Морфофункциональное состояние печени при модели ровании синдрома рейе и коррекции его гепатопротек торами
На правах рукописи
ШАМАРДИНА ЛЮБОВЬ АЛЕКСАНДРОВНА МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ ПЕЧЕНИ ПРИ МОДЕЛИ РОВАНИИ СИНДРОМА РЕЙЕ И КОРРЕКЦИИ ЕГО ГЕПАТОПРОТЕК ТОРАМИ 03.00.25 – гистология, цитология, клеточная биология 14.00.25 – фармакология, клиническая фармакология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
Томск – 2004 2
Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации» Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор Суходоло Ирина Владимировна доктор медицинских наук, профессор, за служенный работник высшей школы РФ Венгеровский Александр Исаакович
Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Красноженов Евгений Павлович доктор медицинских наук, профессор Хазанов Вениамин Абрамович
Ведущая организация: Новосибирская государственная медицинская академия
Защита состоится «»2004 г. в ч. на заседании диссертационного совета Д 208.096.03 в Сибирском государственном меди цинском университете по адресу: 634050, г. Томск, Московский тракт, 2.
С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке Си бирского государственного медицинского университета (634050, г. Томск, пр. Ленина, 107).
Автореферат разослан «_» «_» 2004 г.
Ученый секретарь диссертационного совета А.В. Герасимов
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы Синдром Рейе проявляется как острая энцефалопатия в сочетании с тяже лым нарушением функций печени. Большинство больных – дети школьного и дошкольного возрастов. Основная часть случаев синдрома Рейе связана с прие мом противовоспалительных и противогистаминных лекарственных средств на фоне вирусных инфекций верхних дыхательных путей, ветряной оспы, диареи вирусной этиологии [Reye R. et al., 1963;
Monto A.S., 1999;
Thabet F. et al., 2002]. Летальность при данной патологии составляет 85% [Hayase, Y., 1997;
Yoshida Y. et al., 1999;
Thabet F. et al., 2002]. В патогенезе синдрома Рейе ос новное значение имеет повреждение митохондрий гепатоцитов с нарушением биоэнергетики, -окисления длинноцепочечных и среднецепочечных жирных кислот и синтеза мочевины. Дефекты метаболизма часто обусловлены умень шением содержания свободного карнитина [Glasgow F. T. et al., 1999;
Kakuda T.N., 2000;
Szewczyk A., 2002].
Моделью синдрома Рейе, наиболее близкой к нему по структурно метаболическим проявлениям, является поражение печени и головного мозга, вызванное 4-пентеноевой (аллилуксусной) кислотой [Glasgow A. M., 1975]. Ши рокое распространение, высокая летальность и недостаточная эффективность современных методов фармакотерапии синдрома Рейе определяют необходи мость изучения лекарственных препаратов, способных сдерживать прогресси рование поражения печени и способствовать восстановлению ее детоксикаци онной функции, что снизит токсическую нагрузку на головной мозг.
Созданные кафедрами фармакологии и фармацевтической технологии Сибирского государственного медицинского университета совместно с Том ским институтом химии нефти СО РАН и Тихоокеанским институтом биоорга нической химии ДВО РАН гепатопротекторы эплир (комплекс полярных липи дов озерного илового осадка, содержащий фосфолипиды, сульфолипиды и ка ротиноиды), лохеин (экстракт сибирского растения солянка холмовая, вклю чающий бетаин, флавоноиды и минеральные вещества), максар (полифенолы дальневосточного растения маакия амурская) проявляют при токсическом гепа тите более высокую гепатопротективную активность, чем зарубежные гепато протекторы эссенциале и легалон [Саратиков А.С., Венгеровский А. И., 1995;
Шаловай А.А. и др., 1996].
Необходимо изучить воздействие данных гепатопротекторов на течение экспериментального синдрома Рейе и выбрать препарат, способный наиболее эффективно нормализовать функции печени.
Цель исследования Оценка морфофункциональных изменений в печени крыс при различных моделях синдрома Рейе и воздействии гепатопротекторов лохеина, максара, ле галона, эплира и эссенциале при экспериментальном синдроме Рейе.
Задачи исследования 1. Изучить морфофункциональные изменения в печени крыс при различ ных моделях синдрома Рейе (интоксикация 4-пентеноевой кислотой и ацетил салициловой кислотой на фоне действия пирогенала).
2. Оценить терапевтическое действие лохеина, максара и легалона, вве денных в течение 7, 14 и 30 дней после окончания инъекций 4-пентеноевой ки слоты, на морфофункциональное состояние печени крыс.
3. Оценить терапевтическое действие эплира и эссенциале, введенных в течение 7, 14 и 30 дней после окончания инъекций 4-пентеноевой кислоты, на морфофункциональное состояние печени крыс.
4. Сравнить терапевтическую эффективность лохеина, максара, эплира, эссенциале и легалона при экспериментальном синдроме Рейе.
Научная новизна работы Впервые установлено, что наиболее адекватной моделью синдрома Рейе является интоксикация 4-пентеноевой кислотой в дозе 20 мг/кг при внутри брюшинном введении крысам в течение 7 дней. Изменения ангио- и цитоархи тектоники печени при введении 4-пентеноевой кислоты в дозе 50 мг/кг 10 раз через 4 ч или ацетилсалициловой кислоты на фоне действия бактериального липополисахарида пирогенала в большей степени отличаются от морфофунк циональных проявлений синдрома Рейе. В течение 30 дней после прекращения инъекций 4-пентеноевой кислоты не происходит спонтанного восстановления морфофункциональных показателей печени у крыс.
Гепатопротекторы лохеин, максар, легалон, эплир и эссенциале проявля ют высокую терапевтическую активность при экспериментальном синдроме Рейе. Лечение экспериментальных животных этими препаратами в течение 7, 14, 30 дней сопровождается регрессом морфофункциональных нарушений в пе чени, вызванных введением 4-пентеноевой кислоты.
Эффект гепатопротекторов при экспериментальном синдроме Рейе зави сит от продолжительности фармакотерапии – максимально выраженное лечеб ное действие регистрируется при введении гепатопротекторов в течение дней. Максар и эссенциале в большей степени, чем другие гепатопротекторы, уменьшает морфофункциональные нарушения в печени крыс при эксперимен тальном синдроме Рейе.
