Канцеростатические и канцерогенные свойства синтетических аналогов полиаминов
На правах рукописи
Шевченко Анна Александровна
Канцеростатические и канцерогенные свойства синтетических
аналогов полиаминов
03.00.04 – биохимия
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени кандидата
биологических наук
Москва – 2008
2
Работа выполнена на кафедре биохимии медицинского факультета Российского университета дружбы народов
Научный руководитель:
доктор биологических наук, профессор Сяткин Сергей Павлович
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор Козельцев Владислав Львович доктор биологических наук Соколов Николай Николаевич
Ведущая организация:
ГОУ ВПО Российский государственный медицинский университет
Защита диссертации состоится «18» июня 2008 года в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.203.13 при Российском университете дружбы народов по адресу: 117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 8, медицинский факультет.
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу: 117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 6.
Автореферат разослан « 16 » мая 2008 г.
Ученый секретарь диссертационного совета Д 212.203. профессор Е.В.Лукашева
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы В процессе совершенствования методов лечения злокачественных новообразований человека на первый план в проблеме современной химиотерапии выдвигается разработка и направленный синтез новых высокоэффективных противоопухолевых агентов. В последнее время арсенал применяемых в клинике противоопухолевых средств значительно расширился, однако большинство из них остаются малоэффективными и высокотоксичными.
В настоящее время стало очевидным, что методология подходов разработки новых перспективных химиотерапевтических соединений направленного действия с заранее заданными свойствами должна базироваться на фундаментальных исследованиях особенностей метаболизма опухолевой клетки. В этом отношении обмен полиаминов (ПА), являющихся эссенциальными факторами процессов клеточного роста и дифференцировки (Seiler N., 2003), с учетом активности трансглутаминазы (ТГ) может служить удобной и надежной мишенью для поиска и конструирования противоопухолевых агентов, в частности, в качестве специфических ингибиторов ТГ и регуляторов активности ключевых ферментов обмена ПА.
Была высказана гипотеза о том, что аналоги ПА способны замещать эндогенные ПА в клетке в участках связывания. Это приводит к нарушению функций внутриклеточных ПА (Porter, Bergeron, 1988). Исследования ограничились аналогами ПА алифатической структуры (Wallace H.M., Fraser A.V., 2003). Однако предварительные результаты показали, что онкопротекторной активностью могут обладать также гетероциклические соединения, в частности, бис-уридильные (Syatkin S.P., Fedorontchuk T.V., Lidack M.Yu., et al., 1994), азафлуореновые и бензимидазольные (Сяткин С.П., Березов Т.Т., Фролов В.А., и др., 2007) производные, а также пуриновые алколоиды (Beninati, Lentitni, 1998). Выбор данных веществ был обусловлен тем, что в их структуре можно выделить полиаминовые фрагменты. Изучение характера и степени влияния названных веществ на ключевые ферменты обмена ПА позволит сделать предположение об их возможном канцерогенном или противоопухолевом действии.
Целью исследования было изучение биологических (антипролиферативных и антиопухолевых) и биохимических свойств структурных аналогов ПА из числа гетероциклических соединений оригинального синтеза.
Задачи исследования 1. Изучение влияния производных бензимидазола и азафлуорена на основные показатели обмена ПА на бесклеточных тест-системах из тканей с повышенной клеточной пролиферацией.
2. Определение действия производных анилина и диоксаборенинопиридина на скорость окислительного дезаминирования ПА на бесклеточной тест-системе из ткани регенерирующей печени крыс.
3. Оценка антинеопластических свойств производных азафлуорена, пиперидона и метилксантина на клеточной модели из мышиной меланомы линии B16-F10.
Научная новизна работы Проведено сравнительное исследование влияния ряда гетероциклических соединений оригинального синтеза на метаболизм ПА в бесклеточных тест-системах, на скорость пролиферации и на дифференцировку клеток мышиной меланомы линии B16-F10. Результаты экспериментов позволяют впервые выявить и рекомендовать для дальнейшего исследования биологических свойств ряд синтетических аналогов ПА в качестве потенциальных противоопухолевых средств.
Практическая значимость работы.
Полученные результаты могут быть использованы для формирования базы данных при разработке программного обеспечения расчетов связи «структура-активность» для компьютерного моделирования химических структур с заданными биологическими свойствами, в частности, с антипролиферативным и противоопухолевым действием.
Определены группы веществ из числа исследованных гетероциклических соединений, которые позволяют прогнозировать перспективные направления дальнейшего синтеза соединений с повышенным терапевтическим эффектом действия.
Выявлены вещества с выраженной противоопухолевой активностью, которые рекомендованы для дальнейших клинических исследований в области онкологии, и подлежат патентированию.
Положения, выносимые на защиту 1. Канцерогенные свойства производных диоксаборенинопиридина и бензимидазола.
Пролиферативные свойства производных пиперидона. Антипролиферативные свойства производных анилина. Онкопротекторные свойства и свойства индукторов клеточной дифференциации производных азафлуорена и ксантина.
2. Перспективность дальнейших исследований производных азафлуорена и ксантина в качестве потенциальных противоопухолевых средств.
3. Превосходство в эффективности действия производных азафлуорена над остальными исследованными гетероциклическими соединениями.
Связь исследований с научной программой Работа проведена в рамках темы НИР РУДН «Исследование структуры и биологической активности ферментов с антиопухолевой активностью» № 01.2.00 105254 и темы НИР: № 030507-1-173 «Исследование противоопухолевых свойств новых биологически активных препаратов и создание отечественной иммунолипосомальной системы направленного транспорта лекарств».
Исследования, в рамках научной стажировки, проводились в лаборатории клеточной биологии Второго Римского университета «Tor Vergata» под руководством профессора Симоне Бенинати (2006-2007гг), поддержанные грантом президента Российской Федерации в году.
Апробация работы Результаты работы были представлены на 9 конгрессах и конференциях, в том числе на международных.
Основные результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на 9-ом Международном конгрессе по аминокислотам (Вена, Австрия, 2005);
на 4-ой Международной конференции студентов и молодых ученых "Актуальные вопросы спортивной медицины, лечебной физической культуры, физиотерапии и курортологии" (Москва, 2005);
на Итоговой конференции медицинского факультета Российского университета дружбы народов «Клинические и теоретические аспекты современной медицины» (Москва, 2005);
на Межрегиональной научно-практической конференции, посвященной 85-летию самарского государственного медицинского университета «Новая идеология в единстве фундаментальной и клинической медицины» (Самара, 2005);
на Всероссийской научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Перспектива-2006» (Нальчик, п. Эльбрус, 2006);
на 20-ом Международном конгрессе по биохимии и молекулярной биологии IUBMB и 11-ом FAOBMB конгрессе (Киото, Япония, 2006);
на Международной конференции «Роль полиаминов и их аналогов в раковых и других заболеваниях» (Тиволи, Рим, Италия, 2006);
на 15-ой Международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Гурзуф, 2007);
на 10-ом Международном конгрессе по аминокислотам и белкам (Каллитея, Греция, 2007).
Публикации.
По теме диссертации опубликовано 17 работ, в том числе 6 в рецензируемых журналах.
Структура и объем диссертации Диссертация изложена на _ машинописных страницах текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, заключения и выводов. Список литературы включает _ источника, из них _ зарубежных. Работа содержит _ рисунка и _ таблиц.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования В ходе эксперимента были проведены исследования биологических свойств производных метилксантина (табл. 1) и биохимических свойств гетероциклических соединений оригинального синтеза: А – производные бензимидазола и азафлуорена (табл. 2), Б – производные анилина (табл. 3), В – производные диоксаборенинопиридина (табл. 4), Г – производные пиперидона (табл. 5), Д–производные азафлуорена (выборочная группа) (табл. 6).
