Применение пероксидазы сои в иммуноферментном анализе

На правах рукописи

Берлина

Анна Николаевна

ПРИМЕНЕНИЕ ПЕРОКСИДАЗЫ СОИ

В ИММУНОФЕРМЕНТНОМ АНАЛИЗЕ

Специальность 03.01.04 – биохимия

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени

кандидата химических наук

Москва – 2010

Работа выполнена в лаборатории иммунобиохимии Учреждения Российской

академии наук Института биохимии им. А.Н. Баха РАН и на кафедре химии государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Российская экономическая академия им. Г.В. Плеханова»

доктор химических наук, профессор Научные руководители:

Сахаров Иван Юрьевич кандидат биологических наук Жердев Анатолий Виталиевич доктор химических наук

Официальные оппоненты:

Кузнецов Борис Арсеньевич доктор биологических наук, профессор Мягкова Марина Александровна Учреждение Российской академии наук

Ведущая организация:

Институт биоорганической химии им.

М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Защита состоится 28 октября 2010 года в 14 часов на заседании диссертационного совета (Д 002.247.01) при Учреждении Российской академии наук Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, строение 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, строение 1.

Автореферат разослан 23 сентября 2010 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук А.Ф. Орловский Актуальность проблемы. Одно из приоритетных направлений в современной биохимии, биотехнологии и аналитической химии – поиск новых детектирующих систем с использованием ферментов для улучшения характеристик аналитических методов. В настоящее время широко применяются методы иммуноферментного анализа (ИФА), в которых в качестве маркера наиболее часто используется катионный изофермент с пероксидазы хрена (ПХ). К сожалению, ПХ не всегда оптимальна для аналитического применения, в частности, при создании высокочувствительных систем со стабильным сигналом.

В последние годы описан ряд новых пероксидаз растений, некоторые из которых (например, пероксидазы сои, табака, картофеля, батата, масличной пальмы) относятся к группе анионных пероксидаз. Наиболее перспективна из них пероксидаза сои (ПС) – пока единственная коммерчески доступная анионная пероксидаза. Важным свойством ПС является ее более высокая стабильность по сравнению с ПХ. Применение в ИФА ПС в сочетании с хемилюминесцентной детекцией ее ферментативной активности может привести к созданию высокочувствительных методов определения различных аналитов. Одна из задач, для которых использование новых ферментных маркеров имеет принципиальное значение, – мониторинг токсичных загрязняющих веществ в потребительской продукции и объектах окружающей среды. В частности, сульфаниламиды широко применяются в ветеринарии как антимикробные препараты и поэтому рассматриваются как значимые контаминанты продуктов питания животного происхождения. Предельно допустимые уровни содержания сульфаниламидов в пищевых продуктах, установленные в разных странах, варьируют от 20 до 100 мкг/кг. В связи с этим разработка высокочувствительных иммуноферментных тест-систем для определения сульфаниламидов с применением новых ферментных маркеров, таких как ПС, является практически важной задачей.* Цели и задачи исследования. Оценить возможности использования ПС в качестве маркера в ИФА по сравнению с ПХ на примере определения сульфаметоксипиридазина (СМП) – одного из широко применяемых сульфаниламидов.

Достижение этой цели предусматривало решение следующих задач:

• Разработать и оптимизировать твердофазный иммуноферментный анализ СМП с использованием в качестве ферментного маркера ПС, * Сокращения: ИФА – иммуноферментный анализ, ПС – пероксидаза сои, ПХ – пероксидаза хрена, САМ – N-(N-сульфанил)-4-аминомасляная кислота, СМП – сульфаметоксипиридазин, СТР – стрептавидин, ФБС-Т – 50 мМ фосфатный буфер, рН 7,4, с 0,1 М NaCl и 0,05% Тритона Х-100.

-1 • Изучить влияние условий проведения гетерогенной реакции окисления люминола пероксидом водорода, катализируемой ПС, на интенсивность хемилюминесценции, • Определить аналитические характеристики ИФА СМП с колориметри ческой и хемилюминесцентной детекцией, сравнив ПС и ПХ в качестве маркеров, • Провести апробацию ИФА СМП в реальных образцах.

Научная новизна работы. Изучено влияние условий проведения реакции окисления люминола пероксидом водорода, катализируемой пероксидазой сои, на интенсивность хемилюминесценции. Установлены оптимальные условия проведения этой реакции в гетерогенной системе твердофазного ИФА. Показано, что п-йодофенол в данном случае является не усилителем люминесценции, а тушителем неспецифического свечения. Продемонстри рованы преимущества анионной ПС в качестве маркера по сравнению с катионной ПХ.