Практическая значимость работы Экспериментально обоснована целесообразность включения лохеина, максара, легалона, эплира и эссенциале в комплексную терапию синдрома Рейе.
При его экспериментальной модели гепатопротекторы восстанавливают гисто архитектонику печени, препятствуют развитию некрозов гепатоцитов, стиму лируют процессы регенерации и нормализуют активность митохондриальных и лизосомальных ферментов.
Основные положения, выносимые на защиту 1. Внутрибрюшинное введение крысам 4-пентеноевой кислоты или аце тилсалициловой кислоты на фоне действия пирогенала позволяет воспроизве сти морфофункциональные нарушения в печени, характерные для синдрома Рейе. Наиболее адекватной моделью синдрома Рейе у крыс является интокси кация 4-пентеноевой кислотой в дозе 20 мг/кг в течение 7 дней.
2. Гепатопротекторы лохеин, максар, легалон, эплир и эссенциале, введен ные в течение 7, 14, и 30 дней на фоне интоксикации 4-пентеноевой кислотой, нормализуют гистоархитектонику печени, предотвращают развитие жировой дистрофии и восстанавливают активность внутриклеточных ферментов гепато цитов.
3. Максар и эссенциале в большей степени, чем другие гепатопротекторы, оказывают положительное влияние на течение экспериментального синдрома Рейе.
4. Лучшие результаты терапии экспериментального синдрома Рейе дости гаются при введении гепатопротекторов в течение 30 дней.
Апробация и публикации Материалы диссертационного исследования докладывались на Межре гиональной научной конференции Сибири и Дальнего Востока, посвященной 150-летию со дня рождения академика И. П. Павлова (Томск, 1999);
IV съезде Научного общества гастроэнтерологов России (Москва, 2004);
9-й Российской конференции "Гепатология сегодня" (Москва, 2004). По теме диссертации опубликовано 6 работ.
Объем и структура работы Диссертация состоит из введения, обзора литературы, посвященного строению печени при жировых дистрофиях различной этиологии, патогенезу и клинике синдрома Рейе, 4-х глав, отражающих результаты экспериментальных исследований. Работа изложена на 153 с., иллюстрирована 29 таблицами и рисунками. Библиография включает 248 источников, из них 125 зарубежных.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Эксперименты проводили в осенне-зимнее время на 600 белых беспород ных крысах-самцах массой 200-220 г. Животные находились в стандартных ус ловиях вивария, в параллельно исследуемых группах (по 20 крыс) имели оди наковую массу тела, контролируемую ежедневным взвешиванием для коррек ции вводимой дозы препаратов. Все манипуляции (взвешивание, введение пре паратов, умерщвление животных) осуществляли с 9 до 12 ч.
Исследовали две экспериментальные модели синдрома Рейе у крыс:
1) интоксикация 4-пентеноевой кислотой:
а) крысам вводили внутрибрюшинно 4-пентеноевую кислоту в дозе мг/кг 1 раз в сутки в течение 7 сут [Sakaida N. et al., 1990];
Таблица Распределение животных по экспериментальным группам Серия экспе- Распределение живот- Коли- Вводимые препараты римента ных по группам чество живот ных 1 серия Интактные животные 20 ------- Контроль 1 20 Вода для инъекций Контроль 2 20 Растворители препаратов 4-Пентеноевая кислота, 7 20 4-Пентеноевая кислота, 20 мг/кг 1 раз в инъекций сутки в течение 7 дней 4-Пентеноевая кислота, 10 20 4-Пентеноевая кислота, 50 мг/кг 10 раз инъекций через каждые 4 ч.
Ацетилсалициловая кисло- 20 Препарат ацетилсалициловой кислоты та + пирогенал для инъекций аспизол (50 мг/кг) через час после введения пирогенала (0, мг/кг) однократно 2 серия 4-Пентеноевая кислота 60 4-Пентеноевая кислота (20 мг/кг) еже дневно 7 дней, крахмальная слизь еже +крахмальная слизь, 7, 14, дневно с 8-го дня в течение 7, 14 и 30 дней дней 4-Пентеноевая кислота 60 4-Пентеноевая кислота (20 мг/кг) еже дневно 7 дней, оливковое масло еже +оливковое масло, 7, 14, дневно с 8-го дня в течение 7, 14 и дней дней 4-Пентеноевая кисло- 60 4-Пентеноевая кислота (20 мг/кг) еже дневно 7 дней, дистиллированная вода та+дистиллированная вода, ежедневно с 8-го дня в течение 7, 14 и 7, 14, 30 дней 30 дней 3 серия (фар- 4-Пентеноевая кислота 60 4-Пентеноевая кислота (20 мг/кг) еже макотерапия +лохеин, 7, 14, 30 дней дневно 7 дней, лохеин (5 мл/кг) эксперимен- ежедневно с 8-го дня в течение 7, 14 и тального син- 30 дней дрома Рейе) 4-Пентеноевая кислота + 60 4-Пентеноевая кислота (20 мг/кг) еже легалон, 7, 14, 30 дней дневно 7 дней, легалон (200 мг/кг) еже дневно с 8-го дня в течение 7, 14 и дней 4-Пентеноевая кислота + 60 4-Пентеноевая кислота (20 мг/кг) еже максар 7, 14, 30 дней дневно 7 дней, максар (200 мг/кг) еже дневно с 8-го дня в течение 7, 14 и дней 4-Пентеноевая кислота 60 4-Пентеноевая кислота (20 мг/кг) еже +эплир, 7, 14, 30 дней дневно 7 дней, эплир (30 мг/кг) еже дневно с 8-го дня в течение 7, 14 и дней 4-Пентеноевая кислота + 60 4-Пентеноевая кислота (20 мг/кг) еже эссенциале, 7, 14, 30 дней дневно 7 дней, эссенциале (80 мг/кг) ежедневно с 8-го дня в течение 7, 14 и 30 дней Итого: б) крысам вводили внутрибрюшинно 4-пентеноевую кислоту в дозе мг/кг, 10 раз через 4 ч [Sugimoto T. et al., 1990];
2) интоксикация ацетилсалициловой кислотой на фоне действия бактери ального липополисахарида пирогенала.
