Молекулярная филогения дрожжей рода lachancea
На правах рукописи
Серпова Елена Владимировна Молекулярная филогения дрожжей рода Lachancea Специальность 03.00.15 – Генетика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва – 2009
Работа выполнена в секторе молекулярной биологии дрожжей и лаборатории молекулярной генетики, таксономии и экологии дрожжей (зав.
лабораторией, доктор биологических наук, профессор Г.И. Наумов) Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов (ФГУП «ГосНИИгенетика»), Москва.
Научный консультант:
доктор биологических наук Наумова Елена Сергеевна
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук Шевелев Алексей Борисович Институт Биохимии им. А.Н. Баха РАН кандидат биологических наук Вустин Михаил Михайлович ФГУП «ГосНИИгенетика»
Ведущая организация: Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова
Защита состоится « 22 » декабря 2009 г. в 1400 на заседании Диссертационного совета Д217.013.01 при Государственном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 117545, г.
Москва, 1-й Дорожный проезд, 1. Факс: (495) 315-05-01.
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГУП ГосНИИгенетика.
Автореферат разослан « 20 » ноября 2009 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук Воюшина Т.Л.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность работы. Дрожжи широко распространены во многих экосистемах и играют важную роль в различных пищевых связях.
Таксономически наиболее изучен род Saccharomyces, включающий биологические виды S. cerevisiae, S. arboricolus, S. bayanus, S. cariocanus, S.
paradoxus, S. kudriavzevii и S. mikatae (Naumov et al., 2000;
Kurtzman, 2003;
Wang et Bai, 2008). Дрожжи S. cerevisiae стали первым эукариотическим организмом, у которого определена нуклеотидная последовательность генома (Goffeau et al., 1996). В геноме этих дрожжей обнаружено 55 дуплицированных блоков, включающих в себя несколько сотен пар гомологичных генов (Wolfe, Shields, 2007). Одинаковый порядок и ориентация паралогичных генов в дуплицированных блоках послужили доказательством того, что геном дрожжей S. cerevisiae сформировался в результате дупликации и последующих массовых хромосомных перестроек и делеционных потерь отдельных генов. За последнее десятилетие проведено секвенирование полноразмерных геномов еще более видов аскомицетовых дрожжей. Сравнительный анализ геномных последовательностей ряда видов дрожжей показал, что полная дупликация восьми предковых хромосом у дрожжей S. cerevisiae произошла после их расхождения с дрожжами Kluyveromyces waltii (Kellis et al., 2004).
Молекулярно-генетическое изучение одного из ближайших родственников дрожжей Saccharomyces – рода Kluyveromyces van der Walt emend. van der Walt показало, что этот род очень гетерогенен и содержит ряд дрожжей не находящихся в близком родстве между собой и с типовым видом рода – K. polysporus (Cai et al., 1996;
Naumov, Naumova, 2002;
Kurtzman, 2003;
Kurtzman, Robnett, 2003). В то же время обнаружена небольшая группа видов из различных родов (Zygosaccharomyces cidri, Z. fermentati, K. thermotolerans, K.
waltii, S. kluyveri), имеющих в той или иной степени близкие рибосомальные последовательности. На базе пяти указанных видов был образован новый род Lachancea (Kurtzman, 2003). Недавно описаны еще два новых вида L. meyersii (Fell et al., 2004) и L. dasiensis (Lee et al., 2009).
Помимо дупликации всего генома в ходе эволюции дрожжей S. cerevisiae происходили множественные дупликации отдельных хромосом, сегментов хромосом и отдельных генов. В геноме дрожжей Saccharomyces гены, представленные большим числом копий, образуют мультигенные семейства.
Гены рибосомальной РНК расположены на XII хромосоме по типу тандемных повторов, образуя последовательность ген-спейсер-ген-спейсер. Гаплоидный геном дрожжей S. cerevisiae содержит примерно 120–200 наборов генов рРНК (Maleszka, Clark-Walker, 1993). Упорядоченная структура рРНК и единообразие последовательностей в повторах сохраняются за счет так называемой "концертной" эволюции, при которой тандемные повторы ("члены одного оркестра") эволюционируют как единое целое (Nei, Rooney, 2005). При этом происходит гомогенизация тандемных повторов, так как возникающие мутации элиминируются или распространяются по другим повторам за счет неравного кроссинговера или генной конверсии. В настоящее время анализ последовательностей рРНК является одним из наиболее используемых методов определения родственных отношений дрожжей, как на видовом, так и на более высоких таксономических уровнях (Valente et al., 1999;
Kurtzman, 2000;
Suh et al., 2006). Сравнительный анализ домена D1/D2 гена 26S рРНК позволил разделить все аскомицетовые виды дрожжей на 10 клад;
дрожжи родов Saccharimyces и Lachancea объединились в кладе “Saccharomyces” (Kurtzman, Robnett, 1998, 2003).
Другой тип организации имеют рассеянные по геному не тандемные повторы. К числу таких мультигенных семейств относятся полимерные гены ферментации различных сахаров дрожжей S. cerevisiae. Как правило, эти гены расположены в субтеломерных районах хромосом – наиболее динамичных участках дрожжевого генома (Kellis et al., 2003). Особый интерес представляют -галактозидазные -Галактозидазы гены ферментации мелибиозы.
[К.Ф.3.2.1.22] – широко распространенные ферменты, которые присутствуют у мицелиальных грибов, растений и животных, но довольно редко встречаются у дрожжей. Среди дрожжей Saccharomyces и Lachancea известны как штаммы, способные сбраживать мелибиозу, так и штаммы негативные по этому признаку. В отличие от Saccharomyces, род Lachancea практически не изучен.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является изучение молекулярного полиморфизма, таксономии и эволюции дрожжей рода Lachancea на материале штаммов различного экологического и географического происхождения. В этой связи в работе решались следующие задачи:
1. Сравнение геномов видов рода Lachancea с помощью пульс электрофореза нативных хромосомных ДНК и анализа нуклеотидных последовательностей генов рРНК.
Идентификация -галактозидазных генов ферментации мелибиозы 2.
и определение их хромосомной локализации у дрожжей Lachancea.
3. Определение нуклеотидной последовательности генов MEL дрожжей Lachancea и филогенетический анализ -галактозидаз.
4. Скрининг штаммов Saccharomyces различного географического происхождения с целью обнаружения новых -галактозидазных генов MEL.
-галактозидаз 5. Сравнительный анализ дрожжей клады “Saccharomyces”.
Научная новизна и практическая значимость работы. На материале штаммов различного экологического и географического происхождения впервые исследован молекулярный полиморфизм дрожжей рода Lachancea.
Обнаружен новый вид Lachancea sp., близкородственный дрожжам L.
thermotolerans и обладающий способностью ферментировать мелибиозу.
С помощью пульс-электрофореза нативных хромосомных ДНК изучены видовые особенности геномов дрожжей рода Lachancea. Установлено, что все виды этого рода имеют одинаковое гаплоидное число хромосом равное 8, тогда как предельные размеры хромосом у разных видов существенно отличаются.
Наибольший диапазон размеров хромосомных полос отмечен у штаммов L.
cidri (400–2800 т.п.н.), а наименьший – у L. waltii (1400–2800 т.п.н.).
