Разработка подхода к планированию зондов для эффективной пцр в реальном масштабе времени
На правах рукописи
Гудов Владимир Петрович Разработка подхода к планированию зондов для эффективной ПЦР в реальном масштабе времени Специальность 03.00.23 – Биотехнология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук
Москва 2009
Работа выполнена на кафедре биотехнологии Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова и в лаборатории молекулярной диагностики и генно-инженерных конструкций ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН.
Научный консультант:
академик РАМН, доктор химических наук, профессор Швец Виталий Иванович
Официальные оппоненты:
доктор химических наук, доцент Позмогова Галина Евгеньевна доктор биологических наук Шилов Илья Александрович
Ведущая организация:
Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН.
Защита состоится 2009 г. в 15 часов на заседании Диссертационного совета Д 212.120.01 при Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова по адресу: 119571, г. Москва, пр. Вернадского, 86.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.В. Ломоносова. С авторефератом диссертации можно ознакомиться на сайте www.mitht.ru.
Автореферат разослан « 2009 г.
»
Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат химических наук Лютик А.И.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
* Актуальность работы.
Одной из актуальных задач современной биотехнологии является разработка диагностических наборов реагентов для выявления генетически модифицированных источников (ГМИ) в семенном материале, кормах животных, пищевых продуктах, лекарственном сырье и т.д. Принцип работы современных приборов для анализа ДНК базируются на количественном определении ДНК, используя метод ПЦР в реальном масштабе времени. Зарубежные приборы и реактивы для них, разработанные для осуществления данной методологии достаточно дороги. В настоящее время cуществуют отечественные аналоги приборной и реагентной базы;
доступные по ценовым и качественным характеристикам, для лабораторий, проводящих массовые исследования.
В цели настоящей работы входило создание отечественной методической и компонентной базы для создания зондов для ПЦР в реальном масштабе времени, необходимых для решения различных биотехнологических задач с применением данного метода. В качестве модельной системы нами был выбран широко использующийся компонент для создания векторных систем экспрессионной кассеты трансгенных растений – NOS-терминатор.
В настоящий момент невозможно полностью исключить ошибки в сертификации ГМР. Продукты, полученные с использованием ГМИ, по международным нормам и согласно санитарным нормам РФ должны нести на себе информацию в виде маркировки, из которой явно следовало бы, что продукт был получен из генетически модифицированных организмов. Пищевой продукт маркируется соответствующим образом, если соотношение трансгенного продукта к генетически не модифицированному - более 0,9%.
Для анализа необходимы микроколичества исследуемого образца, содержащего целевой фрагмент ДНК.
В настоящее время ПЦР в реальном масштабе времени широко используются в биологии, медицине, пищевой промышленности, сельском хозяйстве. Являясь количественным методом, он обладает высокой точностью, специфичностью и надежностью.
Одним из ключевых моментов для повышения эффективности ПЦР в реальном масштабе времени является планирование и синтез флуоресцентных зондов, являющихся источником информационного сигнала в данном методе анализа.
Существуют несколько важных критериев при создании зонда для ПЦР в реальном масштабе времени. Эффективность работы зонда определяется:
* В руководстве работой и подготовке ее к защите принимал участие заведующий лабораторией биологически активных наноструктур ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика Н.Ф. Гамалеи РАМН, к.б.н. В.Г. Лунин.
Список принятых сокращений: ПЦР-РВ – полимеразная цепная реакция в реальном масштабе времени;
ГМИ – генетически модифицированный источник.
Длиной олигонуклеотида, связывающего донор и акцептор;
1) Комбинацией доноров и акцепторов флуоресценции;
2) Дислокацией гибридизованного зонда на матрице;
3) Влиянием близкорасположенных к донору или акцептору флуоресценции 4) нуклеотидов в зонде;
пуриновые и пиримидиновые основания, являясь ароматическими гетероциклами, наводят помехи на флуоресцентный сигнал.
Цель работы: Создание методологической и компонентной базы, а также оригинальных схем синтеза флуоресцентных красителей и гасителей флуоресценции для синтеза зондов ПЦР-РВ. Разработка подхода для эффективного планирования зондов для ПЦР в реальном масштабе времени.
Для выполнения работы были поставлены следующие ЗАДАЧИ:
1) Создание отечественной компонентной и методологической базы для синтеза зондов ПЦР-РВ;
2) Обоснование выбора математического аппарата на основе Форстеровской теории переноса энергии, необходимого для планирования зондов ПЦР в реальном масштабе времени;
3) Проведение математического расчета Фостеровского радиуса, оптимального с точки зрения используемой системы.
4) Синтез зондов ПЦР-РВ с различной длиной нуклеотидной части, включая зонды с расчетной длиной олигонуклеотидного спейсера согласно Форстеровской теории. Проверка синтезированных зондов на объекте растительного происхождения, с целью определения в нем NOS-терминатора – широко распространенного маркера генетически модифицированных растений;
Научная новизна. На сегодняшний день информация о планировании зондов для ПЦР в реальном масштабе времени скудна и противоречива, которая говорит о создании флуоресцентных зондов исходя только из эмпирических данных [Nasarabadi S., BioTechniques, 1999, Vol.27(6), p 1116-1117, Holland P., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 1991, Vol.88, p.7276-7280, Bernard P.S., Analytycal Biochemistry, 1999, № 273, p. 221-228]. В данной работе была предпринята попытка подготовить практическую и теоретическую базы для планирования зондов, обладающих хорошими характеристиками, как по возрастанию флуоресцентного сигнала, так и низкому уровню флуоресцентного шума. Результаты работы показали, что с помощью универсальной методологической базы можно создать диагностические наборы для выявления ГМИ в различных сельскохозяйственных культурах, генетически модифицированных груше, сое и кукурузе. Спектральные характеристики красителей, встроенных в зонды, имеют высокий уровень разгорания флуоресценции, а также высокий квантовый выход, и имеют те же спектральные характеристики, что и зарубежные аналоги.
Осуществлена проверка теоретического подхода для планирования флуоресцентных зондов, основанного на эффекте Форстера с правками, учитывающих вероятностную пространственную ориентацию красителя и гасителя молекул флуоресценции. Задача подобного плана была поставлена и осуществлена впервые.
Практическая значимость работы.
Показана перспективность использования математического аппарата, основанного на теории Форстера, что позволит эффективно планировать зонды ПЦР-РВ. Данный шаг несомненно уменьшит число экспериментальных итераций, зачастую необходимых для создания корректно работающей системы в ПЦР-РВ.
Результаты работы позволят работать с компонентами собственного производства, что позволит уменьшить материальные и временные затраты на создание флуоресцентных зондов для ПЦР-РВ.
Публикации по теме диссертационной работы.
