Структурно-функциональные различия hms-областей геномов yersinia pestis и yersinia pseudotuberculosis
На правах рукописи
СУХОНОСОВ Илья Юрьевич
СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ РАЗЛИЧИЯ HMS-ОБЛАСТЕЙ
ГЕНОМОВ YERSINIA PESTIS И YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS
03.00.07 – микробиология
03.00.15 – генетика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание учной степени
кандидата медицинских наук
Саратов – 2008 2
Работа выполнена в ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Научные руководители:
член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор Кутырев Владимир Викторович кандидат медицинских наук Булгакова Елена Германовна
Официальные оппоненты доктор биологических наук, профессор Смирнова Нина Ивановна кандидат медицинских наук, доцент Пронина Елена Александровна
Ведущая организация: ФГУЗ «Иркутский ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока»
Защита состоится «_»_2009 г. в _ часов на заседании диссертационного совета Д.208.078.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» (410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46).
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»»
Автореферат разослан «_»_2009 г.
Учный секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, старший научный сотрудник Слудский А.А.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Три патогенных для человека вида иерсиний – Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis и Yersinia enterocolitica вызывают разные по тяжести и эпидемической значимости заболевания. Возбудитель чумы вызывает быстротечное заболевание с генерализацией процесса и летальным исходом и явился причиной нескольких пандемий, унесших миллионы человеческих жизней. Два других вида микроорганизмов вызывают энтериты разной степени тяжести.
Патогенные штаммы всех трех видов содержат ведущие факторы вирулентности:
хромосомную область пигментации (pgm) и плазмиду кальцийзависимости (pCad). У возбудителей чумы и псевдотуберкулеза эти генетические структуры имеют высокую степень гомологии, но при этом выявлены небольшие как видовые, так и внутривидовые различия в их структурной организации и фенотипическом проявлении. Учитывая исключительную важность этих детерминант для проявления вирулентных свойств микробов, выявление и характеристика даже небольших структурных и функциональных различий может приблизить нас к пониманию причин высокой патогенности возбудителя чумы, поможет в разработке систем молекулярного типирования и идентификации этого патогена. Основные сведения о структуре и функциональной активности ведущих детерминант патогенности получены на зарубежных штаммах. Однако на территории стран СНГ существует природных очага чумы, в которых циркулируют различающиеся по фенотипу и вирулентности штаммы. Исследование геномов этих штаммов находится на начальном этапе. Поэтому сравнительное изучение структурно-функциональной организации детерминант патогенности штаммов разного происхождения с неодинаковой эпидемической значимостью и штаммов псевдотуберкулезного микроба, особенно О1 серотипа - наиболее близкой к чумному микробу эволюционной ветви, будет еще долгое время актуальным.
Область pgm Yersinia pestis (102 т.п.н.) состоит из двух регионов: «острова высокой патогенности» - оперона сидерофорзависимой системы утилизации железа и hms региона, обеспечивающего сорбцию гемина на поверхности микробной клетки [Fetherston et al., 1992]. Оба региона участвуют в обеспечении чумного микроба необходимым для жизни микроэлементом – железом. «Острова высокой патогенности» у иерсиний высококонсервативны. Гены, расположенные на «острове высокой патогенности», не кодируют белки агрессии, но необходимы для выживания и нормального размножения в организме теплокровных животных [Kutyrev V.V. et al., 1992;
Heesemann et al., 1993].
Регион hms включает три функциональные области: кластер генов мембранных белков, hms оперон и ast оперон, отвечающий за утилизацию аргинина.
Экспрессию hms генов, обеспечивающих сорбцию гемина, связывают со способностью чумного микроба к образованию блока преджелудка у блох и относят к факторам, способствующим трансмиссивному пути передачи патогена [Hinnebusch, B.J., R.D. Perry, T.G. Schwan, 1996]. В настоящее время основным биологическим свойством, детерминируемым этим регионом считается образование биопленки, способствующей блокообразованию. Интересно, что биопленку образуют как штаммы чумного, так и штаммы псевдотуберкулезного микроба, но способность блокировать преджелудок блох отмечается только у штаммов чумного микроба.
Причины этого пока не ясны. Штаммы биоваров orientalis, medievalis, antiqua и microtus в зависимости от географического происхождения имеют некоторые различия в структурной организации pgm области, что выражается в различной стабильности признаков пигментации (Hms) и чувствительности к пестицину (Psn), ассоциированных с pgm областью, а также в различных типах мутаций по этим признакам [Itemah, et al., 1993]. У штаммов псевдотуберкулезного микроба выявлены структурные особенности pgm области, отличающие их от классических штаммов чумного микроба, но сближающих со штаммами биовара microtus с ослабленной вирулентностью. Примером этого может служить отсутствие IS100 элемента, ограничивающего pgm область со стороны hms оперона, приводящее к отсутствию образования pgm мутантов, у штаммов псевдотуберкулезного микроба [Buchriesier et al., 1998] и авирулентных для человека штаммов биовара microtus [Zhou et al., 2004]. В то время как, у высоковирулентных штаммов биоваров orientalis, medievalis и antiqua pgm область фланкирована двумя IS100 элементами, вызывающими рекомбинационный процесс с утратой всей области [Portnoy, Falkow, 1981;
Fetherston et al., 1992].
Штаммы чумного микроба пяти подвидов: основного и неосновных – кавказского, алтайского, гиссарского, улэгейского и таласской группы, циркулирующие на территории стран СНГ и Монголии, имеют фенотипические различия, связанные с генами pgm области. Штаммы неосновных подвидов редко образуют Hms- мутанты (10-7). Штаммы основного подвида образуют такие мутанты в результате делеции всей области пигментации с частотой 10-5 [Зудина И.В., 2000].
Cтруктурная организация hms региона штаммов основного и неосновных подвидов чумного микроба не изучена. Выявление областей вариабельных для чумного микроба разных подвидов и псевдотуберкулезного микроба с одной стороны, даст новые сведения об эволюции патогенных иерсиний, с другой стороны, послужит основой при разработке тест-систем для идентификации и молекулярного типирования этих патогенов. С этой точки зрения представляется важным провести видовое и внутривидовое сравнительное изучение структурной организации hms региона у штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов.
Цель работы - провести сравнительный структурно-функциональный анализ hms – областей Yersinia pestis и Yersinia pseudotuberculosis.
Задачи исследования:
Подобрать и охарактеризовать штаммы чумного и 1.
псевдотуберкулезного микробов разного происхождения по основным признакам, ассоциированным с вирулентностью, и их генетическим детерминантам. Создать коллекцию штаммов Yersinia pestis и Yersinia pseudotuberculosis для сравнения хромосомного сегмента пигментации.
Выявить и охарактеризовать вариабельные области на сегменте 2.
пигментации для штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов разного происхождения с помощью метода ПЦР.
Определить и сравнить нуклеотидные последовательности hms 3.
оперонов и вариабельных концевых частей сегмента пигментации (ген порина) у штаммов чумного и псевдотуберкулезного микроба разного происхождения.
Разработать экспериментальную ПЦР систему для дифференциации 4.
вирулентных и авирулентных штаммов чумного микроба разного происхождения и для выявления авирулентных штаммов (клонов), утративших область пигментации.
Установить механизмы Hms- Psn- мутаций у вакцинного штамма Yesinia 5.
pestis EV линии НИИЭГ.
Научная новизна работы Выявлены видовые и внутривидовые различия в стабильности сохранения признаков, ассоциированных с детерминантами вирулентности (pgm областью и pCad) у штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов. Установлено, что частота мутаций по Hms, Psn и Cad признакам у штаммов псевдотуберкулезного микроба на два – четыре порядка выше, чем у штаммов чумного микроба. Эти данные свидетельствуют о том, что у штаммов чумного микроба в процессе эволюции произошла стабилизация основных детерминант вирулентности – генов области пигментации и плазмиды pCad. Обнаружена группа штаммов чумного микроба основного подвида с частотой мутаций по Hms признаку, характерной для штаммов неосновных подвидов. Показано, что снижение частоты и тип мутаций по Hms признаку у этой группы штаммов связаны со структурными особенностями краевого региона области пигментации – отсутствием одного из фланкирующих IS100 элементов. Впервые было показано, что у штаммов псевдотуберкулезного микроба О1 и О3 серотипа к Psn- фенотипу приводят разные типы мутаций. Впервые выявлены и охарактеризованы штаммы псевдотуберкулезного микроба О1 серотипа с областью пигментации, фланкированной IS100 элементами. Установлено, что ориентация IS100 элемента и сайт встраивания его в ген порина, различны у штаммов чумного микроба основного подвида и группы штаммов псевдотуберкулезного микроба О1 серотипа. Впервые установлено, что концевая часть области пигментации штаммов псевдотуберкулезного микроба О3 серотипа не содержит последовательности гена порина и гена сукцинилглютаматдесукцинилазы aruE аргининового оперона.