Практическая значимость работы. Показано, что пероксидаза сои может являться эффективной альтернативой пероксидазе хрена в иммуноферментном анализе. Использование коммерчески доступной ПС в ИФА СМП с хемилюминесцентной детекцией позволило существенно улучшить характеристики аналитического метода, что выразилось в формировании стабильного во времени сигнала и снижении предела обнаружения аналита. Перспективность использования ПС показана для контроля содержания практически значимого загрязняющего вещества, СМП, в образцах молока и озерной воды.

Связь работы с государственными программами. Работа была поддержана ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009–2013 гг. (государственный контракт № 02.740.11.0868 от июня 2010 г.).

Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на международных конгрессах «ICAS-2006» (Москва, 2006), «FESPB-2008» (Тампере, 2008) и «IUPAC-2009» (Глазго, 2009), международных конференциях «Биотехнология и медицина» (Москва, 2006) и «Биотехнология: Экология больших городов» (Москва, 2010) и молодежной конференции «Биохимическая физика» (Москва, 2007).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 2 статьи в журналах, входящих в перечень периодических изданий, публикация в которых рекомендуется ВАК, и 6 тезисов докладов на конгрессах и конференциях.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (5 глав), описания материалов и методов исследования, -2 результатов и их обсуждения (6 глав), выводов и списка цитируемой литературы (270 ссылок). Работа изложена на 140 страницах и включает рисунок и 13 таблиц.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ I. Получение и характеристика иммунореагентов Для оценки возможности применения в ИФА пероксидазы сои (ПС) вместо традиционно используемого изофермента с пероксидазы хрена (ПХ) были разработаны и охарактеризованы методики определения сульфаметокси пиридазина (СМП) с применением двух исследуемых ферментов.

СМП (рис. 1, а) – антимикробный препарат, относящийся к классу сульфаниламидов. Для конъюгирования с белками и получения антител использовался его карбоксилированный структурный аналог, N-(N сульфанил)-4-аминомасляная кислота (САМ, см. рис. 1, б). В качестве иммунореагентов были получены и охарактеризованы конъюгат САМ и овальбумина (САМ–ОВА), биотинилированные поликлональные кроличьи антитела против САМ, конъюгаты стрептавидина с пероксидазами сои и хрена (СТР–ПС, СТР–ПХ).

СМП O N N S NH OCH H2N O а САМ O S NH CH2 CH2 CH2 COOH H2N O б Рис. 1. Химические структуры СМП (а) и его аналога САМ (б) СМП является низкомолекулярным веществом, поэтому для его определения была реализована схема непрямого конкурентного твердофазного ИФА (рис. 2). Конъюгат САМ-ОВА использовался в качестве антигена, адсорбируемого в лунках планшета. Для выявления формирующихся в ходе анализа иммунных комплексов применялся модуль биотин – стрептавидин.

-3 Рис. 2. Схема проведения непрямого конкурентного ИФА СМП с использованием модуля биотин – стрептавидин Было показано, что взаимодействие антител против САМ с конъюгатом САМ–ОВА эффективно ингибируют как САМ, так и СМП (рис. 3), что объясняется наличием общих фрагментов в структурах данных соединений.

1, A 0, Рис. 3. Ингибирование СМП () и САМ () связывания кроличьих 0, антител с конъюгатом САМ–ОВА 1 10 100 1000 в твердофазном ИФА [Конкурент], нг/мл -4 Из антисыворотки, содержащей антитела к САМ, выделяли IgG-фракцию путем осаждения 20% раствором полиэтиленгликоля с молекулярной массой 6000. Биотинилирование IgG проводили по стандартной методике, в основе которой лежит реакция N-гидроксисукцинимидного эфира биотина с аминогруппами иммуноглобулина. Мольное соотношение IgG:биотин в полученном конъюгате, определенное методом титрования свободных поверхностных аминогрупп, равнялось 1:8,8.

Влияние биотинилирования на антигенсвязывающую способность антител тестировали в модифицированной схеме ИФА, в которой в качестве проявляющего реагента применяли конъюгат ПС и антител против IgG кролика. Этот конъюгат синтезировали с использованием перйодатного окисления углеводных фрагментов ПС. Согласно данным, представленным на рис. 4, биотинилирование не влияло на антигенсвязывающую способность специфических антител.

