Моделирование формирования фибринового сгустка и исследование влияния потока крови на этот процесс
На правах рукописи
ШИБЕКО Алексей Михайлович
Моделирование формирования фибринового сгустка и
исследование влияния потока крови на этот процесс
03.00.02 - биофизика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Москва 2009
Работа выполнена в Учреждении Российской Академии Медицинских Наук Гематологический Научный Центр РАМН.
Научный руководитель доктор биологических наук, профессор Ф.И. Атауллаханов
Официальные оппоненты доктор физико-математических наук, профессор А.И. Лобанов;
доктор физико-математических наук, В.Н. Буравцев Ведущее учреждение - Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН
Защита состоится 2009 г. в час.
" " на заседании диссертационного совета Д001.042.02 в Учреждении Российской Академии Медицинских Наук Гематологический Научный Центр РАМН (Москва, 125167, Новозыковский проезд, 4).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ РАМН.
Автореферат разослан " 2009 г.
"
Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук Е.Е. Зыбунова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Основная функция свертывания крови – остановка кровотечения при нарушении целостности сосудистого русла, вызываемого как внешним повреждением, так и различными внутренними микротравмами, постоянно возникающими в организме. Система свертывания крови представляет собой сложную сеть биохимических реакций, однако большая ее часть является регуляторной, управляющей для главной реакции свертывания – образования фибрина и его полимеризации. Именно эта реакция превращает кровь в гель, закрывающий место повреждения и останавливающий кровопотерю. Смысл существования всей остальной системы свертывания в том, чтобы этот переход был осуществлен при строго определенных условиях и строго определенным образом:
при наличии сильного активирующего сигнала, в месте повреждения, не распространяясь за его пределы, образуя плотный сгусток, быстро затыкая дыру.
При этом не нужно забывать, что система свертывания функционирует в довольно сложных условиях: вязкая кровь течет по сосуду, в котором на стенке имеется область, активирующая свертывание. В зоне, граничащей с ней, происходят начальные реакции свертывания, активируются ферменты, которые с диффузией и переносом потоком проникают в соседние области. Появляется сгусток, практически непроницаемый для потока;
сгусток изменяет форму течения жидкости. Как будет вести себя система свертывания в таких условиях? Какие факторы будут управлять образованием сгустка? Что будет решать – произойдет остановка кровотечения или нет? Данная работа – попытка ответить на эти вопросы, основанная на компьютерном моделировании, подкрепленном in vitro экспериментами. В силу большой сложности и многоступенчатости системы свертывания, эта работа ограничена исследованиями фазы начального появления сгустка.
На текущий момент имеется ряд работ, посвященных математическому моделированию свертывания крови в потоке. В них показано, что поток ухудшает образование сгустка: при сильном потоке свертывание может не начаться. Однако, использованные в части работ феноменологические и редуцированные модели свертывания не позволяют сделать заключений о том, какие механизмы в системе свертывания крови обеспечивают ее чувствительность к потоку. В других работах используются детальные, но не верифицированные модели свертывания, и не проводится исследования функций различных реакций системы свертывания крови.
В данной работе был применен новый подход в использовании математического моделирования для исследования сложных биохимических систем. За основу была взята детальная модель свертывания плазмы крови, разработанная в лаборатории физической биохимии системы крови ГНЦ РАМН. Данная модель описывала реакционно-диффузионную систему, в которой свертывание активировалось при контакте с поврежденной поверхностью сосуда. Эта модель давала количественное согласие с множеством in vitro экспериментов. Она была модифицирована, чтобы описывать образование сгустка в условиях потока. После этого исправленная модель использовалась как инструмент исследования системы свертывания.
Использование математической модели позволяло проводить такие численные эксперименты, которые в принципе невозможно провести in vitro, как, например, отключение переноса потоком отдельных факторов свертывания, или изменение скорости определенных реакций, в которых участвует фермент. Такой подход позволял выяснять роль отдельных реакций в формировании нужного ответа системы, находить механизмы, регулирующие проведение свертывания в различных условиях.
Цель работы: изучить механизмы, определяющие влияние потока плазмы крови на начальные этапы образования фибринового сгустка.
Задачи исследования:
1. Основываясь на детальной реакционно-диффузионной модели свертывания крови, разработать двумерную модель свертывания, учитывающую поток, изменяемый образующимся сгустком.
2. Детально разобрать процесс формирования сгустка (полимеризации фибрина);
построить его in vitro модель и провести ее экспериментальную верификацию;
выяснить, в каких режимах может протекать полимеризация фибрина.
3. Используя данные о режимах полимеризации фибрина, исследовать первоначальное образование сгустка в условиях потока, выяснить механизмы, отвечающие за регуляцию данного процесса.
4. Предложить схему проведения in vitro экспериментов для верификации гипотезы о механизме, определяющем чувствительность плазменной системы свертывания крови к скорости потока плазмы крови.