Впервые выявлены четыре области перспективные для разработки системы типирования методом мультилокусного секвенирования вариабельные для штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов. Три из них расположены в межгенных пространствах и одна - в области гена порина (YPO1967). Впервые выявлена область, проявляющая для чумного микроба вариабельность на видовом и подвидовом уровнях. Эта область локализована между генами hutG и YPO1967.
Получены новые сведения о высокой консервативности нуклеотидных последовательностей hms оперонов у штаммов чумного микроба пяти подвидов и таласской группы, что свидетельствует о важной биологической роли этой структуры.
Впервые на молекулярно-генетическом уровне получены доказательства делетирования области пигментации у вакцинного штамма Yersinia pestis EV линии НИИЭГ и его лабораторных вариантов, а, следовательно, невозможности спонтанной реверсии вирулентных свойств.
Практическая значимость работы По результатам работы получены патенты на изобретения зарегистрированные в государственном реестре интеллектуальной собственности Российской Федерации: «Способ определения утраты вирулентности штаммами чумного микроба вследствие потери области пигментации» №2288275 и «Способ дифференциации чумного и псевдотуберкулзного микробов с одновременной внутривидовой дифференциацией штаммов чумного микроба» №2332464.
Составлены методические рекомендации: «Способ дифференциации авирулентных вследствие потери области пигментации и потенциально вирулентных штаммов (клонов) чумного микроба», «Выделение и очистка геномной ДНК Yersinia pestis, пригодной для тонких молекулярно-биологических экспериментов», «Мультиплексная ПЦР для дифференциации вирулентных и авирулентных штаммов Yersinia pestis разного происхождения», одобренные Учным советом Российского научно-исследовательского противочумного института «Микроб» (протокол №1 от 16.03.2007г., протокол №2 от 17.04.2007г., протокол №5 от 22.06.2007г. соответственно) и утвержденные директором Российского научно исследовательского противочумного института «Микроб» по учрежденческому уровню внедрения.
Основные положения, выносимые на защиту Создана коллекция штаммов чумного и псевдотуберкулезного 1.
микробов, пригодная для проведения сравнительного анализа их hms областей.
Возбудители чумы и псевдотуберкулеза имеют выраженные отличия по 2.
частоте наследования основных признаков, связанных с вирулентностью. Частота потери этих признаков в 100 – 1000 раз выше у штаммов псевдотуберкулезного микроба, чем у штаммов чумного микроба.
Структурная организация сегмента пигментации (hutG – YPO 3.
регион) у штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов имеет существенные видовые и внутривидовые различия. Выявлены четыре вариабельные области, которые могут быть использованы для усовершенствования методов идентификации и типирования штаммов чумного микроба.
Области пигментации у штаммов псевдотуберкулезного микроба О 4.
серотипа содержат полноценный ybt регион. Psn- мутанты у штаммов псевдотуберкулезного микроба образуются в результате трех типов мутаций.
Разработанные экспериментальные ПЦР системы пригодны для 5.
дифференциации вирулентных и авирулентных штаммов чумного микроба и для выявления авирулентных штаммов, утративших область пигментации.
Вакцинный штамм Yersinia pestis EV линии НИИЭГ утратил область 6.
пигментации, что исключает у него спонтанную реверсию вирулентности.
Апробация работы Материалы диссертации представлены и доложены на ежегодных итоговых конференциях РосНИПЧИ «Микроб» (Саратов, 2005, 2006 и 2007 гг.), а так же на конференции «Молодые учные в медицине», (IX Всероссийская научно практическая конференции Молодые учные в медицине посвящнная 190-летию Казанского государственного медицинского университета, Казань 2004г.) и симпозиуме «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития», Москва 2004г. Выступления на конференциях (Казань, 2004 и Москва, 2004) были высоко оценены оргкомитетами с присуждением дипломов за лучший доклад. Так же результаты исследования были представлены на следующих конференциях: II Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием, «Инфекции, обусловленные иерсиниями» Санкт-Петербург 2006;
IX съезд Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов Москва 2007;
VI Всероссийского научно-практическая. конференция Москва 2007;
X Всероссийская медико-биологическая конференция молодых исследователей «Человек и его здоровье» Санкт-Петербург, 2007;
VIII Межгосударственная научно-практическая конференции государств участников СНГ Саратов 2007;
Экофорум Санкт-Петербург 2008, IX Межгосударственная научно практическая конференция государств участников СНГ Волгоград, 2008.
Публикации По теме диссертации опубликовано 17 печатных работ, одна - в изданиях рекомендованных ВАК и две оформлены в виде патентов на изобретения «Способ определения утраты вирулентности штаммами чумного микроба вследствие потери области пигментации» №2288275 и «Способ дифференциации чумного и псевдотуберкулзного микробов с одновременной внутривидовой дифференциацией штаммов чумного микроба» №2332464.
Структура и объём диссертации Диссертация представлена на 201 странице машинописного текста, состоит из введения, главы обзора литературы, пяти глав собственных исследований (в т.ч., одной главы с описанием материалов и методов), заключения и выводов. Работа иллюстрирована 17 таблицами и 40 рисунками. Библиографический указатель содержит 208 отечественных и зарубежных источников.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы. Работа выполнена на 67 штаммах Yersinia pestis и 68 штаммах Yersinia pseudotuberculosis. Для работы были отобраны типичные (в соответствии с классификацией, принятой на Совещании по таксонамии и номенклатуре чумного микроба в Саратове в 1985г.) штаммы основного, алтайского, гиссарского, кавказского, улэгейского подвидов и таласской группы из соответствующих природных очагов чумы, а так же вакцинные и экспериментальные штаммы.
Штаммы Yersinia pseudotuberculosis представлены в основном группами О1 и О серотипов. Все штаммы получены из ГКПБ «М» 1 РосНИПЧИ «Микроб». Штамм Yersinia pestis EV линии НИИЭГ получен из лаборатории препаратов против чумы и других ООИ ФГУН ГИСК им. Л.А. Тарасевича.
Методы Микробиологические методы Исследование свойств возбудителя чумы проводили согласно рекомендациям «Руководства по профилактике чумы» [1992].
Для выращивания и определения фенотипических признаков использовали следующие среды:
-культивирование микроорганизмов осуществляли на агаре LB;
-признак пигментации (Hms) у штаммов чумного и псевдотуберкулзного микробов определяли, высевая взвесь односуточной агаровой культуры исследуемого штамма на поверхность полусинтетической среды с Конго красным (среда Hmsd);
-признак кальцийзависимости определяли по методике Higuchi K. и Smith J.
[1961];
-определение чувствительности к пестицину (Psn) проводили методом отсроченного антагонизма [Fredericq, 1957].
Генетические методы Скрининг плазмидной ДНК осуществляли по методике Kado C. и Liu S.-T.
[1981].
Анализ геномов микроорганизмов проводили с использованием нуклеотидных последовательностей генетической базы данных NCBI GenBank, программы Mega, Государственная коллекция патогенных бактерий «Микроб»
алгоритма BLAST. Подбор праймеров осуществляли с помощью программ DNAMAN и PrimerExpress. Аминокислотную последовательность и вторичную структуру порина определяли с помощью программы DNAMAN.
Праймеры синтезировали фосфоамидитным методом на автоматическом синтезаторе ДНК " ASM-800" (ТОО "Биоссет", Россия).
Подготовку препаратов ДНК тестируемых штаммов проводили по схеме описанной в Методических указаниях МУ 3.5.5.-1034-01 «Обеззараживание исследуемого материала, инфицированного бактериями I-IV групп при работе методом ПЦР».
Полимеразную цепную реакцию проводили в микропробирках объемом 0,6 мл на программируемых термоциклерах Терцик МС 2 ("ДНК-технология", Россия) и БИС-2 ("Вектор", Россия).
Продукты ПЦР анализировали методом электрофореза в 0,9 – 1,8 %-ном агарозном и 5% полиакриламидном гелях, который выполняли в соответствии с рекомендациями, изложенными в руководствах Т. Маниатиса с соавт. [1984]. Для документирования полученных результатов гели сканировали с помощью системы "GelDoc 2000" ("BioRad",ClllA).
Секвенирование полученных в ПЦР ампликонов проводили на автоматическом секвенаторе «ABI PRISM® 3100 Genetic Analyzer».