Крысам, не получавшим в течение 1 сут пищи, вводили внутрибрюшинно пирогенал в дозе 0,2 мг/кг и спустя 1 ч – ацетилсалициловую кислоту (аспизол, “Bayer”) в дозе 50 мг/кг однократно [Kilpatrick L. et al., 1989].
В результате проведенных исследований, была выбрана адекватная модель синдрома Рейе – интоксикация 4-пентеноевой (аллилуксусной) кислотой. Дан ная модель позволяет воспроизводить синдром Рейе, в том числе отдельные стадии патологических процессов, что подтверждается результатами морфоло гических и гистохимических исследований. Экспериментальный синдром Рейе можно использовать для оценки эффективности и установления механизма дей ствия лекарственных средств, регулирующих функции печени.
Крысы в течение 7 дней ежедневно получали внутрибрюшинные инъекции 0,5% водного раствора 4-пентеноевой кислоты в дозе 20 мг/кг. С 8-го дня после начала интоксикации крысам вводили в желудок ежедневно эплир (30 мг/кг), эссенциале (80 мг/кг), лохеин (5 мл/кг, что соответствует 160 мг/кг экстрактив ных веществ), максар (200 мг/кг) или легалон (200 мг/кг). Дозы препаратов яв ляются терапевтически эффективными [Саратиков А.С. и соавт., 2001]. Про должительность фармакотерапии составляла 7, 14 и 30 дней (табл. 1).
Лохеин применяли в виде жидкого водно-спиртового экстракта, легалон – в виде суспензии в 1% крахмальной слизи, эплир – в виде раствора в оливковом масле, эссенциале – в ампульном растворе. Навеску максара растворяли в не большом количестве этилового спирта, затем добавлением воды создавали тон кую суспензию вещества.
Через сутки после последнего введения препаратов крыс декапитировали под легким эфирным наркозом. У животных вскрывали брюшную полость, ос матривали и извлекали печень. Для исследования брали образцы центральной и периферической части правой доли печени. Образцы печени фиксировали в 10% нейтральном формалине, жидкости Карнуа и замораживали в жидком азо те. Фиксированные кусочки проводили через спирты и заливали в парафин по стандартной методике.
Парафиновые срезы толщиной 5 мкм исследовали с помощью следую щих гистологических методик:
1. окраска гематоксилином и эозином;
2. окраска по Эйнарсону на РНК и ДНК;
3. ШИК-реакция по Мак-Манусу на гликоген и гликопротеины с контро лем амилазой.
Из замороженных в жидком азоте образцов печени изготавливали срезы толщиной 5 мкм. Их окрашивали суданом черным B на липиды. Тетразолиевым методом по S. Loyda выявляли активность сукцинатдегидрогеназы, NADH2– тетразолийредуктазы, NADPH2–тетразолийредуктазы и -оксибутират дегидрогеназы [Лойда З., 1982], методом одновременного азосочетания по Burstone определяли активность кислой и щелочной фосфатаз [Лойда З., 1982].
Количественную оценку продуктов ферментативных реакций проводили одноволновым методом с помощью цитофотометра ЛЮМАМ-И-3 с объекти вом 40, размером зонда 0,1 мм в проходящем свете с длинной волны 576 нм.
Все данные выражали в условных единицах оптической плотности [Журавлева Т. Б., Прочуханов Р. А., 1978]:
A = lgI"/I, где А – оптическая плотность исследуемого поля, I" – интенсивность све тового потока, проходящего через предметное и покровное стекла микропрепа рата, минуя срез, I – интенсивность светового потока, проходящего через окра шенные участки цитоплазмы клеток.
Количественная характеристика включала анализ состояния интралобу лярных гепатоцитов и печеночных клеток пограничной пластинки. За гепато циты пограничной пластинки принимали клетки первой зоны, имеющие непо средственный контакт с портальным трактом. Состояние гепатоцитов оценива ли вокруг всех портальных трактов исследуемого препарата. Гепатоциты вто рой и третьей зон, не имеющие контакта с портальным трактом, относили к ин тралобулярным. Некротические и регенераторные процессы также изучали от дельно в перипортальной и интралобулярной зонах. Для оценки выраженности вышеуказанных процессов в срезах, окрашенных гематоксилином и эозином, считали количество фокальных некрозов и количество двухъядерных гепатоци тов на 1000 клеток. Полученные данные выражали в процентах.
Оценку достоверности различий средних значений полученных показа телей осуществляли с помощью t-критерия Стьюдента и критерия Манна Уитни для несвязанных выборок. Достоверными считали различия между выборками, при которых значение абсолютного показателя точности (p) бы ло равно или меньше 0,05 [Автандилов Г. Г., 1990]. Все описанные этапы ма тематического анализа были выполнены с использованием пакета программ «Statistica for Windows».
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ После инъекций 4-пентеноевой кислоты в дозе 20 мг/кг в течение 7 дней летальность животных составляла 20%. В печени крыс развивались выраженная дискомплексация печеночных пластинок, циркуляторные нарушения, умерен ная инфильтрация портальных трактов лимфоцитами, плазмоцитами и гистио цитами. В центральных отделах печеночных долек отмечалась выраженная дистрофия гепатоцитов. Ядра печеночных клеток были полиморфны по форме, размерам и тинкториальным свойствам. РНК распределялась в цитоплазме ге патоцитов в виде огрубевших глыбок перинуклеарно, содержание РНК в клет ках снижалось. Содержание липидов в гепатоцитах увеличивалось в 3 раза по сравнению с данным показателем в контрольной группе. Преимущественно в центральной части долек появлялись фокальные некрозы гепатоцитов (количе ство некротизированных клеток в интралобулярной зоне было в 6 раз, в зоне пограничной пластинки в 4 раза выше, чем в контрольной группе) (p0,05). Ко личество двухъядерных гепатоцитов существенно снижалось в интралобуляр ной зоне печеночных долек (на 58%) и менее значительно в зоне пограничной пластинки (на 14%) (p0,05). Гликоген располагался в цитоплазме гепатоцитов в виде крупных, интенсивно окрашенных «чернильных пятен».
