксина на синтез АТФ в клетках HeLa В течение первых 10 мин синтез АТФ постепенно снижается в 7,2 и раза, соответственно, а затем резко падает через 15 мин в 22 и 11,4 раза, соответственно. Через 60 мин инкубации потребление АДР составляет только 0 % (100 мкг/мл) и 0,4 % от нормы.
Результаты показывают, что наряду с первоначальным стимулированием поглощения кислорода (рис. 9) наблюдается значительное снижение синтеза АТФ. Наиболее полно этот эффект выражается в изменении коэффициента фосфорилирования Р/О (табл. 1). Значение Р/О заметно снижается в 10,5-38 раза в случае использования дельта-эндотоксина в концентрации 100 мкг/мл и в 2-9,5 раза – 50 мкг/мл. С учетом того, что дыхание в первые 10 мин остается даже более интенсивным, чем в норме, следует констатировать, что произошло разобщение процессов окислительного фосфорилирования и дыхания. Причем наиболее вероятно его действие как переносчика протонов.
Таблица Влияние дельта-эндотоксина на интенсивность дыхания и синтез АТФ клетками HeLa Концентрац Норма (в ия токсина, Эффект 1 мин 5 мин 10 мин 15 мин 30 мин 60 мин отсутствие мкг/мл токсина) 2,28 ± 1,20 ± 0,40 ± 0,06 ± 1,88 ± 1,60 ± 1,70 ± 0, потребление О2 0,26 0,16 0,09 0, 0,25 0, *** *** *** *** 0,53 ± 0,43 ± 0,40 ± 0,13 ± 0,05 ± 2,86 ± 0, синтез АТР 0,07 0,06 0,08 0,03 0, *** *** *** *** *** 0,23 ± 0,23 ± 0,25 ± 0,11 ± 0,13 ± Р/О 0 1, 0,03 0,03 0,03 0,01 0, *** *** *** *** *** 0,82 ± 1,69 ± 1,88 ± 1,80 ± 1,40 ± 1,10 ± 1,70 ± 0, потребление О2 0, 0,08 0,19 0,21 0,15 0, ** 1,67 ± 1,29 ± 0,77 ± 0,25 ± 0,22 ± 0,08 ± 50 2,86 ± 0, синтез АТР 0,17 0,06 0,08 0,09 0,03 0, *** *** *** *** *** *** 0,99± 0,66± 0,43± 0,18± 0,20± 0,10± Р/О 1, 0,06 0,04 0,03 0,01 0,01 0, *** *** *** *** *** *** Примечание: * – р 0,05;
** – р 0,01;
*** – р 0,001 при n = 20 (n – число пар измерений) Эффект начального стимулирования дыхания является компенсаторной реакцией, связанной с разобщением. Очевидно, этот процесс заканчивается уже в первые 10 мин воздействия токсина, что в дальнейшем вызывает деэнергизацию митохондрий, а, следовательно, и клетки, и всю последующую цепь событий, важнейшим из которых является нарушение транспорта ионов и неэлектролитов в клетке.
2.5 Влияние дельта-эндотоксина на процесс гликолиза В условиях повышенного потребления кислорода увеличивается и потребность митохондрии в восстановительных эквивалентах, поставляемых субстратами дыхательной цепи. Это должно привести к ускорению гликолиза в цитозоле. Однако, поскольку процессы дыхания и окислительного фосфорилирования в митохондрии разобщены, прекращается синтез АТФ, происходит деэнергизация митохондрии, что приводит к торможению работы дыхательной цепи и снижению потребности в субстратах – продуктах гликолиза. В результате прекращается приток в митохондрии метаболитов глюкозы. Вероятно, вследствие дальнейшего снижения дыхательной активности гликолиз переключается на анаэробный режим, приводя к повышению активности лактат дегидрогеназы и концентрации лактата в цитозоле.
Для проверки этих предположений нами было предпринято экспериментальное исследование, включающее анализ активности ключевых ферментов гликолиза клеток HeLa: 3-фосфоглицерат дегидрогеназы (3 ФГДГ) и лактат дегидрогеназы (ЛДГ). В течение первых 10 мин действия эндотоксина активность 3-ФГДГ превышает ее уровень в интактных клетках (норма). При этом в случае концентрации токсина 100 мкг/мл активирование на 25% начиналось уже через 1 мин и достигало максимума (60%) через мин. Через 10 мин активность фермента оставалась высокой и составляла 46% от нормы. Затем начиналось снижение активности, которая достигла через 15 мин 80% исходной. Снижение активности продолжалось до конца опыта, и через 60 мин ее значение составило 15% от нормы.