По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ. Основные результаты исследований были представлены на III Международной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 19 октября, 2004), II Международном конгрессе «Биотехнология;
состояние и перспективы развития» (Москва 10-14 ноября, 2003) а также на Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье» (Рязань, 29 мая – 1 июня, 2007).
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на _ страницах печатного текста, содержит 10 таблиц и 20 рисунков. Список литературы включает 121 источник.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1. Синтез компонентов для создания флуоресцентных зондов.
Одним из важнейших компонентов зонда являются – флуоресцентный краситель и гаситель флуоресценции. Их комбинация определяет полноту переноса энергии внутри зонда. На сегодняшний день из наиболее распространенных флуоресцентных красителей можно выделить две обширные группы - ксантеновые и цианиновые флуоресцентные красители. Данные группы различаются по молекулярному строению и по флуоресцентным свойствам.
Все методики синтеза флуоресцентных красителей и их производных, являются результатами проведенной работы по созданию материальной компонентной базы флуоресцентных красителей и гасителей флуоресценции для синтеза зондов для ПЦР-РВ, в частности для мультиплексных анализов.
Синтез флуоресцентных красителей.
1.1.
Замещенные фенолы (2б,3,4,5) конденсируются с циклическими ангидридами (1) в присутствии катализатора кислоты Льюиса хлорида цинка II при температуре от 180 °С до 200 °С. Конденсирующие средства влияют на тип образующихся веществ и их количества. Заместители входящие в состав фенола также влияют на выход продуктов реакции. Таким образом чем больше элетронодонорных групп входит в состав фенолов, тем выше выход целевых продуктов реакции.
+ * N O N HO N 2б O 6 a,б O.
O 3 O HO N + O N N O O t=180-2000C 7 a,б O O ZnCl2 O.
HO O O OH 4 O + NH O NH NH 8 a,б O OH.
O O OH HO OH O HO 9 a,б O O.
O OH *Получение 8-гидроксиюлолидина, прекурсора 5(6)-ROX, компонента 2 б.
OH OH Cl Br Tемп.
NH2 N 1 - 70 град, (3 часа) 2а 2 - 110 град. (15 часов) 2б Na2CO3, Мол. сита - 3 анг.
F F F F F O O NH NH O F O O N N O F F O F F O F F OH O OH Et3N.
N,N'-diTFA-5(6)-R6G.
8 а,б HO HO 8 в, г O O O O O O O HO O OH N O O OH OH O O,O'-diPiv-5(6)-FAM.
.
9 в, г Cl O O 9 а,б OH OH Схема 1. Синтез флуоресцентных красителей ксантенового ряда, введение защит на 5(6)-FAM и 5(6)-R6G.
Соответственно больший выход при одном и том же типе взаимодействия для родаминовых красителей был достигнут при синтезе 5’(6’)-карбоксиродамина Х (6 а, б), следует отметить, что данный краситель из четырех ксантеновых красителей, синтезированных в этой работе потребовал дополнительного синтеза прекурсора ( б), в виду высокой стоимости последнего. Сам синтез (см. Схема 1) имеет две стадии, где переход от первой стадии ко второй заключается в повышении температуры с 70 °С до 110 °С. Результатом явилась методика, основанная на двухступенчатом синтезе, дающем продукт с высоким практическим выходом продукта из доступных и недорогих предшественников. Максимум спектра поглощения 5(6)-ROX* сдвинут достаточно далеко в красную зону видимого света, а максимум флуоресценции приходится на 650 нм. В синтезе зондов для нашей работы он не был применен, так как давал сравнительно малую область перекрывания собственного спектра флуоресценции с соответствующим гасителем флуресценции – BHQ-3. Для нашей работы была необходима пара красителя и гасителя флуоресценции, в которой краситель бы обладал высоким квантовым выходом и имел бы максимальную область перекрывания спектров флуоресценции флуорофора и поглощения гасителя флуоресценции. Необходимо указать, что спектрально 5(6)-TAMRA (5) почти полностью соответствует красителю цианинового ряда - Сy 3. Очевидно, работая над синтезом новых ксантеновых красителей можно получить более дешевые аналоги дорогостоящих цианиновых красителей, также работающих в красноволновой области спектра.
Таблица 1. Синтез флуоресцентных красителей ксантенового ряда.
Смесь изомеров ксантеновых Выход, % флуорофоров 6 (а,б) 7 (а,б) 8 (а,б) 9 (а,б) Флуоресцентный краситель 5(6)-R6G по спектральным свойствам наиболее приближен к карбоксифлуоресцеину (FAM), но имеет более низкий квантовый выход и меньшую площадь перекрывания собственного спектра флуоресценции и спектра поглощения тушителей флуоресценции, таких как BHQ-1 и RTQ-1.
На стадиях очистки флуоресцентных красителей была применена адсобционная хроматография на силикагеле с размером частиц от 40 до 60 мкр, отдельных слов заслуживает вопрос изомерной чистоты полученных флуоресцентных красителей на данной стадии. Разделить на изомеры полностью на данном этапе невозможно, их сукцинимидные эфиры подвергаются полному разделению на изомеры посредством проточной эффективной хроматографии среднего давления (FPLC, 10-50 атм., см.
пункт 1.2). Для дальнейшего синтеза необходимо было также внести защитные группы на 5(6)-FAM и 5(6)-R6G, с этой целью обработали в основных условиях трифторуксусным ангидридом и пивалоилхлоридом соответственно. И далее продолжали работу с защищенными соединениями (8 в,г и 9 в,г), поставленные защиты удаляются в результате аммонолиза на стадии деблокирования при синтезе зондов.
1.2. Синтез активированных сукцинимидных эфиров флуоресцентных красителей.
На момент проведения работы фосфорамидитный способ введения флуоресцентных красителей еще не был широко используем и красители на олигонуклеотиды вводились постсинтетически с помощью их активированных сукцинимидных эфиров. Это касается введения флуорофоров или гасителей флуоресценции на 5’-конец растущей цепи олигонуклеотида.
Таким образом были синтезированы сукциимидные эфиры O,O-дипивалоил-5’(6’) карбоксифлуоресцеина (13 а, б), 5’(6’)-карбоксиродамина Х (10 а, б), N,N’ – дитрифторацетил-N,N’-диэтил-2,10-диметил-5’(6’)-карбоксиродамина (12 а, б), N,N’ Тетраметил-5’(6’)-карбоксиродамина (11 а, б).
Для получения сукцинимидных эфиров нами был использован метод карбодиимидной активации карбоксильных групп с последующим взаимодействием с N-гидроксисукцинимидом.
