Молекулярно – генетическое исследование комаров комплекса culex pipiens (diptera: culicidae)
На правах рукописи
Храброва Наталья Валерьевна МОЛЕКУЛЯРНО – ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ КОМАРОВ КОМПЛЕКСА CULEX PIPIENS (DIPTERA: CULICIDAE) 03.00.15 – генетика
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Томск – 2006
Работа выполнена в Научно – исследовательском институте биологии и биофизики при Томском государственном университете
Научный консультант: доктор биологических наук, профессор В.Н. Стегний
Официальные оппоненты: доктор биологических наук В.А. Степанов кандидат биологических наук А.В. Симакова
Ведущая организация: Институт цитологии и генетики СО РАН (г. Новосибирск)
Защита диссертации состоится «18 » мая 2006 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 212.267.10 в Томском государственном университете по адресу: 634050 г. Томск, пр. Ленина,
С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Томского государственного университета Автореферат разослан « 14 » апреля 2006 г.
Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук Е.Ю. Просекина ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы. Комары комплекса Culex pipiens (Diptera: Culicidae) представляют большой научный и практический интерес. Они являются активными кровососами людей и известны как переносчики возбудителей ряда опасных заболеваний человека. Высокая экологическая пластичность, сложная таксономическая структура и характер взаимоотношений между членами комплекса привлекают постоянное внимание исследователей (Виноградова, 1997).
Culex pipiens L., 1758 – северный обыкновенный комар, включает в себя две формы или экотипа, pipiens и molestus, для которых характерно симпатрическое распространение, небольшие морфологические и значительные биологические отличия (Виноградова, 1961, 1997;
Лопатин, 2000).
Единственным достоверным морфологическим признаком, позволяющим идентифицировать pipiens и molestus, является величина сифонального индекса личинок.
Culex torrentium Martini, 1924 считается видом – двойником Culex pipiens, литературные сведения о нем фрагментарны, не определены и границы ареала (Natvig, 1948;
Mattingly, 1951а;
Service, 1968;
Jupp, 1979;
Gillies, Gubbins, 1982;
Dahl, 1988). Морфологически C. torrentium и C. p. pipiens близки, распространение симпатричное. В биологическом отношении C. torrentium также похож на C. p. pipiens – неавтогенный, эвригамный и гетеродинамный комар (Dahl, 1988;
Виноградова, 1997). По личинкам виды не различимы, определение ведется только по самцам, диагностическое значение имеют особенности строения гипопигия (Виноградова, 1997).
Исследования представителей рода Culex приобрели особое значение в связи с возникновением трех крупных эпидемий западнонильской лихорадки (West Nile virus) в урбанизированных районах на юге Румынии (Tsai, Popovici, Cernescu et al., 1998), в дельте Волги в России (Lvov, Butenko, Gromashevsky et al., 2000;
Platonov, Shipulin, Shipulina et al., 2001) и на северо – востоке США (Lanciotti, Roehrig, Deubel et al., 1999) в 1996 – 1999 гг. Основным признаком, объединяющим эти эпидемии, явилось вовлечение Culex pipiens в передачу возбудителя заболевания (Hayes, 2001).
Надежная и быстрая идентификация комаров необходима для дифференцировки форм и лучшего понимания их потенциальной роли в передаче возбудителей заболеваний, а также для разработки эффективных мер контроля. Кроме того, возможность точной идентификации видов или подвидов позволяет изучить другие аспекты биологии, например, особенности личиночной экологии, брачного поведения, устойчивости к инсектицидам (Walton, Sharpe, Pritchard et al., 1999;
Kengne, Trung, Baimai et al., 2001;
Manguin, Kengne, Sonnier et al., 2002). Морфологические признаки, особенно, если они носят количественный характер, не всегда удобно использовать для этих целей, т.к. часто они подвержены индивидуальной, географической, комбинативной и модификационной изменчивости. Для облегчения идентификации криптических видов комаров широко применяются разнообразные молекулярно – генетические методы в дополнение к традиционным морфологическим (Wilkerson, Parsons, Albright et al., 1993). ДНК – маркеры можно использовать для идентификации организма на любой стадии развития;
эти маркеры не подвержены изменчивости, вызванной действием факторов окружающей среды (Hoy, 1994;
Walton, Sharpe, Pritchard et al., 1999), что позволяет избежать недостатков, присущих морфометрическим признакам.
Цели и задачи исследования. Цель данной работы заключалась в поиске молекулярно – генетических маркеров для идентификации представителей комплекса Culex pipiens и оценке внутри – и межвидовой изменчивости Culex torrentium, C. pipiens pipiens, C. p. molestus. Для достижения поставленной цели требовалось выполнить следующие задачи:
1. Провести анализ спектров амплифицированных RAPD – фрагментов ДНК для выявления мономорфных специфичных последовательностей ДНК 2. Определить нуклеотидные последовательности специфичных RAPD – фрагментов ДНК для создания SCAR – праймеров 3. Проверить диагностическую ценность молекулярно – генетических маркеров, предложенных другими авторами для идентификации представителей комплекса Culex pipiens 4. Провести секвенирование и сравнение последовательностей второго интрона гена ацетилхолинэстеразы 2 и участка митохондриального гена субъединицы I цитохромоксидазы с у особей C. p. pipiens и C. p. molestus с целью выявления различий, пригодных для получения молекулярно – генетических маркеров 5. Оценить внутри – и межвидовую изменчивость и дивергенцию RAPD – маркеров у членов комплекса Culex pipiens Научная новизна. Впервые были найдены специфичные RAPD – маркеры для идентификации C. torrentium. Определение нуклеотидной последовательности RAPD – фрагментов позволило создать специфичные SCAR – праймеры. ПЦР с использованием SCAR – праймеров является простым, быстрым и надежным методом идентификации C. torrentium. В ходе работы также была изучена диагностическая ценность маркеров, предложенных другими авторами для идентификации C. p. molestus и C. torrentium (Виноградова, Шайкевич, 2005), C. p. pipiens и C. torrentium (Smith, Fonseca, 2004).