3 1, 2 A A 0, 1 0, 0,01 0,1 1 10 0,1 1 [СМП], нг/мл [IgG], мкг/мл Рис. 4. Зависимость сигнала от концен- Рис. 5. Выбор рабочей концентрации трации IgG до () и после биотинили- конъюгата ПС и антител против IgG рования () при взаимодействии в кролика в ИФА СМП. Концентрации системе ИФА с иммобилизованным конъюгата (мкг/мл) – 26,8 (1), 13,4 (2), конъюгатом САМ–ОВА 6,7 (3), 3,4 (4), 1,7 (5), 0,84 (6), 0,42 (7) и 0,21 (8) Были сопоставлены градуировочные кривые ИФА СМП с колориметрической детекцией (субстрат – диаммониевая соль 2,2'-азино бис(3-этилбензтиазолин-6-сульфоновой кислоты) (АБТС)), полученные для разных концентраций конъюгата (рис. 5). Для концентраций конъюгата от 0,84 мкг/мл и ниже предел обнаружения СМП был высоким из-за низких значений сигнала. Увеличение концентрации конъюгата снижает предел -5 обнаружения СМП, однако для концентраций выше 1,7 мкг/мл рост значения сигнала сопровождается увеличением предела обнаружения СМП. Поэтому концентрация конъюгата, равная 1,7 мкг/мл, была выбрана как рабочая и использовалась в дальнейших экспериментах.

Были получены градуировочные кривые ИФА СМП при использовании разных концентраций биотинилированных IgG (рис. 6). Как видим, при концентрациях 1 и 2 мкг/мл достоверное определение СМП невозможно, так как оптическая плотность в отсутствие аналита превышает фоновый сигнал всего в полтора раза. Увеличение концентрации биотинилированных антител вызывает снижение предела обнаружения СМП. Однако при этом возрастает и неспецифическая сорбция, о чем свидетельствует увеличение оптической плотности в присутствии СМП в высокой концентрации, например, 1000 нг/мл.

Наличие неспецифического связывания было также подтверждено в опыте, в котором вместо конъюгата САМ-ОВА адсорбировали нативный овальбумин (данные не приведены). Исходя из этих соображений, концентрация биотинилированных антител, равная 8,5 мкг/мл, была выбрана как оптимальная и использовалась в дальнейших экспериментах.

1, A 0, 0, 1 10 100 [CМП], нг/мл Рис. 6. Выбор концентрации биотинилированных антител в ИФА СМП. Концентрации антител в лунках микропланшета – 1 (1), 2 (2), 4,3 (3), 8,5 (4), 17 (5) и 34 (6) мкг/мл При проведении ИФА для выявления связанных биотинилированных антител применяли их высокоаффинное взаимодействие с конъюгатами стрептавидина (СТР) с ПС и ПХ. Синтез конъюгата СТР–ПС проводили в условиях, описанных ранее (Sakharov I.Y., et al. J. Agric. Food Chem., 2006, v.

54, № 5, p. 1584-1587) и отличающихся от условий, используемых при -6 конъюгировании СТР с ПХ. Так, концентрация перйодата натрия для окисления ПХ равнялась 6,8 мМ, тогда как для ПС – 27 мМ.

Были сопоставлены градуировочные кривые ИФА СМП, полученные для разных концентраций конъюгатов СТР–ПС и СТР–ПХ (рис. 7, 8). ИФА проводили в стандартной реакционной среде – 50 мМ фосфатный буфер, pH 7,4, с 0,1 М NaCl и 0,05% Тритона Х-100 (ФБС-Т). Показано, что предел обнаружения СМП снижается с уменьшением концентраций конъюгатов.

Исходя из вычисленных параметров градуировочных кривых, были выбраны как оптимальные концентрации 3,5 мкг/мл для конъюгата СТР–ПС и 1,7 мкг/мл для СТР–ПХ.

1, 1, A A 0, 0, 0,0 0, 0,01 0,1 1 10 0,01 0,1 1 10 [СМП], нг/мл [СМП], нг/мл Рис. 7. Выбор рабочей концентрации Рис. 8. Выбор рабочей концентрации конъюгата СТР–ПС в ИФА СМП. Кривые конъюгата СТР–ПХ в ИФА СМП. Кривые 1-4 соответствуют концентрациям в 1-4 соответствуют концентрациям в лунках микропланшета, равным 13,8, 6,9, лунках микропланшета, равным 6,9, 3,5, 3,5 и 1,7 мкг/мл 1,7 и 0,9 мкг/мл В данных условиях была получена градуировочная кривая ИФА СМП с использованием конъюгата СТР–ПС и колориметрической детекцией (рис. 9).