Вначале из карбоксикомпонента и карбодиимида получается очень реакционноспособное О-ацилпроизводное изомочевины. Оно очень быстро реагирует с N-гидроксисукцинимидом и переходит в соответствующий активированный эфир. Нами были использованы два карбодиимида – 1-этил-3-(3 диметиламинопропил)-карбодиимидгидрохлорид (EDAC) и 1-циклогексил-3-(3-N этилморфолин)-карбодиимид Выбор n-толуолсульфанат (тозилат) (СМС).
карбодиимида продиктован условиями растворимости компонентов реакции в используемом растворителе.
Для более простой обработки реакционной смеси был применен водорастворимый активатор карбоксильной группы самого флуоресцентного красителя, что позволило эффективно избавиться от диизопропилэтилмочевины, образовавшейся в результате конденсации гидроксисукцинимида с флуоресцентным красителем.
_ Список принятых сокращений: 5(6)-FAM – 5’(6’)-карбоксифлуоресцеин;
О,О’-diPiv-5(6) FAM - O,O-дипивалоил-5’(6’)-карбоксифлуоресцеин;
5(6)-TAMRA – N,N’-тетраметил-5’(6’) карбоксиродамин;
5(6)-R6G – N,N’-диэтил-2,10-диметил-5’(6’)-карбоксиродамин;
N,N’-diTFA 5(6)-R6G – N,N’-дитрифторацетил - N,N’-диэтил-2,10-диметил-5’(6’)-карбоксиродамин;
5(6) ROX – 5’(6’)-карбоксиродамин X;
Cy 3 – 1,1’-(3-дигидроксипропил)-3,3,3',3'-тетраметилиндо карбоцианин;
BHQ-1 - 4'-(2-нитро-4-толуолдиазо)-2'-метокси-4''-(N,N-дигидроксиэтил)-5'-ме тилазобензол;
BHQ-3 - 3-диэтиламино-5-фенилфеназин-4''-(N,N-дигидроксиэтил)-7-диазо бензол;
RTQ-1 - 4'-(2-нитро-4-толуолдиазо)-2'-метокси-4””-(p-N,N-дигидроксиэтил)фенил-5' метилтетразобензол.
+ N O N + N O N DMF, HOSu, EDAC O O - 5(6)-ROX, SE 5(6)-ROX O.
O.
10 а,б 6 a,б O O O O N O O + + N O N N O N DMF, HOSu, EDAC O 5(6)-TAMRA, SE O 5(6)-TAMRA - O O..
7 a,б 11 a,б O - OO O O N O F O F F F O F F O F F O F F F + F N N + O N N O O DMF, HOSu, EDAC O O 5(6)-R6G, SE 5(6)-R6G O.
.
HO O 8 в,г 12 a,б OO O N O CH3 CH O H3C H3C O H3C H3C CH3 CH3 CH3 CH O O CH O O O CH O O O TГФ, СМС, HOSu 5(6)-FAM, SE O O 5(6)-FAM O. O.
O 9 в,г 13 a,б OO O O N O Схема 2. Синтез активированных сукцинимидных эфиров ксантеновых флуоресцентных красителей – O,O’-diPiv-5(6)-FAM, 5(6)-ROX, N,N’-diTFA-5(6)-R6G, 5(6)-TAMRA.
Таблица 2. Синтез сукцинимидных эфиров ксантеновых флуорофоров.
Смесь изомеров сукцинимидных Выход, % эфиров ксантеновых флуорофоров 10 (а,б) 11 (а,б) 12 (а,б) 13 (а,б) Как уже отмечалось, важна изомерная чистота вводимых в состав зонда флуоресцентных красителей. При очистке методом электрофореза флуоресцентно меченые зонды, как и другие меченые биологически активные молекулы, например белки имеют разную электрофоретическую подвижность в геле, в зависимости от того с каким изомером ксантенового флуорофора они связаны. Это обстоятельство усложняет процесс очистки и интерпретации результатов.
Использование FPLC системы позволило разделить 5 и 6 изомеры активированных эфиров, как флуоресцеиновых так и родаминовых ксантеновых флуоресцентных красителей. С целью предотвращения гидролиза сукциниимидных эфиров на силикагеле в результате хроматографии силикагель был прогрет до температуры 160°С для удаления остаточной влаги. В качестве элюентов были использованы абсолютизированные апротонные растворители (ацетон, толуол, ацетонитрил). Использование в составе элюента спирта не допустимо из-за переэтерификации на хроматографической колонке. Полученные эфиры обладали хорошей способностью к кристаллизации и хорошей растворимостью в водных буферных растворах (рН 7-9) и органических растворителях, таких как ацетон, этилацетат, N,N’-диметилформамид.
1.3. Синтез молекул прекурсоров на основе флуоресцентных красителей для иммобилизации их на стекле с контролируемым размером пор (CPG).
Для введения флуоресцентной метки на 3’-конец конец олигонуклеотидов используется специальный сорбент CPG c иммобилизированными на него флуорофорами с якорными группами, по которым продолжается фосфорамидитный синтез олигонуклеотидов.
F F F F O O F F + + N O N N N O R*2 R* O O O O DMTrO O HO NH O O NH O HO CH H3C DMTrO H3C CH O CH O + R*1 N O N CH3 R* O O O O O O O HO O NH O HO O NH O DMTrO DMTrO Рис 1. Прекурсоры флуоресцентных красителей, необходимые для их мобилизации на сорбент - CPG Для всех красителей модель получения амида, и работа с защитными группами ведется по единому сценарию, который представлен ниже на схеме 4.
R*1 [О,О'-diPiv-5-FAM] R*n O O O R*n R*2 [5-TAMRA] O 14, 15, 16, R*n = R*3 [N,N'-diTFA-5-R6G] 3-(Аминопропил)-1-солкеталь R*4 [5-ROX] 5 о O ДМФА, 30 мин., 20 С 10 б, 11 б, O O O NH 12 б, 13 б O O O N OO O 80%, CH3COOH, R*n ночь, 50оС OO N OO O R*n O R*n O NH O O O 1 экв., DMTrCl N O O Пиридин, 5 ч., 4оС NH 3 часа, 0оС O 26, 27, 28, 29 NH HO DMTrO HO O O O 18, 19, 20, DMTrO HO 22, 23, 24, 25 HO ДМФА HOBt EDAC 8 ч., 20 оС CPG-Icaa-NH 30, 31, 32, R*n O O O O O O CPG O NH HN Icaa DMTrO Схема 4. Синтез производных флуоресцентных красителей для иммобилизации на сорбент - CPG.
Сначала нами были получены производные флуоресцентных красителей с линкером – 3-(аминопропил)-1-солкеталем, который очень быстро реагирует с сукциниимидными эфирами флуорофоров c образованием соответствующих амидов карбоновых кислот (14, 15, 16, 17), выход на данной стадии количественный.