Впервые изучены -галактозидазные гены MEL у дрожжей рода Lachancea и установлена их хромосомная локализация у разных штаммов. Из восьми видов рода Lachancea штаммы Mel+ не обнаружены только у двух видов: L. meyersii и L. waltii. Показано, что не сбраживающие мелибиозу штаммы не содержат даже молчащей последовательности MEL Обнаружено накопление полимерных генов MEL у представителей видов L. fermentati, L.
cidri и Lachancea sp. Скрининг штаммов Saccharomyces не европейского происхождения позволил впервые обнаружить полимерные гены MELp1 и MELp2 у дрожжей S. paradoxus. Сравнительный филогенетический анализ галактозидаз клады “Saccharomyces” показал видоспецифичность генов MEL аскомицетовых дрожжей.
Создана коллекция охарактеризованных молекулярными методами штаммов дрожжей Lachancea и Saccharomyces, которая может быть использована в фундаментальных и прикладных исследованиях.
Апробация работы. Основные положения работы были представлены на III-ем Съезде ВОГиС "Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития" (2004, Москва);
Международной школе-конференции молодых ученых “Системная биология и биоинженерия” (2005, Москва);
25-м Международном специализированном симпозиуме по дрожжам (2006, Хельсинки, Финляндия);
12-м Международном конгрессе по дрожжам (2008, Киев, Украина);
V-м съезде ВОГиС "200 лет со дня рождения Дарвина (Москва, 2009). Диссертационная работа была апробирована на заседании секции генетики микроорганизмов Ученого совета ГосНИИгенетика 9 ноября года.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, из них 4 статьи и 5 материалов симпозиумов и конференций.
Структура и объем диссертации. Диссертация включает введение, обзор литературы, экспериментальную часть и обсуждение, а также заключение и выводы. Материалы диссертации изложены на 142 страницах машинописного текста, содержат 31 рисунок и 5 таблиц. Список литературы включает источников.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объекты исследования. В работе было изучено 135 штаммов дрожжей Lachancea и Saccharomyces различного экологического и географического происхождения. Происхождение основных штаммов можно найти на следующих сайтах коллекций в интернете: CBS, www.cbs.knaw.nl;
NRRL, www.ncaur.usda.gov;
NBRC, www.nbrc.nite.go.jp.
Генетический анализ. Дрожжи культивировали и скрещивали на стандартной полной среде YPD при 28°С. Спорообразование индуцировали на среде с ацетатом натрия. Получение гибридов и изоляцию спор проводили при помощи микроманипулятора по стандартным методикам (Захаров и др., 1984).
ПЦР-анализ. Амплификацию различных участков рДНК и галактозидазных генов проводили непосредственно на дрожжевых клетках или с предварительным выделением ДНК согласно методике (Булат, Мироненко, 1990). Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) осуществляли на ДНК амплификаторе “ТерцикТМ” (Россия). ПДРФ-анализ осуществляли с помощью эндонуклеаз AluI, HaeIII, HinfI и HpaII (Fermentas, Литва). Разделение продуктов ПЦР проводили в агарозном геле (1-1,6%) при 60-65В в 0.5 x TBE в течение 2-3 часов.
Молекулярное кариотипирование. Приготовление препаратов хромосомных ДНК и их электрофоретическое разделение проводили на аппарате CHEF-DR III (Bio-Rad, США) согласно Naumov et al. (1990). Перенос хромосомных ДНК на нитроцеллюлозную мембрану проводили вакуумным способом с помощью аппарата "Vacuum blotter" ("Bio-Rad", США). Введение нерадиоактивной метки с использованием dUTP, меченого дигоксигенином (dig-II-dUTP) из набора "DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I", гибридизацию и проявление гибридизационных сигналов проводили согласно инструкции фирмы-изготовителя "Roche" (Германия).
Секвенирование. ПЦР-продукты элюировали из геля при помощи набора "GeneClean Kit", согласно протоколу фирмы-изготовителя (Bio 101 Inc., США).
Нуклеотидные последовательности по двум цепям определяли секвенированием по методу Сэнгера на автоматических секвенаторах ABI 373A ("Applied Biosystems") и Beckman-Coulter (США).
Филогенетический анализ. Нуклеотидные последовательности анализировали при помощи программы SeqMan package (DNAStar Inc., США).
Доступные через интернет нуклеотидные и аминокислотные последовательности взяты из баз данных сайта CBS (http://www.cbs.knaw.nl/databases) и из GenBank на сервере NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Множественное выравнивание нуклеотидных последовательностей осуществляли с использованием программы BioEdit version 5.0.9 (Hall, 1999). Установление филогенетических родственных связей и построение дендрограмм проводили с использованием методов Neighbour Joining и UPGMA из компьютерных пакетов TREECON (van der Peer, de Wachter, 1994) и MEGA 3 (Kumar et al., 2004). Индексы бутстрэпа, определяющие статистическую достоверность выделения групп, подсчитывали для 1000 псевдореплик.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Сравнительный анализ геномов дрожжей рода Lachancea Изучение молекулярного полиморфизма дрожжей Lachancea проводили на материале штаммов различного происхождения. Для определения видовой принадлежности штаммов использовали ПДРФ-анализ не кодирующих участков рДНК: 5.8S–ITS и IGS2 фрагментов. В качестве видовых тестеров использовали типовые культуры L. thermotolerans NRRL Y-8284, L. cidri CBS 4575, L. fermentati CBS 707, L. meyersii CBS 8951, L. waltii CBS 6430 и L.
kluyveri CBS 3082.
Идентификация нового вида Lachancea sp. Сравнительный анализ рибосомальных последовательностей и молекулярное кариотипирование выявили гетерогенность таксономического вида L. thermotolerans. Все изученные штаммы имели одинаковый размер 5.8S-ITS фрагмента и не отличались по HaeIII-профилям этого участка (рис. 1А). Рестриктазный анализ более вариабельного IGS2 участка с помощью эндонуклеазы AluI разделил штаммы на две группы (рис. 1В). К первой группе относится типовая культура L. thermotolerans и штаммы UWO PS 83-1097.1, Yal. 87-1, Yal. 87-2, Yal. 87-5, Yal. 87-13, Fin. 89-2, Fin. 89-11 и DV 87-18, а сбраживающие мелибиозу штаммы NBRC 10066, NBRC 10067, UWO PS 79-139 и UWO PS 82-231 – ко второй группе.
Рис. 1. Рестриктазный анализ амплифицированных 5.8S-ITS (А) и IGS (В) фрагментов штаммов L. thermotolerans соответственно с помощью эндонуклеаз HaeIII и AluI. Дорожки: 1 – NRRL Y-8284, 2 – Yal. 87-1, 3 – Yal. 87-2, 4 – Yal. 87-5, – Yal. 87-13, 6 – Fin. 89-2, 7 – Fin. 89-11,8 – DV18, 9 – UWO PS 83-1097.1, 10 – NBRC 10066, 11 – NBRC 10067, 12 – UWO PS 79 139, 13 – UWO PS 82-231. М – маркер молекулярных масс (п.н.).
Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей домена D1/D (рис. 2) и 5.8S-ITS фрагмента подтвердил деление штаммов на те же две группы, которые, по-видимому, представляют собой близкородственные виды:
L. thermotolerans и Lachancea sp.
Рис. 2. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей домена D1/D2 дрожжей штаммов L. thermotolerans и Lachancea sp. Нумерация приводится согласно последовательности D1/D типовой культуры L. thermotolerans NRRL Y-8284.
Штаммы Lachancea sp. имеют идентичные последовательности домена D1/D2 и отличаются по этому участку от типовой культуры NRRL Y- двумя транзициями: C–T в 467 позиции и G–A в 510. Штаммы Lachancea sp.