Диапазон определяемых концентраций СМП составил 1,3–63 нг/мл при пределе обнаружения 0,4 нг/мл и IC50 (концентрации аналита, вызывающей 50%-ное ингибирование связывания) 4,8 нг/мл. В диапазоне IC20–IC80 среднее отклонение определяемых концентраций СМП варьировало от 4 до 6% (n=8).

-7 0, 0, A 0, 0, 0,1 1 10 100 [С М П ], нг/мл Рис. 9. Градуировочная кривая ИФА с использованием конъюгата СТР–ПС и колориметрической детекцией для определения СМП в ФБС-Т II. Оптимизация условий твердофазного ИФА с хемилюминесцентной детекцией с использованием ПС в качестве метки В современной практике ИФА наиболее распространена колориметри ческая детекция активности ферментного маркера. В тех же случаях, когда необходимо выявление аналита в предельно низких концентрациях, исполь зуется хемилюминесцентная детекция. Однако ПХ является малоактивным катализатором окисления люминола и требует добавления усилителя в субстратную смесь. В отличие от ПХ, ПС способна эффективно окислять люминол даже в отсутствие усилителя. Ранее оптимальные условия для катализа ПС были подобраны в гомогенной среде, т.е. без учета влияния материала микропланшета для ИФА и адсорбированных на нем молекул, а также без добавления усилителя. Поэтому был необходим подбор состава субстратной смеси в условиях, соответствующих проведению твердофазного ИФА.

Было установлено, что наличие в лунках планшета комплекса САМ–ОВА и IgG–биотин приводит к появлению неспецифического свечения, обусловленного присутствием белковых молекул (рис. 10).

Оптимизацию состава субстратной смеси с добавлением п-йодофенола в гетерогенных условиях проводили в лунках микропланшета, на поверхности которых был сформирован комплекс конъюгатов САМ–ОВА, IgG–биотин и СТР–ПС. Исследовали субстратные смеси, содержащие 0,5, 1, 1,5, 2 мМ люминола и 0, 1, 2, 3 мМ п-йодофенола в разных сочетаниях в 100 мМ Трис -8 буфере, рН 8,6. Фоновое свечение регистрировали в лунках, содержащих либо САМ–ОВА, либо САМ–ОВА + IgG–биотин.

Как видно из рис. 11, в отсутствие п-йодофенола в составе субстратной смеси варьирование концентрации люминола практически не влияет на интенсивность люминесценции. Добавление п-йодофенола несколько увели чивает специфический сигнал, в отличие от ПХ, для которой п-йодофенол является мощным усилителем. Наибольший хемилюминесцентный сигнал достигается при использовании 1 мМ люминола в сочетании с 1, 2 или 3 мМ п-йодофенола.

В присутствии Люминесценция через 440 с, отн. ед.

САМ-ОВА и АТ-биотин В присутствии САМ-ОВА В отсутствие белка Рис. 10. Влияние присутствия белка на Рис. 11. Зависимость хемилюми интенсивность хемилюминесценции. несцентного сигнала от состава суб Черные столбцы – 1 мМ люминола без стратной смеси при использовании ПС в п-йодофенола;

серые – 1 мМ люминола, качестве маркера в ИФА 1 мМ п-йодофенола Рис. 12. Зависимость фонового сигнала Рис. 13. Зависимость отношения сигнал/ от состава субстратной смеси фон от состава субстратной смеси -9 Сопоставление неспецифической хемилюминесценции, вызываемой иммобилизованными белковыми комплексами, при разных составах субстратной смеси показало (рис. 12), что увеличение концентрации люминола с 0,5 до 2,0 мМ приводит к росту неспецифического свечения.

В противоположность этому, увеличение концентрации п-йодофенола снижает неспецифическое свечение почти в 10 раз;

наибольшее значение сигнала наблюдается в отсутствие п-йодофенола.

Для каждой субстратной смеси было рассчитано отношение сигнал/фон.

Из рис. 13 видно, что добавление усилителя увеличивает данное отношение, максимум которого достигается для субстратных смесей, содержащих 1 мМ люминола и 2 мМ либо 3 мМ п-йодофенола.

Сопоставление этих двух вариантов показало бльшую стабильность во времени сигнала для субстратной смеси, содержащей 1 мМ люминола и 2 мМ п-йодофенола (рис. 14), которая и была выбрана для дальнейших опытов.

Люминесценция, % 20 40 60 Время, мин Рис. 14. Кинетика хемилюминесцентного сигнала при гетерогенном катализе с использованием ПС и субстратных смесей, содержащих 1 мМ люминола и 2 мМ () либо 3 мМ () п-йодофенола После выбора концентраций субстрата и усилителя необходимо было определить оптимальную концентрацию H2O2. Был сопоставлен ряд концен траций H2O2 в интервале 1–8 мМ. Критерием выбора, как и в предыдущих экспериментах, был высокий сигнал, стабильный в течение долгого времени.