Научная новизна. В первой части работы построена новая математическая модель полимеризации фибрина, в которой учтены двухступенчатая активация фибриногена;
образование комплексов фибрина с фибриногеном и частично активированным фибрином;
формирование протофибрилл и их латеральная агрегация с образованием оптически плотных фибрилл. Для верификации модели была проведена серия in vitro экспериментов. С помощью модели предсказано существование порога в образовании сгустка, выраженного в том, что ненулевые количества активированного фибрина в присутствии фибриногена не образуют сгустка. Был предложен механизм, отвечающий за подобное поведение системы полимеризации фибрина: обратимое формирование комплексов фибриногена и полуактивированного фибрина с олигомерами фибрина задерживает рост последних и не позволяет им образовывать сгусток в течение времени расчета. Во второй части работы разработана оригинальная двумерная детальная модель свертывания в потоке, учитывающая, что образующийся сгусток является непроницаемым для потока и тем самым меняет его форму. С помощью этой модели было исследовано влияние потока на свертывание плазмы крови;
было продемонстрировано, что поток может увеличивать время инициации свертывания, причем зависимость времени инициации свертывания от сдвиговой скорости потока имеет нелинейный характер, что подтверждается экспериментальными данными. Было выяснено, что ингибирующее действие потока связано с переносом активного фактора Ха и тромбина, и предложена гипотеза, что это может быть связано с ослаблением и полным выключением петли положительной обратной связи активации внешней теназы фактором Ха (вызванным уменьшением концентрации фактора Ха из-за его переноса потоком). Предложен ряд экспериментов по проверке этой гипотезы.
Научно-практическое значение. Полученные результаты, свидетельствующие о наличии порога при полимеризации фибрина, могут иметь значение для клинических и биохимических исследований, связанных со свертыванием крови, его патологиями и методами их лечения. Построенная модель полимеризации фибрина может стать частью большой модели свертывания, учитывающей не только плазменное свертывание, но и тромбоцитарное. Разработанная модель свертывания плазмы крови в потоке может быть использована для анализа механизмов действия препаратов, влияющих на свертывание, в условиях, приближенных к физиологическим. Открытый с ее помощью эффект влияния потока на протекание некоторых реакций свертывания может быть важен при разработке новых лекарственных средств, стратегий их использования.
Положения, выносимые на защиту:
Построена детальная in virto модель полимеризации фибрина, проведена ее 1.
экспериментальная верификация.
С помощью разработанной модели полимеризации фибрина предсказано 2.
пороговое поведение образования фибринового сгустка.
Разработана детальная двумерная модель свертывания плазмы крови в 3.
потоке, учитывающая влияние образующегося сгустка на форму течения.
Показано, что эффект ингибирования свертывания потоком вызывается 4.
вымыванием активного фактора Ха и связанным с этим ослаблением и полным выключением петли положительной обратной связи активации внешней теназы – комплекса, инициирующего свертывание.
Апробация работы состоялась 16 сентября 2009 г. на заседании проблемной комиссии № 6 "Биохимия, биофизика и реология крови" в Гематологическом Научном Центре РАМН.
Материалы диссертации докладывались на первой международной конференции "Математическая Биология и Биоинформатика" (Пущино, октябрь 2006), на XXIst Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis (Geneva, Швейцария, июль 2007), на 11th International School-Conference of young scientists in Puschino (Пущино, октябрь 2007), на международной конференции Modeling of Blood Diseases (Lyon, Франция, ноябрь 2007), на 53rd Annual Meeting Society of Thrombosis and Haemostasis Research (Wein, Австрия, февраль 2009).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 тезисов в сборниках трудов 9 конференций и 1 статья.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 116 страницах машинописного текста, состоит из введения, четырех глав (главы 1 — обзора литературы, главы 2 — описания материалов и методов, главы 3 — описания экспериментальных и теоретических результатов, и главы 4 — обсуждения результатов), выводов, двух приложений (состоящих из уравнений разработанных моделей) и библиографического указателя, включающего 116 источников. Работа выполнена на базе Гематологического Научного Центра РАМН в лаборатории физической биохимии системы крови (зав. лабораторией проф. Атауллаханов Ф.И.).
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследований.
Исследование полимеризации фибрина.
Модель полимеризации фибрина, разработанная в данной работе, представляла собой систему дифференциальных уравнений, переменными которой были концентрации фибриногена и его производных, тромбина и антитромбина III.
Модель обладала следующими особенностями:
1) Активация фибриногена происходит в 2 этапа;
2) Мономеры фибрина собираются в олигомеры;
3) Олигомеры N-го порядка переходят в протофибриллы, которые латерально агрегируют, образуя фибриллы, или присоединяются к уже существующим;
4) Фибриноген и полуактивированный фибрин обратимо образуют комплексы со всеми олигомерами.
Система обыкновенных дифференциальных уравнений решалась методом Эйлера.
Реагенты: БСА (бычий сывороточный альбумин) был приобретен в Sigma (St.
Louis, MO, USA). PPACK (Фен-Про-Арг-хлорометил кетон) был приобретен в Calbiochem (Darmstadt, Germany).
Белки: В экспериментах использовался бычий фибриноген (Sigma, St. Louis, MO, USA), очищенный диализом. Его концентрация определялась при помощи спектрофотометра AMINCO DW-2a по коэффициенту экстинкции A10cm% = 1.523.
. Человеческий -тромбин был приобретен в Haematologic Technologies (Essex Junction, VT, USA). Активность тромбина определялась титровкой активных сайтов с помощью PPACK.
Эксперименты проводились в 96-луночных плоскодонных полистироловых планшетах. После активации фибриногена тромбином (конечная концентрация 0.5 нМ) при помощи ридера Thermo Multiskan Ascent регистрировалась кинетика изменения оптической плотности раствора на длине волны 405 нм. Измерения проходили при температуре 37°С, перед этим образцы инкубировались при данной температуре в течение 7 минут.