Результаты исследований 1.Характеристика коллекции штаммов чумного и псевдотуберкулёзного микробов разного происхождения по признакам, ассоциированным с основными детерминантами вирулентности Для изучения вариабельности hms сегмента хромосомной области пигментации у двух патогеных видов иерсиний был проведен подбор штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов разного происхождения. В коллекцию вошли 47 штаммов чумного микроба пяти подвидов (основного, гиссарского, алтайского, кавказского, улэгейского) и таласской группы, циркулирующих на территории стран бывшего СНГ и Монголии и 68 штаммов псевдотуберкулезного микроба различных серотипов, выделенных с 1926 по 1986 г.г., в разных географических регионах. Коллекция штаммов чумного микроба включает представителей из очагов всех типов: сусликового, сурочьего, песчаночьего, пищухового и полевочьего. Коллекция штаммов псевдотуберкулезного микроба представлена двумя группами штаммов – О1 серотипа – близкой к чумному микробу эволюционной ветви и О3 серотипа, включающей «бадхызские» штаммы, таксономическое положение которых долгое время оставалось неясным и высказывались предположения об их принадлежности к виду Y. pestis. Все штаммы были проверены по признакам, коррелирующим с вирулентностью: признаку пигментации, чувствительности к пестицину (для штаммов кавказского подвида и штаммов псевдотуберкулезного микроба), зависимости роста от ионов кальция при температуре 37 °C и плазмидному составу. Для изучения признака пигментации у штаммов псевдотуберкулезного микроба была модифицирована среда Hmsd, так как на оригинальной среде штаммы псевдотуберкулезного микроба вырастали очень быстро и дифференциация Hms+ и Hms- клонов была не четкой или отсутствовала.
Сравнение экспериментальных данных по фенотипу, плазмидному скринингу и ПЦР – анализу hms оперона и ybt региона свидетельствует о том, что основные генетические детерминанты вирулентности – гены области пигментации и плазмида кальцийзависимости у штаммов чумного микроба проявляют более высокую степень стабильности, чем у штаммов псевдотуберкулезного микроба.
У штаммов чумного микроба основного подвида по признакам пигментации и чувствительности к пестицину наблюдается частота мутаций 10-3 - 10-5. Их совместная утрата происходит в результате делеции области пигментации. Нами выявлена небольшая группа штаммов основного подвида из очагов песчаночьего типа с низкой частотой мутаций по Hms признаку, такой же, как и у штаммов всех неосновных подвидов и таласской группы. Мутанты по Hms признаку у этих штаммов образуются с частотой 10-7 - 10-9. Однако причины, приводящие к появлению таких мутантов, нами не установлены. Появление Psn– мутантов у штаммов кавказского подвида происходит с частотой 10-9. По данным Hare [1999] у штамма биовара medievalis KIM неохарактеризованные повреждения каждого из генов hms оперона появляются с частотой в сорок раз меньшей, чем делеции области пигментации, а повреждения psn гена с частотой 10-7. Как видим, внутригенные мутации hms оперона и ybt региона достаточно редкое событие для штаммов чумного микроба.
Штаммы псевдотуберкулезного микроба обладают слабой выраженностью признака пигментации. Они легко утрачивают Hms и Psn признаки в лабораторных условиях. У штаммов псевдотуберкулезного микроба непигментированные и нечувствительные к пестицину клоны образуются в результате независимых мутаций в области hms оперона и ybt региона. Штаммы псевдотуберкулезного микроба утрачивают признак пигментации с частотой 10-1 до 10-2, в результате неидентифицированных нами мутаций (вероятно, точечных или небольших по протяженности). Наиболее частым (10-3) типом мутаций в области ybt региона также являются неидентифицированные нами мутации (вероятно, точечные или небольшие по протяженности). Двадцать шесть из сорока семи резистентных к пестицину штаммов не обнаружили повреждений при ПЦР скрининге генов ybt региона.
Дополнительно у штаммов О1 серотипа образование резистентных к пестицину клонов происходит в результате утраты всего ybt региона, а у штаммов О3 серотипа с частотой 10-5 – в результате протяженных делеций, захватывающих psn ген. Как видно из приведенных результатов, гены области пигментации штаммов псевдотуберкулезного микроба в большей степени подвержены мутациям, приводящим к потере Hms и Psn признаков, чем гены штаммов чумного микроба.
Более того, характер мутационных процессов, затрагивающих, большие участки этой области у штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов различны.
Для второй обязательной детерминанты вирулентности - pCad также выявлены различия в стабильности сохранения плазмиды и признака кальциийзависимости у штаммов чумного и псевдотуберкулезного микроба. Среди исследованных штаммов чумного микроба обнаружены лишь единичные, лишенные плазмиды pCad. Штаммы псевдотуберкулезного микроба легко утрачивают как признак кальцийзависимости, так и плазмиду pCad при культивировании и хранении на искусственных питательных средах (более половины изначально вирулентных исследованных нами штаммов лишены плазмиды pCad). При этом утрата признака кальцийзависимости у штаммов псевдотуберкулезного микроба происходит не только при элиминации плазмиды, но и при нарушении ее структуры.
Все вышесказанное свидетельствует об эволюционном процессе стабилизации основных детерминант вирулентности: области пигментации и плазмиды pCad у патогенных иерсиний. Вероятно, этот факт оказался важным при освоении новых экологических ниш чумным микробом и способствовал увеличению его патогенности.
2.Генетические вариации региона hutG–YPO1950 области пигментации у штаммов чумного и псевдотуберкулёзного микробов разного происхождения 2.1.Тактика поиска и выявление различий в регионе hutG-YPO1950 у штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов разного происхождения Изучение структурной организации области hutG-YPO1950 у штаммов чумного микроба разных подвидов и псевдотуберкулезного микроба проведено в несколько этапов. На первом этапе необходимо было выявить вариабельные области региона методом ПЦР скрининга ДНК типичных штаммов чумного микроба пяти подвидов и таласской группы. На втором этапе проведен ПЦР анализ аллелей вариабельных областей на 47 штаммах чумного микроба и 68 штаммах псевдотуберкулезного микроба разного происхождения. На третьем этапе два региона, важные для экспрессии признака пигментации, – сравнили у типичных штаммов иерсиний методом определения нуклеотидных последовательностей. На последнем этапе, на базе полученных новых сведений о структурной организации hutG-YPO1950 региона чумного и псевдотуберкулезного микробов, осуществлена разработка экспериментальных ПЦР систем для дифференциации вирулентных и авирулентных штаммов чумного микроба.
На основе нуклеотидной последовательности генома штамма CO92 биовара Orientalis (AL590842), депонированной в GenBank [Buchrieser et al., 1999] рассчитаны 59 пар праймеров на гены hutG-YPO1950 региона.
Для сравнения структурной организации области hutG-YPO1950 выбраны типичных штаммов разных подвидов - два штамма основного подвида: 231(708) (Аксайский высокогорный очаг, серый сурок), КМ 803 (А-1822) (Кызылкумский пустынный очаг, от блохи из норы большой песчанки);
штаммы неосновных подвидов - два штамма алтайского подвида: КМ 683 (И-2359) (монгольская пищуха), И-3086 (полевка Брандта);
штамм улэгейского подвида – И-3069 (полевка Брандта);
штамм гиссарского подвида – А-1249 (арчевая полевка);
штамм кавказского подвида – 1146 (обыкновенная полевка);
штамм таласской группы – А-1802 (21/10) (блохи мыши полевки). В выборке присутствуют два штамма основного подвида, представляющие группы с высокой (10-5) и низкой (10-7) степенью частоты Hms мутаций (231(708) и КМ 803 (А-1822) штаммы соответственно). Двумя штаммами из разных очагов представлен и алтайский подвид. Штамм КМ 683 (И-2359) – выделен в Алтайском горном очаге пищухового типа, а штамм И-3086 – в аймаке Убурхангай (Монголия) с основным носителем – полевкой Брандта.
При ПЦР скрининге ДНК типичных штаммов чумного микроба подавляющее большинство ампликонов, образованных одноименными праймерами не различались по подвижности в агарозном геле. Выявлены только четыре четко различающиеся по размеру области у штаммов чумного микроба разного происхождения (Рисунок 1).
Рисунок 1. Вариабельные области hutG–YPO1950 региона у штаммов Yersinia pestis разного происхождения Ярко выраженные внутривидовые отличия обнаружены в области гена порина YPO1967 (вариабельная область 3). Это проявилось в нарушении гена вставкой IS100 у штаммов биоваров orientalis, medievalis, antiqua и у штамма основного подвида из Аксайского высокогорного очага в противоположность интактному гену у штаммов биовара microtus, возбудителя псевдотуберкулеза IP32953, а также штаммов всех неосновных подвидов, таласского и штамма основного подвида из Кызылкумского пустынного очага. Учитывая одинаковое состояние гена порина у штаммов биовара microtus, циркулирующих в угодье Ксилин Гол Китая и на Кингхай Тибетском плато и штаммов неосновных подвидов, можно было ожидать и другие признаки их сходства. Как известно, все они ферментируют рамнозу, не способны ферментировать арабинозу и редуцировать нитраты, обладают избирательной вирулентностью для лабораторных животных. Однако, второй характерной структурной особенности штаммов биовара microtus, связанной с pgm областью, вставки IS285 в гене гипотетического протеина YPO1956 у штаммов неосновных подвидов, таласской группы и штамма из Кызылкумского пустынного очага не обнаружено.
Результаты ПЦР-скрининга hutG–YPO1950 региона референтных штаммов чумного микроба разных подвидов сопоставлены с нуклеотидными последовательностями этого региона штаммов биовара orientalis - СО92, биовара medievalis – KIM, биовара antiqua – Antiqua, биовара microtus – 91001 и штамма возбудителя псевдотуберкулеза IP32953. Компьютерный анализ известных нуклеотидных последовательностей штаммов чумного микроба разных биоваров показал, что вариабельные для подвидов области 1, 2 и 4 отличаются не только у штаммов разных подвидов, но и у штаммов разных биоваров.