Как следует из рис. 15, увеличение концентрации H2O2 приводит к более быстрому падению сигнала. С другой стороны, при [H2O2] 1 мМ низкое значение сигнала вызывает уменьшение отношения сигнал/фон (данные не приведены). Концентрация H2O2, равная 2 мМ, была выбрана как оптимальная.

- 10 Люминесценция, отн. ед.

4000 2000 0 20 40 60 Время, мин Рис. 15. Кинетика хемилюминесцентного сигнала при гетерогенном катализе с использованием ПС и разных концентраций H2O2: 1 – 1 мМ, 2 – 1,5 мМ, 3 – 2 мМ, 4 – 4 мМ, 5 – 6 мМ, 6 – 8 мМ Таким образом, оптимальный состав субстратной смеси для определения активности ПС в условиях твердофазного ИФА следующий: 1 мМ люминола, 2 мМ п-йодофенола и 2 мМ H2O2 в 100 мМ Трис-буфере, рН 8,6.

III. Сравнение аналитических характеристик ИФА СМП с использованием ПХ и ПС в качестве маркеров и хемилюминесцентной детекцией В выбранных условиях катализа мы сравнили ИФА СМП с использованием пероксидаз сои и хрена, рассматривая данные для разной продолжительности реакции окисления люминола.

Градуировочные кривые ИФА СМП с использованием ПХ и хемилюми несцентной детекцией представлены на рис. 16. При регистрации хемилюминесценции через 20 с после начала реакции предел обнаружения СМП составил 0,3 нг/мл, IC50 – 12,4 нг/мл, диапазон определяемых концентраций – 1,2–85 нг/мл (Табл. 1). Коэффициент вариации сигнала в рабочем диапазоне изменялся от 3,4 до 8,5%, а среднее отклонение определяемых концентраций СМП не превосходило 12% (n=6).

С увеличением продолжительности реакции окисления люминола значения хемилюминесцентного сигнала снижаются. При этом возрастают величины предела обнаружения и IC50 (см. Табл. 1), а также коэффициенты вариации результатов измерений (Табл. 2).

- 11 15000 Люминесценция, отн. ед.

5000 0,01 0,1 1 10 [СМП], нг/мл Рис. 16. Градуировочные кривые ИФА СМП с использованием ПХ и хемилюми несцентной детекцией. Интенсивность люминесценции измерена через 20 (кривая 1), 160 (2), 300 (3), 440 (4), 580 (5), 1160 (6) и 1740 с (7) после начала реакции окисления люминола Таблица 1. Зависимость аналитических параметров ИФА СМП с использо ванием ПХ и хемилюминесцентной детекцией от продолжительности реакции окисления люминола IC50, Продолжительность Диапазон опреде- Предел реакции окисления нг/мл ляемых концентраций обнаружения СМП люминола, с СМП (IC20–IC80), нг/мл (IC10), нг/мл 20 12,4 1,2–85 0, 160 16,0 2,6–80 0, 300 22,0 4,0–85 1, 440 35,0 8,0–125 2, Таблица 2. Коэффициенты вариации при определении СМП методом ИФА с использованием ПХ и хемилюминесцентной детекцией [СМП], Продолжительность реакции окисления люминола, с нг/мл 20 160 300 Коэффициент вариации (n=6), % 56 8,2 9,7 10,2 11, 19 8,5 9,4 15,3 19, 6 3,4 6,9 9,5 11, 2 4,8 7,7 12,0 НО НО – не определялся - 12 Далее были получены градуировочные кривые ИФА СМП с использованием ПС и хемилюминесцентной детекцией (рис. 17). При регистрации хемилюминесценции через 20 с после начала реакции предел обнаружения, IC50 и диапазон определяемых концентраций равнялись 0,02, 0,17 и 0,045–0,63 нг/мл, соответственно (Табл. 3). Таким образом, при замене ПХ (см. Табл. 1) на ПС в ИФА с хемилюминесцентной детекцией предел обнаружения снижается в 15 раз.

С ростом продолжительности окисления люминола, катализируемого ПС, аналитические параметры ИФА практически не изменялись (см. Табл. 3).

Люминесценция, отн. ед.