Исследуемые вещества были получены в лаборатории синтеза гетероциклических соединений кафедры органической химии РУДН (зав. кафедрой - профессор Варламов А.В.), в виде порошков, а также в лаборатории клеточной биологии Второго Римского Университета «Tor Vergata».
Все исследуемые вещества были растворены в соответствии с их физико-химическими свойствами до соответствующей конечной концентрации в пробах. Приготовленные растворы хранились в плотно закрытых емкостях темного стекла в холодильнике.
Таблица Пуриновые алкалоиды - метилированные производные ксантина Код Код веще Химическое название веще Химическое название ства ства 1,3,7-триметилксантин 8-ХЛОРТЕОФИЛЛИН 8-Cl-ТФ КФ КОФЕИН 3,7-диметилксантин 8-БРОМТЕОФИЛЛИН 8-Br-ТФ ТБ ТЕОБРОМИН 1,3-диметилксантин ТЕОФИЛЛИНА-7-АЦЕТАТ ТФ ТФ-7-Ац ТЕОФИЛЛИН Таблица Производные бензимидазола и азафлуорена (группа А).
Код Код веще Химическое название веще Химическое название ства ства 1А 7А 7-аминопиридо[1,2-] бензимидазол 9-[-пиридиламинометилен]-4-азафлуорен 2А 8А 7-нитропиридо[1,2-]бензимидазол 1-амино-9-фениламино-4-азафлуорен 3А 9А 1-амино-4-азафлуорен 1-амино-4-азафлуоренон- 4А 10А 1,4-диазоацетонафтилено[1,2-f]флуорантен 1-амино-4-азафлуоренол 5А 11А 2-метоксикарбонил-(-бензоилэтил)анилин 3-дицианометилен-4-азафлуорен 9-[-(-гидроксиэтил)аминометилен] 6А 12А 5-(2-метоксикарбонил)фенил--фурфурол 4-азафлуорен Таблица Производные анилина (группа Б).
Код Код Химическое название Химическое название веще веще ства ства 3-(2-трифторметиланилино)- 1 1Б 7Б 3-анилино-1-фенилпропанон- фенилпропанон- 2Б 8Б 1-фенил-3-(4-толуидино)-пропанон-1 3-(3-хлоранилино)-1-фенилпропанон- 3Б 9Б 3-(4-хлоранилино)-1-фенилпропанон-1 3-(3-нитроанилино)-1-фенилпропанон- Этиловый эфир 4-(3-оксо-3 4Б 10Б 3-(4-броманилино)-1-фенилпропанон- фенилпропиламино) бензойной кислоты 5Б 11Б 3-(4-йоданилино)-1-фенилпропанон-1 3-(3-ацетиланилино)-1-фенилпропанон- 6Б 3-(2-фторанилино)-1-фенилпропанон- Таблица Производные диоксаборенинопиридина (группа В).
Код Химическое название вещества СоА1 6-Метил-2-(2-молил)-4,8а-дифенилпергидро[1,3,2]-диоксаборинино[5,4-с]пиридин 6-Метил-2-(4-метоксифенил)-4,8а-дифенилпергидро[1,3,2]-диоксаборинино СоА2 [5,4-с]пиридин 6-Метил-2-(2,4,6-триметилфенил)-4,8а-дифенилпергидро[1,3,2]-диоксаборинино СоА3 [5,4-с]пиридин 6-Метил-2-(3-трифторметилфенил)-4,8а-дифенилпергидро[1,3,2]-диоксаборинино СоА4 [5,4-с]пиридин СоА5 6-Метил-2-(2-тиенил)-4,8а-дифенилпергидро[1,3,2]-диоксаборинино[5,4-с]пиридин 6-Метил-2,4,8а-трифенилпергидро[1,3,2]-диоксаборинино[5,4-с]пиридин СоА 6-Метил-2-(3-фтор-4-хлорфенил)-4,8а-дифенилпергидро[1,3,2]-диоксаборинино СоА [5,4-с]пиридин 6-Метил-2-(3-толил)-4,8а-дифенилпергидро[1,3,2]-диоксаборинино[5,4-с]пиридин СоА 6-Метил-2-(4-толил)-4,8а-дифенилпергидро[1,3,2]-диоксаборинино[5,4-с]пиридин СоА Таблица Производные пиперидона (группа Г).
Код Химическое название вещества 17-метил-6,7,9,10,16,17,19,20-октагидро-18H-16,20-эпиминодибензо [h,o][1,4,7] 1Г триоксациклогексадецин-18-он 6,7,9,10,16,17,19,20-октагидро-18H-16,20- эпиминодибензо [h,o][1,4,7] 2Г триоксациклогексадецин-18-он 17-(2-гидроксиэтил)-6,7,9,10,16,17,19,20- октагидро -18H-16,20- эпиминодибензо 3Г [h,o][1,4,7] триоксациклогексадецин-18-он 18-оксо-N-пиридин-2-ил-6,7,9,10- тетрагидро -18H-дибензо [h,o][1,4,7] 4Г триоксациклогексадецин-17-карбоксамид N-(17,19-диметил-18-оксо-6,7,9,10,17,18-гексагидро-16H- дибензо [h,o][1,4,7] 5Г триоксациклогексадецин-16-ил)-N-метилацетамид Таблица Структурные формулы производных азафлуорена (группа Д - выборочная).
Код Код Формула и название Формула и название веще веще ства ства N N Br 1Д 3Д O NH O NH 1-амино-2-бром-4-азафлуоренон- 1-амино-4-азафлуоренон- N N N NH 2Д 4Д O Br 1-бром-4-азафлуоренон- 1-амино-9-фениламино-4-азафлуорен 1. Количественный анализ основных показателей обмена ПА в бесклеточных тест системах.
В экспериментах использовали белых беспородных крыс - самцов массой 100 – 130 г, содержащихся на стандартном рационе вивария РУДН со свободным доступом к воде.
Штамм гепатомы Г-27 был получен из Онкологического научного центра РАМН им. Н. Н.
Блохина. Штамм гепатомы пассировался на крысах, как было описано ранее И. Н.
Швембергером (1970).
Частичная гепатэктомия была проведена по методике Higgins, Anderson (1931) под эфирной анестезией. Для получения регенерирующей ткани печени животные усыплялись декапитацией через 12-15 часов после операции. Извлекались малые дольки печени и перфузировали на льду физиологическим раствором с температурой 2–40С, взвешивались и гомогенизировались. Бесклеточные тест-системы представляли собой цитозольную фракцию (20 000 g x 20 мин при 40С) 33 % гомогената ткани печени с добавлением необходимых компонентов. Полученый супернатант 33% гомогената использовался для экспериментов по определению активности аминоксидаз (по методике в модификации С.П.Сяткина, 1981) и ОДК, уровня ПА методом ВЭЖХ (в модификации С.П.Сяткина и К.А.Голомазовой, 2006). Пробы предварительно бензоилировались бензоилхлоридом. Расчет количеств бензоильных производных ПА проводился автоматически по компьютерной программе прибора «Милихром 5-3» с учетом предварительного анализа площадей пиков бензоильных производных путресцина (Пут), спермидина (Сд) и спермина (См) в растворах стандартов.
2. Количественный анализ основных факторов пролиферации и дифференциации на клеточной модели.