также отличаются от типовой культуры L. thermotolerans NRRL Y-8284 по последовательности 5.8S-ITS фрагмента: две транзиции T–C в позициях 180 и 196. Указанные нуклеотидные замены являются уникальными и не обнаружены у остальных видов Lachancea.
Каритипический анализ показал, что дрожжи L. thermotolerans и Lachancea sp. имеют различные молекулярные кариотипы (рис. 3).
Рис. 3. Молекулярные кариотипы дрожжей L.
thermotolerans и Lachancea sp. Дорожки: 1 – Pichia canadensis (syn. Hasenula wingei) YB-4662-VIA (хромосомный стандарт), 2 – Saccharomyces. cerevisiae YNN 295 (хромосомный стандарт), L. thermotolerans:
3,12 – NRRL Y-8284 (Т), 4 – Yal. 87-1, 5 – Yal. 87-2, 6 – Yal. 87-5, 7 – Yal. 87-13, 8 – Fin. 89-2, 9 – Fin. 89-11, 10 – DV18, 11 – UWO PS 83 1097.1;
Lachancea sp.: 13 – NBRC 10066, 14 – NBRC 10067, 15 – UWO PS 79-139, 16 – UWO PS 82-231. Размеры хромосомных полос даны для YNN 295 и YB-4662-VIA.
Таким образом, сравнительный анализ рибосомальных последовательностей и молекулярное кариотипирование позволили дифференцировать среди дрожжей таксономического вида L. thermotolerans две группы штаммов, представляющие собой близкородственные виды. Один из них, L. thermotolerans охватывает, как правило, штаммы, не усваивающие мелибиозу. Второй вид Lachancea sp. является новым для науки и включает штаммы, усваивающие мелибиозу.
Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей 5.8S ITS участка 8 видов Lachancea. Помимо штаммов L. thermotolerans и Lachancea sp. мы провели секвенирование 5.8S-ITS участка у штаммов: L.
kluyveri (CBS 6547, CBS 6626, CBS 2861, CBS 4104, CBS 10369), L. waltii (CBS 8527, CBS 8528, CBS 7703), L. cidri (CBS 2950) и L. fermentati (CBS 6544, CBS 6711, CBS 7004, CBS 7005, CBS 7007). Нуклеотидные последовательности этого участка остальных штаммов Lachancea были взяты из компьютерных баз данных коллекции CBS и GenBank. На основании сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей 5.8S-ITS участка было построено филогенетическое древо (рис. 4).
Рис. 4. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей 5.8S-ITS участка дрожжей Lachancea. Приводятся значения бутстрепа 50%. Шкала соответствует 20 нуклеотидным заменам на 1000 нуклеотидных позиций. Т – типовая культура. Цифрами в скобках обозначены группы штаммов, имеющие идентичные нуклеотидные последовательности: 1 – Yal. 87-2, Yal. 87-5, Yal. 87-13, DV87-18, UWOPS 83-1097, Fin. 89-2, Fin. 89-11;
2 – UWOPS 82-231, NBRC 10067;
3 – CBS 9958, CBS 9923, CBS 9924, CBS 9925;
4 – CBS 8527, CBS 8528, CBS 7703;
5 – CBS 2950, CBS 5666;
6 – CBS 797, CBS 4686, CBS 6544, CBS 6711, CBS 7004, CBS 7005, CBS 7007;
7 – CBS 6545;
8 – CBS 6547, CBS 6548, CBS 6626, CBS 2861, CBS 4104, CBS 10369, NBRC 1811, CBS 10368.
Штаммы одного вида имели, как правило, идентичные последовательности ITS1 и ITS2. Единичные нуклеотидные замены были обнаружены только среди штаммов L. thermotolerans, L. kluyveri и L. fermentati.
На филогенетическом древе выделяются три основных кластера. Первый сформировали дрожжи L. thermotolerans, Lachancea sp., L. waltii и L. meyersii.
Различия по ITS-последовательностям у этих дрожжей составили от 2 до нуклеотидов. Наиболее близкородственными являются дрожжи L.
thermotolerans и Lachancea sp., а наиболее дивергировавшим – вид L. meyersii.
Второй кластер со 100%-ной достоверностью объединяет виды L. cidri и L.
fermentati, штаммы которых отличаются 10 нуклеотдиными заменами в районе ITS1 и 5–6 нуклеотдиными заменами в районе ITS2. Различия между штаммами двух кластеров составили более 50 нуклеотидных замен. Отдельное положение на филогенетическом древе занимают штаммы L. kluyveri, которые имеют идентичные ITS-последовательности или отличающиеся 1-3 нуклеотидами.
Обнаруженные у дрожжей L. kluyverii нуклеотидные замены в районе ITS1/ITS не связаны с географическим происхождением штаммов и источником их выделения. Это наиболее дивергентный вид рода Lachancea. Различия по последовательностям ITS1/ITS2 между L. kluyveri и другими видами этого рода составляют более 80 нуклеотидов.
Видовые особенности молекулярных кариотипов дрожжей Lachancea.
Для достижения оптимального разделения хромосомных полос разного размера дрожжей Lachancea проводился индивидуальный подбор режимов кариотипирования каждого вида. Порядок и размер хромосомных полос устанавливали согласно кариотипическим стандартам штаммов S. cerevisiae YNN 295 и Pichia canadensis (syn. Hasenula wingei) YB-4662-VIA.
На рис. 5 приведена суммарная схема молекулярных кариотипов 8 видов Lachancea, составленная на основе нескольких электрофоретических гелей. В схему также включен кариотип недавно описанного вида L. dasiensis (Lee et al., 2009). Сравнительный анализ паттернов 51 штамма выявил значительный полиморфизм дрожжей Lachancea. Хромосомная ДНК различных штаммов разделилась на 7–9 электрофоретических полос размером от 400 до 2800 т.п.н.
Большинство штаммов имеют паттерны с 8 хромосомными полосами. Наиболее гомогенными по молекулярным кариотипам являются дрожжи L. dasiensis, L.
meyersii, L. waltii и L. kluyveri. У штаммов последних двух видов незначительный полиморфизм отмечен только для хромосомных полос размером от 1500 до 2400 т.п.н. Большинство изученных штаммов L. kluyveri не отличались по молекулярным кариотипам от типовой культуры CBS 3082.
Штаммы L. meyersii имеют практически идентичные паттерны с хромосомными полосами размером от 1000 до 2800 т.п.н. Большое сходство кариотипов дрожжей L. meyersii может быть связано с одинаковым источником Рис. 5. Суммарная схема молекулярных кариотипов дрожжей рода Lachancea. Размеры хромосомных полос (т.п.н.) приводятся по стандартным штаммам Saccharomyces cerevisiae YNN 295 и Pichia canadensis YB-4662-VIA. Использовались различные режимы кариотипирования.
их выделения: из морской воды в мангровой бухте Багамских островов.
Несмотря на различное географическое происхождение, штаммы Lachancea sp.
также имеют практически идентичные кариотипы с 8 хромосомными полосами размером от 900 до 2800 т.п.н.