Введение крысам 4 пентеноевой кислоты в дозе 50 мг/кг через 4 ч 10 раз на протяжении 2 сут приводило к летальности 25% животных. При гистологиче ском исследовании в печени крыс регистрировалась более выраженная, чем при введении 4-пентеноевой кислоты в дозе 20 мг/кг, дискомплексация печеночных пластинок. В центральных и промежуточных зонах долек развивалась мелкока пельная жировая дистрофия гепатоцитов, встречались клетки со среднекапель ным ожирением. Содержание липидов в гепатоцитах было в 3,8 выше, чем у контрольных животных. Количество фокальных некрозов в зоне пограничной пластинки увеличивалось в 10 раз, в интралобулярной зоне долек – в 8,4 раза (p0,05). Количество двухъядерных гепатоцитов в зоне пограничной пластинки было ниже на 44%, в интралобулярной зоне – на 77%, чем в контрольной груп пе (p0,05). Гликоген определялся только в гепатоцитах перипортальной зоны в виде «чернильных пятен».
Введение ацетилсалициловой кислоты на фоне действия пирогенала при водило к гибели 35% крыс. В печени животных выявлялись резко выраженная дискомплексация печеночных пластинок во всех отделах долек, лимфогистио цитарная инфильтрация портальных трактов и центральных вен, внутридолько вые инфильтраты. В центральной и промежуточной зонах долек развивалось диффузное мелко- и среднекапельное ожирение гепатоцитов. Содержание ли пидов возрастало в 6 раз. Количество фокальных некрозов было существенно выше, чем в контрольной группе (в 15,6 раза в зоне пограничной пластинки и в 11,1 раза – в интралобулярной зоне долек) (p0,05). Во всех отделах печеноч ных долек отмечалось тотальное угнетение процессов регенерации. Количество двухъядерных гепатоцитов снижалось на 72% в зоне пограничной пластинки и на 87% – в интралобулярной зоне. Гликоген в цитоплазме клеток практически отсутствовал.
Активность ферментов в гепатоцитах после введения крысам 4-пенте ноевой кислоты в дозах 20 мг/кг и 50 мг/кг или ацетилсалициловой кислоты на фоне действия пирогенала значительно изменялась по сравнению с актив ностью в контрольной группе. Активность митохондриального фермента сук цинатдегидрогеназы статистически достоверно снижалась в 1,7-5,6 раза, NADH2-тетразолийредуктазы – в 1,5-2,6 раза, NADPH2-тетразолийредуктазы – в 2-3,7 раза, -оксибутиратдегидрогеназы – в 1,7-3 раза (p0,05). Активность лизосомального фермента кислой фосфатазы достоверно увеличивалась в 1,7 2,1 раза при введении 4-пентеноевой кислоты, и снижалась в 1,9 раза при вве дении ацетилсалициловой кислоты (p0,05).
Активность щелочной фосфатазы в печени крыс после введения 4 пентеноевой кислоты в дозе 20 мг/кг выявлялась в звездчатых ретикулоэндоте лиоцитах и эндотелии сосудов, при использовании 4-пентеноевой кислоты в дозе 50 мг/кг – только в эндотелии сосудов. Комбинация ацетилсалициловой кислоты и пирогенала полностью угнетала активность щелочной фосфатазы.
Таким образом, после сравнительного анализа морфофункционального со стояния печени крыс при трех моделях синдрома Рейе для исследования тера певтической эффективности и механизма действия гепатопротекторов было выбрано введение 4-пентеноевой кислоты в дозе 20 мг/кг в течение 7 дней. Эта модель позволяет воспроизвести все проявления синдрома Рейе. Использование в качестве токсина 4-пентеноевой кислоты в дозе 50 мг/кг и комбинации аце тилсалициловой кислоты с пирогеналом приводило к высокой летальности жи вотных, что осложняло изучение фармакотерапии экспериментального синдро ма Рейе.
Как отмечают А. Ф. Блюгер и А. Я. Майоре (1982), несмотря на разнообра зие патогенных агентов, вызывающих поражение печени, в морфологической картине выявляются во многом однотипные изменения. Они характеризуются гемомикроциркуляторными расстройствами, инфильтрацией портальных трак тов мононуклеарными клетками, дистрофией и деструкцией гепатоцитов. В итоге нарушается гистоархитектоника печени. Однако в связи с преимущест венным поражением клеточных органелл и в зависимости от степени наруше ния внутриорганного кровообращения и проницаемости сосудистой стенки для воздействия различных гепатотропных агентов характерны отличительные осо бенности [Лужников Е. А., 1981]. Введение крысам 4-пентеноевой кислоты приводит к развитию в ткани печени микровезикулярной жировой инфильтра ции [Sakaida N. et al., 1990].
Установленные нами морфогистохимические нарушения при модели син дрома Рейе соответствуют данным биохимических исследований крови. Пока зано, что при введении 4-пентеноевой кислоты в сыворотке крови крыс значи тельно повышается содержание липидов и через 7, 14 и 30 дней после оконча ния инъекций токсина оно продолжает увеличиваться [Арбузов А.Г., 2001].
Кроме жировой дистрофии гепатоцитов при экспериментальном синдроме Рейе нами отмечены белковая дистрофия и некроз гепатоцитов преимущест венно в перицентральной зоне долек.
Центролобулярная локализация некрозов является характерным морфоло гическим субстратом острых поражений печени гепатотоксическими вещества ми. Токсины в печени подвергаются воздействию системы цитохрома Р-450. В результате этого в гепатоцитах образуются высокореактивные токсические ме таболиты, которые удаляются путем конъюгации с глутатионом. Концентрация глутатиона в клетках перицентральной зоны ниже, а активность цитохрома Р 450 выше, чем в других отделах долек. Таким образом, высокая концентрация токсических метаболитов генерируется самими гепатоцитами, не обладающими достаточными запасами глутатиона, а некроз клеток обусловлен не прямым действием токсинов, а опосредован метаболической функцией гепатоцитов [Логинов А. С., Аруин Л. И., 1985;
Щеголев А. М., 1995].