Клеточные культуры. Клетки меланомы линии murino B16-F10 с высокой метастатической активностью были выращены в соответствии с условиями стандартного культивирования (Fidler IJ. И Cifone MA., 1979). Использовалась питательная среда, состоящая из Dulbecco‘s modified Eagle’s medium (D-MEM), ph 7.4, обогащенного 10% бычьей эмбриональной сывороткой FCS (Fetal Calf Serum), с добавлением L-глутамина 2 мМ и смеси пенициллина со стрептомицином (100 ед/мл пенициллина, 0,1 мг/мл стрептомицина). Клетки культивировались при температуре 37 °С, во влажной атмосфере, содержащей 5% CO2. Общее число клеток периодически высчитывалось по специальной методике с использованием микроскопа.
Для экспериментов, проведенных в рамках данного исследования, были приготовлены исходные растворы веществ оригинального синтеза с заданной концентрацией в диметилсульфоксиде (ДМСО), подкисленном соляной кислотой. Для обработки клеточной культуры были использованы растворы веществ с конечными концентрациями 5, 25 и 100 µM, полученные путем разбавления материнских растворов. В контрольные группы добавлялся только подкисленный раствор ДМСО с соответствующей конечной концентрацией. В случае производных метилксантина, клетки обрабатывали водными растворами этих веществ с конечными концентрациями 50, 500 µM и 1 мМ. Такие конечные концентрации веществ были выбраны на основе данных литературы.
Оценка антипролиферативной активности и цитотоксичности тестируемых веществ.
Клетки мышиной меланомы линии B16-F10 размещались в специальных инкубаторах с ячейками (до 105 клеток в каждой) и культивировались в стандартных условиях, как указано выше. На следующий день в питательную среду к клеткам добавлялись растворы исследуемых веществ с заданной конечной концентрацией и инкубировались в течении 24, 48 и 72 часов. По истечению данных интервалов времени, клетки смывались со дна ячеек инкубатора с помощью 1 мМ раствора ЭДТА, центрифугировали со скоростью 500 оборотов/мин в течение 10 минут на центрифуге Minifuge T (Haereus, Sepatech) и подсчитывалось их количество по методике с использованием предметного стеклышка с нанесенной сеткой и оптического микроскопа.
Процент пролиферации клеток, инкубированных с тестируемыми веществами, высчитывался следующим образом:
Уровень пролиферации (%) = (N° обработанных веществом клеток / Nк контрольных клеток) x 100.
Для оценки цитотоксичности веществ подсчитывалось количество клеток в присутствии красителя 1% Trypan Bluе, после окрашивания погибших клеток в синий цвет, и вычислялось по формуле:
Цитотоксичность (%) = (N° окрашенных клеток / Nоб всех клеток) x Определение внутриклеточных уровней ПА. Хроматографический метод модифицировали специально для определения уровней ПА в лизате клеточной культуры мышиной меланомы линии B16-F10. Перед хроматографическим разделением свободные ПА переводились в соответствующие производные путем химической модификации о-фтальальдегидом (1:1).
Депротеинезация клеточного лизата осуществлялась добавлением раствора перхлорной кислоты, с последующим центрифугированием (14.000 оборотов/мин в течении 15 мин) и фильтрованием супернатанта. Определение было выполнено на аппарате AKTABASIC HPLC (Amersham Pharmacia Biotech., Milan, Италия). Обратнофазовые разделения проводились при комнатной температуре в колонках LC-18 Supelcosyl column (150mm x 4,6mm, 3 µm) (Supelco, Milan, Италия).
Определение активности ТГ «in vivo» и «in vitro». Клетки мышиной меланомы линии B16 F10 инкубировались вместе с 14[C]-метиламином (0.5 µл/мл MEM) (стандартная радиоактивность: 38.15 mCi/mmole) и тестированными веществами с соответствующей конечной концентрацией в течении 48 и 72 часов. Клетки лизировали, добавляя раствор ТХУ.
Осадок многократно промывался 10% раствором ТХУ и центрифугировали, повторяя промывание более 6 раз. Радиоактивность в осадке и супернатанте измерялась на сцинцилляторе (Трио-carb 2100, PACKARD, производительность 70-90%).
Определение прямого действия ТГ проводилось следующим методом. Лизат из клеток мышиной меланомы B16-F10 инкубировался с радиоактивным 3[H]-Пут и раствором исследуемого вещества с заданной конечной концентрацией в течение 1 часа. Реакция останавливалась в течении 30 минут на льду путем добавления в пробу смеси 10% раствора ТХУ с 200 мМ раствором метиламина. Выпавший осадок промывался, и измерялась его радиоактивность согласно методу определения активности ТГ «in vivo», описанному выше.
Определение уровней меланина внутри клеток. Клетки мышиной меланомы B16-F культивировались в стандартных условиях, как указано выше. По истечению суток менялась среда, и они обрабатывались тестируемыми веществами. Определения проводились через 48 и 72 часа. Клетки смывались с помощью раствора 1 мМ ЭДТА, центрифугировались (500 об/мин, 10 мин), суспендировались в фосфатном PBS-буфере (состав буфера: 150 мМ NaCl, 10 мМ трис-HCl, рН 7,5) и снова центрифугировались. Осадок растворялся в 1 мл лизирующего буфера (состав буфера: трис-HCl 50мM, ЭДТА 2мM, NaCl 150мM, Triton-X-100 1%, ингибиторы протеазы: PMSF 200мM, леупептин 1мг/мл, бестатин 1мг/мл, пепстатин A 1мг/мл, апротинин 1мг/мл и бензамидин 1M). Полученный раствор оставлялся на льду под действием ультразвуковой машины в течении 30-40 секунд. После этого проба переносилась в эппендорф и центрифугировалась (12000 об/мин, 5 мин). Супернатант сохранялся для определения уровня белков (по методу Bradford, см. ниже). К осадку добавлялся 1 мл смеси этанола и эфира (1:1) и раствор центрифугировался. Промывание повторялось. К конечному осадку добавлялся 1 мл 1N раствора NaOH, и проба оставлялась в термостате при температуре 37°C до полного растворения осадка. Измерялась абсорбция полученного раствора на спектрофотометре при длине волны 475 нм. Концентрация меланина вычислялась по стандартному калибровочному графику.
Количественный анализ белка. Выполнялся по методу Брэдфорда (Bradford, 1976).
Смешивались 200 µл BIORAD (реакционная смесь), 790 µл воды и 10 µл клеточного осадка.
Через 10 минут, эта смесь переносилась в кювету, и считывалась абсорбция на спектрофотометре (UVIKON 860-spectra) при длине волны 595нм. Концентрация белка в пробе рассчитывалась с помощью калибровочного графика, построенного для бычьей альбуминовой сыворотки, растворенной в 0.1N растворе NaOH, в качестве стандарта.
Количество белка в пробах из исследуемых тканей для расчета удельной активности ПАО и ДАО определялась по Lowry (1951) в модификации С.П. Сяткина (1981).
Статистический анализ данных. Статистический анализ полученных результатов проводился с помощью t-критерия Стьюдента (Афифи, Эйзен, 1982). Различия считались достоверными, если коэффициент вероятности случайных событий был меньше P 0,05.
Результаты исследования Исследовалось влияние производных метилксантина и гетероциклических веществ оригинального синтеза из групп А, Б, В, Г, Д на обмен ПА в тканях с повышенной клеточной пролиферацией. Тестирование проводилось на двух уровнях:
1. Бесклеточный. В качестве моделей для исследований использовались две бесклеточные тест-системы из тканей с повышенным митотическим индексом:
регенерирующая печень крыс – быстро пролиферирующая ткань с усиленным синтезом ПА за счет повышения активности ОДК и с нормальной активностью аминоксидаз (ПАО и ДАО), солидная гепатома крыс Г-27 – опухолевая ткань с повышенной «патологической» клеточной пролиферацией, характеризующейся нормальной или незначительно повышенной активностью ОДК и практически полной потерей активности аминоксидаз (ПАО и ДАО).