Полиморфизм размеров хромосомных полос обнаружен среди штаммов L. thermotolerans, L. fermentati и L. cidri. Несмотря на одинаковый диапазон размеров хромосом от 700 до 2800 т.п.н., размеры индивидуальных хромосом отличались у каждого из 9 изученных штаммов L. thermotolerans. Типовая культура NRRL Y-8284 имеет 7 хромосом, тогда как хромосомная ДНК остальных штаммов разделилась на 8 электрофоретических полос. Различия по числу хромосомных полос были ранее отмечены у штаммов L. thermotolerans, изолированных в Испании (Belloch, 1998). Недавно проведенное секвенирование и аннотирование полноразмерного генома дрожжей L.
thermotolerans подтвердило наличие семи хромосом у штамма NRRL Y- (Souciet et al., 2009). Хромосомная ДНК дрожжей L. fermentati разделилась на полос. Сходные паттерны имеют только штаммы CBS 4686, CBS 7004, CBS 7005 и CBS 7007, выделенные из альпехина (отходы производства оливкового масла) в Испании и способные ферментировать мелибиозу. Эти штаммы, по видимому, представляют собой отдельную экологическую популяцию дрожжей L. fermentati. В отличие от остальных дрожжей L. fermentati, выделенные из альпехина штаммы имеют более низкий уровень ДНК-ДНК-реассоциации с типовой культурой CBS 707: 70–77% (Kurtzman et al., 1991).
Наиболее гетерогенными оказались дрожжи L. cidri, кариотипы которых различаются по числу и размерам хромосомных полос: у типовой культуры CBS 4575 и штамма CBS 2950 выявлено 9 электрофоретических полос, а у штамма CBS 5666 – восемь. Все три штамма имели одинаковые предельные размеры хромосомных полос: от 400 до 2800 т.п.н. Однако размеры индивидуальных хромосом существенно отличались. Сходными по размерам являются только две верхние хромосомные полосы и две самые нижние размером. У штамма CBS 2950 имеется дополнительная нижняя хромосома размером около 580 т.п.н. Нельзя исключать, что штаммы CBS 4575 и CBS являются анеуплоидными и содержат экстра хромосомы.
Таким образом, помимо межвидовых различий кариотипических профилей, у ряда видов Lachancea мы обнаружили внутривидовой полиморфизм размеров хромосомных полос. Почти каждый из изученных штаммов L. thermotolerans, L. fermentati и L. cidri имеет уникальный паттерн.
Независимо от кариотипического профиля, штаммы одного вида, как правило, имеют идентичные ITS1 и ITS2 последовательности. Гомогенные по молекулярным кариотипам дрожжи L. kluyverii оказались наиболее полиморфными по ITS-последовательностям: до 3 нуклеотидных замен.
2. –Галактозидазные гены дрожжей Lachancea Мы провели изучение -галактозидазных генов у семи видов рода Lachancea. Штаммы недавно описанного вида L. dasiensis в опытах не участвовали.
Саузерн-гибридизация хромосомных ДНК с зондами MEL позволила определить локализацию -галактозидазных генов у изученных штаммов Lachancea. На рис. 6 представлена Саузерн-гибридизация хромосомных ДНК L.
kluyveri с зондом MELk1. У всех изученных штаммов обнаружена только одна гибридизационная полоса размером 1500–1600 т.п.н. (рис. 6, дорожки 2–14).
Рис. 6. Саузерн-гибридизация хромосомных ДНК дрожжей L. kluyveri с зондом MELk. Дорожки: 1, 15 – Saccharomyces cerevisiae YNN 295 (хромосомный стандарт);
– CBS 3082 (T), 3 – CBS 6545, 4 – CBS 6547, 5 – CBS 6548, 6 – CBS 6626, 7 – NBRC 1811, 8 – NBRC 10955, 9 – CBS 10367, 10 – CBS 10368, 11 – CBS 10369, 12 – CBS 2861, 13 – CBS 4104, 14 – CBS 5828.
Недавно определена полная нуклеотидная последовательность генома типовой культуры L. kluyveri CBS 3082 и показано, что ген MELk1 расположен в субтеломерной области правого плеча хромосомы VII (http://www.genolevures.org).
С помощью Саузерн-гибридизации с зондом MELz установлена локализация генов MEL у дрожжей L. cidri (рис. 7). У штаммов CBS 2950 и CBS 5666 обнаружено по одному гибридизационному сигналу, но различной хромосомной локализации. У первого штамма ген MEL расположен в хромосоме размером около 2300 т.п.н. (MELz2), а у второго размером около 1900 т.п.н. (MELz2) (рис. 7, дорожки 3 и 4). У штамма CBS 4575 зонд MELz гибридизовался с двумя хромосомами размером 1900 т.п.н. (MELz1) и наименьшей хромосомой 500 т.п.н. (MELz3) (рис. 7, дорожка 2).
У штамма CBS 4686 L. fermentati была проведена амплификация гена MELf1. Полученный ПЦР-продукт был использован в качестве зонда при Саузерн-гибридизации хромосомных ДНК 9 штаммов L. fermentati (рис. 8, дорожки 2–10). У типовой культуры CBS 707, а также у штаммов CBS 797, CBS Рис. 7. Пульс-электрофорез хромосомных ДНК (A) дрожжей L. cidri и Саузерн-гибридизация с зондом MELz (B). 1 – Saccharomyces cerevisiae YNN (хромосомный стандарт);
2 – CBS (T), 3 – CBS 2950, 4 – CBS 5666. Размеры хромосомных полос приводятся по S.
cerevisiae YNN 295.
A B 4506, CBS 6544 и CBS 6711 гибридизационные сигналы отсутствовали.
Указанные штаммы имеют фенотип Mel-. У штаммов CBS 4686, CBS 7004 и CBS 7005 обнаружена одна гибридизационная полоса размером около т.п.н. (рис. 8, дорожки 4–6). У штамма CBS 7007 зонд MELf1 гибридизовался к двум хромосомным полосам: одной размером 1600 т.п.н. (как у других Mel+ штаммов), а второй размером около 1250 т.п.н. (MELf2) (рис. 8, дорожка 7).
Рис. 8. Пульс-электрофорез хромосомных ДНК (A) дрожжей L.
fermentati и Саузерн-гибридизация с зондом MELf1 (B). 1 – Saccharomyces cerevisiae YNN (хромосомный стандарт);
2 – CBS 707, 3 – CBS 797, 4 – CBS 4686, 5 – CBS 7004, 6 – CBS 7005, 7 – CBS 7007, 8 – CBS 4506, 9 – CBS 6711, 10 – CBS 6544. Размеры хромосомных полос приводятся по S. cerevisiae YNN 295.
A B У всех четырех штаммов Lachancea sp было обнаружено по два гибридизационных сигнала (рис. 9). У штаммов (NBRC 10066, NBRC 10067, UWO PS 79-139) их положение было одинаковым – в районе 900 и 1100 т.п.н.
(рис. 9, дорожки 4, 6, 7), а у штамма UWO PS 82-231 зонд MELs гибридизовался к полосам размером около 1050 и 1350 т.п.н. (рис. 9, дорожка 5).
Рис. 9. Пульс-электрофорез хромосомных ДНК дрожжей Lachancea (A) и Саузерн гибридизация с зондом MELs (B). 1 – S. cerevisiae YNN (хромосомный стандарт);
L.
thermotholerans: 2 – NRRL Y 8284 (Т), 3 – UWO PS 83-1097;
Lachancea sp.: 4 – UWO PS 79 139, 5 – UWO PS 82-231, 6 – NBRC 10066, 7 – NBRC 10067.
Размеры хромосомных полос приводятся по YNN 295.