Обращает на себя внимание тот факт, что при развитии экспериментально го синдрома Рейе на фоне снижения количества глюкозы в крови [Арбузов А.
Г., 2001] нами выявлены значительное повышение содержания гликогена в ге патоцитах и изменение его структуры (гликоген располагался в цитоплазме клеток в виде грубых, интенсивно окрашенных гранул – «чернильных пятен»).
Имеются данные о гетерогенности гликогена в нормальной ткани печени – его молекулярная масса, степень дисперсности, детали структуры могут варьи ровать при различных физиологических условиях [Кудрявцева М. В. и соавт., 1983]. В нормальной печени гликоген представлен главным образом легкодос тупной фракцией, составляющей около 84% от его суммарного количества. У больных с тяжелой формой поражения печени доля этой фракции падает до %. Таким образом, по мере усиления тяжести поражения печени постоянно снижается доля легкодоступной фракции гликогена и соответственно возраста ет доля труднодоступной фракции этого полисахарида. При этом значительно изменяется морфология гепатоцитов: гранулы гликогена приобретают рыхлую, комковатую структуру. Труднодоступная фракция гликогена более прочно свя зана с белком, ее содержание лишь слабо изменяется в условиях стимуляции гликогенолиза [Кудрявцева М. В. и соавт., 1983;
Кудрявцева М. В., 1990].
В печени животных с экспериментальным синдромом Рейе, оставленных без лечения, прогрессировали морфофункциональные нарушения, развившиеся после введения 4-пентеноевой кислоты.
Жировая дистрофия гепатоцитов распространялась на промежуточные и перипортальные отделы печеночных долек. При гистохимическом исследова нии печени крыс через 7-30 дней после окончания введения 4-пентеноевой ки слоты содержание липидов в гепатоцитах увеличивалось в 1,2-1,7 раза по срав нению с содержанием липидов в клетках животных, исследованных после пре кращения воздействия токсина (p0,05).
В печени у нелеченных животных через 7-14 дней значительно повыша лось количество фокальных некрозов. В интралобулярных зонах долек оно воз растало в 1,3-1,5 раза, в перипортальных зонах – в 3,3-3,6 раза (p0,05). Спустя 30 дней количество некротизированных гепатоцитов незначительно снижалось.
Количество двухъядерных гепатоцитов через 7 дней после окончания вве дения 4-пентеноевой кислоты снижалось (в 2,1 и 1,6 раза в интралобулярной и перипортальной зонах соответственно) (p0,05). Через 14-30 дней данный пока затель несколько повышался, оставаясь значительно ниже, чем у животных сра зу после завершения инъекций 4-пентеноевой кислоты.
Спустя 7 дней у нелеченных животных содержание гликогена в гепатоци тах существенно уменьшалось, он регистрировался только в клетках перипор тальной зоны в виде крупных глыбок. Через 14 дней гликоген встречался в еди ничных гепатоцитах перипортальной зоны в виде мелких гранул. К 30 дню этот полисахарид в печени животных не определялся.
Через 7-30 дней после прекращения введения 4-пентеноевой кислоты ак тивность сукцинатдегидрогеназы и -оксибутиратдегидрогеназы в гепатоцитах дополнительно снижалась на 17-63% и 15-28% соответственно. Активность NADH2- и NADPH2-тетразолийредуктаз спустя 7-14 дней снижалась на 34% и 25% соответственно по сравнению с активностью у животных, исследованных сразу после окончания введения гепатотоксина. К 30 дню активность этих фер ментов возрастала на 16% и 88% соответственно, оставаясь значительно ниже нормы (p0,05). Активность кислой фосфатазы через 7-30 дней дополнительно повышалась на 18-81% (p0,05). Активность щелочной фосфатазы в эндоте лиоцитах не выявлялась.
Таким образом, в печени животных с экспериментальным синдромом Рейе через 30 дней после окончания введения 4-пентеноевой кислоты сохранялись глубокие морфофункциональные нарушения. Прогрессировали изменения гис тоархитектоники печени, расстройства микроциркуляции, некрозы гепатоци тов, угнетение процессов регенерации, жировая дистрофия гепатоцитов, не вос станавливалась активность ферментов – маркеров внутриклеточного метабо лизма.
Влияние гепатопротекторов растительного происхождения при вве дении в течение 7, 14 и 30 дней на морфофункциональное состояние печени крыс с экспериментальным синдромом Рейе Изученные нами лекарственные средства лохеин, максар, легалон, эплир и эссенциале обладают высокой гепатопротективной активностью при экспери ментальном остром и хроническом гепатите, вызванном тетрахлорметаном, па рацетамолом, аллиловым спиртом, D-галактозамином [Белобородова Э. И., Шаловай А. А., 1993;
Саратиков А. С. и соавт., 1996;
Шаловай А. А. и соавт., 1996;
Венгеровский А. И., 2002].
Растительные полифенолы, входящие в состав данных препаратов, прояв ляют антирадикальную активность в процессе обратимого окисления восста новленных фенольных форм в хиноны. Терапия растительными полифенолами сопровождается сохранением ресурсов восстановленного глутатиона и повыше нием функции антиоксидантной системы гепатоцитов – глутатионзависимых ферментов и супероксиддисмутазы. Полифенолы образуют хелатные комплексы с ионами железа и выключают эти катализаторы из реакций свободнорадикаль ного окисления, стабилизируют мембраны, ингибируя фосфодиэстеразу цикли ческих нуклеотидов и вызывая накопление цАМФ в клетках [Сыров В. Н. и со авт., 1987;
Виноградова Л. Ф., 1993;
Altoriay J. et al., 1992].
Терапия гепатопротекторами растительного происхождения лохеином, максаром и легалоном сопровождалась регрессом морфофункциональных на рушений, вызванных в печени крыс 4-пентеноевой кислотой.
Применение лохеина и максара в течение 7-30 дней восстанавливало архи тектонику печеночных долек и практически нормализовало состояние цен тральных вен и портальных сосудов. При терапии легалоном сохранялась уме реная дискомплексация печеночных пластинок. На 7 день лечения регистриро валась активность щелочной фосфатазы в эндотелиоцитах синусоидов, что го ворит об улучшении микроциркуляции в ткани печени. К 30 дню гепатопротек тивной терапии активность данного фермента восстанавливалась и в желчных капиллярах.