В случае концентрации 50 мкг/мл активирование было менее значительным и максимум (32%) отмечали через 10 мин. Также более медленно происходило и снижение активности, достигая через 60 мин 32% исходной.
Эти данные согласуются с представленными на рисунке 8, демонстрирующими динамику изменения потребления кислорода клетками под действием тех же концентраций дельта-эндотоксина. Сопоставление этих результатов показывает, что начальное стимулирование дыхания приводит к ускорению катаболизма глюкозы с образованием пирувата и 3 – фосфоглицерата, и как следствие, субстратов дыхательной цепи. Однако в периоды времени более 10 мин для концентрации 100 мкг/мл и 15 мин для мкг/мл происходит снижение интенсивности дыхания, и вслед за этим угнетается гликолиз. Фактически происходит затухание процесса в течение 60 мин. Это связано не только с практически полным прекращением синтеза АТФ в митохондриях, но и с тем, что к этому времени происходит достаточно интенсивное разрушение клеток с освобождением их содержимого в культуральную среду. Как видно из данных, представленных на рисунке 8 и 9, через 15 мин действия дельта-эндотоксина начинается нарастающее снижение интенсивности дыхания и синтеза АТФ. Однако к этому времени остается еще много не разрушенных клеток. Возможно, что в таких анаэробных условиях клетки переключаются на преимущественное образование в ходе гликолиза лактата.
А и н с ь %о и х тс кт в о т, 1 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Время, мин.
100 мкг/мл 50 мкг/мл Рис. 10. Изменение активности 3-фосфоглицерат дегидрогеназы в цитозоле клеток под действием дельта-эндотоксина в концентрации 100 мкг/мл и мкг/мл Было отмечено активирование ЛДГ в клетках HeLa (рис. 11) в период времени от 15 до 30 мин, то есть в условиях наблюдаемого уменьшения потребления кислорода. Через 5-15 мин, напротив, отмечено практическое отсутствие активности ЛДГ. Это объясняется подавлением образования лактата в условиях повышенной аэробности.
Активность, % от исх 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Время, мин 100 мкг/мл 50 мкг/мл Рис. 11. Изменение активности лактат дегидрогеназы в клетках HeLa в результате действия дельта-эндотоксина В период времени после 15 мин, когда резко снижается поглощение кислорода, гликолиз переключается на анаэробный режим с образованием лактата, о чем свидетельствует увеличение активности ЛДГ.
Активность, % от исх 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Время, мин 100 мкг/мл 50 мкг/мл Рис. 12. Изменение активности лактат дегидрогеназы в супернатанте в результате действия на клетки HeLa дельта-эндотоксина Нами регистрировалась активность ЛДГ во внеклеточной (культуральной) среде через разные промежутки времени действия токсина.
Выход ЛДГ в культуральную среду под действием дельта-эндотоксином (рис. 12) регистрировался уже спустя 5 мин после начала инкубации. При этом активность фермента была выше при концентрации токсина 100 мкг/мл (21% общей активности) по сравнению с 50 мкг/мл (8%). Далее активность ЛДГ возрастала практически линейно при обеих концентрациях и достигала 100% (100 мкг/мл) и 79% (50 мкг/мл) через 60 мин инкубации.
Таким образом, усиление клеточного дыхания приводит к ускорению процесса гликолиза в клетках культуры в течение всего периода усиленного дыхания (1-15 мин). Это связано с возросшими потребностями митохондрий в субстратах цепи переноса электронов (дыхательной цепи). Синтез АТФ в то же время значительно снижается в результате разобщения, что приводит к деэнергизации митохондрии и нарушению транспорта веществ через ее мембрану. В результате происходит снижение интенсивности дыхания, по видимому, в результате резкого снижения поступления в митохондрии субстратов для цитратного цикла и прекращения вследствие этого наработки восстановительных эквивалентов. Далее, как следует из представленных выше данных, происходит переключение гликолиза преимущественно на анаэробный механизм с образованием лактата и активированием ЛДГ (через 10 мин инкубации). Однако в этот же период появляются нарушения в проницаемости цитоплазматической мембраны, которые проявляются в наибольшей степени после 15 мин инкубации. Результатом этого является нарастающий во времени и зависящий от концентрации токсина выход ЛДГ во внеклеточную среду.