Исследование воздействия потока на систему свертывания.
Модель свертывания плазмы крови в условиях потока состояла из дифференциальных уравнений в частных производных, описывающих изменение концентрации реагента со временем из-за его диффузии, переноса потоком и участия в химических реакциях. Конечным итогом реакций описываемой системы был фибриновый сгусток, непроницаемый для потока. Этот сгусток изменял форму течения в моделируемой области. Для нахождения новой формы потока решались уравнения Навье-Стокса. Полученные с их помощью значения скоростей использовались в уравнениях типа реакция-диффузия-конвекция, в которых и определялись концентрации веществ.
Моделирование проводилось в двумерной области размером 1000 на 6000 мкм.
Жидкость считалась вязкой и несжимаемой. Левая граница области представляла собой приток, правая – отток. Верхняя и нижняя границы области представляли собой физические границы, на которых выполнялись условия прилипания, т.е. на них скорость жидкости равнялась нулю. На входе и выходе было условие постоянства давления. Уравнения Навье-Стокса решались численно, методом Кобелькова. Этот метод предполагает использование трех не совпадающих друг с другом сеток для вычисления двух компонент скорости и давления.
Уравнения типа реакция-диффузия-конвекция, описывающие изменение концентрации реагентов, решались при помощи метода переменных направлений.
При расчетах были использованы следующие допущения, касающиеся процесса образования фибринового сгустка и его взаимодействия с потоком. Во-первых, скорость полимеризации фибрина считалась достаточно высокой для того, чтобы пренебречь сносом фибрина потоком. Т.е., сгусток оставался там, где он образовывался. Во-вторых, проницаемость фибринового сгустка для потока зависела от концентрации фибрина. Если она была ниже некоторого значения (точки гелеобразования, значение этой величины было выбрано равным 450 нМ), то проницаемость была равна 1 (сгусток полностью проницаем для потока), и она уменьшалась до 0 (сгусток полностью непроницаем для потока), когда концентрация фибрина превосходила критическое значение.
В расчетах было необходимо сопрягать меняющееся поле скоростей с изменяющимся распределением реагентов. Связать изменения в поле скоростей с изменением концентраций реагентов можно используя квазистационарный подход, учитывающий тот факт, что скорость установления стационарного потока жидкости много больше скорости роста сгустка. Это позволило решать уравнения Навье Стокса независимо от уравнений, описывающих изменение концентраций химических реагентов. При решении уравнений Навье-Стокса методом разнесенных сеток, вся область была разбита на ячейки. Как только концентрация фибрина в ячейке превосходила критическую, ячейка становилась непроницаемой для потока.
Когда число заполненных ячеек превосходило n (в расчетах использовалось n=25), решались уравнения Навье-Стокса с новыми условиями (в заполненных ячейках скорость потока равна 0). Полученные значения скоростей использовались в уравнениях для расчета концентраций реагентов.
Для определения реакций, ответственных за регуляцию свертывания потоком, был введен параметр, характеризующий длину фазы инициации свертывания.
Лагтайм был определен как временной интервал между контактом плазмы с тканевым фактором и моментом, когда сгусток закрывает более половины активатора. Зависимость лагтайма от сдвиговой скорости потока, измеренная при нормальных условиях, позволила отслеживать изменения, вызываемые различными переменами в системе. Для количественного описания зависимости лагтайма от сдвиговой скорости потока были введены коэффициенты CiS j (общее ингибирование свертывания потоком в интервале сдвиговых скоростей i-j) и R (нелинейность этого ингибирования).
Результаты Моделирование полимеризации фибрина.
В серии экспериментов in vitro фибриноген активировался тромбином.
Концентрация тромбина была одинаковой (0,5 нМ), а концентрация фибриногена варьировалась в диапазоне 0,5 мкМ-70 мкМ (Рис. 1А.). После добавления тромбина начиналось образование сгустка, которое регистрировалось по изменению оптической плотности на длине волны 405 нм. Для количественной характеристики кинетики оптической плотности были введены два параметра: лагфаза и максимальная оптическая плотность в конце эксперимента (на 40-й минуте) (Рис. 1Г, нормировано на максимальное значение для серии экспериментов).
А (1) Fg=70uM Б (1) Fg=70 uM 500 (2) Fg=35uM 1,5 (2) Fg=35 uM (3) 450 (3) Fg=17uM 1, (3) Fg=17 uM (3) оптическая плотность, ед.
(4) Fg=9uM 1,3 (4) Fg=9 uM 1,2 (5) Fg=4uM (5) Fg=4 uM 350 (2) 1, сигнал, усл.ед.
(6) Fg=2uM (4) (4) 1,0 (6) Fg=2 uM (7) Fg=1uM 0,9 (7) Fg=1 uM (8) Fg=0,5uM 0,8 (2) (8) Fg=0,5 uM 0, (5) 0,6 (5) 0,5 0,4 (6) 100 (6) 0, (7) 0,2 (7) (1) (8) 0,1 (8) (1) 0, 0 10 20 30 0 10 20 30 время, мин время, мин В Г Эксперимент (n=3) Эксперимент (n=3) Модельный расчет Модельный расчет Финальный сигнал, % от максимума 1, 0, Лагфаза, мин 0, 0, 0, 0, 0 10 20 30 40 50 60 70 0 10 20 30 40 50 60 Начальная концентрация фибриногена, мкМ Начальная концентрация фибриногена, мкМ Рис. 1. Кинетика оптической плотности фибринового сгустка при разных начальных концентрациях фибриногена (эксперимент и модельный расчет)(А и Б). Концентрация тромбина 0.5нМ. (В) Зависимость лагфазы от начальной концентрации фибриногена (эксперимент и модельный расчет). (Г) Зависимость финальной оптической плотности (нормировано на максимальное значение для серии экспериментов) от начальной концентрации фибриногена (эксперимент и модельный расчет).