Гепатопротекторы растительного происхождения в результате стимуляции -окисления жирных кислот в митохондриях печени снижают количество общих липидов и триглицеридов в сыворотке крови животных с экспериментальным синдромом Рейе [Арбузов А. Г., 2001]. Содержание липидов в гепатоцитах при лечении лохеином в течение 7-14 дней снижалось на 19-45%, при применении максара – на 24-55%, легалона – на 8-20% (p0,05). В результате терапии ло хеином в течение 30 дней содержание липидов уменьшалось на 57%, при дей ствии максара – на 59%, легалона – на 41% (p0,05) (рис. 1). Таким образом, наиболее эффективно жировую дистрофию уменьшали лохеин и максар.
Нормализация барьерной и матриксной функций мембран гепатоцитов под влиянием гепатопротекторов, содержащих полифенолы, является эффектом, направленным на задержку в лизосомах некрозогенных ферментов с предохра нением паренхимы печени от развития некрозов [Логинов А. С. и соавт., 1981;
Венгеровский А. И. и соавт., 1987;
Ягода А. В. и соавт., 1988;
Саратиков А. С. и соавт., 1990;
Рыжикова М. А. и соавт., 1998].
При терапии лохеином в течение 7 дней количество фокальных некрозов оставалось таким же, как при модели синдрома Рейе, через 14-30 дней снижа лось на 16-47% в области пограничной пластинки и на 17-60% в интралобуляр ной зоне (p0,05). Максар в большей степени, чем лохеин и легалон, снижал количество фокальных некрозов в печени крыс. Применение максара в течение 7-14 дней уменьшало количество некротически измененных гепатоцитов на 13 22% и 18-25% в перипортальной и интралобулярной зонах долек соответствен но. К 30-му дню лечения максаром количество некротизированных клеток сни жалось до нормы в перипортальной зоне и на 69% в интралобулярной зоне (p0,05). Применение легалона в течение 7-14 дней практически не влияло на количество фокальных некрозов в печени, к 30-му дню лечения данный показа тель снижался на 19% и 33% в перипортальной и интралобулярной зонах соот ветственно (p0,05). Таким образом, в интралобулярной зоне печеночных долек снижение количества фокальных некрозов под воздействием гепатопротектив ных средств было более выражено, чем в зоне пограничной пластинки (рис. 2).
Антинекротическое действие гепатопротективных препаратов направлено на наиболее повреждаемую гепатотоксинами зону паренхимы печени. Так, при гепатите, вызванном тетрахлорметаном и парацетамолом, количество некроти зированных клеток максимально снижается в центролобулярном отделе пече ночных долек, где гепатотоксины трансформируются цитохромом P-450 в сво бодные радикалы и электрофильные интермедиаты. На фоне поражения печени аллиловым спиртом гепатопротективное действие развивается в перипорталь ной зоне, клетки которой испытывают дефицит восстановленного глутатиона, образующего конъюгаты с метаболитами аллилового спирта – акролеином и эпоксидами [Саратиков А. С. и соавт., 1995].
Использование гепатопротекторов растительного происхождения значи тельно активировало процессы регенерации в печени животных. После 7- дней введения лохеина и максара количество двухъядерных гепатоцитов в пе рипортальных отделах долек печени было достоверно, на 7-32% и 20-33% соот ветственно выше контрольных значений (p0,05). В интралобулярных зонах на 7-14 дни лечения лохеином и максаром данный показатель оставался ниже, чем у контрольных животных, однако, был достоверно выше, чем у животных, ис следованных после окончания интоксикации. Через 30 дней терапии лохеином количество двухъядерных гепатоцитов в печени крыс нормализовалось, при ис 0, 1, 1, 0, Примечание к рис. 1- 0,2 1, р0,05 1- 1- 1-по сравнению с контролем усл. ед. опт. пл. 1- 2-по сравнению 4-пентеное- 1-4 1-5 1-3, 1- 0, вой кислотой, 7 дней 3-по сравнению с 4-пенте- 1-3 1- 1-3 1-3, ноевой кислотой, 7 дней без 1-3 1- лечения 1-4 1-3, 0, 4-по сравнению с лохеином 5-по сравнению с максаром 6-по сравнению с эплиром 0, 4-ПК – 4-пентеноевая ки слота Контроль 4-ПК, 7 дней 4-ПК без 4-ПК+Лохеин 4-ПК+Максар 4-ПК+Легалон 4-ПК+ Эплир 4 лечения ПК+Эссенциале 7 дней 14 дней 30 дней Рис. 1. Содержание липидов в гепатоцитах крыс при моделировании синдрома Рейе и коррекции его лохеином, максаром, легалоном, эплиром и эссенциале в течение 7, 14, дней пользовании максара – превышало норму на 45% (p0,05). При лечении лега лоном в течение 7 дней количество двухъядерных гепатоцитов оставалось та ким же, как при модели синдрома Рейе, затем к 14-му дню повышалось во всех отделах долек, оставаясь несколько ниже нормы, к 30-му дню терапии норма лизовалось в интралобулярной зоне и превышало показатель контроля на 7% в области пограничной пластинки (p0,05) (рис. 3).
Применение лохеина, максара и легалона в течение 7-30 дней на фоне экс периментального синдрома Рейе нормализовало содержание и расположение гликогена в гепатоцитах крыс.
Гепатопротективная терапия экспериментального синдрома Рейе препара тами растительного происхождения нормализует в крови активность ферментов – индикаторов цитолиза и холестаза (-глутамилтранспептидазы, аланинами нотрансферазы, аспартатаминотрасферазы, кислой и щелочной фосфатаз), сни жает концентрацию билирубина и свободных фенолов [Венгеровский А. И., 1996;
Венгеровский А. И., 1997;
Арбузов А. Г., 2001].