Продукты реакции были подвергнуты колоночной хроматографии при атмосферном давлении. Очищенные амиды повергли гидролизу в 80% уксусной кислоте с целью снятия изопропилиденовой защиты и получения двух гидроксильных функциональных групп (18, 19, 20, 21), выход на данном этапе также количественный. На первичную спиртовую группу поставили тритильную защитную группу, использовав 4,4’-диметокситритилхлорид в пиридине (22, 23, 24, 25).
Тритилированные амиды флуорофоров подвергли хроматографии на колонке под атмосферным давлением. Для функционализации оставшейся вторичной гидроксильной группы нами был применен янтарный ангидрид в присутствии 4 диметиламинопиридина (DMAP). Полученные карбоксилированные соединения (26, 27, 28, 29) были иммобилизованы на аминомодифицированный CPG с образованием пептидной связи модифицированным карбодиимидным методом.
В качестве активатора карбоксильной группы нами был использован EDAC, а в качестве добавки - гидроксибензотриазол (HOBt) для уменьшения О N ацильной миграции, тем самым увеличив плотность загрузки.
Для иммобилизации, аминомодифицированный CPG и карбоксилированный флуорофор инкубируют вместе при перемешивании в абсолютизированном диметилформамиде. На данной стадии необходимо деликатное перемешивание без использования магнитной мешалки, для предупреждения физического истирания твердой стеклянной фазы. Следует отметить о возможности использования фосфорамидитов флуоресцентных красителей для иммобилизации на CPG, но в этом случае сорбент будет модифицирован свободной гидроксильной группой, таким образом открывается химический алгоритм, позволяющий получать модифицированными сорбенты с другой основой, такие как сефадекс, сефароза, целлюлоза, модифицированный полистирол.
Таблица 3. Создание библиотеки модифицированных сорбентов.
компонент Выход % Rn* FAM 22 TAMRA 23 R6G 24 ROX 25 FAM 26 TAMRA 27 R6G 28 ROX 29 Индивидуальность и структура соединений были подтверждены данными ТСХ, электронной и 1Н-ЯМР-спектроскопии. Метод двухмерного 1Н-ЯМР позволил различить между собой 5 и 6 –карбоксиизомеры сукцинимидных эфиров ксантеновых флуорофоров. Также для исследования чистоты полученных соединений был применен метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC), который позволил оченить чистоту полученных сукцинимидных эфиров ксантеновых флуоресцентных красителей.
1.4 Синтез гасителя флуоресценции BHQ-1 и его амидофосфита.
Гаситель флуоресценции BHQ-1 был синтезирован в результате реакции азосочетания 4'-(2-нитро-4-фенилдиазо)-2'-метокси-5'-метил-бензилдиазония хлорида (34) и N,N-дигидроксиэтиланилина (35).
Затем одну гидроксильную группу защитили 4,4’-диметокситритильной (DMTr) защитой, в данном случае требуется строгий контроль за температурой и скоростью добавления 4,4’-диметокситритилхлорида, поскольку для следующей стадии необходим монотритилированный продукт (37).
4'-(2-нитро-4-толуолдиазо)-2'-метокси-5'-метилазобензил-4''-(N-етил-2-O-(4,4' - диме токситритил))-N-2-цианоэтил-(N,N-диизопропил)-амидофосфит (39) необходим для использования в автоматических синтезаторах олигонуклеотидов для введения непосредственно в течении синтеза на 5’ –конец растущей цепи олигонуклеотида, также данный компонент может быть использован для модификации сорбента для твердофазного синтеза, имеющего свободную аминолинкерную якорную группу, таким образом можно синтезировать зонды имеющие модификацию гасителем флуоресценции на 3’-конце олигонуклеотидной цепи.
OH - OH N Cl 34 N N 35 N N N OH + N NH N O N NO2 OH O NO DMTrCl в пиридине H3C CH Cl N CH P ODMTr O CH3 N N 38 N N N O N NO2 OH ODMTr N N CН2Сl2, Et3N N N N O NO2 O OP 39 N N Схема 5. Получение амидофосфитa BHQ-1.
Таблица 4. Синтез фосфорамидита BHQ-1.
Компонент Выход, % 36 37 39 Синтез олигонуклеотидов вели, используя амидофосфитный метод на автоматических синтезаторах АSM-800 Новосибирск).
(OOO “Биоссет”, Флуоресцентные красители вводили на 3’-конец олигонуклеотида, используя колонки с модифицированным сорбентом CPG (500 ), имеющим готовые якорные группы с О,О’-дипивалоил-5-флуоресцеином. Гаситель флуоресценции вводили посредством полученных амидофосфитов BHQ-1 и RTQ-1. Для синтеза олигонуклеотидов использовались 5’-O-(4,4’-диметокситритил)-2’-дезоксинуклеозид фосфорамидиты (Glen Research, USA). Твердофазный фосфорамидитный метод синтеза олигонуклеотидов, широко используемый в автоматических синтезаторах является стандартизованной операцией описанной в литературе [S. A. Kates, F.
Albericio, Marcel Dekker Inc. (USA), New York, 2000, p. 475-529]. Полученные зонды обессоливали и чистили методом гель-электрофореза в полиакриламиде.
Первичную структуру полученных зондов подтверждали секвенированием по Максаму–Гилберту [Maxam A.M., Gilbert W., Meth. Enzymol. 1980. 65. p. 499].
Пары красителей и гасителей флуоресценции, а именно FAM-BHQ-1, ROX-BHQ были проанализированы согласно площади 2, R6G-BHQ-1, TAMRA-BHQ- перекрывания спектров флуоресценции и поглощения соответственно флуорофора и гасителя флуоресценции, что влияет на базовый уровень флуоресценции зонда.
Также нами был учтен такой фактор, влияющий на перенос энергии, как экстинкция флуорофора и его квантовый выход. Площадь перекрывания спектров флуоресценции и поглощения флуорофора и гасителя флуоресценции должна быть максимальной и квантовый выход флуорофора должен быть высоким (97% для FAM). Среди вышеперечисленных комбинаций флуорофоров и гасителей флуоресценции лучшим для нашего эксперимента являлась пара, состоящая из флуоресцеина, как флуоресцентного красителя и гасителя флуоресценции BHQ- (Black Hole Quencher, abs.=534 нм). Гаситель флуоресценции RTQ-1 (abs.=520 нм) также взятый нами для эксперимента является непатентованным спектральным аналогом BHQ-1, тоже имеет высокую площадь перекрывания спектра флуоресценции флуорофора (FAM) и своего спектра поглощения, содержащие его зонды необходимой длины были синтезированы на базе ЗАО «Синтол» для проведения работы. Для сравнения функциональности близких по спектральным характеристикам BHQ-1 и RTQ-1 было решено провести работу с двумя сериями зондов, содержащих оба вышеперечисленных гасителя флуоресценции, где флуорофор оставался неизменным.