2.2.ПЦР – анализ вариабельных областей 1 и 2 hutG–YPO1950 региона у штаммов чумного микроба разного происхождения и штаммов псевдотуберкулезного микроба Области 1 и 2 расположены в пространстве между геном hutG и геном порина YPО1967. Этот регион анализировался с помощью праймеров HSI75 - HSI76 (размер фрагмента для штамма Y. pestis CO92 – 446 п.н.) и HSI75 - HSI78 (размер фрагмента для штамма Y. pestis CO92 – 872 п.н.). Праймер HSI78 комплементарен последовательности ДНК, расположенной в начале гена hutG. Праймер HSI захватывает 11 нуклеотидов IS100 и 10 нуклеотидов гена порина YPО1967 за счет чего ампликоны с данной парой праймеров могут образовываться как у штаммов с геном порина YPО1967, трункированным IS100, так и с интактным. Праймер HSI отстоит на 71 нуклеотид от гена hutG (Рисунок 2).
Рисунок 2. Положение праймеров, использованных для анализа 1 и 2 вариабельных областей у штаммов чумного микроба разного происхождения При амплификации фрагментов ДНК штаммов алтайского и улэгейского подвидов, выделенных в Убурхангае (Монголия) от полевки Брандта, с праймерами HSI75 - HSI76 образуются ампликоны одинакового размера, с ДНК остальных штаммов – ампликоны различающиеся по размеру не более чем на 100 п.н..
Ампликоны, образованные с праймерами HSI75 - HSI78, также различаются для всех подвидов чумного микроба, кроме алтайского и улэгейского подвидов из Монголии.
Штамм кавказского подвида с этими праймерами образует ампликон размером около 2292 п.н., что значительно превышает аналогичный фрагмент штамма CO92 биовара orientalis. Это может свидетельствовать о встраивании в область, фланкированную праймерами HSI76 - HSI78 какого-либо мобильного элемента. Ампликоны штаммов псевдотуберкулезного микроба отличались по размеру от ампликонов, образованных штаммами любых подвидов чумного микроба. Более того, большая группа штаммов псевдотуберкулезного микроба (штамм Mollaret III, «бадхызские» штаммы и штаммы, выделенные на территориях Астраханской области (Аст.2, Аст.207 – серотипа, 343) не образовывала ампликоны с праймерами HSI75 - HSI76.
Анализ нуклеотидной последовательности штамма Y. pestis CO92 (биовар orientalis), ограниченной праймерами HSI75 - HSI78, выявил две области вариабельных тандемных повторов (VNTR). Область 1 (CAAGTAAT)4 расположена между праймерами HSI76 -HSI78, область 2 (ATAGAAAG)8 расположена вне гена порина между праймерами HSI75 - HSI76. С помощью программы BLAST выявлена вариабельность этого региона у штаммов разных биоваров.
Как показывают результаты наших экспериментов и приведенные данные GenBank, вариабельные области региона hutG-YPO1967 могут оказаться перспективными для идентификации и дифференциации штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов, типирования штаммов чумного микроба разного происхождения. Все изученные нами штаммы объединяются в группы согласно подвидам, а штаммы основного, алтайского, улэгейского подвида, дополнительно, в группы согласно очаговой принадлежности. Штаммы основного подвида разделились на три группы согласно очаговой принадлежности. Таласские штаммы и штаммы гиссарского подвида образовывали мономорфные группы из трех и шести штаммов соответственно. Штаммы алтайского подвида представлены тремя группами в соответствии с очаговой и мезоочаговой принадлежностью. Штаммы улэгейского подвида разделились на две группы: первая группа представлена штаммами из аймака Убурхангай, вторая – штаммами из Баян-Улэгейского аймака.
Штаммы алтайского и улэгейского подвидов, выделенные в Монголии в аймаке Убурхангай от полевки Брандта, попадают в одну группу. Как известно, штаммы неосновных подвидов проявляют высокую степень родства и многими молекулярно генетическими методами типирования не дифференцируются. Поэтому использование вариабельных областей 1 и 2 для типирования штаммов неосновных подвидов чумного микроба это, пожалуй, первый эффективный опыт.
2.3.ПЦР – анализ вариабельной области 3 hutG - YPO1950 региона у штаммов чумного микроба разного происхождения Область 3 представляет собой ген порина YPО1967 поврежденный IS элементом у штамма Y. pestis CO92. Для анализа этой области у штаммов чумного микроба разного происхождения использовали три пары праймеров (IH1-IH2, IH3 IH4 и IH1-IH4). Праймеры IH2 и IH3 комплементарны областям IS100 элемента, праймеры IH1 и IH4 - областям гена порина, фланкирующим место встраивания IS100 элемента (размер фрагмента для штамма CO92 – 2690 п.н.) (Рисунок 3).
А Б А – ген YP01967 штаммов основного подвида Б – ген YP01967 штаммов основного подвида из Кызылкумского пустынного очага и штаммов неосновных подвидов Рисунок 3. Структурная организация гена порина YPO1967 у штаммов Yersinia pestis разного происхождения Штамм Y. pestis 231(708) основного подвида с праймерами IH1- IH2 и IH3-IH образует специфичные ампликоны размером 787 п.н. и 796 п.н. (соответственно). В то время как, штаммы неосновных подвидов и штамм основного подвида КМ 803 (A 1822) (Кызылкумский пустынный очаг) не образует специфичные ампликоны.
Однако эти штаммы образуют ампликоны размером 733 п.н. с праймерами IH1-IH4, фланкирующими IS100, интегрированный в ген порина. Длина синтезированного фрагмента ДНК соответствует суммарному размеру частей гена YPO1967, ограниченных праймерами, что свидетельствует об отсутствии IS100 в данном гене.
Ампликон размером 2690 п.н. (с последовательностью IS100 элемента) синтезировался только у 231(708) штамма чумного микроба основного подвида. ПЦР – скрининг 47 штаммов чумного микроба разного происхождения с праймерами IH – IH4 показал, что ген YPO1967 штаммов всех неосновных подвидов и таласской группы, а также группы штаммов основного подвида из очагов песчаночьего типа интактный. Ген YPO1967 у остальных исследованных штаммов основного подвида нарушен включением IS100 элемента.
Поскольку высокая частота образования Hms- мутантов у штаммов с геном порина YPO1967 нарушенным IS100 элементом связана с делецией области пигментации в результате гомологичной рекомбинации двух фланкирующих IS элементов, отсутствие одного из них должно резко снижать частоту возникновения Hms- мутантов, что и наблюдается у всех перечисленных штаммов с интактным геном порина.
Сопоставляя данные, полученные в наших экспериментах, с данными зарубежных исследователей, приходим к выводу, что отсутствие IS100 элемента в гене порина у штаммов всех неосновных подвидов и таласской группы, а также группы штаммов основного подвида из очагов песчаночьего типа и штаммов биовара microtus приводит к отсутствию возможности делеции pgm области и снижает частоту Hms- мутаций до 10-7. Среди штаммов основного подвида штаммы с интактным геном обнаружены впервые.
2.4.ПЦР – анализ вариабельной области 3 hutG-YPO1950 региона штаммов псевдотуберкулезного микроба из разных географических регионов Вариабельность гена порина штаммов возбудителя псевдотуберкулеза изучалась в ПЦР с праймерами IH1 - IH4. Были выявлены 6 штаммов, у которых образовывался фрагмент размером 2690 п.н. Это штаммы, выделенные в Алматы А17, А2526, в Дагестане - 251Д, 141Д, 414, в Туркмении - B19. При тестировании штаммов праймерами IH1 - IH2 и IH3 - IH4 специфичные ампликоны не образовывались. Мы предположили, что IS100 элемент встраивается в ген порина псевдотуберкулезного микроба в обратной ориентации по сравнению с его ориентацией в гене порина чумного микроба. Поэтому, были рассчитаны две пары праймеров (HSI81 - IH2 и IH3 - HSI84) на концевые участки инвертированного IS элемента (Рисунок 4).
Фрагменты HSI81-IH2 и IH3 – HSI84, рассчитанные для инвертированного встраивания IS100 в сайт TCTCT гена порина Y. pestis CO92 имеют размеры п.н. и 442 п.н. соответственно. Реальные размеры ампликонов составляли около п.н. и 650 п.н. соответственно. Это предполагает разные сайты интеграции IS100 у штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов. Предположение было подтверждено при секвенировании гена порина псевдотуберкулзного микроба.