Активность сукцинатдегидрогеназы, NADH2- и NADPH2-тетразолий редуктаз при терапии лохеином в течение 7-30 дней возрастала в 1,1-1,8 раза, активность -оксибутиратдегидрогеназы и кислой фосфатазы к 30-му дню нор мализовалась (p0,05). При использовании максара на протяжении 30 дней ак тивность NADH2-, NADPH2-тетразолийредуктаз, -оксибутиратдегидрогеназы и кислой фосфатазы полностью нормализовалась, активность сукцинатдегидро геназы повышалась в 1,8 раза (p0,05). При терапии легалоном в течение 7- дней активность ферментов восстанавливалась менее значительно, чем при ис пользовании лохеина и максара: через 30 дней активность сукцинатдегидроге назы, NADH2-, NADPH2-тетразолийредуктаз и -оксибутиратдегидрогеназы по вышалась в 1,4-1,6 раза, активность кислой фосфатазы уменьшалась в 1,3 раза (p0,05).
Гепатопротекторы лохеин, максар и легалон, введенные в течение 7, 14 и 30 дней на фоне экспериментального синдрома Рейе, вызванного у крыс 4 пентеноевой кислотой, проявили высокую терапевтическую активность. При использовании гепатопротективных средств в течение 30 дней отмечался наи более выраженный терапевтический эффект.
Влияние гепатопротекторов фосфолипидной природы при введении в течение 7, 14 и 30 дней на морфофункциональное состояние печени крыс с экспериментальным синдромом Рейе На фоне интоксикации 4-пентеноевой кислотой препараты фосфолипидов, стабилизируя мембраны гепатоцитов, уменьшают в крови активность цитоли тических ферментов, уровень билирубина и продуктов эндогенной интоксика ции, ликвидируют гипогликемию и гипопротеинемию [Венгеровский А. И. и соавт., 1993;
Арбузов А. Г., 2001;
Венгеровский А. И., 2002].
В печени животных, получавших лечение гепатопротекторами фосфоли пидной природы в течение 7-30 дней на фоне модели синдрома Рейе, сохраня лись умеренная перицентральная дискомплексация печеночных пластинок, 1, 20 % 1-5 1- 1, 1-3 1-3, 1- 1- 5 1-3 1- 2-4 1-3, Контроль 4-ПК, 7 дней 4-ПК без лечения 4-ПК+Лохеин 4-ПК+Максар 4-ПК+Легалон 4-ПК+ Эплир 4-ПК+Эссенциале Зона пограничной пластинки Интралобулярная зона Рис. 2. Количество фокальных некрозов на 1000 клеток в печени крыс при моделировании синдрома Рейе и коррекции его лохеином, максаром, легалоном, эплиром и эссенциале в течение 30 дней циркуляторные нарушения и перипортальная инфильтрация. Однако гистоар хитектоника и состояние сосудов печени было значительно лучше, чем у крыс, исследованных после окончания введения 4-пентеноевой кислоты.
Эплир и эссенциале стимулируют -окисление длинноцепочечных и сред нецепочечных жирных кислот в митохондриях гепатоцитов, уменьшают гипер липидемию, восстанавливают синтез мочевины и кетоновых тел [Арбузов А. Г., 2001].
Применение эплира и эссенциале на протяжении 7-30 дней снижало со держание липидов в гепатоцитах на 13-62% по сравнению с содержанием ли пидов, определенным сразу после окончания инъекций 4-пентеноевой кислоты (p0,05) (рис. 1).
При введении эплира в течение 7 дней количество фокальных некрозов в зоне пограничной пластинки оставалось таким же, как при экспериментальном синдроме Рейе, несколько повышалось (на 11%) в интралобулярной зоне. Через 14-30 дней лечения эплиром количество фокальных некрозов уменьшалось на 9-28% в области пограничной пластинки и на 11-32% в интралобулярной зоне по сравнению с данными показателями у крыс после 7 инъекций 4-пентеноевой кислоты (p0,05). При использовании эссенциале в течение 7-30 дней количе ство фокальных некрозов снижалось на 13-63% в зоне пограничной пластинки и на 14-68% в интралобулярной зоне (p0,05) (рис. 2).
Количество двухъядерных гепатоцитов на 7-й день лечения эплиром и эс сенциале в зоне пограничной пластинки было на 5% и 32% соответственно вы ше, чем у животных после окончания введения 4-пентеноевой кислоты, в ин тралобулярной зоне повышалось на 8% и 31% соответственно (p0,05). Через 14 дней терапии эплиром количество двухъядерных гепатоцитов в зоне погра ничной пластинки превышало норму на 14%, к 30-му дню нормализовалось.
При использовании эссенциале на протяжении 14-30 дней оно было выше нор мы на 49-38% (p0,05). В интралобулярной зоне к 14 дню лечения эплиром и эссенциале количество двухъядерных гепатоцитов повышалось на 76% и 115% соответственно, не достигая показателя контроля, на 30 день терапии эплиром увеличивалось на 107%, при использовании эссенциале нормализовалось (p0,05) (рис. 3).
Лечение эплиром на протяжении 7 дней не влияло на нарушенные при мо дели синдрома Рейе расположение гликогена в гепатоцитах и его локализацию в печеночных дольках. Только к 30 дню лечения расположение полисахарида в клетках нормализовалась, однако значительное количество гепатоцитов не со держало гликоген. При терапии эссенциале уже к 7 дню гликоген находился в клетках в виде мелкой зернистости по всей цитоплазме, а к 30 дню лечения и содержание гликогена в клетках печени визуально не отличались от нормы.