A B Все изученные до настоящего времени штаммы L. thermotholerans имеют фенотип Mel-. Нами был обнаружен штамм UWO PS 83-1097, изолированный из дрозофилы на Каймановых островах, который способен ферментировать мелибиозу. Согласно Саузерн-гибридизации с зондом MELs, этот штамм обладает одним геном MELh1, расположенным в хромосоме размером около 1020 т.п.н (рис. 9, дорожка 3). У остальных штаммов L. thermotholerans гибридизационные сигналы с зондом MELs не обнаружены.
Сравнительный анализ -галактозидазных генов дрожжей рода Lachancea. Мы провели секвенирование -галактозидазных генов MEL у штаммов L. kluyveri (CBS 10369), L. cidri (CBS 2950, CBS 4575), L. fermentati (CBS 4686, CBS 7004, CBS 7005, CBS 7007). У штаммов Lachancea sp. UWO PS 79-139 и UWO PS 82-231 хромосомы, содержащие гены MEL были элюированы агарозного геля и на их основе была проведена амплификация генов MELs1, MELs2 и MELs3. У двух других штаммов Lachancea sp. (NBRC 10066, NBRC 10067) секвенирование -галактозидазных генов было проведено Takakuwa et al. (2007), и соответствующие гены были обозначены как MELth1 и MELth2.
Полученные нуклеотидные последовательности сравнили с соответствующими фрагментами последовательностей генов MEL дрожжей Lachancea, доступными через GenBank. У 16 изученных штаммов L. kluyveri обнаружено 9 типов галактозидазных последовательностей, обозначенных как MELk1–MELk9. По уровню сходства гены MEL дрожжей Lachancea можно разделить на 4 группы.
Гены MEL одного вида имеют, как правило, большое сходство (94–100%), тогда как гены MEL разных видов идентичны на 68–86%. Исключением являются гены MELs1–MELs3 дрожжей Lachancea sp. и ген MELh1 штамма L.
thermotolerans UWO PS 83-1097, которые сходны на 98–99%, что больше соответствует внутривидовому уровню. В то же время сходство дивергентных генов MELk2 и MELk4 больше соответствует межвидовому уровню: 79–82%.
Рис. 10. Филогенетический анализ аминокислотных последовательностей галактозидаз дрожжей рода Lachancea. В качестве внешней группы использована галактозидаза дрожжей Torulaspora delbrueckii. Приводятся значения бутстрепа 50%. Шкала соответствует 20 аминокислотным заменам на 1000 аминокислотных позиций.
На рис. 10 представлен филогенетический анализ аминокислотных последовательностей -галактозидаз дрожжей рода Lachancea. В целом, изученные -галактозидазы имеют от 68 до 99% сходства. При анализе относительно внешней группы (-галактозидаза MELt дрожжей Torulaspora delbrueckii) на древе выделяются два основных кластера. Первый включает галактозидазы MELk1–MELk9 дрожжей L. kluyveri, имеющие 82–99% идентичности. Во втором кластере со 100%-ной поддержкой выделяются три подгруппы. Одна из них представлена белками MELz1–MELz3 дрожжей L.
cidri, вторая – -галактозидазами MELf1 и MELf2 дрожжей L. fermentati. В третью подгруппу объединились белки MELs1–MELs3, MELth1 и MELth дрожжей Lachancea sp., а также -галактозидаза MELh1, штамма L.
thermotolerans UWO PS 83-1097. Причем, последняя -галактозидаза наиболее сходна с белком MELs3 и отличается от него тремя аминокислотными заменами. Сравнительный анализ -галактозидаз дрожжей Lachancea показал, что уровень их сходства внутри одного вида составляет 94–100%, тогда как галактозидазы разных видов, как правило, идентичны на 68–86%.
3. Сравнительный анализ -галактозидаз клады "Saccharomyces" Помимо дрожжей рода Lachancea, сбраживающие мелибиозу штаммы обнаружены еще в трех родах клады "Saccharomyces": Saccharomyces, Zygotorulospora и Torulospora.
У дрожжей S. cerevisiae идентифицировано два семейства галактозидазных генов. Первое включает полимерные гены MEL1–MEL11, обнаруженные в разных комбинациях у штаммов европейского происхождения (Naumov et al., 1995d, 1996b). Ко второму семейству относятся гены MEL12– MEL15, идентифицированные у штаммов S. cerevisiae африканского происхождения (Наумов, Наумов, 1997а,б;
Наумов и др., 2002). По одному гену MEL секвенировано у S. paradoxus (MELp), S. bayanus var. bayanus (MELb), S.
bayanus var. uvarum (MELu) и S. mikatae (MELj), а также у гибридного таксона S.
pastorianus (MELpt) и его синонима S. carlsbergensis (MELx) (Turakainen et al., 1991;
Turakainen et al., 1993;
Naumova et al., 1996;
Наумова и др., 2003).
Проведенный ранее в нашей лаборатории сравнительный анализ генов MEL выявил довольно низкий уровень сходства генов MEL1–MEL11 и MEL12– MEL15 дрожжей S. cerevisiae: 86–88%. В то же время идентичность последних трех генов и гена MELp дрожжей S. paradoxus составила 95–98%, что ближе к внутривидовому, чем межвидовому уровню.
С целью обнаружения новых -галактозидазных генов мы провели скрининг сбраживающих мелибиозу штаммов Saccharomyces преимущественно не европейского происхождения. Согласно проведенному нами ПДРФ-анализу 5.8S-ITS-фрагментов 11 штаммов относятся к S. cerevisiae и по два – к S.
paradoxus и S. bayanus. Для картирования генов MEL использовали пульс электрофорез нативных хромосомных ДНК и последующую Саузерн гибридизацию с зондом MEL1 дрожжей S. cerevisiae (рис. 11). В качестве контроля Саузерн-гибридизации был использован штамм S. cerevisiae ВКПМ Y-61, обладающий пятью генами MEL, имеющими различную хромосомную локализацию: MEL3 (хромосома XVI), MEL4 (XI), MEL5 (IV), MEL6 (XIII) и MEL7 (VI) (рис. 11, дорожка 2). Следует отметить, что гены MEL3 и MEL расположены в дуплете, содержащем хромосомы XIII и XVI. Саузерн-анализ штаммов S. cerevisiae, изолированных из сахарного тростника в Бразилии (CBS 7961, CBS 7962), виноделия в Южной Африке (YO 495, YO 504, YO 614) и Китае (NBRC 0289, NBRC 0290) и нектара пальмы в Малайзии (UWO 03-429.1, UWO 03-433.3, UWO 03-459.1, UWO 03-461.4) показал, что все они обладают только одним геном MEL (рис. 11, дорожки 3–7, 10–15).
Одна гибридизационная полоса также обнаружена у штаммов BB2 и Харьковская 39, изолированных соответственно с винограда в Белоруссии и из шампанского на Украине (рис. 11, дорожки 8 и 9). У 12 штаммов единственный ген MEL расположен в хромосоме II, в которой у дрожжей S. cerevisiae картирован только ген MEL1. У штамма YO 495 гибридизационный сигнал обнаружен в дуплете ДНК хромосом XV и VII (дорожка 5), в которых расположены, соответственно, гены MEL2 и MEL8. Секвенирование отдельных -галактозидазных генов и рекомбинационный тест на аллелизм подтвердили, что большинство штаммов обладает геном MEL1, тогда как у штамма YO идентифицирован ген MEL8.