Следует отметить, что, по-видимому, определение уровня ЛДГ в культуральной жидкости может служить удовлетворительным и простым тестом для установления чувствительности клеток к дельта-эндотоксину.
Разобщающая способность дельта-эндотоксина подтверждена методами ИК - и ЯМР-спектроскопии. Показано, что он обладает лабильными протонами, которые способен легко отдавать после растворения.
Большое количество «кислых» протонов обусловлено доминирующим содержанием в составе белкового дельта-эндотоксина аспарагиновой и глутаминовой аминокислот. Вещества природного или синтетического происхождения, обладающие лабильными протонами, могут являться разобщителями процессов окислительного фосфорилирования (синтеза АТР), происходящего в митохондриях, если они обладают способностью проникать через биологические мембраны. Возможность этого подтверждает действие дельта-эндотоксина, полученного методом щелочного гидролиза, на искусственную азолектиновую мембрану, который в концентрации 50 и мкг/мл вызывал падение ее сопротивления в 2-5 раз.
ВЫВОДЫ 1. Цитопатическое действие дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis subsp. sotto пропорционально его концентрации и времени контакта с клетками;
связано с изменением структуры клеток, проявляющимся как нарастающая вакуолизация с последующим разрушением клеток, и различается по силе эффекта для разных клеточных линий: чувствительность клеток HeLa значительно выше, чем клеток B16 и L1210.
2. При действии дельта-эндотоксина после 15 мин выявлено нарушение транспорта ионов K+, Na+, Ca2+ и Mg2+ через цитоплазматическую мембрану клеток HeLa, B16 и L1210 вслед за ранней активацией Mg2+-зависимой K+, Na+- АТФазы. Обнаружена общая для всех типов клеток закономерность уменьшения внутриклеточной концентрации K+, и Mg2+ при возрастающей концентрации Na+ и Ca2+.
3. Установлено, что дельта-эндотоксин в первые минуты действия угнетает синтез АТФ на фоне активации дыхания, действуя на культуры клеток аналогично разобщителям процессов окислительного фосфорилирования и дыхания.
4. Дельта-эндотоксин на первых этапах действия (до 15 мин) вызывает интенсификацию процесса гликолиза в клетках HeLa, повышая активность 3 фосфоглицерат дегидрогеназы;
затем ее уровень постепенно снижается, уступая место активации лактат дегидрогеназы – фермента, характерного для анаэробного режима гликолиза.
5. Финальные этапы действия дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis subsp. sotto, предшествующие разрушению клеток, связаны с деэнергизацией митохондрий, снижением потребления кислорода, активацией анаэробного пути гликолиза, нарушением целостности мембран и выходом лактат дегидрогеназы во внеклеточную среду.
Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Каменек, Д. В. Дельта-эндотоксин Bacillus thuringiensis как природный ионофор:
анализ методами ИК- и ЯМР-спектроскопии / Д. В. Каменек, О. Н. Ильинская, Л. М.
Цофина, Л. К. Каменек, // Ученые записки Казанского государственного университета.
Cер. Естеств. Науки. 2008. Т. 150. Кн. 1. С. 6976.
2. Каменек, Д. В. Влияние дельта эндотоксина Bacillus thuringiensis subsp. sotto на процесс гликолиза в перевиваемых линиях клеток / Д. В. Каменек, М. С. Феклина, Л.
К. Каменек, УлГУ. – Ульяновск, 2008.– 17 с. Деп. в ВИНИТИ 12.05.08 №406-В2008.
3. Феклина, М. С. Действие дельта-эндотоксина на активность клеток периферической крови in vivo и in vitro / М. С. Феклина, Д. В. Каменек, Э. К. Юнусова, Л. К. Каменек, УлГУ. – Ульяновск, 2008.– 17 с. Деп. в ВИНИТИ 12.05.08 №407-В2008.