Большинство исследованных штаммов псевдотуберкулезного микроба с праймерами IH1 - IH4 образовывали ампликоны размером 733 п.н., а, значит, они содержат интактный гена порина. Выявлена довольно многочисленная группа штаммов, у которой с праймерами IH1 - IH4 ампликоны не образовывались. К этой группе штаммов относятся: штамм Mollaret III, «бадхызские» штаммы и штаммы, выделенные на территории Астраханской области (Аст.2, Аст.207 – О3 серотипа), 343 (серотип не определен). Эта же группа штаммов не образовывала ампликоны с праймерами HSI75-HSI76. Отсутствие двух перекрывающихся фрагментов при амплификации говорит о существовании довольно протяженной делеции в этой области. Поэтому штаммы анализировались с помощью дополнительных пар праймеров для выяснения размера отсутствующей области. Левая граница делеции была установлена быстро. Фрагмент ДНК, ограниченный праймерами HSI75-HSI включает в себя начало гена hutG. В области гена hutG перекрываются фрагменты ДНК, образованные праймерами HSI75-HSI78 и HSI79-HSI80. С праймерами HSI79 HSI80 образовались ампликоны размером 714 п.н. Следовательно, в хромосоме исследуемых штаммов присутствует ген hutG гистидинового оперона.
Для определения правой границы использовали перекрывающиеся пары праймеров HSI71-HSI72, HSI73-HSI74 (на область начала гена порина YP01967);
HSI69-HSI70, HSI67-HSI68 (на область межгенного пространства YP01967- aruE) и HSI65-HSI66, HSI61-HSI62 (на ген aruE). Ни с одной из этих пар праймеров не происходила амплификация ДНК изучаемых штаммов. Только с праймерами HSI57 HSI58, HSI55-HSI56 (на область гена aruB) ДНК тестируемых штаммов образовали специфические ампликоны размерами 755 п.н. и 619 п.н. соответственно. Следует отметить, что праймер HSI58 комплементарен области межгенного пространства aruE - aruB. Таким образом, правой границей делеции является ген aruB, а сама делеция включает ген порина и ген aruE. Судя по тому, что большинство штаммов с делецией области, начинающейся от гена hutG, относятся к О3 серотипу, а серотип двух других штаммов не определен, можно отнести эту делецию к структурным особенностям хромосомы штаммов О3 серотипа.
1 – ген порина штаммов выделенных в Алматы, Дагестане, Туркмении, Астраханской области.
2 - ген порина характерный для большинства штаммов псевдотуберкулезного микроба О серотипа.
3 – hutG - aru регион, характерный для штаммов псевдотуберкулезного микроба О серотипа.
---- отсутствующий фрагмент ДНК 4 – сайты посадки праймеров на область hutG – aru Рисунок 4. Структурная организация аналога гена порина YPО1967 и прилегающих к нему областей у штаммов Yersinia pseudotuberculosis выделенных в разных регионах До настоящего времени у штаммов возбудителя псевдотуберкулеза был выявлен только интактный ген порина. Нами впервые обнаружены штаммы псевдотуберкулезного микроба O1 серотипа, несущие ген порина трункированный IS100 элементом. Мобильный элемент встроен в ген порина этих штаммов в ориентации обратной по сравнению с ориентацией в гене порина чумного микроба.
Возможно, при анализе большего количества штаммов псевдотуберкулезного микроба будут обнаружены штаммы с геном порина аналогичным по структуре гену штаммов основного подвида чумного микроба. Наши данные свидетельствуют о существовании независимых эволюционных цепочек штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов с интактным и нарушенным геном порина.
Протяженная делеция области hutG-aruB у штаммов псевдотуберкулезного микроба O3 серотипа и «бадхызских» штаммов подтверждает значительную эволюционную отдаленность этих штаммов от штаммов чумного микроба.
2.5.ПЦР – анализ вариабельной области 4 hutG-YPO1950 региона у штаммов чумного и псевдотуберкулёзного микробов разного происхождения Область 4 расположена между геном гипотетического мембранного белка YPO1961 и геном регуляторного белка семейства GntR YPO1960. Для анализа этой области использовали праймеры HSI35 - HSI36 и HSI37 - HSI38. Праймер HSI расположен в области гена YPО1960, праймер HSI36 - между генами YPO1960 и YPO1961 (размер фрагмента для штамма CO92 – 768 п.н.) (Рисунок 5).
Рисунок 5. Структурная организация вариабельной области 4 Yersinia pestis Праймер HSI37 расположен в конце гена YPО1960, праймер HSI38 – в начале гена aruC (размер фрагмента для штамма CO92 – 839 н.). Подвижность в 2 % агарозном геле ампликонов, образованных при ПЦР с ДНК восьми типичных штаммов чумного микроба и праймерами HSI35- HSI36 была различной для группы штаммов неосновных подвидов (altaica, ulegeica, hissarica, caucasica), штамма группы talassica, штаммов основного подвида из Аксайского высокогорного очага и Кызылкумского пустынного очага. Аналогичная картина наблюдалась при ПЦР – анализе восьми типичных штаммов с праймерами HSI37 - HSI38. Разница в размере ампликонов HSI35- HSI36 и HSI37 - HSI38 одинакова для всех исследованных штаммов. Следовательно, различие в размере ампликонов связано с фрагментом ДНК, ограниченным праймерами HSI37 и HSI36. Этот фрагмент ДНК расположен в пространстве между генами YPO1960 и YPO1961 и в геноме штамма CO92 содержит пять гексануклеотидных повторов ATCAAC. Вероятно, именно различие числа тандемных повторов является причиной различного размера ампликонов у штаммов чумного микроба разного происхождения.
Разница в размерах ампликонов HSI35 - HSI36 и HSI37 - HSI38 у штаммов разных подвидов небольшая. Кроме того, ампликоны, образованные с ДНК штаммов четырех неосновных подвидов, имеют одинаковую подвижность в агарозном геле.
Исследование 47 штаммов чумного микроба подтвердило невысокие дифференцирующие возможности этой области для штаммов чумного микроба.
Поэтому как мишень для внутривидовой дифференциации штаммов чумного микроба методом ПЦР эта вариабельная область имеет ограниченное применение. В тоже время, она может оказаться полезной ДНК – мишенью при типировании методом мультилокусного секвенирования. У штаммов псевдотуберкулезного микроба эта область позволяет различать три группы штаммов: штаммы О серотипа, «бадхызские» штаммы, штаммы О3 серотипа.
Суммируя экспериментальные данные можно заключить, что у штаммов чумного микроба разного происхождения области hms и aru оперонов довольно консервативны. При ПЦР анализе нами не выявлены структурные различия в этих регионах. Более вариабельны эти регионы у штаммов псевдотуберкулезного микроба. Так, штаммы О3 серотипа лишены области hutG-aruB. Штаммы О серотипа отличаются от штаммов О1 серотипа и штаммов чумного микроба также и способностью образовывать Psn- мутанты c отсутствием гена (части гена) psn. Для штаммов О1 серотипа, в свою очередь, характерно образование Psn- мутантов за счет утраты ybt региона. Нами установлено, что образование pgm Hms-Psn- мутантов у штаммов неосновных подвидов, таласской группы, а также группы штаммов основного подвида из очагов песчаночьего типа невозможно. Это объясняется отсутствием IS100 элемента в гене порина YPО1967, ограничивающим область пигментации, а также отсутствием этого элемента в других генах и межгенных пространствах перед опероном. Исследованные нами штаммы hms - псевдотуберкулезного микроба, также не могут образовывать Hms Psn мутанты с делецией области пигментации, хотя некоторые из них содержат поврежденный IS100 элементом ген порина. В данном случае обратная ориентация IS100 элемента не позволяет осуществляться реципрокной рекомбинации между мобильными элементами и, как следствие, делеции области пигментации. Наиболее частыми мутациями, приводящими к изменению Hms и Psn фенотипа у штаммов псевдотуберкулезного микроба, вероятно, являются точковые мутации и небольшие делеции. Три вариабельные области, содержащие VNTR последовательности, выявлены нами в межгенных пространствах области hutG–YPO1950. Изучение распространения аллелей этих областей у штаммов чумного микроба разного происхождения и штаммов псевдотуберкулезного микроба показало возможность использования этих областей для создания генетических систем идентификации и типирования штаммов чумного микроба.
нуклеотидных последовательностей вариабельных 3.Определение областей региона hutG- YPO 3.1.Определение и сравнение нуклеотидных последовательностей гена порина YPО1967 чумного и псевдотуберкулёзного микробов, выделенных в разных географических регионах Для секвенирования генов порина использовали праймеры IH2 и IH3, комплементарные нуклеотидной последовательности IS100 элемента, и праймеры IH1, IH4, HSI81, HSI82, HSI83, HSI84, HSI71 HSI72, комплементарные нуклеотидным последовательностям гена порина. Сиквенс гена порина осуществлен у восьми типичных штаммов Y. pestis пяти подвидов и таласской группы, одного штамма Y. pseudotuberculosis Аст.2618 с интактным геном и пяти штаммов Y.
pseudotuberculosis с псевдогеном порина. Все штаммы Y. pseudotuberculosis, выбранные для секвенирования гена порина относятся к О1 серотипу.