Если на Рис. 1. проследить, как изменяется вид кривой светорассеяния при увеличении начальной концентрации фибриногена, то можно увидеть, что сначала лагфаза практически не меняется, но, начиная с концентрации 9 мкМ, она увеличивается, и дальше, чем больше фибриногена имеется в начале, тем длиннее лагфаза. Конечный уровень сигнала растет по мере увеличения концентрации фибриногена, однако в случаях с большой концентрацией фибриногена (кривые 1-4) он не успевает выйти на стационар. Для кривых 1-2, из-за большой лагфазы, его уровень оказывается даже ниже, чем для кривой 3. Зависимость максимальной оптической плотности в конце эксперимента (на 40-й минуте) (Рис. 1Г, нормированные значения) от начальной концентрации фибриногена демонстрирует, что сгусток образуется в любом случае, правда при больших концентрациях фибриногена его образование замедлено (это видно и на Рис.1А, где рост оптической плотности при больших концентрациях фибриногена начинается заметно позже).
В модельных расчетах зависимость времени появления сгустка от начальной концентрации фибриногена также имеет минимум. Результаты моделирования представлены на Рис. 1Б, В, Г. Можно наблюдать очень хорошее согласие теории с экспериментальными данными.
В использованной выше экспериментальной системе фибриноген активируется тромбином в постоянной концентрации. Однако в организме активные факторы, к которым принадлежит тромбин, быстро удаляются при помощи ингибиторов.
Трехкомпонентная система, состоящая из фибриногена, тромбина и антитромбина III, обеспечивает быстрое расходование активатора и является лучшим приближением к процессам in vivo, чем рассмотренная ранее двухкомпонентная система. Ее исследование проводилось при помощи математического моделирования.
Концентрация фибриногена была физиологической (8600 нМ), как и антитромбина III (3500 нМ). Концентрация тромбина варьировалась в диапазоне 0,1 20 нМ. В данном случае тромбин успевал произвести только определенное количество фибрина, и дальше его полимеризация шла в присутствии фибриногена.
Зависимость сигнала в конце численного эксперимента от концентрации тромбина представлена на Рис. 2А. Эта зависимость имеет s-образный вид. При концентрации тромбина меньше 1 нМ сгусток не образуется. Полимеризация небольшого количества фибрина в присутствии большого количества фибриногена за время эксперимента не происходит. Зависимость величины, обратной лагфазе (Рис. 2Б), стремится к нулю при ненулевых концентрациях тромбина.
А Б 3, 1, Финальный сигнал, % от максимума 2, 0, - 1/Лагфаза, мин 2, 0, 1, 0, 1, 0, 0, 0,0 0, 0 5 10 15 20 0 5 10 15 IIa, нМ IIa, нМ Рис.2. Результаты моделирования трехкомпонентной системы (концентрация фибриногена 8600нМ, концентрация АТIII 3500нМ). (А) Зависимость финального сигнала от концентрации тромбина (отнормировано на максимальное значение для серии экспериментов). (Б) Зависимость величины, обратной лагфазе от концентрации тромбина.
Было показано, что за появление порога в полимеризации фибрина отвечают промежуточные комплексы фибриногена с олигомерами фибрина, а двустадийность активации фибриногена необходима для появления полуактивированного фибрина и, соответственно, усиления эффекта (Рис.3). Линия (1) – контроль;
линия (2) – система без образования комплексов фибриногена и полуактивированного фибрина с олигомерами фибрина;
линия (3) – система, в которой активация фибриногена проходила в один шаг. В рассмотренных случаях зависимость обратной лагфазы от концентрации тромбина качественно практически не отличается от этой зависимости в контроле (Рис. 3А). Они стремятся к нулю при ненулевых концентрациях тромбина, хотя эти концентрации сильно меньше, чем в контроле.
Однако в зависимости финального сгустка от концентрации тромбина исчезает участок, на котором он не образуется (Рис. 3Б). Но так ведет себя система полимеризации при плазменной концентрации фибриногена (8600 нМ). Увеличение этой концентрации в 4 раза (см. врезку на Рис.3Б, концентрация фибриногена 34400 нМ), приведет к тому, что больше фибриногена будет образовывать комплексы с фибрином, усиливая связанный с этим эффект. В системе без образования комплексов фибриногена с олигомерами фибрина порог отсутствует (нет участка, где при ненулевых концентрациях тромбина не образовывался бы сгусток), а в системе с одностадийной активацией фибриногена порог есть.
АА Б (1) Контроль 300 (2) Запрет на образование комплексов (3) (1) Контроль 6, (3) Одностадийная активация фибриногена (2) (2) Запрет на образование 5, Финальный сигнал, усл.ед.
комплексов 5,0 (3) (3) Одностадийная 4,5 (1) - активация 1/Лагфаза, мин 4, фибриногена (2) 3, (3) (2) (1) 3, Финальный сигнал, 2, (1) 2,0 усл.ед.