0,01 0,1 1 [СМП], нг/мл Рис. 17. Градуировочные кривые ИФА СМП с использованием ПС и хемилюми несцентной детекцией. Интенсивность люминесценции измерена через 20 (кривая 1), 160 (2), 580 (3), 1160 (4) и 1740 с (5) после начала реакции окисления люминола Таблица 3. Зависимость аналитических параметров ИФА СМП с использо ванием ПС и хемилюминесцентной детекцией от продолжительности реакции окисления люминола IC50, Продолжительность Диапазон опреде- Предел реакции окисления нг/мл ляемых концентраций обнаружения СМП люминола, с СМП (IC20–IC80), нг/мл (IC10), нг/мл 20 0,17 0,045–0,63 0, 160 0,22 0,045–1,1 0, 300 0,28 0,07–1.0 0, 440 0,35 0,08–1,5 0, 580 0,34 0,08–1,2 0, 1160 0,45 0,08–2,5 0, 1740 0,45 0,08–2,3 0, - 13 Коэффициент вариации результатов измерений достоверно не изменялся во времени, составляя не более 11% (Табл. 4). Сравнение коэффициентов вариации для ИФА с использованием ПС и ПХ (см. Табл. 2) свидетельствует о том, что выбор пероксидазы-маркера не влияет на точность анализа.

Таблица 4. Коэффициенты вариации при определении СМП методом ИФА с использованием ПС и хемилюминесцентной детекцией [СМП], Продолжительность реакции окисления люминола, с нг/мл 20 160 300 440 580 1160 Коэффициент вариации (n=6), % 2,06 НО НО НО НО 12,0 5,8 0, 0,69 НО 2,0 11,0 9,2 11,0 1,0 7, 0,23 9,0 5,7 4,5 8,8 4,8 0,7 2, 0,08 3,0 8,0 4,5 5,0 5,3 4,4 2, НО – не определялся Сопоставление форматов ИФА с двумя способами детекции и двумя маркерами показывает (Табл. 5), что минимальный предел обнаружения СМП достигается для ИФА с хемилюминесцентной детекцией и ПС в качестве маркера.

Таблица 5. Сравнение аналитических параметров ИФА СМП при исполь зовании ПС и ПХ с хемилюминесцентной и колориметрической детекцией Фермент- Способ Предел IC50, Диапазон Коэффи ный детекции обнаруже- нг/мл определяемых циент маркер ния СМП, концентраций вариа нг/мл СМП, нг/мл ции, % ПС Хемилюминес центный 0,02 0,17 0,045–0,63 3,0–9, Колориметриче ский 0,4 4,8 1,3–63 4,1–6, ПХ Хемилюминес центный 0,3 12,4 1,2–85 3,4–8, Колориметриче ский 0,4 4,8 1,3–60 1,7–8, - 14 IV. Применение ИФА с ПС в качестве маркера для определения СМП в пробах молока и озерной воды 4.1. Определение СМП в молоке методом ИФА с колориметрической детекцией В соответствии с приоритетными объектами, тестируемыми на содержание сульфаниламидов, в задачу нашего исследования входила характеристика пригодности разработанного метода ИФА с использованием ПС для контроля СМП в молоке. При этом принципиальное значение имело определение условий проведения анализа, в которых предотвращается влияние матрикса проб на получаемые результаты.

Поскольку в молоке в высоких концентрациях содержится казеин (в коровьем молоке – до 2,7%), было изучено его влияние на параметры разрабатываемого метода. Для этого были получены градуировочные кривые ИФА СМП с колориметрической детекцией при использовании в качестве реакционной среды ФБС-Т с добавлением 0,015, 0,05 и 0,15% казеина. Анализ кривых показал, что при использовании 0,15% казеина предел обнаружения СМП равен 0,12 нг/мл, диапазон определяемых концентраций – 0,33–15, нг/мл, а IC50 – 2,0 нг/мл. Таким образом, введение в рабочий буфер казеина понижает предел обнаружения СМП. Коэффициенты вариации сигнала в рабочем диапазоне метода не превышали 10%.

Для оценки пригодности разрабатываемого ИФА для определения СМП в молоке были приобретены в розничной сети образцы молока с жирностью 3,2%. СМП был введен в исходное и в обезжиренное центрифугированием молоко в концентрациях 50, 150 и 1500 нг/мл, что соответствует 0,5, 1,5 и ПДК. Для предотвращения влияния матрикса пробы разводили ФБС-Т в раз.

Применимость разработанного ИФА для определения СМП количественно оценивали методом «введено – найдено». Концентрации СМП рассчитывали по градуировочным графикам, полученным при использовании в качестве рабочего буферного раствора ФБС-Т либо ФБС-Т с 0,15% казеина.