2. Клеточный. Тестирование проводилось на клеточной культуре мышиной меланомы линии B16-F10 с высокой метастатической активностью.
1. Исследование биохимических свойств гетероциклических веществ оригинального синтеза на бесклеточном уровне.
1.1. Тест-система из регенерирующей печени крыс.
Количественная оценка влияния синтетических аналогов ПА из исследуемых групп на обмен ПА в бесклеточной тест-системе из регенерирующей печени крыс определялась характером и величиной их действия на активность аминоксидаз - ПАО и ДАО. Полученные Активность АО, нкат/мг белка белка экспериментальные данные представлены на рисунках 1-3.
Пут Сд См ль А А А 1А 2А 3А 4А 5А 6А 7А 8А 9А ро нт Ко Вещества Примечание. Результаты представлены в виде M± m для 9 измерений.
Рис. 1. Влияние производных бензимидазола и азафлуорена (группа А) на скорость окислительного дезаминирования Пут, Сд и См в бесклеточной тест – системе из регенерирующей печени крыс.
Полученные результаты (рис. 1) свидетельствуют о том, что все исследованные вещества группы А, кроме 1А, существенно увеличивают распад См. Окисление Пут ускоряют соединения 3А, 10А и 12А, а Сд – 4А, 7А, 9А и 10А.
Как видно из диаграммы (рис. 2), все протестированные соединения группы Б вызывали статистически достоверные изменения в скорости окислительного дезаминирования ПА.
Активность АО, нкат/мг белка белка Пут Сд См ль Б Б 1Б 2Б 3Б 4Б 5Б 6Б 7Б 8Б 9Б ро нт Ко Вещества Примечание. Результаты представлены в виде M± m для 9 измерений.
Рис. 2. Влияние производных анилина (группа Б) на скорость окислительного дезаминирования Пут, Сд и См в бесклеточной тест – системе из регенерирующей печени крыс.
Вещество 9Б ингибировало дезаминирование Сд, а вещество 11Б – Пут и См. Это позволяет прогнозировать у них канцерогенные свойства. Все остальные вещества проявили канцеростатические свойства, активируя процесс окислительного дезаминирования. Довольно резкая активация См наблюдалась при действии вещества 5Б. Наибольшее активирующее действие на окислительный распад всех трех ПА оказало вещество 3Б.
Все тестируемые вещества группы В также вызывали статистически достоверные изменения активностей ДАО и ПАО (рис. 3).
Активность АО, нкат/мг белка белка Пут 8 Сд См ль А А А А А А А А А ро Со Со Со Со Со Со Со Со Со нт Ко Вещества Примечание. Результаты представлены в виде M± m для 9 проб Рис. 3. Влияние производных диоксаборенинопиридина (группа В) на скорость окислительного дезаминирования Пут, Сд и См в бесклеточной тест – системе из регенерирующей печени крыc.
Процесс окислительного дезаминирования Пут значительно ингибировался всеми тестируемыми веществами этой группы. Скорость окислительного дезаминирования Сд уменьшалась в 2 раза, См - уменьшалась незначительно или оставался неизменным (при действии СоА2 и СоА3). Это позволило предположить наличие у всех исследуемых веществ данной группы канцерогенных свойств.
Влияние тестируемых веществ из группы А на обмен ПА в ткани регенерирующей печени оценивались по характеру и силе их действия на скорость синтеза ПА. Результаты этой серии опытов представлены в таблице 7 и на рис. 4.
Таблица 7.
Влияние производных бензимидазола и азафлуорена (группа А) на активность ОДК в бесклеточной тест – системе из регенерирующей печени крыс Ингибирование, Вещество Активность ОДК, нкат/мг белка % 12,96±0,07 Контроль 6,32± 0,05* 51, 1А 7,25±0,08* 44, 2А 4,26±0,06* 67, 3А 8,33±0,07* 35, 4А 9,23±0,05* 28, 5А 10,98±0,07* 15, 6А 8,00±0,06* 38, 7А 3,61±0,08* 72, 8А 5,02±0,06* 61, 9А 2,18±0,06* 83, 10А 10,00 ±0,08* 22, 11А 7,56±0,06* 41, 12А Примечание Результаты представлены в виде M± m для 9 проб *Статистически достоверные отличия от контроля, P0, е ка А в о ть О К н т/м бе ка б л Д, ка г л кти н с ль А А А 1А 2А 3А 4А 5А 6А 7А 8А 9А ро нт Ко Вещества Рис. 4. Влияние производных бензимидазола и азафлуорена (группа А) на активность ОДК в бесклеточной тест – системе из регенерирующей печени крыс.
Следует отметить, что все исследованные вещества проявили ингибирующее действие на активность ОДК. Самыми активными оказались вещества 1А,3А, 8А и 10А.
Уровни ПА рассматривались как интегральные показатели изменения баланса скорости распада и синтеза ПА под влиянием тестируемых веществ. Результаты представлены на рис. 5.
Концентрации ПА, нмоль/мл Путресцин Спермидин 20 Спермин ль А А А 1А 2А 3А 4А 5А 6А 7А 8А 9А ро нт Ко Вещества Примечание. Результаты представлены в виде M± m для 9 проб Рис. 5. Влияние производных бензимидазола и азафлуорена (группа А) на уровни ПА в бесклеточной тест – системе из регенерирующей печени крыс.
Все исследованные соединения вызывали снижение уровней Пут и ПА. Наиболее эффективными оказались 3А, 8А и 10А.
1.2 Тест-система из гепатомы Г-27 крыс.
Количественная оценка влияния тестируемых соединений на скорость синтеза ПА в бесклеточной тест-системе из гепатомы Г-27 крыс проводилась аналогичным образом.
Результаты этой серии опытов представлены в таблице 8 и на рис. 6.
Таблица 8.
Влияние производных бензимидазола и азафлуорена (группа А) на активность ОДК в бесклеточной тест – системе из гепатомы Г-27 крыс Активность ОДК, Ингибирование, Вещество нкат/мг белка % 15,79±0,06 Контроль 7,36± 0,06* 53, 1А 8,64±0,08* 45, 2А 5,32±0,07* 66, 3А 9,21±0,05* 41, 4А 10,58±0,06* 33, 5А 12,36±0,08* 21, 6А 9,18±0,06* 41, 7А 4,75±0,07* 69, 8А 6,32±0,07* 59, 9А 3,95±0,06* 74, 10А 12,07±0,09* 23, 11А 8,39±0,07* 46, 12А Примечание. Результаты представлены в виде M± m для 9 проб.
*Статистически достоверные отличия от контроля, P0, Полученные данные указывают на то, что все исследованные вещества проявили ингибирующее действия на активность ОДК. Наиболее эффективными ингибиторами оказались вещества 3А, 8А, 9А и 10А.
кат/м белка белка г кти н сть О К, н Д А во ль А А А 1А 2А 3А 4А 5А 6А 7А 8А 9А ро нт Ко Вещества Примечание. Результаты представлены в виде M± m для 9 проб.
Рис. 6. Влияние производных бензимидазола и азафлуорена (группа А) на активность ОДК в бесклеточной тест – системе из гепатомы Г-27 крыс Все протестированные вещества группы А так же, как и в серии опытов с регенерирующей печенью, вызывали понижение уровней ПА (рис. 7). Соединения 3А, 8А, 9А и 10А были ааааааа наиболее активными.
Концентрации ПА, нмоль/мл 40 Путресцин Спермидин 30 Спермин ль А А А 1А 2А 3А 4А 5А 6А 7А 8А 9А ро нт Ко Вещества Примечание. Результаты представлены в виде M± m для 9 проб.