3.1.1.Нуклеотидная последовательность интактного гена порина и первичная структура порина чумного и псевдотуберкулёзного микробов При сравнении нуклеотидных последовательностей гена порина штамма основного подвида чумного микроба из Кызылкумского пустынного очага, всех штаммов неосновных подвидов, таласской группы штаммов и штамма Y.
pseudotuberculosis Аст.2618 с помощью компьютерной программы Mega обнаружена их идентичность. Изучение гомологии нуклеотидной последовательности общей для экспериментальных штаммов и последовательностей, депонированных в GenBank, проведено с помощью программы BLAST. Нуклеотидные последовательности экспериментальных штаммов оказались идентичными нуклеотидным последовательностям гена порина Yersinia pestis штаммов Angola биовара antiqua;
Pestoides F кавказского подвида, 91001 биовара microtus, а также штамма Y.
pseudotuberculosis IP32953.
Открытая рамка считывания (ОРС) интактного гена порина размером 1080 п.н.
начинается с кодона ATG, определяющего синтез метионина и заканчивается стоп кодоном ТAA (ochre кодон). Предполагаемый полипептидный продукт состоит из 360 ак. Молекулярная масса порина – 39561Да. Это кислый белок с pI – 5,53.
В геномах всех представителей рода Yersinia содержится несколько разных генов поринов. Практически все эти порины имеют близкие размеры аминокислотных последовательностей (346 – 374 ак). Довольно высокий процент гомологии (79 – 81 %) выявлен с разными поринами патогенных и непатогенных представителей рода. Наиболее близкими оказались белки внешних мембран (порины) Yersinia intermedia ATCC 29909;
Yersinia mollaretii ATCC 43969;
Yersinia bercovieri ATCC 43970;
Yersinia frederiksenii ATCC 33641.
3.1.2.Нуклеотидная последовательность трункированных генов порина порина чумного и псевдотуберкулёзного микробов Ген порина YPО1967 с встроенным IS100 элементом занимает краевую часть области пигментации размером 3046 п.н. С помощью программы DNAMAN выявлена открытая рамка считывания (ОРС) гена порина, начинающаяся с кодона ATG и заканчивающаяся стоп-кодоном TAA. Мобильный элемент интегрирован в сайт TCTCT гена порина через 870 п.н. после старта. Последовательность TCTCT фланкирует IS100 элемент, т.к. при встраивании произошла ее прямая дупликация.
Мобильный элемент несет на концах несовершенные инвертированные повторы протяженностью 28 п.н. В составе IS100 элемента выявлены две, перекрывающиеся на один нуклеотид ОРС. Нуклеотидная последовательность гена порина штамма основного подвида из Аксайского высокогорного очага идентична нуклеотидной последовательности гена порина YPО1967 штамма CO92 биовара orientalis.
Нуклеотидные последовательности гена порина штаммов Y. pseudotuberculosis с нарушенным геном порина включают полную последовательность IS100 элемента в инвертированной ориентации (II) по сравнению с ориентацией IS100 в гене порина штамма CO92. Интеграция IS100 элемента в ген порина у псевдотуберкулезного микроба произошла через 670 п.н. после старта в сайт – AGAAAG.
Суммируя данные по структурной организации части pgm области, несущей ген порина, можно выделить три варианта организации этого сегмента ДНК. У большинства штаммов псевдотуберкулезного микроба О1 серотипа, штаммов чумного микроба с низкой эпидемической значимостью всех неосновных подвидов, таласской группы и биовара microtus, а также отдельных филогенетических линий высоковирулентных штаммов чумного микроба основного подвида и биовара antiqua ген порина находится в интактном состоянии. ОРС гена порина позволяет транслировать полипептид с молекулярной массой 39561Да. Большинство высоковирулентных штаммов чумного микроба основного подвида, биоваров и некоторые филогенетические линии antiqua, medievalis, orientalis псевдотуберкулезного микроба О1 серотипа содержат трункированные гены порина, но с различными сайтами интеграции IS100 элементов и ориентацией. Штаммы псевдотуберкулезного микроба О3 серотипа лишены протяженного сегмента ДНК, включающего гены порина и aruE.
3.2.Определение и сравнение нуклеотидных последовательностей hms оперонов штаммов Yersinia pestis, выделенных в разных географических регионах Нуклеотидную последовательность hms оперона (7651 п.н.) определили у типичных штаммов чумного микроба основного подвида (Y. pestis 231 (708), Y. pestis КМ 803 (А-1822)), кавказского подвида (Y. pestis 1146), алтайского подвида (Y. pestis КМ683(И-2359)), улэгейского подвида (Y. pestis И-3069), гиссарского подвида (Y.
pestis А-1249) и штамма из Таласского высокогорного очага - Y. pestis А-1802 (21/10).
При выравнивании нуклеотидных последовательностей в программе Mega выявлен высокий консерватизм оперона у штаммов пяти подвидов и таласской группы.
Структура hms оперонов всех штаммов оказалась идентичной за исключением последовательности штамма кавказского подвида. У этого штамма обнаружены две нуклеотидные замены. В промоторной области hmsH гена штамма кавказского подвида выявлена единичная нуклеотидная замена A на G. Нуклеотидная замена в гене hmsF через 778 п.н. после старта уникальна и может служить генетической меткой штаммов Y. pestis caucasica.
Для сравнения полученных последовательностей с генетическим банком данных использовали компьютерную программу Нуклеотидные Blast.
последовательности hms оперона (Таблица 14) у штаммов всех подвидов, кроме Y.
pestis subsp. caucasica, идентичны последовательности штамма KIM биовара medievalis. Штаммы CO92 биовара orientalis и Antiqua биовара antiqua отличаются от штамма KIM биовара medievalis заменой T на G через 149 нуклеотидов после страта гена hmsR. Штамм биовара microtus несет нуклеотидную замену C на T через нуклеотида после старта гена hmsR. Наибольшее количество нуклеотидных различий во всех генах оперона выявлено у штамма Y. pseudotuberculosis IP32953 при сравнении его со штаммом KIM биовара medievalis. В гене hmsH - пять замен, в гене hmsF – три, в hmsR - четыре и в гене hmsS – одна замена.
Все замены в гене hmsH (1 - ACG/ACA (Y.pseudotuberculosis /Y.pestis) – Thr;
2 GAG / GAA– Glu;
3 - ATC/ATA– Ile), в гене hmsF (1 - ACC /ACA –Thr;
3 - GTT/ GTG – Val;
4 - TTG/TTA – Leu), в гене hmsR (1 - CTG /TTG – Leu;
3 - CGT/CGC– Arg;
4 ATT/ ATC– Ile) привели к образованию кодонов-синонимов. В гене hmsF штамма кавказского подвида чумного микроба и pestoides F миссенс мутация CTA/CAA вызвала замену нейтральной гидрофобной аминокислоты Leu на нейтральную полярную аминокислоту Gln. Замена 187 нуклеотида в гене hmsR у штаммов биоваров orientalis и antiqua (GTC/GGC), привела к замене аминокислоты Val на Gly (обе нейтральные гидрофобные). В гене hmsS замена нуклеотида A на G в триплете GTC приводит к замене одной нейтральной гидрофобной аминокислоты на другую (изолейцин на валин). Выявленные нуклеотидные замены, различающие штаммы биоваров orientalis, medievalis, microtus и штаммы кавказского подвида, предполагают возможность использования вариабельных областей hms оперона для создания системы типирования методом мультилокусного секвенирования.
Как видим, внутривидовые различия hms оперона чумного микроба невелики, и во всех случаях происходит замена одной нейтральной аминокислоты на другую.
Оперон hms чумного микроба отличается единичными нуклеотидными заменами во всех генах от hms оперона псевдотуберкулезного микроба, но практически все замены образуют кодоны-синонимы, что не должно приводить к изменению способности сорбировать кислые красители чумного микроба. Поэтому остается не выясненным вопрос о том, что приводит к слабой пигментсорбирующей способности у штаммов псевдотуберкулезного микроба и высокой частоте мутаций, приводящих к утрате Hms фенотипа и отсутствию способности блокировать преджелудок блох.
4.Разработка экспериментальных ПЦР систем для дифференциации вирулентных и авирулентных штаммов чумного микроба разного происхождения 4.1.Мультиплексная ПЦР система для дифференциации вирулентных и авирулентных штаммов чумного микроба разного происхождения При разработке мультиплексной ПЦР системы для дифференциации вирулентных и авирулентных штаммов чумного микроба разного происхождения мы выбрали ДНК – мишени из двух областей генома обязательных для проявления вирулентных свойств.
В качестве первой ДНК-мишени выбран ген порина YPO1967, так как структурные особенности этого гена в большинстве случаев позволяют дополнительно различать штаммы основного подвида с универсальной вирулентностью и штаммы неосновных подвидов с избирательной вирулентностью.
Отсутствие IS100 элемента в гене порина исключает возможность делетирования области пигментации, а, следовательно, резко снижает частоту образования авирулентных клонов. Образование точечных мутантов по генам острова патогенности явление чрезвычайно редкое (частота – менее 10-9), поэтому штаммы с интактным геном можно всегда считать потенциально вирулентными. Для конструирования мультиплексной ПЦР использовали праймеры IH1 и IH4, фланкируюшие IS100, встроенный в ген YPO1967 у штаммов основного подвида.