1, 1,0 0,5 0 1 IIa, нМ 0,0 0 5 10 15 20 0 5 10 15 IIa, нМ IIa, нМ Рис.3. Исследование влияния различных компонентов системы полимеризации фибрина на зависимости лагфазы и финального сигнала от начальной концентрации тромбина. Концентрация фибриногена 8600 нМ, концентрация АТIII 3500 нМ. (А) Зависимость лагфазы от концентрации тромбина. (Б) Зависимость максимального фибрина от концентрации тромбина (норма, запрещено образование комплексов фибрин-фибриноген, одностадийная активация фибрина). Во вставке представлена та же зависимость в случае начальной концентрации фибриногена 34400 нМ (концентрация АТIII 3500 нМ). (линия (1) – контроль;
линия (2) – запрещено образование комплексов фибрин-фибриноген;
линия (3) – одностадийная активация фибрина).
Моделирование роста сгустка в потоке.
Была проведена серия численных экспериментов по формированию фибринового сгустка при разных сдвиговых скоростях потока. На Рис. 4А представлена зависимость лагтайма (временной интервал между началом свертывания и моментом, когда сгусток закрывает более половины активатора) от сдвиговой скорости потока. Она может быть аппроксимирована экспоненциальной функцией y = a + b e cx, где a = 1.54 ± 0.73, b = 2.86 ± 0.32, c = 0.129 ± 0.004. Здесь у – это лагтайм, а х – сдвиговая скорость потока. При небольших сдвиговых скоростях (0 13 с-1) лагтайм медленно увеличивался по мере увеличения скорости сдвига от 2.5 минут для неподвижной плазмы до 10-20 минут. Однако этот рост становится очень быстрым при больших сдвиговых скоростях, и при 28 с-1 лагтайм достигает 100-120 минут. Основываясь на полученных данных (представленных на Рис. 4А), можно сказать, что:
1) свертывание ингибируется потоком;
2) это ингибирование имеет сильно нелинейный характер, т.е. система свертывания может сопротивляться ингибирующему воздействию потока в определенном диапазоне его скоростей, но эффективно выключается на больших сдвиговых скоростях потока.
А Б (1) Концентрация желирования фибрина = 380 нM (1) Плотный сгусток на 450 нM фибрина (2) Концентрация желирования фибрина = 450 нM (2) Плотный сгусток на 3800 нM фибрина 160 (3) Концентрация желирования фибрина = 760 нM (3) Плотный сгусток на 7600 нM фибрина (3) (1) Лагтайм, мин Лагтайм, мин (2) (3) 100 (2) 80 (1) 60 0 0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 -1 - Сдвиговая скорость потока, с Сдвиговая скорость потока, с Рис. 4. Зависимость лагтайма от сдвиговой скорости потока при разных параметрах гелеобразования фибирна. (А) На зависимость лагтайма количественно, но не качественно влияет концентрация, при которой фибрин образует гель (точка гелеобразования). В большинстве расчетов была использована величина 450 нМ (линия 2). Здесь показано, что увеличение этого значения до 760 нМ (линия 3) уменьшает диапазон скоростей, на которых свертывание может противостоять подавлению потоком, но общий эффект потока не меняется. Уменьшение значения точки гелеобразования до 380 нМ (линия 1) увеличивает этот диапазон. (Б) Лагтайм не зависит от выбора концентрации, при которой фибрин формирует плотный сгусток. Далее везде было использовано значение 3800 нМ.
Как показано на этом рисунке, изменение этого значения не оказывает никакого эффекта.
Большинство параметров модели основано на экспериментальных данных.
Однако, в данном исследовании было сделано два допущения, не проверенных экспериментально. Это концентрация фибрина, при которой он переходит в гель (точка гелеобразования), и концентрация фибрина, определяющая, что сгусток стал плотным, т.е. определяющая лагтайм. Для оценки влияния этих параметров на полученный результат были проведены расчеты при разных значениях их величин.
Увеличение концентрации точки гелеобразования ведет к увеличению влияния потока на систему свертывания и наоборот. Но эти изменения носят количественный характер, не качественный. Главный эффект, состоящий в том, что свертывание может противостоять потоку в определенном диапазоне скоростей и подавляется более быстрым потоком, остается (Рис. 4А). Более того, значение концентрации фибрина, при которой сгусток становится плотным, не влияет на наблюдаемый эффект вообще (Рис. 4Б). Наиболее вероятное объяснение этому состоит в том, что когда сгусток закрывает от потока часть активатора, реакции свертывания внутри сгустка протекают быстро, минимально задерживая полное превращение фибриногена в фибрин.
Все описанные выше численные эксперименты были проведены при одном и том же размере активатора в 1000 µ. Очевидно, что in vivo размер области повреждения может сильно варьировать, поэтому необходимо было проверить, как скажется изменение размера активатора на обнаруженной нами зависимости лагтайма от скорости потока. Была проведена серия расчетов при постоянной скорости потока (17 с-1) и разных размерах активатора (Рис. 5). Увеличение длины активатора вело к уменьшению лагтайма и наоборот. Зависимость была гиперболической, что следует из ее линейности в полуобратных координатах (Рис. 5, вставка). При данном значении скорости сдвига свертывание фактически отсутствовало для длины активатора меньше 500 µ.
250 Лагтайм, мин 0 400 800 1200 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 - Размер активатора, 10 м Рис. 5. Зависимость лагтайма от размера активатора. Все численные эксперименты были проведены при сдвиговой скорости потока 17 с-1. На вставке показана зависимость лагтайма в полуобратных координатах.