Как следует из Табл. 6, при использовании ФБС-Т ошибка в определении СМП очень высока, что следует объяснить влиянием матрикса молока. При проведении же ИФА в среде, содержащей 0,15% казеина, полнота выявления СМП варьировала в пределах 80–120% (см. Табл. 6). При этом значения найденных концентраций СМП не зависели от того, проводилось ли предварительное удаление жира или нет. Таким образом, 50-кратное разведение проб молока в сочетании с применением 0,15% казеина позволяет исключить влияние матрикса и проводить корректное определение СМП разработанным иммуноферментным методом с колориметрической детекцией и ПС в качестве маркера.

- 15 Таблица 6. Характеристика полноты выявления СМП в пробах молока методом ИФА с колориметрической детекцией Рабочий Проба 1 Проба буферный Введено, Полнота Введено, Полнота раствор нг/мл выявления, % нг/мл выявления, % ФБС-Т 50 786 50 150 567 150 1500 522 1500 ФБС-Т 50 110 + 0,15% казеина 150 87 1500 100 4.2. Определение СМП в молоке методом ИФА с хемилюминесцентной детекцией Образцы молока из розничной сети с жирностью 3,2% после введения СМП в концентрациях 8, 23, 70, 210 нг/мл были охарактеризованы методом ИФА с хемилюминесцентной детекцией. Для этого варианта анализа, в отличие от колориметрического ИФА, добавление казеина приводит к появлению неспецифического свечения и меняет ход градуировочных кривых.

Для устранения влияния матрикса проб молока предложено применение центрифугирования (для обезжиривания) и последующей обработки трихлоруксусной кислотой. Данная пробоподготовка, вызывая денатурацию и осаждение белков, позволяет стандартизировать пробы. В экспериментах «введено – найдено» полнота выявления СМП составила от 71 до 130% (Табл. 7), что свидетельствует об эффективности разработанного метода.

Таблица 7. Характеристика полноты выявления СМП в образцах молока методом ИФА с хемилюминесцентной детекцией [СМП] в образце, нг/мл Полнота выявления, % Коэффициент вариации, % Проба 8 6, 23 5, 70 4, 210 2, Проба 7, 7, 9, 5, - 16 Проба 4, 5, 9, 3, Проба 6, 3, 4, 0, 4.3. Определение СМП в озерной воде методом ИФА с хемилюминес центной детекцией Одной из важных областей применения разрабатываемых аналитических методов является экологический мониторинг. Используемые в медицине и ветеринарии лекарственные препараты способны накапливаться в окружающей среде. Загрязнение водоема веществами антибактериального действия может повлечь за собой накопление данных соединений и в его обитателях (например, в рыбе и моллюсках). Поэтому необходимо было оценить пригодность разрабатываемых методов для контроля содержания СМП в природных водах.

Для этой работы были использованы пробы озерной воды, взятые из разных точек в Бутовских озерах (Москва). Первоначально, как и для определения СМП в молоке, изучалось влияние матрикса. Сопоставление буферных растворов, отличающихся по молярности, позволило выбрать в качестве оптимальной среды 10 мМ фосфатный буфер, рН 7,4.

Градуировочные кривые, получаемые в этом буфере и в озерной воде, практически совпадают. Пробы воды показали в конкурентном ИФА отсутствие СМП, что позволило применить их при характеристике полноты выявления СМП методом «введено – найдено».

Была получена градуировочная кривая для определения СМП в озерной воде методом ИФА с использованием ПС и хемилюминесцентной детекцией (рис. 18). Предел обнаружения СМП составил 0,14 нг/мл, IC50 – 1,3 нг/мл, диапазон определяемых концентраций – 0,35–8 нг/мл. Коэффициент вариации сигнала при определении СМП в рабочем диапазоне изменялся от 1,9 до 9,5% (n=3).

- 17 Люминесценция, отн. ед.

0,01 0,1 1 [СМП], нг/мл Рис. 18. Градуировочная кривая ИФА СМП в 10 мМ фосфатном буфере, рН 7,4, с использованием ПС и хемилюминесцентной детекцией. Интенсивность люминесценции была измерена через 440 с после начала реакции окисления люминола Данные характеристики, а также значения полноты выявления (от 70 до 116%;

см. Табл. 8) свидетельствуют о пригодности разработанного метода ИФА для определения СМП в озерной воде.