Образующийся в ПЦР с ДНК вирулентных штаммов ампликон имеет размер 2690п.н. Авирулентные штаммы основных подвидов с праймерами IH1 - IH ампликонов не образуют, т.к. не содержат последовательности нуклеотидов, комплементарной праймеру IH4. Штаммы неосновных подвидов и штаммы основного подвида из Кызылкумского пустынного очага с этими праймерами образуют ампликон размером 733 п.н.
Специфичность ампликонов подтверждена методом секвенирования. Таким образом, предлагаемая пара праймеров позволяет различать потенциально вирулентные и авирулентные штаммы основного подвида;
потенциально вирулентные штаммы неосновных подвидов и штаммы из Кызылкумского пустынного очага основного подвида по наличию или отсутствию области пигментации.
В качестве второй ДНК – мишени тестировались гены родоспецифичной плазмиды кальцийзависимости, которая имеет высокую степень гомологии у патогенных иерсиний. Однако даже внутри вида Y. pestis имеются различия структурной организации плазмиды. Чтобы определить вторую область для тестирования в качестве ДНК-мишени был проведен компьютерный анализ известных нуклеотидных последовательностей плазмиды pCad штаммов чумного микроба разных биоваров. Поиск второй пары праймеров для мультиплексной ПЦР был предпринят в области генов yopN и lcrH, имеющих одинаковую структуру у всех штаммов чумного микроба. Подходящая пара праймеров не комплементарная паре праймеров IH1 и IH4, обозначенная lcr7-lcr6, обнаружена в области гена lcrH и инициирует образование специфичного ампликона размером 262 п.н.
Специфичность ампликона подтверждена методом секвенирования. Эффективность мультиплексной ПЦР проверена на 47 штаммах Y. pestis разных подвидов.
Параллельно все штаммы протестированы праймерами на внутренние гены области пигментации (hmsS и psn) и на плазмидный состав. Во всех случаях наличие ампликонов в мультиплексной ПЦР коррелировало с наличием плазмиды pCad и наличием ампликонов генов hmsS и psn, а также вирулентностью штамма. Сочетание двух пар праймеров, рассчитанных на гены YPO1967 и lcrH, позволяет определять наличие или отсутствие двух обязательных детерминант вирулентности – области пигментации и плазмиды кальцийзависимости.
4.2.Разработка ПЦР для дифференциации авирулентных вследствие потери области пигментации и вирулентных штаммов (клонов) чумного микроба Поиск пары праймеров для выявления делеции области пигментации проведен в регионах, граничащих с IS100 элементом, оставшимся после делетирования области пигментации. Подходящая пара праймеров IH1-IY4 с ДНК штаммов (клонов) чумного микроба, утративших область пигментации, образует ампликон размером 2468 п.н. Этот ампликон образован фрагментом гена YPО1967 (196 п.н.), IS100 элементом (1949 п.н.) и фрагментом YPO1898 гена-модулятора вирулентности (322 п.н.).
Специфичность ПЦР с праймерами IH1-IY4 определяли на ДНК штамма Y.
pestis 231 pgm, отсутствие области пигментации которого было установлено ранее с помощью праймеров IH1 - IH4 и праймеров на внутренние гены области пигментации (hmsS и psn).
Эффективность выявления авирулентных штаммов чумного микроба изучена на 18 вакцинных, кандидатов в вакцинные и авирулентных штаммах, депонированных в ГКПБ «Микроб». Все восемнадцать штаммов были проверены на наличие признака пигментации. Штаммы, лишенные области пигментации, были бесцветными, а контрольный - Y. pestis 231(708) и штаммы TWJ, 707 (Касуга) (они имеют в своем геноме область пигментации) на HmsD среде приобретали ярко красное окрашивание. Кандидаты в вакцинные штаммы TWJ, 707 (Касуга) авирулентны в результате отсутствия плазмиды кальцийзависимости. Далее штаммы анализировали на наличие генов области пигментации (hms оперона и ybt региона) восемью парами праймеров. Отсутствие ампликонов со всеми парами праймеров у всех штаммов, которые на среде Hmsd оставались не окрашенными, подтвердило делетирование у них области пигментации.
Для определения специфичности ампликонов IH1 - IY4 было проведено секвенирование ампликона штамма EV линии НИИЭГ. Сиквенс ампликона показал, что в его состав входят: фрагмент гена YPО1967 (196 п.н.), IS100 элемент (1952 п.н.), ограничивающий область пигментации со стороны ybt региона и фрагмент YPO гена-модулятора вирулентности (320 п.н.) идентичные таковым у штамма биовара orientalis – CO92. Таким образом, ПЦР с праймерами IH1 - IY4 специфично и эффективно выявляет авирулентные штаммы (клоны) чумного микроба у которых произошла делеция области пигментации.
ПЦР система, для выявления мутантов с делецией области пигментации может быть успешно применена для изучения опасности (безвредности) вакцинных штаммов, полученных много лет назад, когда подтверждение авирулентных свойств штамма на генетическом уровне было невозможно. Тем более что в литературных источниках (даже относительно новых), встречаются противоречивые сведения о биологической безопасности вакцинных штаммов, которые в настоящее время используются для вакцинации людей.
На основании ПЦР анализа восьми генов hms оперона и ybt региона области пигментации, а также с помощью ПЦР, выявляющей делеции области пигментации и определения нуклеотидной последовательности ампликона IH1-IY4 было установлено, что механизм образования вакцинного штамма Y. pestis EV линии НИИЭГ и других исследованных вакцинных штаммов заключается в делеции области пигментации с сохранением правого фланкирующего IS100 элемента.
Неоспоримое доказательство отсутствия области пигментации у мутантных штаммов получено при постановке ПЦР с праймерами IH1-IY4 комплементарными нуклеотидным последовательностям, находящимся непосредственно за областью пигментации с обеих е сторон. С этой парой праймеров мутантные штаммы, но не вирулентный, образовали ампликон размером 2468 п.н., соответствующим суммарной длине IS100 элемента и прилегающих фрагментов ДНК до последовательностей, комплементарных праймерам IH1 и IY4, что подтверждено определением нуклеотидной последовательности ампликона. Потеря ybt-региона, входящего в состав области пигментации, резко снижает способность чумного микроба выживать в условиях макроорганизма и делает штамм Y. pestis EV линии НИИЭГ авирулентным и, следовательно, допускает применение его в качестве живой вакцины.
В ГКПБ «М» института «Микроб» имеется экспериментальный штамм EV НИИЭГ 131, заявленный как вирулентный ревертант вакцинного штамма EV линии НИИЭГ. Наши исследования этого штамма с помощью праймеров IH1-IY4 и праймеров на гены hms и ybt регионов показали, что у него сохранена область пигментации. На среде Hmsd этот штамм образовывал пигментированные и непигментированные колонии. Авторы штамма отмечали, что одновременно с реверсией вируленности, у него появлялась зависимость от лейцина и восстановилась способность к расщеплению глицерина. Наши эксперименты подтвердили наличие этой способности у штамма ревертанта. Штамм EV относится к биовару orientalis. Все штаммы этого биовара не способны расщеплять глицерин, т.к. ген glpD (ген glp оперона, определяющего способность штаммов расщеплять глицерин) несет делецию 93 п.н. [Motin et al., 2002]. Приобретение штаммом EV линии НИИЭГ области пигментации размером 102 т.п.н. во время пассажей через организм животных и одновременное восстановление способности расщеплять глицерин представляется более чем сомнительным. Дополнительно к проведенному исследованию штамма EV НИИЭГ 131 было осуществлено сравнение ампликонов, образующихся с праймерами HSI75 - HSI78 (вариабельные области 1-2), у разных вариантов лабораторных штаммов EV. Оказалось, что все лабораторные варианты штаммов EV, кроме EV НИИЭГ 131 образовывали ампликоны одного размера – п.н.. Ампликон штамма EV НИИЭГ 131 был немного меньшего размера – 845 п.н.
Рассчитанные размеры области, заключенной между праймерами HSI75 и HSI78, у штаммов биовара orientalis – 852 п.н. и 848 п.н. для CO92 (Колорадо, США) и 6/ (выделен на о. Мадагаскар) соответственно. Обращает на себя внимание, что у штаммов восточного биовара, выделенных в одном географическом регионе (о.
Мадагаскар - штаммы EV и 6/69), с праймерами HSI75 и HSI78 образуются ампликоны одинакового размера. Ампликон HSI75 - HSI78 вирулентного ревертанта EV НИИЭГ 131 не соответствует по размеру ни одному из штаммов биовара orientalis.
Как видим, штамм EV НИИЭГ 131 имеет значительные отличия от исходного штамма EV и не принадлежит к биовару orientalis.