В качестве нулевого приближения для определения критических элементов механизма, ответственного за влияние потока на свертывание, были проведены численные эксперименты, в которых отдельные факторы свертывания не переносились потоком. Этот подход позволил отдельным факторам свертывания игнорировать поток, тем самым показывая относительный вклад конвекции каждого из них в свертывание. Линия (2) на Рис. 6А показывает зависимость лагтайма от сдвиговой скорости потока в in silico экспериментах с отключенной конвекцией всех факторов предшественников (т.е. факторов II, V, VII, VIII, IX, X, XI, фибриногена).
Можно видеть, что конвекция этих факторов никоим образом не влияет на начальную фазу свертывания.
И совсем другая картина наблюдается в случае, когда отключена конвекция всех активных форм (т.е. факторов IIa, Va, VIIa, VIIIa, IXa, Xa, XIa) (линия (3) на Рис. 6А). В этих условиях во всем рассмотренном диапазоне скоростей потока сгусток формировался точно такой же, как в неподвижной плазме. Ни лагтайм (Рис. 6А), ни форма сгустка не зависели от сдвиговой скорости потока. Система стала абсолютно нечувствительной к потоку. Таким образом, именно унос активных факторов изменяет поведение системы свертывания в условиях потока.
Дальнейший анализ, проведенный по аналогии, выявил, какие именно из активных форм ответственны за наблюдаемый эффект. Отключение конвекции факторов IIa и Xa дает такой же эффект, как и отключение конвекции всех активных форм (линия (5) на Рис. 6А). Когда была отключена конвекция всех активных форм, кроме факторов IIa и Xa (т.е. Va, VIIa, VIIIa, IXa, XIa) (линия (4) на Рис. 6А), влияние потока на систему свертывания уменьшилось примерно в 2.6 раза S ( C 015 =0.39), а чувствительность системы к изменению скорости потока уменьшилась в 1.6 раза ( R =0.63). Расчеты были сделаны для активатора размером 500 µ.
А Б (1) Контроль (1) Контроль (2) Фактор Xa не активирует внешнюю теназу (2) Все предшественники не переносятся потоком 120 (3) Все активные формы не переносятся потоком (3) Фактор IIa не участвует в реакциях,кроме активации фибрина (4) Все активные формы, кроме IIa и Xa, (2) (1) 100 (2) не переносятся потоком (1) (5) Факторы IIa и Xa Лагтайм, мин Лагтайм, мин (3) 80 не переносятся потоком (4) (5) (3) 0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 -1 - Сдвиговая скорость потока, с Сдвиговая скорость потока, с Рис. 6. Зависимость лагтайма от сдвиговой скорости потока определяется активацией фактора VII фактором Ха. (А) Зависимость лагтайма от сдвиговой скорости потока в диапазоне скоростей 0-28 с-1. Линия 1 – контроль;
линия 2 – все предшественники (факторы II, V, VII, VIII, IX, X, XI, фибриноген) не переносятся потоком;
линия 3 – все активные формы (факторы IIa, Va, VIIa, VIIIa, IXa, Xa, XIa) не переносятся потоком;
линия 4 – все активные формы, кроме факторов IIa и Xa, не переносятся потоком;
линия 5 – факторы IIa и Xa не переносятся потоком. Как видно из этих кривых, зависимость лагтайма от сдвиговой скорости потока в основном определяется переносом факторов IIa и Xa. (Б) Зависимость лагтайма от скорости потока при выключении различных реакций.
Линия 1 – контроль;
линия 2 – фактор Ха не активирует внешнюю теназу;
линия 3 – фактор IIa не участвует в реакциях, кроме активации фибриногена. Можно видеть, что активация фактором Ха комплекса VII-TF играет критическую роль в формировании нелинейного ответа системы свертывания на поток.
После того, как были выявлены факторы, чей перенос потоком является ключевым в регуляции поведения системы свертывания в условиях потока, реакции, в которых эти факторы участвуют, исключались из системы свертывания. Реакции активации фибриногена тромбином и протромбина фактором Xa являются критическими компонентами системы свертывания (без них фибриновый сгусток не будет образовываться), и их выключение не рассматривалось. Остальные реакции, участниками которых являются IIa и Ха – это петли положительной обратной связи активации факторов V, VII, VIII, XI тромбином и активации комплекса VII-TF фактором Ха. Оказалось, что “выключение” всех петлей положительной обратной связи, в которых участвует тромбин, умеренно увеличило CiS j и практически не поменяло R (линия (3) на Рис. 6Б, Таблица 1). Таким образом, хотя система немного лучше подавлялась потоком, ее чувствительность к изменению скорости потока осталась на том же уровне ( R =1.12). И совсем другая картина наблюдается в случае отключения реакции активации комплекса VII-TF фактором Ха (линия (2) на Рис. 6Б): система стала в 3 раза менее чувствительной к изменению скорости потока ( R =0.33), но подавлялась потоком в 7.7 раз лучше.
Проверка полученного в модельных расчетах переключения системы потоком может быть осуществлена при помощи следующих экспериментов.