Рис. 11. Саузерн-гибридизация хромосомных ДНК штаммов Mel+ рода Saccharomyces с зондом MEL1. Дорожки: S. cerevisiae: 1 – YNN 295 (хромосомный стандарт), 2 – ВКПМ Y-61 – контрольный штамм, 3 – CBS 7961-2B, 4 – CBS 7962-4B, 5 – YO 495-2A, 6 – YO 504-4D, 7 – YO 614-2C, 8 – BB2, 9 – Харьковская 39, 10 – NBRC 0289, 11 – NBRC 0290, 12 – UWO 03-429.1, 13 – UWO 03-433.3, 14 – UWO 03 459.1, 15 – UWO 03-461.4;
S. bayanus: 16 – MCYC 623, 17 – UWO 99-807.1.1, 18 – UWO 99-808.3, S. mikatae: 19 – NBRC 1816, S. paradoxus: 20 – UWO PS 80-13, 21 – UCD 61-359, 22 – UCD 61-248.
Саузерн-гибридизация показала, что сбраживающие мелибиозу штаммы S. paradoxus также имеют только по одному гену MEL, но разной хромосомной локализации (рис. 11, дорожки 20–22). У штаммов UWO PS 80-13 и UCD 61 359 гибридизационный сигнал обнаружен в хромосомной полосе, которая по размеру соответствует хромосоме VI стандартного штамма S. cerevisiae YNN 295 (дорожки 20 и 21). Ранее секвенированный ген MELp штамма UCD 61- (Naumova et al., 1996) расположен в хромосоме X (рис. 11, дорожка 22). Для идентификации гена MEL штамма S. paradoxus UCD 61-359 был проведен рекомбинационный анализ с геном MELp штамма UCD 61-248. Штамм UWO PS 80-13 не спорулировал и, следовательно, был непригоден для генетического анализа. В качестве контроля использовали не сбраживающий мелибиозу штамм 95-1 также североамериканского происхождения. У штаммов UCD 61 359 и 95-1 были индуцированы ауксотрофные мутации ade и lys. Полученные мутанты имели высокую жизнеспособность аскоспор – 89% и 91% соответственно. Межштаммовые гибриды имели нормальное расщепление ауксотрофных маркеров, жизнеспособность аскоспор составляла от 30 до 87% (табл. 1).
Табл. 1. Анализ гибридов дрожжей S. paradoxus Происхождение Число Жизнеспо Расщеп- Мейотическое гибридов изолиро- собность ление расщепление аскоспор, Mel+:Mel ванных контрольных тетрад % маркеров UCD 61-359 lys 95-1 ade 48 87 83:84 84 LYS:83 lys 81 ADE:86 ade UCD 61-248 95-1 ade 93 42 77:81 80 ADE:78 ade UCD 61-248 61-359 lys 92 30 80:30 54 LYS:56 lys Моногенное расщепление по способности ферментировать мелибиозу подтвердило, что штаммы UCD 61-359 и UCD 61-248 обладают только одним геном MEL. Наличие Mel-сегрегантов в скрещивании UCD 61-359 UCD 61 248, соответствовало дигенному расщеплению по признаку ферментации мелибиозы. Таким образом, рекомбинационный тест на аллелизм подтвердил, что штаммы UCD 61-248 и UCD 61-359 обладают разными -галактозидазными генами, соответственно MELp1 и MELp2. У штаммов UWO PS 80-13 и UCD 61 359 были амплифицированы фрагменты ДНК, размером около 1300 п.н.
Полученные нуклеотидные последовательности были идентичными и отличались от соответствующего фрагмента последовательности гена MELp штамма UCD 61-248 по 16 нуклеотидам (98.7% сходства).
Изолированные в Аргентине штаммы S. bayanus UWO 99-808.3 и UWO 99-807.1.1 обладают только одним геном MEL, расположенным в хромосомной полосе, которая по размеру соответствует хромосоме VI контрольного штамма S. cerevisiae YNN 295 (рис. 11, дорожки 17, 18 и 1). Следует отметить, что у всех ранее изученных штаммов S. bayanus гены MEL имеют такую же хромосомную локализацию (Naumov et al., 1994). Мы провели секвенирование генов MEL у штаммов S. bayanus различного происхождения. Полученные нуклеотидные последовательности сравнили между собой и с имеющимися в GenBank последовательностями генов MEL других штаммов S. bayanus и S.
pastorianus. Уровень сходства проанализированных -галактозидазных последовательностей составил 98–100%. Наиболее дивергентными оказались галактозидазные гены дальневосточных штаммов 136.01 и 148.01.
Молекулярный анализ выявил полиморфизм дрожжей S. mikatae по молекулярным кариотипам и по последовательностям ITS1 участка. Саузерн гибридизация с зондом MELj показала, что 13 штаммов S. mikatae обладают только одним геном MEL, расположенным в хромосоме XV. У штамма NBRC 10999 обнаружена дополнительная гибридизационная полоса, по размеру соответствующая хромосоме XVI контрольного штамма S. cerevisiae YNN 295.
Сравнительный анализ последовательностей -галактозидаз и домена D1/D2 26S рРНК дрожжей клады "Saccharomyces". Мы провели филогенетический анализ выравненных аминокислотных последовательностей -галактозидаз дрожжей Lachancea, Saccharomyces, Zygotorulaspora и Torulaspora. Для сравнения были использованы -галактозидазы трех видов аскомицетовых дрожжей, не входящих в кладу "Saccharomyces": Debaryomyces hansenii, Pichia guilliermondii (клада Debaryomyces/ Lodderomyces) и Schizosaccharomyces pombe (клада "Archiascomycetes"). Последние дрожжи относятся к подотделу Archiascomycotina.
На филогенетическом древе выделяются две основные группы (рис. 12A).
В первую группу со 100%-ной достоверностью объединились -галактозидазы дрожжей клады "Saccharomyces". Внутри этой группы выделяются три кластера. Первый включает -галактозидазы дрожжей рода Saccharomyces. В этом кластере выделяются три подгруппы. Одна из них представлена белками MEL дрожжей S. cerevisiae, вторая – MELр1 и MELр2 дрожжей S. paradoxus, а третья – -галактозидазами дрожжей S. bayanus и S. pastorianus. К последней подгруппе примыкает -галактозидаза MELj дрожжей S. mikatae. Сходство галактозидаз дрожжей рода Saccharomyces составляет от 82 до 100%. К первому кластеру примыкают белки MELt (Torulaspora delbrueckii) и MELr (Zygotorulaspora mrakii). -Галактозидазы последних двух видов дрожжей значительно отличаются от белков MEL дрожжей Saccharomyces: уровень сходства составляет 74–77%.
Второй кластер объединяет -галактозидазы дрожжей L. cidri, L.
fermentati, Lachancea sp. и L. thermotholerans (значение индекса бутстрепа 91%).
В этом кластере со 100%-ной достоверностью выделяется группа, включающая белки MELs1–MELs3 дрожжей Lachancea sp. и MELh1 дрожжей L.
thermotholerans. Указанные белки идентичны на 98–99%. В целом сходство галактозидаз этого кластера составляет 70–100%.
В третий кластер вошли белки MELk1–MELk9 дрожжей L. kluyveri, которые идентичны на 88–100%. Уровень сходства белков MELk1–MELk9 с белками MEL дрожжей L. cidri, L. fermentati, Lachancea sp. и L. thermotholerans составляет от 68 до 73%. Примерно такой же уровень сходства отмечен между -галактозидазами L. kluyveri и дрожжей рода Saccharomyces: 67–70%.