Исследование области у штаммов чумного и hutG–YPO псевдотуберкулезного микробов позволило выявить видовые и внутривидовые структурные различия, которые послужили базой для разработки экспериментальной мультилокусной ПЦР системы для дифференциации вирулентных и авирулентных штаммов чумного микроба и ПЦР для выявления авирулентных штаммов чумного микроба вследствие утраты области пигментации. С помощью второй ПЦР впервые получены неоспоримые доказательства отсутствия области пигментации у вакцинного штамма Y. pestis EV линии НИИЭГ и его лабораторных вариантов: EV исходный, EV76, EV(76)51”f”, EV(76)51Mfg lot2.
ВЫВОДЫ Создана коллекция, включающая штаммы чумного микроба 1.
характерные для пяти подвидов и таласской группы из всех типов очагов, и штаммы псевдотуберкулезного микроба, представленные в основном О1 и О3 серотипом.
Выборка штаммов охарактеризована по признакам, ассоциированным с вирулентностью.
Частота мутаций по Hms, Psn и Cad признакам у штаммов 2.
псевдотуберкулезного микроба на два – четыре порядка выше, чем у штаммов чумного микроба.
На сегменте пигментации (hutG– YPO1950 регион) у штаммов чумного 3.
и псевдотуберкулезного микробов обнаружены четыре вариабельные области (одна – в области гена порина, три – в межгенных пространствах), которые могут быть использованы для усовершенствования методов идентификации и типирования штаммов чумного микроба.
Показано наличие полноценного ybt региона в области пигментации у 4.
штаммов псевдотуберкулезного микроба О3 серотипа. Выявлено три типа Psn мутаций у штаммов псевдотуберкулезного микроба: утрата всего ybt региона;
протяженная делеция, включающая ген psn;
внутригенные мутации.
Показано, что две разработанные ПЦР позволяют дифференцировать 5.
вирулентные и авирулентные штаммы чумного микроба разного происхождения.
Мультилокусная ПЦР с праймерами на ген порина YPO1967 и lcrH плазмиды pCad обладает способностью дифференцировать вирулентные и авирулентные штаммы чумного микроба всех подвидов и таласской группы;
ПЦР с праймерами, ограничивающими область пигментации, выявляет авирулентные штаммы чумного микроба, утратившие область пигментации.
Получены молекулярно-генетические доказательства того, что 6.
вакцинный штамм Yersinia pestis EV линии НИИЭГ утратил область пигментации, и как следствие возможность реверсии вирулентности.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Сухоносов И.Ю., Булгакова Е.Г., Кутырев В.В. ПЦР – анализ концевого 1.
фрагмента HMS – области у штаммов патогенных иерсиний // Проблемы особо опасных инфекций, выпуск 86, Саратов - 2003. – С. 96-101.
Сухоносов И.Ю., Булгакова Е.Г., Кутырев В.В. Структурные изменения 2.
области пигментации у непигментированных, нечувствительных к пестицину мутантов чумного микроба // «Молодые учные в медицине», IX Всероссийская научно-практическая конференции, посвящнная 190-летию Казанского государственного медицинского университета – Казань, 2004 – С. 47-48.
Сухоносов И.Ю., Булгакова Е.Г., Кутырев В.В. ПЦР-анализ области 3.
пигментации штамма Yersinia pestis EV НИИЭГ // Матер. симпозиума: Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития – Москва, 2004 – С. 412.
Сухоносов И.Ю., Булгакова Е.Г., Новичкова Л.А., Анисимова Л.В., 4.
Кутырев В.В. Фенотипическая молекулярно-генетическая характеристика штаммов Yersinia pseudotuberculosis, выделенных в разных регионах России и сопредельных государст // Инфекции, обусловленные иерсиниями, II Всероссийская научно практическая конференция с международным участием - Санкт-Петербург, 2006 – С.
127-128.
Булгакова Е.Г., Гаева А.В., Сухоносов И.Ю., Краснов Я.М., Гусева Н.П., 5.
Киреев М.Н., Анисимова Л.В., Новичкова Л.А., Кутырев В.В. Молекулярно генетические портреты штаммов возбудителя чумы // Матер. IX съезда Всерос.
научно-практ. об-ва эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. - М.:
Санэпидмедиа, 2007. - Т. 3. - С. 17-18.
Булгакова Е.Г., Гаева А.В., Сухоносов И.Ю., Краснов Я.М., Гусева Н.П., 6.
Анисимова Л.В., Новичкова Л.А., Кутырев В.В. Разработка способа дифференциации чумного и псевдотуберкулезного микробов с одновременной внутривидовой дифференциацией штаммов чумного микроба // Генодиагностика инф. болезней. (Молек. диагностика). VI Всерос. науч.-практ. конф. Сб. трудов.- М.:
Паис, 2007. – Т. 1. - С. 353-354.
Булгакова Е.Г., Гаева А.Н., Сухоносов И.Ю., Краснов Я.М., Гусева Н.П., 7.
Кутырев В.В. Способ дифференциации чумного и псевдотуберкулзного микробов с одновременной внутривидовой дифференциацией штаммов чумного микроба // Патент на изобретение №2332464.
Булгакова Е.Г., Сухоносов И.Ю., Кутырев В.В. Способ определения 8.
утраты вирулентности штаммами чумного микроба вследствие потери области пигментации // Патент на изобретение №2288275.
Куклев В.Е., Сухоносов И.Ю., Осина Н.А., Яшечкин Ю.И., Булгакова 9.
Е.Г., Куличенко А.Н., Кутырев В.В. Применение мультилокусной ПЦР для ускоренной идентификации Y. pestis // Генодиагностика инф. болезней. (Молек.
диагностика). VI Всерос. науч.-практ. конф. Сб. трудов. - М.: Паис, 2007. – Т. 1. - С.
376-377.
10. Сухоносов И.Ю., Булгакова Е.Г., Краснов Я.М., Гусева Н.П. Анисимова Л.В., Новичкова Л.А., Кутырев В.В. Сравнение hms оперона штаммов Yersinia pestis разного происхождения и Yersinia pseudotuberculosis // Генодиагностика инф.
болезней. (Молек. диагностика). VI Всерос. науч.-практ. конф. Сб. трудов.- М.: Паис, 2007. – Т. 1. - С. 400-401.
11. Сухоносов И.Ю., Краснов Я.М. Нуклеотидная последовательность генов hms-оперона у штаммов Yersinia pestis разного происхождения // Фундаментальная наука и клин. медицина. X Всерос. медико-биол. конф. молодых исследователей «Человек и его здоровье». - Санкт-Петербург, 2007. - С. 440-441.
12. Анисимова Л.В., Булгакова Е.Г., Краснов Я.М., Сухоносов И.Ю., Гусева Н.П., Новичкова Л.А., Кутырев В.В. Вариабельность нуклеотидной последовательности генов lcrV, yopN, yopM плазмиды кальцийзависимости // Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ / Материалы VIII Межгосударственной научно-практической конференции государств участников СНГ.- Саратов, 2007. - С. 154 – 155.
13. Сухоносов И.Ю., Булгакова Е.Г., Краснов Я.М., Гусева Н.П., Анисимова Л.В., Новичкова Л.А., Кутырев В.В. Вариабельность гена порина чумного и псевдотуберкулзного микробов разного происхождения // Международные медико санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ / Материалы VIII Межгосударственной научно-практической конференции государств участников СНГ.- Саратов, 2007. - С.
294 – 296.
14. Сухоносов И.Ю., Булгакова Е.Г., Краснов Я.М., Гусева Н.П., Анисимова Л.В., Кутырев В.В. Мультиплексная ПЦР для дифференциации вирулентных и авирулентных штаммов Yersinia pestis разного происхождения // Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ / Материалы VIII Межгосударственной научно-практической конференции государств участников СНГ.- Саратов, 2007. - С. 296 - 298.
15. Гаева А.В., Булгакова Е.Г., Сухоносов И.Ю., Краснов Я.М., Гусева Н.П., Анисимова Л.В., Новичкова Л.А., Кутырев В.В. Индикация и внутривидовая дифференциация вирулентных и авирулентных штаммов Yersinia pestis / Вестник российской военно-медицинской академии - Санкт-Петербург, 2008. - №3 (23) – Приложение 2 – Часть II – С. 322.
16. Сухоносов И.Ю., Булгакова Е.Г., Анисимова Л.В., Новичкова Л.А., Кутырев В.В. Генетический отбор авирулентных клонов чумного микроба при конструировании живых вакцин / Вестник российской военно-медицинской академии - Санкт-Петербург, 2008. - №3 (23) – Приложение 2 – Часть II – С. 320 – 321.
17. Булгакова Е.Г., Я.М. Краснов, А.В. Гаева, И.Ю. Сухоносов, Н.П. Гусева, Л.В. Анисимова, Л.А. Новичкова, В.В. Кутырев. Молекулярное типирование штаммов чумного микроба разного происхождения // Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными заболеваниями на территории государств-участников СНГ: Материалы IX Межгосударственной научно-практической конференции государств участников СНГ.- Волгоград, 2008. С. 40-42.