Добавление 10 нМ фактора VIIa (т.е. увеличение его концентрации до уровня плазменной концентрации его предшественника – фактора VII) в модели очень значительно укорачивает лагтайм (подавление потоком уменьшилось в 14 раз, C 0 24 =0.07) и уменьшает чувствительность к изменению скорости в 4 раза ( R =0.25) S (Рис. 7). То, что чувствительность к изменению скорости потока в плазме, где фактор VII уже существенно активирован, должна быть очень низкой, будет важным подтверждением основных выводов об устройстве механизма регуляции свертывания потоком: именно петля положительной обратной связи активации фактора VII регулирует зависимость времени появления сгустка от сдвиговой скорости потока. В этом эксперименте начальное отношение активного фактора VIIа к неактивному фактору VII будет 1:1, так что всех комплексов фактора VII/VIIа с TF будет внешней теназой (вместо 1%, как в нормальной плазме). Это может быть интерпретировано как увеличение скорости активации внешней теназы петлей обратной связи, что позволяет системе существенно пренебречь действием потока.
(1) Контроль (2) добавление 5 нМ TFPI (3) добавление 10нМ фактора VIIa (1) (4) добавление 6800nM ATIII (4) (2) Лагтайм, мин (3) 0 7 14 21 - Сдвиговая скорость потока, с Рис. 7. Зависимость лагтайма от сдвиговой скорости потока определяется активацией фактора VII, ингибированием посредством TFPI и ATIII. Показана зависимость лагтайма от сдвиговой скорости потока в нормальной плазме (линия 1), и в плазме с добавками фактора VIIa, TFPI, ATIII. Добавление фактора VIIа приводит к драматическому уменьшению лагтайма, а его зависимость от сдвиговой скорости потока становится линейной (линия 3). Добавление TFPI сдвигает область выключения свертывания к более низким скоростям потока (линия 2).
Добавление ATIII немного увеличивает лагтайм (линия 4) в сравнении с контролем. Эти результаты показывают, что активация фактора VII и ингибирование внешней теназы TFPI являются контролирующим механизмом, определяющим поведение свертывания в потоке.
С другой стороны, добавление 5 нМ TFPI (3-х кратное увеличение по сравнению с контролем), должно привести и к значительному увеличению подавления потоком S ( C 012 =5.55) (Рис. 7), и к существенному увеличению чувствительности системы к изменению скорости потока ( R =4.5). Добавление TFPI будет оказывать малый эффект при отсутствии потока, как и добавление фактора VIIa. Увеличение TFPI приведет к улучшению ингибирования петли обратной связи активации внешней теназы, что сделает систему более чувствительной как к изменению скорости потока, так и к подавлению потоком. Можно предположить, что концентрация TFPI является определяющим фактором для диапазона скоростей потока, в котором свертывание может образовывать сгусток.
Как возможный контроль, добавка 6800 нМ антитромбина III (3-х кратное увеличение по сравнению с контролем) должно вызвать только умеренное S увеличение подавления свертывания потоком ( C 024 =1.38), существенно меньше, чем в случае добавки TFPI (Рис. 7), и практически не должно изменить чувствительность системы к изменению скорости потока ( R =1.22). Таким образом, влияние антитромбина III на начальные фазы свертывания в потоке должно быть весьма умеренным.
Таблица 1. Влияние возмущения системы на чувствительность к потоку R C iS j Условия i-j, с- Контроль, точка гелеобразования 380 нМ 0.76 0-28 0. Контроль, точка гелеобразования 760 нМ 2.72 0-20 2. Контроль, плотный сгусток на 450 нМ 0.97 0-28 фибрина Контроль, плотный сгусток на 7600нM 1.02 0-28 1. фибрина 1 0-28 Контроль 3.351 2. Контроль (размер активатора 500 µ) 0- Предшественники не переносятся потоком 1.03 0-28 Активные формы не переносятся потоком 0 0-28 Активные формы, кроме IIa и Xa, не 0.392 0. 0- переносятся потоком Факторы IIa и Xa переносятся потоком 0.01 0-28 Нет реакции активации VII-TF фактором 7.73 0-12 0. Xa Нет реакций активации фактором IIa 1.72 0-12 1. факторов V, VII, VIII, XI Добавление 5 нМ TFPI 5.55 0-12 4. Добавление 6800 нМ ATIII 1.38 0-24 1. Добавление 10 нМ VIIa 0.07 0-24 0. Таблица 1 показывает, как изменения в системе свертывания меняют длину периода запуска свертывания в условиях потока. Два коэффициента представляют собой два разных типа воздействия потока на систему свертывания. CiS j показывает, Коэффициент рассчитан по отношению к контролю при размерах активатора 1000 µ Коэффициент рассчитан по отношению к контролю при размерах активатора 500 µ насколько сильнее система свертывания подавляется потоком (в диапазоне сдвиговых скоростей от i с-1 до j с-1), чем в контроле ( CiS j 1 или CiS j 1). В каждом случае зависимость лагтайма от сдвиговой скорости потока была аппроксимирована (там, где это было возможно) экспоненциальной функцией вида y = y 0 + A e Rx.
Параметр R показывает, стала ли система более чувствительной к изменению скорости потока, чем в контроле ( R 1 или R 1).
Выводы.
1. Разработана оригинальная детальная in vitro модель полимеризации фибрина, описывающая все основные этапы этого процесса, и проведена ее экспериментальная верификация.
2. С помощью модели было обнаружено пороговое поведение системы полимеризации фибрина: образование фибринового сгустка в присутствии фибриногена не происходит при низких концентрациях фибрина.