Таблица 8. Характеристика полноты выявления СМП в пробах озерной воды методом ИФА с хемилюминесцентной детекцией [СМП] в образце, нг/мл Полнота выявления, % Коэффициент вариации, % Проба 6 8, 2 7, 0,7 1, Проба 6 2 3, 0,7 3, Проба 6 9, 2 5, 0,7 8, - 18 ВЫВОДЫ 1. Разработан иммуноферментный анализ антибактериального препарата сульфаметоксипиридазина с колориметрической детекцией и использованием пероксидазы сои в качестве ферментного маркера.

Предел обнаружения сульфаметоксипиридазина составляет 0,4 нг/мл.

2. Изучено влияние условий проведения реакции окисления люминола пероксидом водорода, катализируемой пероксидазой сои, на интенсивность хемилюминесценции. Проведена оптимизация условий гетерогенного окисления люминола. Показано, что введение п-йодо фенола в реакционную смесь вызывает десятикратное снижение некаталитического окисления люминола.

3. Разработан иммуноферментный анализ сульфаметоксипиридазина с хемилюминесцентной детекцией. Предел обнаружения сульфаметокси пиридазина составляет 0,02 нг/мл. Переход от колориметрической к хемилюминесцентной детекции активности пероксидазы сои приводит к 20-кратному снижению предела обнаружения.

4. Проведено сравнение характеристик разработанного иммунофермент ного анализа сульфаметоксипиридазина с хемилюминесцентной детекцией пероксидаз сои и хрена в качестве маркеров. Установлено, что пероксидаза сои обладает преимуществами по сравнению с традиционно используемой пероксидазой хрена, заключающимися в снижении предела обнаружения сульфаметоксипиридазина в 15 раз и значительном возрастании стабильности сигнала.

5. Показана возможность иммуноферментного определения сульфаметоксипиридазина в пробах молока и озерной воды с использованием хемилюминесцентной детекции пероксидазы сои.

- 19 СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ 1. Берлина А.Н., Жердев А.В., Дзантиев Б.Б., Сахаров И.Ю. Применение пероксидазы сои для иммуноферментного определения сульфаметокси пиридазина в молоке. // Прикладная биохимия и микробиология, 2007, том 43, № 5, с. 614–620.

2. Sakharov I.Yu., Berlina A.N., Zherdev A.V., Dzantiev B.B. Advantages of soybean peroxidase over horseradish peroxidase as the enzyme label in chemi luminescent enzyme-linked immunosorbent assay of sulfamethoxypyridazine. // Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2010, v. 58, № 6, р. 3284–3289.

3. Берлина А.Н., Алпеева И.С., Жердев А.В., Дзантиев Б.Б., Сахаров И.Ю.

Иммуноферментный анализ сульфаметоксипиридазина с помощью биотин/стрептавидиновой пары. // Труды Международной конференции «Биотехнология и медицина», Москва, Россия, 14–17 марта 2006 г., c. 247.

4. Alpeeva I.S., Berlina A.N., Zherdev A.V., Efremov E.E., Dzantiev B.B., Sakharov I.Yu. Advantages of application of anionic soybean peroxidase in chemiluminescent ELISA. // Proceedings of International Congress on Analytical Sciences (ICAS–2006), June 25–30, 2006, Moscow, Russia, p. 137–138.

5. Берлина А.Н., Жердев А.В., Дзантиев Б.Б., Сахаров И.Ю. Применение анионной пероксидазы сои в иммуноферментном анализе сульфаметокси пиридазина с колориметрической и хемилюминесцентной детекцией. // Труды Седьмой ежегодной молодежной конференции ИБХФ РАН – вузы «Биохимическая физика», Москва, Россия, 12–14 ноября 2007 г., c. 25.

6. Sakharov I.Yu., Alpeeva I.S., Berlina A.N. Anionic plant peroxidases in chemiluminescent ELISA: Perspectives and advantages. // Abstracts of the 8th International Peroxidase Symposium. Satellite symposium of the XVIth Congress of the Federation of European Societies of Plant Biology (FESPB–2008). August 20–23, 2008, Tampere, Finland, PX-S11-2.

7. Berlina A.N., Zherdev A.V., Dzantiev B.B., Sakharov I.Yu. Ultrasensitive chemiluminescent ELISA of sulfamethoxypyridazine using soybean peroxidase.

// Abstracts of the 42nd IUPAC congress: Chemistry Solutions, August 2–7, 2009, Glasgow, UK, S210-004.

8. Берлина A.Н., Жердев A.В., Дзантиев Б.Б., Сахаров И.Ю. тИФА для определения сульфаметоксипиридазина с использованием пероксидазы сои в качестве метки. // Труды Международной конференции «Биотехнология: Экология больших городов», 15–17 марта 2010 г., Москва, Россия, с. 443.

- 20