Рис. 7. Влияние производных бензимидазола и азафлуорена (группа А) на уровни ПА в бесклеточной тест – системе из гепатомы Г-27 крыс.
2. Исследование биологических свойств тестируемых веществ оригинального синтеза и производных метилксантина на клеточном уровне.
2.1. Влияние исследуемых веществ на пролиферацию клеток мышиной меланомы линии B16-F10.
Оценка влияния тестируемых веществ на пролиферацию клеток мышиной меланомы линии B16-F10 проводилась путем сравнения количества клеток после инкубации с одним из веществ с заданной концентрацией в течении 24, 48 и 72 часов с контрольными клетками (без обработки веществами). Результаты представлены на рис. 8-9.
После 24, 48 и 72 часов инкубации с веществами группы Г было отмечено в разной степени увеличение клеточного роста (рис. 8а). Вещества группы Д (рис. 8б) существенно снижали скорость роста клеток мышиной меланомы B16-F10. Самой высокой антипролиферативной активностью обладало вещество 1Д в концентрации 25 µМ, а также 3Д в той же концентрации, после 48 и 72 часов инкубации.
Контроль Контрол 300 ь 1Г 5µМ 1Д 25 uM 1Г 100µМ 2Г 5µМ 2Д 25 uM 2Г 100µМ 3Д 25 uM 3Г 5µМ 3Г 100µМ Пролиферация, % Пролиферация, % 50 0 24 ч 48 ч 72 ч 24 ч 48 ч 72 ч а) б) Примечание: Результаты представлены в виде M± m для 4 проб.
Рис 8. Влияние производных пиперидона (группа Г) (а) и производных азафлуорена (группа Д выборочная) (б) на пролиферацию клеток мышиной меланомы линии B16-F10.
Все вещества группы производных метилксантина снижали уровень роста клеток мышиной меланомы B16-F10 (рис. 9а). Наиболее активным оказался ТФ в концентрации 1мМ на протяжении всего периода инкубирования.
Контроль Контроль 120 ТФ 1 mM Теобромин 1 mM ТФ-7-Ац 1 mM Кофеин 1 mM 100 100 8-Br-ТФ 1 mM 8-Cl-ТФ 1 mM Пролиферация, % Пролиферация, % 80 60 40 20 0 24 ч 48 ч 72 ч 24 ч 48 ч 72 ч а) б) Примечание: Результаты представлены в виде M± m для 4 проб.
Рис. 9. Влияние производных метилксантина (а) и производных ТФ (б) на пролиферацию клеток мышиной меланомы линии B16-F10.
Производные ТФ также вызывали значительное снижение клеточного роста культуры клеток мышиной меланомы B16-F10 (рис. 9б). Более сильные антипролиферативные свойства показали вещества ТФ-7-Ац и 8-Cl-ТФ в концентрации 1 мМ.
2.2. Цитотоксичность исследуемых веществ. Результаты исследования цитотоксичности тестируемых веществ суммированы в таблицах 9-18. Вещества, значения цитотоксичности которых не превышают 30%, оказывают допустимый токсический эффект на клетки. Посчитана также токсичность действия растворителя (раствора подкисленного ДМСО) на клетки, значение которого берется за контроль.
Таблица Цитотоксичность вещества № 1Г в концентрациях 5 µM и 100 µM после 24, 48 и 72 часов инкубации с клетками мышиной меланомы линии B16-F10.
Время инкубации 24 ч 48 ч 72 ч 25,81 % 19,02 % 17,53 % Контроль+ДМСО 5µM 26,30 % 18,92 % 19,04 % 100µM 28,91 % 25,11 % 25,31 % Таблица Цитотоксичность вещества № 2Г в концентрациях 5 µM и 100 µM после 24, 48 и 72 часов инкубации с клетками мышиной меланомы линии B16-F10.
Время инкубации 24 ч 48 ч 72 ч 30,30 % 9,39 % 11,17 % Контроль 32,93 % 12,21 % 14,46 % Контроль+ДМСО 5µM 16,33% 17,76 % 19,05 % 100µM 18,20 % 15,80% 13,33 % Таблица Цитотоксичность вещества № 3Г в концентрациях 5 µM и 100 µМ после 24, 48 и 72 часов инкубации с клетками мышиной меланомы линии B16-F10.
Время инкубации 24 ч 48 ч 72 ч 68,03 % 36,20 % 32,71 % Контроль 69,23 % 34,18 % 35,80 % Контроль+ДМСО 5µM 61,70% 21,47 % 21,72 % 100µM 45,20% 16,50% 17,07 % Цитотоксичность веществ данной группы имеет достаточно низкие значения для обеих концентраций и всех трех интервалов времени инкубации веществ с культурой клеток мышиной меланомы линии B16-F10.
Таблица Цитотоксичность вещества № 1Д в концентрациях 5 µM, 25 µM и 100 µM после 24, 48 и 72 часов инкубации с клетками мышиной меланомы линии B16-F10.
Время инкубации 24 ч 48 ч 72 ч 19,68 % 21,70 % 15,05 % Контроль+ДМСО 5µM 18,05 % 17,11 % 15,44 % 25µM 25,30 % 20,37 % 16,53 % 100µM 33,61 % 31,61 % 32,86 % Таблица Цитотоксичность вещества № 2Д в концентрациях 5 µM и 25 µM после 24, 48 и 72 часов инкубации с клетками мышиной меланомы линии B16-F10.
Время инкубации 24 ч 48 ч 72 ч 8,1 % 9,6 % 7,6 % Контроль+ДМСО 5µM 11,4 % 12,1 % 8,2 % 25µM 21,4 % 22,8 % 21,4% Таблица Цитотоксичность вещества № 3Д в концентрациях 5 µM и 25 µM после 24, 48 и 72 часов инкубации с клетками мышиной меланомы линии B16-F10.
Время инкубации 24 ч 48 ч 72 ч 15,2 % 9,2 % 12,0 % Контроль+ДМСО 5µM 17,5 % 8,3 % 9,6 % 25µM 23,8 % 18,2 % 11,8 % Таблица Цитотоксичность вещества № 4Д в концентрациях 5 µM и 100 µM после 24, 48 и 72 часов инкубации с клетками мышиной меланомы линии B16-F10.
Время инкубации 24 ч 48 ч 72 ч 12,53 % 22,83 % 31,26 % Контроль 15,24 % 21,30 % 32,85 % Контроль+ДМСО 5µM 19,28 % 23,54 % 36,63 % 100µM 20,85 % 38,20% 43,50 % Вещества группы Д проявили также низкие показатели цитотоксичности во всех случаях, кроме вещества 4Д, где токсичность превышала предельно допустимые значения.
Таблица Цитотоксичность 8-Cl-ТФ в концентрациях 50 µM, 500 µM и 1 мM после 24, 48 и 72 часов инкубации с клетками мышиной меланомы линии B16-F10.
Время инкубации 24 ч 48 ч 72 ч 17,3 % 3,7 % 2,7 % Контроль+ДМСО 50µM 6,5 % 3,0 % 2,1 % 500µM 12,2 % 8,3 % 5,2 % 1мM 11,1 % 7,0 % 5,8 % Таблица Цитотоксичность 8-Br-ТФ в концентрациях 50 µM, 500 µM и 1 мM после 24, 48 и 72 часов инкубации с клетками мышиной меланомы линии B16-F10.
Время инкубации 24 ч 48 ч 72 ч 32,0 % 7,2 % 3,7 % Контроль+ДМСО 50µM 26,6 % 18,1 % 7,9 % 500µM 24,0 % 8,9 % 11,7 % 1мM 37,5 % 26,6 % 16,1 % Таблица Цитотоксичность ТФ-7-Ац в концентрациях 50 µM, 500 µM и 1 мM после 24, 48 и 72 часов инкубации с клетками мышиной меланомы линии B16-F10.