3. Показано, что формирование комплексов фибриногена с олигомерами фибрина ведет к задержке появления сгустка, а при малых количествах фибрина – к тому, что сгусток не образуется.
4. Разработана детальная модель свертывания плазмы крови в потоке, учитывающая изменения скоростей тока жидкости (плазмы крови), вызываемые растущим сгустком. С ее помощью продемонстрировано, что поток может регулировать временной интервал запуска свертывания крови, осуществляя отток фактора Ха и тем самым влияя на дополнительную активацию внешней теназы – комплекса, активирующего свертывание.
5. Предложена схема проведения in vitro экспериментов для верификации гипотезы о механизме, определяющем чувствительность плазменной системы свертывания крови к скорости потока плазмы крови.
Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Panteleev M.A., Ovanesov M.V., Shibeko A.M., Tokarev A.A., Sinauridze E.I., and Ataullakhanov F.I.. Computer simulation study of blood coagulation control.
Mathematical models and methods in biology and medicine. Bedlewo,Poland, 2005 p. 12.
2. Shibeko A.M., Lobanova E.S., Panteleev M.A., Avilov O.E., Gusev A.V., Shnol E.E., Ataullakhanov F.I. “Mathematical Modeling of Fibrin Clot Formation in the Presence of Blood Flow”, 1st International Conference “Mathematical Biology and Bioinformatics”, Puschino, Russia, 9-15 October 2006. pp. 55- 3. Баландина А.Н., Пантелеев М.А., Ованесов М.В., Шибеко А.М., Разработка установки для исследования пространственной динамики генерации тромбина при свертывании крови. Труды VI ежегодной молодежной конференции ИБХФ РАН ВУЗы «Биохимическая физика», Москва, Россия, 24-27 ноября 2006 г. стр. 7- 4. Баландина А.Н., Пантелеев М.А., Ованесов М.В., Сарбаш В.И., Шибеко А.М., Атауллаханов Ф.И., Разработка установки для исследования пространственной динамики генерации тромбина. III всероссийская научная конференция «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии», Москва, Россия, 1-3 февраля 2007, стр.17- 5. Balandina A.N., Kireev D.A., Panteleev M.A., Shmirev I.I., Shibeko A.M., Ataullakhanov F.I. Threshold behavior of the blood clotting system activated by the tissue factor Abstracts of XXIst Congress of the international society on thrombosis haemostasis., Geneva, Switzerland, July 6-12 2007.
6. Баландина А.Н., Ованесов М.В., Шибеко А.М., Пантелеев М.А., Сарбаш В.И., Атауллаханов Ф.И. Пространственная динамика генерации тромбина в плазме крови. 11-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых “Биология Наука XXI века”. Пущино, Россия, 29 октября – 2 ноября 2007, стр 231.
7. Баландина А.Н., Киреев Д.А., Пантелеев М.А., Шмырев И.И., Шибеко А.М., Атауллаханов Ф.И. Пороговое поведение системы свертывания крови при активации различной плотностью тканевого фактора. 11-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых “Биология Наука XXI века”.
Пущино, Россия, 29 октября – 2 ноября 2007, стр 69.
8. Balandina A.N., Panteleev M.A., Kireev D.A., Shibeko A.M., Lipets E.N., Shmirev I.I., Ataullakhanov F.I. Application of a New Method of Biochemical Systems Reduction:
Regulatory Functions of Positive Feedbacks in Blood Clot-ting Abstracts of II International conference “Mathematical biology and bioinformatics”, Pushchino, Russia, September 7 – 13, 2008, pp. 56 – 57.
9. Shibeko A.M., Panteleev M.A., Ataullakhanov F.I. Blood Flow Suppresses Feedback Activation of Extrinsic Tenase by Factor Xa and Prevents Clotting (theoretical research), Modeling of Blood Diseases, France, Lyon, 5.11.2007 – 8.11.2007. p. 18.
10. Shibeko A.M., Panteleev M.A., Ataullakhanov F.I. Binding of fibrinogen to fibrin as a regulator of fibrin polymerization initiation, Modeling of Blood Diseases, France, Lyon, 5.11.2007 – 8.11.2007. p. 19.
11. Shibeko A. M., Avilov O. E., Panteleev M. A., Lobanova E. S., Ataullakhanov F. I.
Blood Flow Suppresses Feedback Activation of Extrinsic Tenase by Factor Xa and Prevents Clotting, XXIst Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis, Switzerland, Geneva 06.07.2007 – 12.07.2007.
12. Шибеко А.М., Пантелеев М.А., Атауллаханов Ф.И. Реакция связывания фибрина с фибриногеном как регулятор начальной стадии полимеризации фибрина.
11-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых “Биология Наука XXI века”. Пущино, Россия, 29 октября – 2 ноября 2007. стр. 63.
13. Shibeko A.M. Blood Flow controls Coagulation Onset via the positive Feedback of Factor VII activation by Factor Xa, 53rd Annual Meeting Society of Thrombosis and Haemostasis Research. 4-7 February 2009, Wein, Osterreich.
14. Panteleev M.A., Ovanesov M.V., Kireev D.A., Shibeko A.M., Sinauridze E.I., Ananyeva N.M., Butylin A.A., Saenko E.L., Ataullakhanov F.I. “Spatial Propagation and Localization of Blood Coagulation Are Regulated by Intrinsic and Protein C Pathways”.
Biophysical Journal, V 90, March 2006 pp. 1489–1500.