Таким образом, на данной стадии был обоснован выбор флуорофоров и акцепторов флуоресценции, на базе которых были синтезированы зонды для нашей работы. Для эффективного переноса энергии с донора флуоресценции на акцептор флуоресценции нами был предложен подход для оптимизации зондов для ПЦР-РВ, базирующийся на теории Форстера, согласно которому можно с высокой точностью спланировать расстояние между донором и акцептором флуоресценции. Таким образом, для планирования зондов для РТ-ПЦР провели предварительный расчет дистанции между донором и акцептором флуоресценции, для оценки расстояния между двумя этими молекулами и синтеза зондов для работы.
2. Решение уравнения Форстера.
Для моделирования зондов необходимо было решить вопрос расстояния между флуорофором и гасителем флуоресценции, с этой целью необходимо было узнать Форстеровский радиус для выбранных пар флуоресцентного красителя и гасителя флуоресценции, что являлось бы отправной точкой в вопросе длины нуклеотидного звена в составе зондов для ПЦР-РВ. С этой целью было рассмотрено и подвергнуто математическим преобразованиям базовое уравнение Форстера, для возможности решения уравнения, используя имеющиеся в наличие возможности получения данных согласно спектральным характеристикам флуорофоров и гасителей флуоресценции, в программной среде дифференциального вычисления – МАTLAB.
Теория нерадиоактивного переноса энергии впервые была исследована Форстером [T. Forster, Annalen der Physik (Leipzig) 1948, 2, 55.], который использовал квантовые механизмы для описания переноса энергии в течение резонансного межмолекулярного взаимодействия. Взаимодействие обратно пропорционально расстоянию между двумя молекулами-флуорофорами и энергетический переход можно описать следующим образом [F. E. Auzel, Proceedings of the IEEE 1973, 61, 758.]:
Hsa - функция Гамильтона (Гамильтониан), E - Энергия электронного состояния состоящая из суммы энергии колебательных движений электронов и их энергии электронных переходов Волновые функции рассмотрены для элементарной матрицы описывающей начальный уровень системы с донором в возбужденном состоянии и акцептора в невозбужденном состоянии, конечное состояние показывает переход донора в исходное энергетическое состояние и возбуждение акцептора.
Теоретически, этот переход можно записать так:
s - истинное время жизни донора в возбужденном состоянии, Ro - критическое расстояние между донором и акцептором энергии.
Ro можно также записать следующим образом [G. Blasse, Materials Chemistry and Physics 1987, 16, 201.]:
где - длинна волны излучения, Sa () - коэффициент молярной экстинкции, S° коэффициент квантового выхода донора излучения в отсутствии акцептора энергии, n – коэффициент преломления среды, N – число Авогадро, подынтегральное выражение показывает полноценность энергетического взаимодействия излучения донора и поглощения акцептора энергии.
Теория Форстера переноса энергии, выражавшаяся межмолекулярным взаимодействием была развита и расширена Декстером, который добавил к теории Форстера полимолекулярное взаимодействие [D. L. Dexter, Journal of Chemical Physics 1953, 21, 836.]. По факту, для каждого атома изолированной молекулы, он может учитывать энергетический переход. Однако, процесс переноса энергии зависит от близко лежащих взаимодействий, переходы маловероятны на удалении, так (ao/ )2n - разделение, взаимодействующих ионов, может быть также близки к третьей группе -взаимодействия меньшей чем X, так что эффект переноса энергии стремиться к запрещенным энергетическим переходам. Перенос энергии для полимолекулярных систем можно записать как:
где s – положительное целое число, которое может принимать следующие значения: s = 6 двухмолекулярного взаимодействия, s = 8 двухмолекулярного квадромолекулярного взаимодействия s = 10 для квадромолекулярного квадромолекулярного взаимодействия.
Инокути и Хирояма [M. Inokuti, F. Hirayama, Journal of Chemical Physics 1965, 43, 1978.] развили теоретические расчеты Декстера, касательно обменных взаимодействий, экспериментально подтвердив данное явление. Они обнаружили зависимость между квантовым выходом и временем люминисценции донора как функцию количества акцептора [M. Inokuti, F. Hirayama, Journal of Chemical Physics 1965, 43, 1978.].
Когда две молекулы вовлечены в процесс переноса энергии находятся в возбужденных состояниях, интеграл перекрывания стремится к нулю и соответственно к выражению (3) возможно для энергии перехода должно также быть равно нулю [F. E. Auzel, Proceedings of the IEEE 1973, 61, 758]. Однако на практике, это говорит, что энергия переноса может занимать место между нерезонирующими молекулами настолько долго насколько разница энергий будет скомпенсирована появлением и аннигиляцией фононов в системе. Слияние матриц вибрационных состояний молекул называемых фононами разрешает энергию перехода пока общая энергия стабильности системы не изменяется. Энергия одного фононзависимого переноса энергии между молекулами в системе равна к d или kT, где d - температура Дебая [F. E. Auzel, Proceedings of the IEEE 1973, 61, 758.]. Если энергия переноса между молекулами больше чем Дебаевская отсеченная частота, перенос описывается в рамках многофотонного процесса.
Для теоретического расчета дистанции, на которой перенос энергии будет наиболее эффективным между парами флуоресцентных красителей и гасителей флуоресценции 5-FAM-BHQ-1 и парой FAM-RTQ-1 рассчитывается согласно теории Форстера.
Уравнение Форстера имеет следующий вид:
R0=(8.8 1023 k2 n-4 QYD J())1/6, где k2 – фактор дипольной ориентации (от 0 до 4;
k2 = 2/3, для различно ориентированных молекул донора и акцептора) QYD – квантовый выход флуорофора n – коэффициент преломления J() - спектральный интеграл, вычисляется по формуле:
J() = gA() FD() 4d cм3М-1, где gA = молярный коэффициент экстинкции акцептора (см3M-1).
FD = излучение донора, как фракция от общего испускания света системы FRET, доля излучения при данной длине волны, в случае максимума он равен 1.
Само уравнение было разбито на две смысловые части:
A = 8.8 1023 k2 n-4 QYD, g ( ) FD ( ) 4 d ;
B = J()= A Получаем следующий вид уравнения:
R0=(A B)1/6, Коэффициент А имеет обычное скалярное решение. Представляет собой произведение величин, которые являются табличными данными. Коэффициент B, в результате преобразования [J. of biochemistry, Vol. 256. No. 20, Issue of October 25, pp 10485-10489, 1981], можно представить в виде – F( ) ( ) d J( ) =, F()d где F() – флуоресценция донора, выраженная в произвольных еденицах, () – коэффициент экстинкции акцептора, выраженный в M-1cm-1, - длина волны, выраженная в см. Данный интеграл был решен при помощи встроенной функции программного пакета MATLAB 7.