Время инкубации 24 ч 48 ч 72 ч 9,5 % 6,7 % 4,3 % Контроль+ДМСО 50µM 9,7 % 3,4 % 6,6 % 500µM 16,0 % 8,4 % 6,3 % 1мM 27,0 % 13,6 % 8,2 % Производные ТФ оказывали незначительное токсическое влияние на клетки мышиной меланомы B16-F10. Наиболее цитотоксичным проявило себя вещество 8-Br-ТФ.
2.3. Влияние испытуемых веществ на уровень образования полиаминов в клетках мышиной меланомы B16-F10.
Определение уровней ПА в контрольных клетках мышиной меланомы B16-F10 и в клетках, обработанных тестируемыми веществами в концентрациях с максимально проявленным антипролиферативным эффектом в пределах допустимой цитотоксичности, проводилось путем обратнофазного хроматографического разделения (ВЭЖХ), как описано выше в разделе «Материалы и методы».
На рис. 10-13 показаны хроматограммы, полученные соответственно для смеси стандартов (спермин: SPM, спермидин: SPD, путресцин: PUT, диаминоктан: DAO), для контрольных клеток мышиной меланомы B16-F10 и для клеток, инкубированных с веществами (веществом 1Д в концентрации 25 µM) в течении 48 и 72 часов.
PUT SPD DAO SPM Рис. 10. Хроматограмма смеси 4 стандартов:спермина (SPM), спермидина (SPD), путресцина(PUT) и диаминоктана (DAO).
SPD SPM DAO PUT Рис. 11. Хроматограмма ПА, экстрагированных из контрольных клеток мышиной меланомы B16-F10.
DAO SPD SPM PUT Рис.12. Хроматограмма ПА, экстрагированных из клеток мышиной меланомы B16-F10, инкубированных с веществом 1Д в концентрации 25 µM в течении 48 часов.
DAO SPD SPM PUT Рис.13. Хроматограмма ПА, экстрагированных из клеток мышиной меланомы B16-F10, инкубированных с веществом 1Д в концентрации 25 µM в течении 72 часов.
На хроматограммах контрольных (рис.11) и обработанных веществом 1Д (рис.12-13) клеток уровень путресцина был ниже предельной концентрации, регистрируемой прибором в используемым нами методом.
С другой стороны, площадь пиков спермина (SPM) и спермидина (SPD) в клетках, инкубированных с веществом 1Д в концентрации 25 µM в течении 48 и 72 часов, заметно уменьшилась по сравнению с пиками контрольных клеток. Уровни ПА в контрольных и обработанных веществами клетках вычислялись по калибровочному графику концентраций стандартов и пересчитывались на количество белка в каждой пробе.
На диаграмме (рис. 14) суммированы полученные результаты. Уровни ПА, выраженые в нмоль/мг белка, даны в зависимости от времени инкубации.
нмоль полиамина/мг белка См Сд оллр Контроль 1Д 48ч 1Д 72ч Примечание: Результаты представлены в виде M± m для 3 проб.
Рис.14. Уровни См и Сд в контрольных клетках мышиной меланомы B16-F10 и в клетках, инкубированных с веществом 1Д в концентрации 25 µM в течении 48 и 72 часов.
Количество См в клетках под влиянием вещества 1Д в концентрации 25 µM снизилось на 40,7% после 48 часов инкубации и на 41,1% после 72 часов по сравнению с его уровнем в контрольных клетках.
Вещество 1Д вызвало понижение уровней Сд на 47%, действуя 48 часов, и на 57,3% после 72 часов действия по сравнению с контролем.
Следуя той же методике, проводилось исследование лизата клеток мышиной меланомы B16-F10, предварительно инкубированных в течении 48 и 72 часов с 1 мМ растворами ТФ и КФ и производных ТФ. Аналогичным способом были посчитаны уровни ПА в пробах. Результаты представлены на рис. 15.
Спм Спм 72ч 48ч 12 Спд Спд нмоль полиамина / мг белка нмоль полиамина / мг белка 8 6 4 2 0 Контроль ТФ КФ Контроль ТФ КФ а) б) Примечание: Результаты представлены в виде M± m для 3 проб.
Рис. 15. Уровни ПА в контрольных клетках мышиной меланомы B16-F10 и в клетках, инкубированных с ТФ и КФ в концентрациях 1 мM в течении 48 (а) и 72 часов (б).
Диаграммы, отражающие результаты хроматографического измерения содержания ПА в клетках мышиной меланомы B16-F10, предварительно инкубированных с 1 мM растворами ТФ и КФ в течение 48 (рис. 15а) и 72 часов (рис. 15б), показывают наличие незначительного понижение уровней ПА. Снижение уровней См и Сд наблюдалось лишь в течение 48 часов воздействия веществ. Далее количество ПА в клетках практически не менялось.
Спм Спм 48ч 72ч 12 Спд Спд нмоль полиамина / мг белка нмоль полиамина / мг белка 10 8 6 4 2 0 8-Cl-ТФ 8-Br-TФ 8-Cl-ТФ 8-Br-TФ Контроль ТФ Контроль ТФ а) б) Примечание: Результаты представлены в виде M± m для 3 проб.
Рис. 16. Уровни ПА в контрольных клетках мышиной меланомы B16-F10 и в клетках, инкубированных с производными ТФ в концентрациях 1 мM в течении 48 (а) и 72 часов (б).
Производные ТФ в концентрации 1мМ также оказывали противоопухолевое влияние, понижая уровни ПА (рис. 16). Самым активным образом проявил себя 8-Br-ТФ, уменьшая уровень См более, чем на 40% и Сд более, чем в два раза, после 48 и 72 часов инкубации клеток меланомы с веществами. Хлор-производное (8-Cl-ТФ) в той же концентрации было менее активным, чем 8-Br-ТФ. Тем не менее, оно намного превышало онкопротекторную активность ТФ, вызывая существенное снижение содержания См и Сд, после 48 и 72 часов воздействия на клетки.
2.4. Влияние испытуемых веществ на активность ТГ в клетках мышиной меланомы B16 F10.
48ч 72ч Активность ТГ, % 1Д 2Д 3Д Контроль Примечание: Результаты представлены в виде M± m для 5 проб.
Рис. 17. Влияние веществ группы Д на активность ТГ «in vivo» в клетках мышиной меланомы B16-F10.
Из диаграммы (рис. 17) видно, что все три вещества группы Д увеличивали активность ТГ, после 72 часов инкубирования с клетками мышиной меланомы B16-F10. При этом, после часов активировало фермент лишь 1Д, остальные два вещества проявили свойства ингибиторов ТГ.
Следует отметить, что все три производных метилксантина являются активаторами ТГ. При этом ТФ наиболее эффективно действовал на ТГ, удваивая ее активность (рис. 18а).
По сравнению с ТФ его производные почти в два раза увеличивали активность ТГ, после часов инкубирования с клетками мышиной меланомы B16-F10 (рис. 18б). Интересно, что после 48 часов инкубации особого эффекта на активацию ТГ эти вещества не оказывали.
48ч 250 48ч 72ч 72ч 200 Активность ТГ, % Активность ТГ, % 150 100 50 0 Контроль ТФ КФ ТБ 8-Cl-TФ 8-Br-ТФ Контроль ТФ а) б) Примечание: Результаты представлены в виде M± m для 5 проб.
Рис. 18. Влияние производных метилксантина (а) и производных ТФ (б) на активность ТГ «in vivo» в клетках мышиной меланомы B16-F10.