Активность сукцинатдегидрогеназы, NADH2- и NADPH2-тетразолийре дуктаз в клетках печени крыс при терапии эплиром в течение 7-30 дней на 12 56% превышала активность у животных после окончания введения 4 пентеноевой кислоты (p0,05). Активность -оксибутиратдегидрогеназы при введении эплира на протяжении 7 дней снижалась на 5%, затем к 14-30 дням увеличивалась на 8-31% по сравнению с активностью у крыс после 7 инъекций 1- 12 1-3, 1- 2, 1- % 1, 1- 1-5 2,3, 2- 1- 1, Контроль 4-ПК, 7 дней 4-ПК без лечения 4-ПК+Лохеин 4-ПК+Максар 4-ПК+Легалон 4-ПК+ Эплир 4 ПК+Эссенциале Зона пограничной пластинки Интралобулярная зона Рис. З. Количество двухъядерных гепатоцитов на 1000 клеток в печени крыс при моделировании синдрома Рейе и коррекции его лохеином, максаром, легалоном, эплиром и эссенциале в течение 30 дней 4-пентеноевой кислоты (p0,05). Эссенциале на протяжении 7-14 дней повышал активность сукцинатдегидрогеназы, NADH2-, NADPH2-тетразолийредуктаз и оксибутиратдегидрогеназы на 19-106%, к 30 дню лечения нормализовал актив ность NADH2-, NADPH2-тетразолийредуктаз и - оксибутиратдегидрогеназы, увеличивал активность сукцинатдегидрогеназы на 71% (p0,05). Активность кислой фосфатазы при терапии эплиром и эссенциале в течение 7 дней повы шалась на 13% и 4%, затем к 14 дню уменьшалась на 2% и 15% соответственно по сравнению с активностью в группе после окончания инъекций 4 пентеноевой кислоты (p0,05). При использовании эссенциале в течение дней активность данного фермента нормализовалась, при терапии эплиром – уменьшалась на 23% (p0,05).
Гепатопротекторы, содержащие фосфолипиды, потенцируют функции эн догенных липидорастворимых антиоксидантов и глутатионзависимой антипе рекисной системы гепатоцитов, чем обусловлен их мембраностабилизирующий эффект. Гепатопротекторы восстанавливают нормальный спектр фосфолипидов в мембранах гепатоцитов. Фосфолипиды как структурные антиоксиданты огра ничивают доступ свободных радикалов внутрь мембран к полиеновым жирным кислотам [Венгеровский А. И., 1991;
Буко В. У. и соавт., 1994].
Эплир обогащает микросомы и митохондрии фосфатидилэтаноламином.
Каротиноиды, входящие в состав эплира, являются акцепторами алкоксильных, алкильных и перекисных радикалов. Тиолы эплира стимулируют синтез глута тиона в гепатоцитах и оказывают собственное антиоксидантное действие [Вен геровский А. И., 1991].
Таким образом, гепатопротекторы лохеин, максар, легалон, эплир и эссен циале, введенные животным в течение 7, 14 и 30 дней на фоне эксперименталь ного синдрома Рейе, защищают паренхиму печени от токсического воздействия 4-пентеноевой кислоты, повышают резистентность клеток к деструктивному воздействию токсина вследствие мембраностабилизирующего влияния и нор мализации реакций метаболизма. Препараты предотвращают гибель животных, вызывают регресс структурных и метаболических нарушений, вызванных в пе чени крыс 4-пентеноевой кислотой.
Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о возможности включения лохеина, максара, легалона, эплира и эссенциале в комплексную те рапию синдрома Рейе.
ВЫВОДЫ 1. При внутрибрюшинном введении крысам 4-пентеноевой кислоты или инъекции ацетилсалициловой кислоты через 1 ч после введения пирогенала в печени развиваются морфофункциональные нарушения, аналогичные патоги стологическим проявлениям синдрома Рейе.
2. Наиболее адекватной моделью синдрома Рейе является интоксикация 4 пентеноевой кислотой, введенной внутрибрюшинно в дозе 20 мг/кг в течение дней.
3. Применение гепатопротекторов лохеина, максара, легалона, эплира и эс сенциале на фоне экспериментального синдрома Рейе в течение 7, 14 и 30 дней оказывает положительное влияние на морфофункциональное состояние печени – нормализует ее гистоархитектонику, уменьшает жировую дистрофию гепато цитов, количество фокальных некрозов, активность кислой фосфатазы, увели чивает содержание гликогена, активность сукцинатдегидрогеназы, NADH2-, NADPH2-тетразолийредуктаз, -оксибутиратдегидрогеназы и щелочной фосфа тазы, усиливает регенераторные процессы.
4. Максар и эссенциале при экспериментальном синдроме Рейе достоверно эффективнее, чем другие гепатопротекторы, уменьшают структурные и мета болические нарушения в печени животных.
5. Эффективность гепатопротективной терапии при экспериментальном синдроме Рейе зависит от ее продолжительности – наиболее значительные по ложительные эффекты по отношению к структуре гепатоцитов, активности их внутриклеточных ферментов, состоянию циркуляторного русла печени крыс наблюдаются при введении препаратов в течение 30 дней.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИСЕРТАЦИИ 1. Морфофункциональное состояние печени крыс при экспериментальном син дроме Рейе и на фоне лечения гепатопротекторами // Межрегион. науч. конф. Си бири и Дальнего Востока, посвящ. 150-летию со дня рождения акад. И. П. Павло ва. – Томск: Изд-во Томского ун-та, 1999. – С. 166-167 (соавт.: М.Б. Червякова).
2. Структурно-метаболические нарушения в печени и головном мозге при экс периментальном синдроме Рейе // Сиб. журн. гастроэнтерологии и гепатологии. – 2002. – № 14-15. – C. 80-82 (соавт.: Ю.Ю. Мельник, И.В. Суходоло, А.И. Венге ровский).
3. Влияние гепатопротекторов растительного происхождения на морфофунк циональное состояние печени крыс при моделировании синдрома Рейе // Науки о человеке: Сб. статей: по матер. 4-го конгр. молодых ученых и специалистов, Томск, 15-16 мая 2003 года. – Томск, 2003. – C. 185 (соавт.: Ю.Ю. Мельник).
4. Влияние гепатопротекторов, содержащих полифенолы, на функциональную морфологию печени при экспериментальном синдроме Рейе // Бюл. Сиб. медици ны. – 2003. – Т. 2, № 4. – C. 41-45.
5. Морфофункциональное состояние печени крыс при лечение эксперименталь ного синдрома Рейе гепатопротекторами растительного происхождения // Рос.
журн. гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. – 2004. – Т. 14, Прил.
22. – С. 103 (соавт.: Ю.Ю. Мельник).
6. Морфофункциональные показатели гепатоцитов крыс при лечении экспери ментального синдрома Рейе гепатопротекторами фосфолипидной природы // Экс перим. и клин. гастроэнтерология. – 2004. – № 1. – С. 97 (соавт.: Ю.Ю. Мельник).