Аминокислотные последовательности -галактозидаз дрожжей Sch.
pombe, D. hansenii и P. guilliermondii сильно отличались от белков MEL дрожжей клады "Saccharomyces": уровень сходства в среднем составляет 49%.
В свою очередь наиболее близкими являются -галактозидазы дрожжей D.
hansenii и P. guilliermondii, которые идентичны на 69%. Их сходство с галактозидазой MELm Sch. pombe не превышает 57%.
Мы сравнили полученные результаты с данными филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей домена D1/D2 26S рРНК дрожжей клады "Saccharomyces", а именно родов Lachancea, Saccharomyces, Torulaspora и Zygotorulaspora. В филогенетический анализ были также включены типовые культуры Sch. pombe, D. hansenii и P. guilliermondii. На филогенетическом древе, построенном на основании нуклеотидных последовательностей домена D1/D2 все исследованные дрожжи разделились на две основные подгруппы (рис. 12B). В первую со 100%-ной поддержкой вошли все представители клады "Saccharomyces". Внутри этой группы можно выделить два кластера. В первом кластере объединены виды рода Saccharomyces. Наиболее дивергентным представителем этого рода является S. bayanus, который вместе с гибридными дрожжами S. pastorianus сформировал отдельную подгруппу. Наиболее филогенетически близкими являются S. cerevisiae, S. paradoxus и S. cariocanus.
К первому кластеру примыкают дрожжи T. delbrueckii и Z. mrakii. Второй кластер включает 8 видов Lachancea. В этом кластере с 95%-ной поддержкой выделяются две подгруппы. Одна включает виды L. meyersii, L. dasiensis, L.
waltii, Lachancea sp. и L. thermotolerans, а вторая L. cidri и L. fermentati. Дрожжи L. kluyveri занимают отдельное положение в этом кластере.
А В Рис. 12. Филогенетический анализ аминокислотных последовательностей галактозидаз (A) и нуклеотидных последовательностей домена D1/D2 (B) дрожжей клады "Saccharomyces".
.
Вторую группу составили относящиеся к кладе Debaryomyces/ Lodderomyces дрожжи P. guilliermondii и D. hansenii (значение индекса бутстрепа – 100%). Наиболее дивергентной является последовательность домена D1/D2 дрожжей Sch. pombe.
В общем виде топологии филогенетических деревьев по аминокислотным последовательностям -галактозидаз и нуклеотидным последовательностям домена D1/D2 26S рРНК совпадают. На обоих деревьях дрожжи клады "Saccharomyces" со 100%-ной достоверностью выделяются в отдельную группу.
Это указывает на общее эволюционное происхождение -галактозидазных генов дрожжей Lachancea, Saccharomyces, Zygotorulaspora и Torulaspora.
Биологический вид S. bayanus является самым дивергентным в роде Saccharomyces по результатам филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей домена D1/D2 и аминокислотных последовательностей галактозидаз (рис. 12). На обоих деревьях дрожжи T. delbrueckii и Z. mrakii примыкают к дрожжам рода Saccharomyces. В то же время филогения галактозидаз не во всем совпадает с филогенией рибосомальных генов. На филогенетическом древе, построенном на основании сравнения нуклеотидных последовательностей домена D1/D2, дрожжи S. paradoxus являются наиболее близкородственным видом дрожжам S. cerevisiae. На близкое генетическое родство этих видов указывают и другие молекулярные данные (Naumova et al., 2003;
Kellis et al., 2003;
Kurtzman, 2003). Однако, на филогенетическом древе, построенном по результатам анализа последовательностей -галактозидаз дрожжи S. paradoxus занимают отдельное положение (рис. 12A).
Другое несоответствие топологий двух филогенетических деревьев касается дрожжей L. cidri и L. fermentati. На филогенетическом древе, построенном по результатам сравнения нуклеотидных последовательностей домена D1/D2, эти виды со 100%-ной достоверностью выделяются в отдельную подгруппу в кластере, образованном дрожжами Lachancea (рис. 12B). Однако, согласно сравнительному анализу аминокислотных последовательностей галактозидаз, дрожжи L. fermentati более родственны дрожжам Lachancea sp. и L. thermotolerans, чем L. cidri (рис. 12A). Белок MELf1 дрожжей L. fermentati идентичен с белками MELs1-MELs3 и MELh на 93-94%, тогда как его сходство с белками MELz1-MELz3 дрожжей L. cidri только 76%.
Наиболее существенным отличием двух типов филогений является положение на филогенетических деревьях дрожжей L. kluyveri. В отличие от других видов Lachancea, эти дрожжи сформировали отдельный кластер на филогенетическом древе, построенном по данным сравнительного анализа аминокилотных последовательностей -галактозидаз (рис. 12A).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ Проведенный нами молекулярный анализ указывает на близкое генетическое родство изученных штаммов Lachancea. На основании сравнительного анализа рибосомальных последовательностей и молекулярного кариотипирования обнаружен новый вид Lachancea sp., близкородственный дрожжам L. thermotolerans и обладающий способностью ферментировать мелибиозу.
На материале штаммов различного экологического и географического происхождения изучены видовые особенности геномов дрожжей Lachancea.
Кариотипический анализ выявил значительный полиморфизм размеров хромосом у дрожжей Lachancea. Хромосомная ДНК большинства штаммов разделилась на восемь электрофоретических полос. Таким образом, все виды рода Lachancea, по-видимому, имеют одинаковое гаплоидное число хромосом равное 8. Это указывает на эволюционное родство дрожжей L. thermotolerans, L. cidri, L. fermentati, L. kluyveri, L. meyersii, L. waltii и Lachancea sp. Кариотипы всех указанных видов содержат хромосомную полосу размером около т.п.н. Однако, в отличие от дрожжей Saccharomyces, предельные размеры хромосом у разных видов Lachancea существенно отличаются. Это может свидетельствовать о различных размерах геномов изученных видов.
Наибольший размах размеров хромосомных полос отмечен у штаммов L. cidri (от 400 до 2800 т.п.н.), а наименьший – у L. waltii (от 1400 до 2800 т.п.н.).
Поскольку диапазон размеров хромосомных полос практически одинаков у штаммов одного вида, этот признак является видоспецифичным.
Помимо межвидовых различий кариотипических профилей, у ряда видов Lachancea мы обнаружили внутривидовой полиморфизм размеров хромосомных полос. Почти каждый из изученных штаммов L. thermotolerans, L.
fermentati и L. cidri имеет уникальный паттерн. В то же время, независимо от кариотипического профиля, штаммы одного вида имеют практически идентичные ITS1 и ITS2 последовательности. Например, гомогенные по молекулярным кариотипам дрожжи L. kluyverii оказались наиболее полиморфными по ITS-последовательностям: до 3 нуклеотидных замен.
Изменчивость размеров индивидуальных хромосом у дрожжей Lachanceа подтверждает большую динамичность дрожжевых хромосом, обнаруженную при сравнительном анализе полных геномов S. cerevisiae и других видов.