Исследовали влияние веществ группы Д, производных метилксантина и ТФ на активность ТГ «in vitro». Ни одно из протестированных веществ прямого действия на ТГ активность не оказало.
2.5. Влияние испытуемых веществ на уровень образования меланина в клетках мышиной меланомы B16-F10.
На рис. 19 показаны уровни образованного меланина в клетках мышиной меланомы B16 F10, после 48 и 72 часов инкубации с веществами группы Д в концентрации 25 µM.
48ч 72ч Уровень меланина, % 1Д 2Д 3Д Контроль Примечание: Результаты представлены в виде M± m для 5 проб.
Рис. 19. Влияние веществ группы Д на уровень образования меланина в клетках мышиной меланомы B16-F10.
По сравнению с контрольными клетками, в клетках, обработанных веществами 2Д и 3Д, уровень меланина практически не изменялся после 48 часов инкубации и незначительно увеличивался, после 72 часов инкубации. Резкое и многократное возрастание количества выработанного меланина наблюдалось у клеток, обработанных веществом 1Д.
Значительное влияние на уровень образования меланина в клетках мышиной меланомы B16-F10 оказали производные метилксантина в концентрации 1 мМ (рис. 20а), повышая его во много раз уже через 48 часов инкубации. Наиболее активным образом из этой группы веществ проявил себя ТФ.
Производные ТФ в концентрации 1 мМ резко увеличивали уровни образования меланина в клетках лишь через 72 часа инкубации (рис. 20б), это говорит об их относительно замедленном действии по сравнению с ТФ.
48ч 600 48ч 72ч 72ч Уровень меланина, % Уровень меланина, % 300 0 8-Cl-ТФ 8-Br-ТФ Контроль ТФ Контроль ТФ КФ ТБ а) б) Примечание: Результаты представлены в виде M± m для 5 проб.
Рис. 20. Влияние производных метилксантина (а) и производных ТФ (б) на уровень образования меланина в клетках мышиной меланомы B16-F10.
Полученные результаты по количественной оценке влияния тестируемых веществ на активность ТГ и уровни меланина подтверждают предположение о том, что антипролиферативный эффект может быть вызван посредством индукции клеточной дифференциации.
2.6. Влияние тестируемых веществ на дифференцировку клеток мышиной меланомы В16-F На фотографиях, сделанных оптическим микроскопом (рис. 21), можно наблюдать появление видимых морфологических изменений в клетках, обработанных раствором вещества 1Д. В клетках, инкубированных 48 часов с веществом 1Д 25 µM, четко заметны признаки дифференцировки – появление цитозольных отростков, схожих с дендритами нейронов (эмбриональное происхождение этой ткани – нейроэктодерма). Внешне клетки выглядят намного темнее по сравнению с контролем, что объясняется повышенной выработкой в них меланина.
а) б) Рис. 21. Клетки меланомы B16-F10: а) контроль;
б) после 48 часов действия вещества 1Д при концентрации 25µМ.
При инкубировании клеток мышиной меланомы B16-F10 с 1мМ раствором ТФ одновременно с торможением скорости деления и роста клеток наблюдалось начало дифференцировки клеток, что подтверждалось появлением отростков, похожих на дендриты и аксоны нейронов, а также заметное потемнение клеток (рис. 22). Это говорит об увеличении уровня внутриклеточного меланина.
а) б) Рис.22. Влияние ТФ на дифференцировку клеток мышиной меланомы B16-F10:
а) контрольные клетки мышиной меланомы B16-F10;
б) дифференцированные клетки мышиной меланомы B16-F10 под действием 1мМ ТФ.
ВЫВОДЫ 1. Производные диоксаборенинопиридина и бензимидазола снижают скорость окислительного дезаминирования путресцина и полиаминов, проявляя тем самым канцерогенные свойства.
2. Производные анилина существенно ускоряют окислительный распад путресцина и ПА, проявляя тем самым потенциальные антипролиферативные свойства.
3. Производные азафлуорена на бесклеточном уровне (тест-системы из регенерирующей и опухолевой ткани) демонстрируют потенциальные онкопротекторные свойства, существенно снижая уровни и скорость синтеза путресцина и полиаминов, при этом существенно повышая скорость окислительного дезаминирования этих веществ.
4. Наиболее активные производные азафлуорена (1-амино-4-азафлуоренон-9;
1-бром-4 азафлуоренон-9;
1-амино-2-бром-4-азафлуоренон-9;
1-амино-9-фениламино-4-азафлуорен) на клеточном уровне (клетки мышиной меланомы B16-F10) также проявляют противоопухолевые свойства, снижая скорость пролиферации (на 25-70%) и внутриклеточные уровни полиаминов (на 40-60%). Эти вещества увеличивают активность трансглутаминазы (в 1,5-3 раза) и индуцируют выработку меланина (в 1,5 – 8 раз), вызывают морфологические изменения в клетках (появление цитозольных отростков), демонстрируя свойства индукторов клеточной дифференциации.
5. Производные пиперидона проявляют пролиферативные свойства, увеличивая скорость клеточного роста (клетки мышиной меланомы B16-F10) в 1,5-2 раза.
6. Ксантиновые производные замедляют скорость клеточной пролиферации (клетки мышиной меланомы B16-F10) на 20-60%, снижают внутриклеточные уровни полиаминов на 30-40%, увеличивают активность трансглутаминазы в 1,5-2 раза, активируют выработку меланина в 3-5 раза, вызывают морфологические изменения в клетках (появление цитозольных отростков), проявляя онкопротекторные свойства.
7. Ни одно из протестированных производных азафлуорена и ксантина не оказало прямого действия на активность трансглутаминазы «in vitro».
8. Наиболее перспективным из тестированных веществ с точки зрения противоопухолевых свойств является 1-амино-4-азафлуоренон-9 в конечной концентрации 25 µM. Это вещество эффективнее по всем использованным при тестировании показателям, чем наиболее активные производные пуриновых алкалоидов в концентрации1 мМ.
Список опубликованных работ по теме диссертации 1. Golomazova K., Syatkin S., Svinarev V., Fedoronchuk T., Shevchenko A. Carcinogenic and Carcinostatic Properties of Psychotropic Medications //. - Amino Acids - Springer Wien New York, Vol.29(1), 2005. – Р.20-21.
2. Шевченко А.А., Голомазова К.А. Канцерогенные свойства психотропных препаратов // Материалы четвертой международной конференции студентов и молодых ученых "Актуальные вопросы спортивной медицины, лечебной физической культуры, физиотерапии и курортологии". – М.: РГМУ, Апрель 2005 г. - С. 45- 3. Голомазова К.А., Шевченко А.А. Пролиферативные свойства синтетических аналогов полиаминов // Материалы четвертой международной конференции и молодых ученых "Актуальные вопросы спортивной медицины, лечебной физической культуры, физиотерапии и курортологии". – М.: РГМУ, Апрель 2005 г. - С. 27- 4. Шевченко А.А., Голомазова К.А. Влияние структурных аналогов полиаминов на скорость окислительного дезаминирования путресцина, спермидина и спермина в ткани регенерирующей печени крыс // Материалы итоговой научной студенческой конференции. – М.: РУДН, Апрель 2005 г. – С. 109-110.
5. Сяткин С.П., Голомазова К.А., Левов А.Н., Федорончук Т.В., Свинарев В.И., Шевченко А.А., Березов Т.Т. Канцерогенные и канцеростатические свойства производных бензимидазола и азафлуорена как структурных аналогов полиаминов // Материалы межрегиональной научно практической конференции, посвященной 85-летию самарского государственного медицинского университета «Новая идеология в единстве фундаментальной и клинической медицины». – Самара:, июнь 2005 г.- С. 389-393.