График спектров излучения и поглощения флуоресценции имеет вид:
Рис 1. Графики флуоресценции FAM и поглощения RTQ-1 и BHQ-1.
Для решения такого вида интегралов применимы следующие два метода:
1. Метод трапеций, когда известны величина длины волны и соответствующего ей интенсивности флуоресценции или величины поглощения для гасителя флуоресценции. Данная функция реализуется в MATLAB 7 посредством оператора trapz(...,dim) — возвращает интеграл по строкам или по столбцам для входной матрицы в зависимости от значения переменной dim. В данном случае создаются две матрицы, состоящие из одного столбца, где между нумерованными ячейками имеется зависимость значения оси абсцисс и оси ординат. То есть для точного решения достаточно дискретного массива данных, с шагом, на пример, в 1 нм по оси абсцисс. Данные массивы предоставлены в базах данных MolProbes и Applera Inc (США). Также эти данные можно получить, используя результаты измерения обычного спектрофотометра с любой величиной шага дискретизации. Нами были проделаны такого рода измерения и сняты спектры флуоресценции и поглощения.
2. Метод квадратур, когда известна функция, площадь которой нам необходимо узнать.
A( )d Подынтегральное выражение fun задается как стандартная функция. С помощью функции quad(fun,a.b), можно решить такого вида интеграл, которая возвращает численное значение определенного интеграла от заданной функции fun на отрезке длин волн [0, ]. Используется значительно усовершенствованный в MATLAB адаптивный метод Симпсона.
Нами был использован первый метод, так как данные с зависимостью функции (А- интенсивность флуоресценции) от аргумента ( – длина флуоресценции флуорофора и поглощения гасителя флуоресценции) являются легко доступными при снятии спектра флуоресценции. Второй метод требует нахождения функции А(), что является лишним и сложным шагом в нашей задаче, так как численная зависимость А от нам известна для каждого флуорофора и гасителя флуоресценции.
Матрица, составленная на основе спектра флуоресценции FAM, где длина волны выражена в нанометрах. Эта матрица представляет собой таблицу, где указаны дискретные значения относительной величины флуоресценции от соответствующей ей длины волны. Форма ввода массива соответствующих значений в виде матрицы принята в среде MATLAB.
Для подсчета коэффициента экстинкции акцептора для различных длин волн воспользуемся законом Бугера-Ламберта-Бера:
С=А /( I), где С – концентрация зонда, моль/литр, А – оптическая плотность раствора при определенной длине волны нм, I – длина оптического пути, см, – молярный коэффициент экстинции при нм, М-1см-1.
Выразив, получаем:
A = CI А общий интеграл будет иметь вид:
F() A d J( ) = C I F( )d Таким образом, нам необходимы еще две матрицы, построенные на результатах измерения оптической плотности гасителя флуоресценции в составе зонда для ПЦР в реальном масштабе времени. Выразив величину экстинкции гасителя флуоресценции через величину его оптической плотности для определенных, интересующих на длин волн – были записаны еще две матрицы для двух гасителей флуоресценции BHQ-1 и RTQ-1.
Имея величину на оси абсцисс и соответствующую ей значение ординаты в области перекрывания спектров можно использовать метод трапеции. Рассчитав площади трапеций с шагом, выраженным в матрице, используя расчетные мощности математической среды MATLAB, нам удалось решить этот интеграл и уравнение в целом.
Для пары флуоресцентного красителя 5-FAM и BHQ-1 это расстояние составило 55 ангстрем, что соответствует длине олигонуклеотидной цепочки в 24 звена, а для пары FAM-RTQ-1 данная величина равна 50 ангстремам, что соответствует длине цепочки в 21 нуклеотид.
На следующем этапе работы сравнили соответствие расчетных и практических результатов касательно длины зонда для ПЦР-РВ.
3. Проверка теоретических результатов, на практике, методом ПЦР в реальном масштабе времени.
В цели настоящей работы входила оптимизация флуоресцентно-меченого зонда для ПЦР-РВ. Исходя из вышеизложенного, был выбран широко использующийся компонент для создания векторных систем экспрессионной кассеты трансгенных растений – NOS-терминатор.
Для анализа на присутствие ГМИ источников была выбрана соя (Soy-18). Для оценки оптимальной длины олигонуклеотидного спейсера нами было синтезировано два набора зондов, различающихся как по длине олигонуклеотидного участка, так и по гасителю флуоресценции, входящего в состав зондов (рис. 2).
Для работы были синтезированы следующие праймеры и зонды для ПЦР в реальном времени (табл. 2):
Вопрос о выборе участка, где зонд специфично связывается с матрицей, решается методом подбора последовательности зонда (рис. 2), сайт гибридизации должен обладать высокой специфичностью, зонд необходимо располагать как можно ближе по возможности к праймеру без взаимного перекрывания, избегая повторов больше чем в 4 нуклеотида в последовательности и комлементарности между зондом и праймерами. Олигонуклеотидная последовательность праймеров для амплификации была выбрана согласно методическим указаниям Министерства здравоохранения РФ [5], NOS - UP 5’ - TTA TCC TAG TTT GCG CGC TA – 3’, NOS – LOW 3’ - GAA TCC TGT TGC CGG TCT TG – 5’. В качестве мишени для анализа на присутствие ГМИ источников была выбрана соя (Soy-18).
Табл. 2. Последовательности праймеров и зондов для проведения ПЦР в реальном времени.
Название Последовательность NOS-40-RT 5’-3’ RTQ1-CGT CAT GCA TTA CAT GTT AAT TAT TAC ATG CTT AAC GTA A- FAM NOS-40-BH 5’-3’ BHQ1 -CGT CAT GCA TTA CAT GTT AAT TAT TAC ATG CTT AAC GTA A- FAM NOS-37-RT 5’-3’ RTQ1 -CGT CAT GCA TTA CAT GTT AAT TAT TAC ATG CTT AAC G- FAM NOS-37-BH 5’-3’ BHQ1 -CGT CAT GCA TTA CAT GTT AAT TAT TAC ATG CTT AAC G- FAM NOS-34-RT 5’-3’ RTQ1 -CGT CAT GCA TTA CAT GTT AAT TAT TAC ATG CTT A- FAM NOS-34-BH 5’-3’ BHQ1 -CGT CAT GCA TTA CAT GTT AAT TAT TAC ATG CTT A- FAM NOS-31-RT 5’-3’ RTQ1 -CGT CAT GCA TTA CAT GTT AAT TAT TAC ATG C- FAM NOS-31-BH 5’-3’ BHQ1 -CGT CAT GCA TTA CAT GTT AAT TAT TAC ATG C- FAM NOS-28-RT 5’-3’ RTQ1 -CGT CAT GCA TTA CAT GTT AAT TAT TAC A- FAM NOS-28-BH 5’-3’ BHQ1 -CGT CAT GCA TTA CAT GTT AAT TAT TAC A- FAM NOS-25-RT 5’-3’ RTQ1 -CGT CAT GCA TTA CAT GTT AAT TAT T- FAM NOS-25-BH 5’-3’ BHQ1 -CGT CAT GCA TTA CAT GTT AAT TAT T- FAM NOS-22-RT 5’-3’ RTQ1 -CGT CAT GCA TTA CAT GTT AAT T- FAM NOS-22-BH 5’-3’ BHQ1 -CGT CAT GCA TTA CAT GTT AAT T- FAM Рис 2. Нуклеотидная последовательность NOS – terminator, положение зондов на матрице.