Помимо дупликации всего генома, в ходе эволюции дрожжей S. cerevisiae происходили множественные дупликации отдельных хромосом, коротких сегментов хромосом и отдельных генов, а также массовая потеря около 90% дуплицированных генов, в основном, за счет небольших делеций (Wolfe, Shields, 1997;
Langkjr et al., 2000;
Pikur, Langkjr, 2004). Крупные хромосомные перестройки (реципрокные транслокации), обнаруженные у дрожжей Saccharomyces, вызывают значительное снижение фертильности межвидовых гибридов и, вероятно, являются одной из причин репродуктивной изоляции и образования новых биологических видов (Naumov et al., 2000;
Delneri, 2003). Известно, что реципрокные транслокации способны индуцировать образование мультивалентов во время мейоза и приводить при расхождении хромосом к частому формированию анеуплоидных гамет, снижающих фертильность гибридов. В процессе эволюции у дрожжей Lachancea, по-видимому, сохранилось предковое количество хромосом, равное 8. Обнаруженная нами вариабельность кариотипов может быть результатом различных хромосомных перестроек (дупликаций и делеций коротких сегментов хромосом или отдельных генов, реципрокных транслокаций и др.), происходивших в процессе эволюции дрожжей Lachancea.
Известно, что субтеломерные районы хромосом представляют собой наиболее пластичную часть генома, которая обеспечивает приспособляемость дрожжей к различным условиям среды. В субтеломерных районах хромосом дрожжей локализованы различные мультигенные семейства, такие как семейства генов, контролирующих ферментацию различных сахаров: мальтозы, сахарозы, мелибиозы и др. (Mortimer et al., 1992). Особый интерес представляют -галактозидазные гены ферментации мелибиозы, которые широко представлены у мицелиальных грибов, растений и животных, но довольно редко встречаются у аскомицетовых дрожжей. Сбраживающие мелибиозу штаммы обнаружены у четырех из 14 родов клады "Saccharomyces":
Lachancea, Saccharomyces, Zygotorulospora и Torulospora. Из восьми видов рода Lachancea штаммы Mel+ не известны только у L. meyersii и L. waltii. Среди дрожжей L. thermotolerans и L. fermentati нами обнаружены как штаммы, способные сбраживать мелибиозу, так и штаммы, негативные по этому признаку. Подобно дрожжам S. cerevisiae, не сбраживающие мелибиозу штаммы Lachancea не содержат даже молчащей последовательности MEL.
Саузерн-гибридизация показала, что Mel+-штаммы S. bayanus, S. mikatae, S.
paradoxus и L. kluyveri имеют только по одной копии гена MEL и не накапливают их как некоторые популяции S. cerevisiae. В то же время, обнаружены полимерные гены MEL у дрожжей L. cidri, Lachancea sp. и у некоторых штаммов L. fermentati. Молекулярно-генетическое изучение дрожжей Saccharomyces не европейского происхождения позволило впервые обнаружить у S. paradoxus полимерные гены MELр1 и MELр2, имеющие 98.7% сходства и расположенные, соответственно, в хромосомах X и VI.
Сравнительный анализ -галактозидаз дрожжей Lachancea показал, что уровень их сходства внутри одного вида составляет 94–100%, а у разных видов 68–86%.
Сравнительный филогенетический анализ -галактозидаз аскомицетовых дрожжей свидетельствует о видоспецифичности генов MEL дрожжей клады "Saccharomyces". В общем виде топологии филогенетических деревьев, построенных на основании аминокислотных последовательностей галактозидаз и нуклеотидных последовательностей домена D1/D2 26S рРНК совпадают. На обоих деревьях дрожжи клады "Saccharomyces" со 100%-ной достоверностью выделяются в отдельную группу от дрожжей не входящих в эту кладу. Это указывает на общее эволюционное происхождение галактозидазных генов дрожжей Lachancea, Saccharomyces, Zygotorulaspora и Torulaspora. В то же время филогения -галактозидаз не во всем совпадает с филогенией рибосомальных генов. Наиболее существенным отличием двух типов филогений является положение дрожжей L. kluyveri, которые сформировали отдельный кластер на филогенетическом древе, построенном по данным сравнительного анализа аминокилотных последовательностей галактозидаз. Следует отметить, что дрожжи L. kluyveri достаточно сильно отличаются от остальных видов рода Lachancea по ряду молекулярных и физиологических признаков (Kurtzman, 2003) и могут относиться к отдельному роду, родственному дрожжам Lachancea.
ВЫВОДЫ 1. Впервые проведен сравнительный анализ геномов дрожжей Lachancea.
Кариотипический анализ показал, что все 8 видов рода Lachancea имеют одинаковое гаплоидное число хромосом равное 8.
2. Выявлен значительный внутривидовой и межвидовой полиморфизм кариотипов дрожжей рода Lachancea. Наибольший размах размеров хромосомных ДНК отмечен у штаммов L. cidri (от 400 до 2800 т.п.н.), а наименьший – у L. waltii (от 1400 до 2800 т.п.н.).
3. С помощью молекулярного кариотипирования и анализа последовательностей генов рРНК обнаружен новый вид Lachancea sp., близкородственный дрожжам L. thermotolerans.
4. Впервые изучены -галактозидазные гены MEL у дрожжей рода Lachancea. Обнаружены полимерные гены MEL у L. fermentati, L. cidri и Lachancea sp.
5. Молекулярно-генетическим анализом у дрожжей S. paradoxus выявлены полимерные гены MELp1 и MELp2, которые картированы, соответственно, в хромосомах X и VI.
6. Сравнительный филогенетический анализ -галактозидаз клады “Saccharomyces” свидетельствует о родовой и видовой специфичности генов MEL аскомицетовых дрожжей.
Список работ, опубликованных по теме диссертации:
1. Наумова Е.С., Серпова Е.В., Наумов Г.И. Видообразование у дрожжей Lachancea thermotolerans: молекулярно-генетические данные // ДАН.
2005. Т. 405. №5. С. 711–714.
2. Наумов Г. И., Серпова Е. В., Наумова Е. С. Генетически изолированная популяция Saccharomyces cerevisiae в Малайзии // Микробиология. 2006. Т 75. №2. С. 245–249.
3. Наумова Е.С., Серпова Е.В., Коршунова И.В., Наумов Г.И.
Молекулярно-генетические особенности дрожжей Lachancea kluyveri // Микробиология, 2007, T. 76. №3. С. 361–368.
4. Наумова Е.С., Серпова Е.В., Наумов Г.И. Молекулярная систематика дрожжей рода Lachancea // Биохимия, 2007. T. 72. № 12. С. 1659– 1667.
5. Серпова Е.В., Наумова Е.С., Наумов Г.И.. Системный подход в идентификации дрожжей Saccharomyces // Материалы международной школы конференции молодых ученых “Системная биология и биоинженерия”, ноября – 2 декабря 2005, Москва, Россия, С. 116.
6. Наумова Е. С., Серпова Е. В., Наумов Г. И. Молекулярный анализ дивергентных штаммов Kl. thermotolerans // Материалы III-го Съезда ВОГиС "Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития", 6– июня 2004, Москва, Россия, С. 399.
7. Ivannikova Yu.V., Serpova E.V. Comparative genomics of species Saccharomyces // In: Systems Biology of Yeasts – from Models to Applications, 25th International Specialised Symposium on Yeasts (ISSY25), June 18-21, 2006, Hanasaari, Espoo, Finland, P. 83.
8. Serpova E.V., Naumova E.S., Naumov G.I. Evolutionary systematics of Lachancea yeasts // Book of abstracts. 12th International Congress on Yeasts (ICY2008), August 11–15, 2008, Kyiv, Ukraine, P. 25.
9. Серпова Е.В., Наумова Е.С., Наумов Г.И. Эволюционная динамика хромосомных областей генома дрожжей Saccharomyces // Материалы V-го съезда ВОГиС "200 лет со дня рождения Дарвина", 21–28 июня 2009, Москва, Россия, С. 46.