6. Шевченко А.А. Доклинические исследования структурных аналогов полиаминов как потенциальных противоопухолевых агентов // Материалы всероссийской научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Перспектива-2006». – Нальчик: Каб. Балк.ун-т., Апрель 2006. - С. 87-91 (0,4 п.л.).
7. Berezov T., Syatkin S.,Golomazova K., Levov A.,Fedoronchuk T., Svinarev V., Shevchenko A.
Carcinogenic and carcinostatic properties of benzimidazole and azafluorene derivatives as a polyamines structural analogs // The 20th IUBMB International Congress of Biochemistry and Molecular Biology and 11th FAOBMB Congress, Kyoto, Japan (June 2006). – P. 188.
8. S.P. Syatkin, K.A. Golomazova, A. Levov, T.V. Fedoronchuk, V.I. Svinarev, A.A. Shevchenko, T.T.
Berezov. Quantitative evaluation of benzimidazole and azafluorene derivatives influence on polyamine metabolism as potential antitumor agents // International Conference on the Role of Polyamines and their Analogs in Cancer and Other Diseases, Tivoli (Rome), Italy (September, 2006) – P. 231- 9. V.A. Frolov, S.P. Syatkin, K.A. Golomazova, V.I. Svinarev, A.A. Shevchenko, T.V. Fedoronchuk.
The influence of psychotropic medications on polyamines metabolism in tissues with high rate of proliferation // International Conference on the Role of Polyamines and their Analogs in Cancer and Other Diseases, Tivoli (Rome), Italy (September, 2006) – P. 217- 10. Lentini A., Provenzano B., Caraglia M., Shevchenko A., Abbruzzese A. and Beninati S. Impairment of the metastatic activity of melanoma cells by transglutaminase-catalyzed incorporation of polyamines into laminin and Matrigel. Amino Acids, Volume 34, Number 2, 2008. (Printed in The Netherlands). – Р.251- 11. Натрошвили Н. Г., Неборак Е. В., Шевченко А.А. Влияние производных диоксаборининопиридина на скорость окислительного дезаминирования полиаминов. // Итоговая конференция студенческого научного общества медицинского факультета РУДН «Клинические и теоретические аспекты современной медицины», 24 – 27 апреля 2007 г./ Материалы конференции. – М.: РУДН, 2007. – с. 97.
12. Неборак Е.В., Натрошвили Н. Г. Шевченко А. А. Окислительное дезаминирование путресцина, спермидина и спермина на фоне действия аналогов полиаминов анилинового ряда //Итоговая конференция студенческого научного общества медицинского факультета РУДН «Клинические и теоретические аспекты современной медицины», 24 – 27 апреля 2007 г./ Материалы конференции. – М.: РУДН, 2007. – с. 98.
13. Сяткин С.П., Фролов В.А., Голомазова К.А., Левов А.Н., Федорончук Т.В., Свинарев В.И., Шевченко А.А., Неборак К.В., Натрошвили Н.Г. Применение окислительного дезаминирования полиаминов и путресцина при мониторинге канцерогенных и противоопухолевых свойств производных бензимидазола и азафлуорена // Материалы XV международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии. и экологии», 31 мая-10 июня, 2007, Гурзуф. - 2007. - С. 92-94.
14. A. Shevchenko, S. Beninati. A new synthetic polyamine analogue reduces B16-F10 melanoma cells proliferation by the enhancement of transglutaminase activity // 10th International Congress on Amino Acids. Kallithea, Greece (August 20-25, 2007). - Amino Acids - Springer Wien New York, Vol.33, 2007 - P. 15. S.P. Syatkin, K.A. Golomazova, T.V. Fedoronchuk, A.N. Levov, T.T. Berezov, V.I. Svinarev, A.A.
Shevchenko, N.G. Natroshvili, E.V. Neborak. Prediction of antiproliferative and carcinogenic properties of benzimidazole and azafluorene derivatives as synthetic structural analogs of polyamines // 10th International Congress on Amino Acids. Kallithea, Greece (August 20-25, 2007).
- Amino Acids - Springer Wien New York, Vol.33, 2007 - P. 43.
16. Т.Т.Березов, В.А.Фролов, С.П.Сяткин, К.А. Голомазова, Т.В. Федорончук, А.А. Шевченко, А.Н.Левов. Прогноз возможных онкопротекторных и канцерогенных свойств структурных аналогов полиаминов из группы производных бензимидазола и азафлуорена. Вестник РУДН.
– 2007. - № 6. – С. 331-335.
17. С.П.Сяткин, Т.Т.Березов, В.А.Фролов, К.А. Голомазова, А.Н.Левов, А.А. Шевченко, Т.В.
Федорончук. Прогноз канцерогенных и противоопухолевых свойств производных бензимидазола и азафлуорена. Вестник РУДН. – 2007. - № 6. – С. 70-73.
Список сокращений ПА – полиамины PBS – фосфатный буфер ТГ – трансглутаминаза BSA - Bovine Serum of Albumine (бычья ТФ – теофиллин альбуминовая сыворотка) КФ – кофеин ПАО – полиаминоксидаза ДАО – диаминоксидаза 8-Br-ТФ – 8-бромтеофиллин ОДК – орнитиндекарбоксилаза 8-Cl-ТФ – 8-хлортеофиллин ТФ-7-Ац – теофиллин-7-ацетат ВЭЖХ – высокоэффективная жидкостная хроматография D-MEM – Dulbecco‘s modified Eagle’s medium (питательная среда) См, SPM – спермин FCS – Fetal Calf Serum (бычья эмбриональная Сд, SPD – спермидин сыворотка) Пут, PUT – путресцин ДМСО – диметилсульфоксид DAO – диаминоктан ТХУ – трихлоруксусная кислота Благодарности 1. Левову А.Н. (к.х.н., доцент) – синтезировал и предоставил для исследования вещества оригинального синтеза из числа гетероциклических производных бензимидазола, азафлуорена, анилина, диоксаборенинопиридина и пиперидона.
2. Симоне Бенинати – профессору, зав. кафедрой клеточной биологии Второго Римского Университета «Tor Vergata» за предоставленную возможность проведения научных исследований в рамках проекта в период прохождения зарубежной научной стажировки (2006 2007), финансированной президентом Российской Федерации.
Шевченко Анна Александровна Канцеростатические и канцерогенные свойства синтетических аналогов полиаминов Данная работа посвящена исследованию антипролиферативных и противоопухолевых свойств структурных аналогов полиаминов из группы производных метилксантина и веществ оригинального синтеза. Исследование проводилось на бесклеточных моделях, полученных из регенерирующей печени крыс и гепатомы Г-27 крыс, и на клеточных культурах мышиной меланомы B16-F10. В ходе эксперимента было оценено влияние указанных выше веществ на активность аминоксидаз, орнитиндекарбоксилазы, трансглутаминазы, антипролиферативую активность, на уровни полиаминов и меланина в бесклеточных тест-сисемах и в клетках.
Shevchenko Anna Alexandrovna Carcinostatic and carcinogenic properties of synthetic polyamine analogues.
This work is dedicated to investigation of antiproliferative and antitumor properties of structural analogues of polyamines – methilxantines and original synthesis substances. The investigation was carried out on non-cellular models, obtained from regenerating rat liver and rat hepatoma Г-27, and on the cell culture of murine melanoma line B16-F10. Influence of cited above substances on amineoxydase, ornitinedecarboxylase, transglutaminase and antiproliferative activity, levels of polyamines and melanin was assessed in the non-cellular testing models and in the cells.