Эффективность работы флуоресцентного зонда складывается из ряда факторов:
1) Величина разгорания зонда после расщепления ДНК-полимеразой;
2) Воспроизводимость результатов ПЦР в реальном времени;
3) Низкий уровень начальной флуоресценции зонда.
Таким образом, в результате оптимизации мы предполагали, что наши зонды, согласованные с расчетными данными будут обладать всеми этими вышеперечисленными качествами.
Рис 3. Схема ПЦР в реальном масштабе времени.
Работа была осуществлена в два этапа. На первом этапе были использованы зонды с применением флуоресцентного гасителя BHQ-1(NOS-37-BH, NOS-34-BH, NOS-31-BH, NOS-28-BH, NOS-25-BH, NOS-22-BH). Эта работа была выполнена на приборе iCycler (BIO-RAD, USA). Где была возможность использовать градиент температуры отжига, с целью определения оптимального значения.
Оптимальная температура отжига для зондов различной длины составила 60°С.
Второй этап опыта был проведен на приборе АНК-32 (Санкт-Петербург, Россия).
В данном опыте были задействованы все зонды, указанные в табл. 2. Целью данного эксперимента являлось сравнение эффективности работы всех зондов, выделение из них лучших и сравнение длины их спейсерной части с рассчитанной в предыдущей главе.
В результате анализа стало понятно, что этим требованиям отвечают зонды с длинной линкера в 22-25 нуклеотидных звеньев, что соотносится с данными, полученными при расчете радиуса Форстера. Также была подсчитана величина Е, характеризующая эффективность переноса энергии с флуорофора на гаситель флуоресценции. Данная математическая модель может быть применена для дизайна флуоресцентно-меченых зондов для ПЦР в реальном масштабе времени.
На рис. 4 и рис. 4.1 показаны результаты ПЦР-РВ с зондами различающимися как по длине, так и по температуре отжига, таким образом можно выделить зонды с длиной спейсера в 22 и 25 нуклеотидных звеньев с температурой отжига в 55,7 °С, с целью уменьшения неспецифичной гибридизации для следующего эксперимента была взята температура в 60°С. Таким образом следующая часть работы была приведена к данному общему условию. И останется только один фактор для вариации - длина олигонуклеотидного спейсера, который необходимо оптимизировать.
Рис 4. График зависимости интенсивности флуоресценции от циклов ПЦР в реальном времени, общий вид (iCycler, BIO-RAD Laboratories Inc.).
Рис 4.1. График зависимости интенсивности флуоресценции от циклов ПЦР в реальном времени, с отдельными, выделенными значениями (iCycler, BIO-RAD Laboratories Inc.).
Рис 5. График зависимости интенсивности флуоресценции от циклов ПЦР в реальном времени, общий вид (AНК-32, Россия).
Рис 5.1. График зависимости интенсивности флуоресценции от циклов ПЦР в реальном времени, с отдельными, выделенными значениями (AНК-32, Россия).
На рис. 5 и рис. 5.1 показаны результаты ПЦР-РВ со всем спектром синтезированных зондов, среди полученных результатов стоит выделить зонды с длиной спейсерной части в 22 и 25 нуклеотидов.
Табл. 3. Результаты ПЦР в реальном масштабе времени, полученные на iCycler (BIO-RAD, USA), где Сt – значение нулевого цикла, Тотжига – температура отжига, Fотн – относительная величина флуоресценции, количество звеньев – количество нуклеотидных звеньев между флуорофором и гасителем флуоресценции в зонде.
Расчетная величина Форстера для пары FAM-BHQ-1 – 24 звена Кол-во Зонд Е Ct Tотжига Fотн.
Звеньев NOS-37-BH 27,9 67 125 37 0, NOS-34-BH - 67 - 34 0, NOS-31-BH 37,9 67 134 31 0, NOS-28-BH - 67 - 28 0, NOS-25-BH - 67 - 25 0, NOS-22-BH 38,9 67 140 22 0, NOS-37-BH 27,3 66 120 37 0, NOS-34-BH 29,2 66 210 34 0, NOS-31-BH 35,2 66 80 31 0, NOS-28-BH - 66 - 28 0, NOS-25-BH - 66 - 25 0, NOS-22-BH 43,5 66 115 22 0, NOS-37-BH 25,8 64,3 180 37 0, NOS-34-BH 27,2 64,3 190 34 0, NOS-31-BH 28,1 64,3 95 31 0, NOS-28-BH 33,2 64,3 45 28 0, NOS-25-BH 46,0 64,3 38 25 0, NOS-22-BH 35,2 64,3 35 22 0, NOS-37-BH 26,8 61,5 230 37 0, NOS-34-BH 27,1 61,5 275 34 0, NOS-31-BH 27,6 61,5 400 31 0, NOS-28-BH 27,8 61,5 175 28 0, NOS-25-BH 29,7 61,5 140 25 0, NOS-22-BH 29,9 61,5 110 22 0, NOS-37-BH 25,8 57,7 350 37 0, NOS-34-BH 26,8 57,7 250 34 0, NOS-31-BH 27,0 57,7 260 31 0, NOS-28-BH 27,1 57,7 297 28 0, NOS-25-BH 27,1 57,7 300 25 0, NOS-22-BH 27,2 57,7 305 22 0, NOS-37-BH 26,2 55 210 37 0, NOS-34-BH 26,7 55 225 34 0, NOS-31-BH 26,8 55 440 31 0, NOS-28-BH 27,0 55 280 28 0, NOS-25-BH 27,0 55 290 25 0, NOS-22-BH 27,0 55 435 22 0, NOS-37-BH 26,3 53,1 238 37 0, NOS-34-BH 26,5 53,1 245 34 0, NOS-31-BH 26,6 53,1 320 31 0, NOS-28-BH 26,7 53,1 350 28 0, NOS-25-BH 26,7 53,1 420 25 0, NOS-22-BH 26,8 53,1 475 22 0, NOS-37-BH 26,2 52 325 37 0, NOS-34-BH 26,6 52 255 34 0, NOS-31-BH 26,7 52 550 31 0, NOS-28-BH 26,8 52 295 28 0, NOS-25-BH 27,0 52 340 25 0, NOS-22-BH 26,7 52 500 22 0, Табл. 4. Результаты ПЦР в реальном масштабе времени, полученные на АНК- (Санкт-Петербург, Россия), где Сt – значение нулевого цикла, Тотжига – температура отжига, Fотн – относительная величина флуоресценции, количество звеньев – количество нуклеотидных звеньев между флуорофором и гасителем флуоресценции в зонде.