4. Морозова, Е. П. Действие экологически-безопасного дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis на интенсивность поглощения кислорода фитопатогенными бактериями / Е. П. Морозова, Д. В. Каменек, Т. А. Луковенко // Материалы симпозиума с международным участием «Актуальные проблемы адаптации к природным и экосоциальным условиям среды», Ульяновск 24-26 сентября 2002 г. – Ульяновск:
2002. C. 8183.
5. Каменек, Л. К. Действие дельта эндотоксина Bacillus thuringiensis на культуру раковых клеток / Л. К. Каменек, Д. В. Каменек //. Сборник тезисов 8-й Пущинской международной школы-конференции молодых ученых «БИОЛОГИЯ – НАУКА ХХI ВЕКА». – Пущино, 2004. C.114 – 115.
6. Каменек, Л. К. Органеллы клетки /Учебно-методическое пособие // Л. К. Каменек, О.
Ю. Шроль, А. А. Тюльпинева, Д. В. Каменек – Ульяновск: Изд-во УлГУ, 2001. – 42 с.
7. Каменек, Д. В. Действие дельта эндотоксина Bacillus thuringiensis на дыхательную активность раковых клеток в культуре / Д. В. Каменек, Л. К. Каменек // Материалы XIII Международной научной конференции «Ферменты микроорганизмов: структура, функции, применение». – Казань, 2005. – С. 40.
8. Каменек, Д. В. Действие дельта эндотоксина Bacillus thuringiensis на культуры раковых клеток. / Д. В. Каменек, Л. К. Каменек // Сборник тезисов 9-й Пущинской международной школы-конференции молодых ученых «БИОЛОГИЯ – НАУКА ХХI ВЕКА». – Пущино. – 2005. С.114.
9. Каменек, Д. В. Действие дельта эндотоксина Bacillus thuringiensis на ионный транспорт в клетках HeLa и HeP / Д. В. Каменек, Л. К. Каменек, О. Н. Ильинская // Сборник тезисов 9-й Пущинской международной школы-конференции молодых ученых «БИОЛОГИЯ – НАУКА ХХI ВЕКА». – Пущино, 2006. – С. 374.
10. Каменек, Д. В. Особенности действия дельта эндотоксина Bacillus thuringiensis на раковые культуры клеток / Д. В. Каменек, М. А. Горшкова // Сборник материалов Международной конференции молодых ученых «Ломоносов – 2007». – Москва: Изд-во МГУ, 2007. С. 77.
11.. Феклина, М. С. Влияние дельта-эндотоксина на клетки периферической крови мышей in vivo и in vitro / М. С. Феклина, Д. В. Каменек, С. В. Куркин, Л. Д. Терехина, Д. А. Терехин // Сборник тезисов 11-й Пущинской международной школы конференции молодых ученых «БИОЛОГИЯ – НАУКА ХХI ВЕКА». – Пущино, 2007.
– С. 116.
12. Феклина, М. С. Оценка влияния дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis на нейтрофилы крови мышей in vivo и in vitro / М. С. Феклина, Д. В. Каменек, С. В.
Куркин, Л. Д. Терехина, Д. А. Терехин // Материалы Всероссийской конференции с международным участием «Медико-физиологические проблемы экологии человека». – Ульяновск, 2007. – С. 269.
13. Феклина, М. С. Оценка влияния дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis на нейтрофилы крови мышей in vivo и in vitro / М. С. Феклина, Л.К. Каменек, О.В.
Столбовская, Д. В. Каменек С. В. Куркин, Л. Д. Терехина // Материалы IV Всероссийской научно-технической конференции «Проблемы экологии и охраны природы. Пути их решения», – Ульяновск: УлГУ, 2007.С 102 105.
14. Каменек, Д. В. Действие дельта эндотоксина Bacillus thuringiensis на культуры раковых клеток / Д. В. Каменек, Л. К. Каменек // Материалы II Международной научно-практической конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии». – Казань: КГУ, 2008. – С. 47-48.
Просьба отзывы отправлять почтой на имя Ученого секретаря диссертационного совета Д 212.081.08 Абрамовой З.И. (420008, Казань, Кремлевская,18, отдел аспирантуры), по факсу : (843)238-71-21 или на е-mail: [email protected].