Расчетная величина Форстера для пары FAM-BHQ-1 – 24 звена Расчетная величина Форстера для пары FAM-RTQ – 21 звено Кол-во Зонд Е Ct Tотжига Fотн.
Звеньев NOS-40-BH 26,86 60 270 40 0, NOS-37-BH 26,50 60 345 37 0, NOS-34-BH 26,71 60 420 34 0, NOS-31-BH 26,72 60 600 31 0, NOS-28-BH 27,61 60 700 28 0, NOS-25-BH 26,24 60 710 25 0, NOS-22-BH 26,47 60 790 22 0, NOS-40-RT 26,34 60 240 40 0, NOS-37-RТ 26,72 60 290 37 0, NOS-34-RТ 26,34 60 350 34 0, NOS-31-RТ 26.71 60 360 31 0, NOS-28-RТ 26,72 60 460 28 0, NOS-25-RТ 25,52 60 490 25 0, NOS-22-RТ 25,52 60 530 22 0, При анализе таблиц 3 и 4 обратили внимание на результаты ПЦР-РВ с зондами, имеющих длину 22 и 25 нуклеотидов, и на расчет для них теоретической эффективности, выраженной в долях (Е=1 – наилучшая эффективность), таким образом, наблюдается строгое соответствие между расчетными данными и результатами ПЦР-РВ.
Уровень флуоресценции 5-FAM измерялся относительно флуоресценции 5-R6G.
Эксперимент проводили при эквивалентных значениях флуоресценции у внешнего контроля и флуорофора, входящего в состав зонда.
В ходе работы были созданы оригинальные схемы синтеза и очистки флуоресцентных красителей ксантенового ряда, гасителей флуоресценции их активированных производных с целью получения зондов для ПЦР-РВ. Это позволит получать ПЦР-диагностикумы для обнаружения различных ДНК-мишеней.
Спектральные характеристики синтезированных красителей, встроенных в зонды, имеют хорошую динамику повышения флуоресцентного сигнала и высокий квантовый выход и имеют те же спектральные характеристики, что и зарубежные аналоги. Также была применена и подтверждена математическая модель для создания зондов, имеющих минимальный уровень стартовой флуоресценции, что объясняется наиболее эффективным переносом энергии с донора на акцептор в системе переноса флуоресцентной энергии.
ВЫВОДЫ 1. Разработаны оригинальные схемы синтеза флуоресцентных красителей (ROX, TAMRA, R6G, FAM) и гасителей флуоресценции (BHQ-1, RTQ-1) и их активированных производных, для создания зондов ПЦР-РВ.
2. Предложен новый математический подход для планирования зондов для ПЦР в реальном масштабе времени. Предложен доступный и универсальный метод расчета величины Форстеровского радиуса для любых линейных зондов.
3. Разработан алгоритм расчета Форстеровского радиуса для систем зондов с флуорофором – FAM и гасителями флуоресценции BHQ-1 и RTQ-1 с помощью программной среды для математических вычислений – MATLAB.
4. Подтверждена эффективность математического подхода планирования зондов для ПЦР-РВ. Обнаружена корреляция между значениями связанных с расчетом величины Е, эффективностью работы системы с переносом энергии по Форстеру, и величины флуоресцентного сигнала, полученного в результате протекания ПЦР в реальном масштабе времени. На практике данный подход позволит в лабораторных условиях с высокой степенью точности и надежности планировать зонды для ПЦР-РВ для решения любых диагностических задач.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Гудов В.П., Алексеев Я.И., Варламов Д.А., Лунин В.Г., Харченко П.Н.
Разработка подхода эффективного планирования флуоресцентно-меченых зондов для ПЦР в реальном времени. // Доклады РАСХН. 2007 г. № 6. с. 7 – 11.
2. Гудов В.П., Лунин В.Г., Швец В.И. Создание модифицированных сорбентов для твердофазного синтеза зондов для ПЦР в реальном масштабе времени // Вестник МИТХТ. 2009 г. Т. 4, № 5, c. 28-33.
3. Гудов В.П. Создание зондов для диагностикума трансгенных растений.
Изучение подходов эффективного планирования зондов для ПЦР в реальном масштабе времени. // Материалы Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье». Рязань. 29 мая – 1 июня 2007 г., с. 209-211.
4. Гудов В.П., Алексеев Я.И., Лунин В.Г. Синтез флуоресцентно-меченых зондов и их составляющих для проведения ПЦР реальном времени. // II Международный конгресс «Биотехнология;
состояние и перспективы развития», Материалы конгресса, часть 1, с. 192, Москва 2003 г, 10-14 ноября.
5. Goodoff P. Vladimir Preparation of succinimidyl active esters of N,N’-Tetramethyl 5(6)-Carboxyrhodamine and 5(6)-Carboxy-X-Rhodamine. // The Book.
Biotechnology in Agriculture and the Food Industry. Editor Zaikov G.E. pp. 35-38, Nova Publishers, Inc, New York 2004.
Карзанова М.Е. Кунда М.С., Гудов В.П., Лунин В.Г., Воронина О.Л.
6.
«Разработка диагностических наборов для выявления трансгенных растений» // III Международная конференция «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеренарии», материалы конференции, Москва 2004 г., октября, с. 127-128.
Гудов В.П. Новые методы синтеза флуоресцентных красителей для создания 7.
зондов, использующихся в ПЦР в реальном времени. // IV Молодежная научная конференция «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеренарии», Сборник работ конференции, Москва 2004 г., 31 марта, с. 9-11.
Гудов В.П., Создание флуоресцентных красителей и их активированных 8.
производных, с целью синтеза зондов для ПЦР в реальном времени. // III Молодежная научная конференция «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеренарии», Сборник работ конференции, Москва г., 10 апреля, с. 23- Гудов В.П., Новые методы синтеза флуоресцентных красителей и их 9.
модификаций для секвенирования ДНК и создания зондов для ПЦР в реальном времени. // II Молодежная научная конференция «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеренарии», Сборник работ конференции, Москва 2002 г., 3 апреля, с. 24-25.