Показано, что эти маркеры позволяют идентифицировать особей C. torrentium, в то время как, C. p.
pipiens и C. p. molestus идентичны по этим маркерам. Выявлено соответствие результатов при использовании различных типов молекулярно – генетических маркеров. Впервые предложен способ идентификации гибридных особей от скрещивания C. torrentium и C. p. molestus.
Проведен анализ изменчивости RAPD – маркеров в популяциях C. p. pipiens, C. p. molestus и C.
torrentium из г. Томска, Томской области и Республики Казахстан. Полученные результаты позволили сделать вывод о генетической дифференциации C. torrentium, C. p. pipiens и C. p. molestus и об отсутствии природной гибридизации между ними в районе проведенных исследований. Кроме того, показано, что в открытых личиночных биотопах (Томская область и Республика Казахстан) доминантным видом является C. torrentium;
личинки C. p. pipiens встречаются с небольшой частотой.
Практическая ценность работы. Молекулярно – генетические маркеры, рассмотренные в настоящей работе, можно использовать в любых исследованиях, где необходима надежная идентификация C. torrentium и C. p. pipiens, в частности, при изучении устойчивости к инсектицидам, путей передачи возбудителей заболеваний, при разработке новых методов контроля за численностью переносчиков, для анализа гибридогенеза, а также, в популяционно – генетических, таксономических, филогенетических и фаунистических исследованиях. Принципы поиска и создания специфичных маркеров (RAPD– и SCAR – маркеры), изложенные в диссертации, можно применять для получения диагностических маркеров практически для любого организма.
Апробация результатов работы. Результаты исследований были представлены на II Международной конференции «Проблема вида и видообразования», Томск (2001);
на III Съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров, Москва (2004);
на III Международной конференции «Проблема вида и видообразования», Томск (2004).
Публикации. По теме диссертации опубликовано шесть работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов, списка цитируемой литературы. Работа изложена на 118 страницах машинописного текста, включает таблиц, 17 рисунков. Список литературы содержит 164 источника, в том числе 137 на иностранном языке.
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ В главе на основе отечественных и зарубежных литературных источников обобщены данные о комплексе Culex pipiens. Особое внимание уделено C. p. pipiens и C. p. molestus. Подробно рассматриваются особенности биологии и экологии, а также проблема гибридизации между C. p. pipiens и C. p. molestus. Также приведены данные по биологии C. torrentium.
Кроме того, в литературном обзоре подробно обсуждается возможность использования различных типов молекулярно – генетических маркеров для видовой диагностики;
наибольшее внимание уделено RAPD – и SCAR – маркерам, а также маркерам мтДНК и ITS2 регионам рДНК.
2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ 2.1. Материал В работе использовалась ДНК, выделенная из личинок комаров IV стадии. Сбор личинок проводили по стандартной методике. Личинки Culex pipiens pipiens и C. torrentium, были отловлены в открытых естественных водоемах и цистернах для сбора дождевой воды, личинки С. p. molestus – в затопленных подвальных помещениях городских зданий, личинки С. territans и C. modestus – в естественном водоеме (Таблица 1). Личинки фиксировались в 96% - ом этаноле.
Вид / подвид (форма) n Место сбора Тип водоема Дата сбора C. torrentium и C. p. pipiens 48 РК, г. Алматы Е, О 24.08. C. torrentium 48 ТО, с. Белоусово И, О 30.07. C. torrentium 48 ТО, д. Михайловка И, О 11.06. C. torrentium и C. p. pipiens 48 ТО, с. Моряковский Затон И, О 03.08. C. torrentium 48 РК, с. Аксаковка Е, О 05.08. C. torrentium 48 РК, с. Науалы Е, О 08.08. C. torrentium 48 ТО, Керамический завод И, О 13.08. C. torrentium 48 ТО, Керамический завод И, О 05.07. C. torrentium 48 РК, г. Алматы 1 И, О 08.08. C. torrentium 48 РК, г. Алматы 2 И, О 08.08. C. torrentium 24 г. Томск, ул. Короленко, 15 Е, О 12.07. C. torrentium 24 г. Томск, ул. Короленко, 15 Е, О 16.06. C. p. pipiens 48 РК, г. Семипалатинск И, О 16.08. C. p. molestus 48 г. Томск, ул. Тимакова, 3 И, З 28.06. C. p. molestus 48 г. Томск, ул. Тимакова, 3 И, З 15.07. C. p. molestus 48 г. Томск, ул. Яковлева, 14 И, З 21.07. C. p. molestus 48 г. Томск, ул. Алтайская, 78/2 И, З 03.08. C. p. molestus 48 г. Томск, ул. Тимакова, 3 И, З 24.09. C. p. molestus 24 г. Томск, ул. Алтайская, 78/2 И, З 07.07. C. p. molestus 24 г. Томск, ул. Короленко, 15 И, З 12.07. C. p. molestus 48 г. Томск, ул. Иркутский тракт, 104 И, З 17.12. C. p. molestus 48 РК, г. Сарышаган И, З 09.02. F1: C. p. molestus x C. torrentium 36 Лаборатория ---- 15.09. F1: C. p. molestus x C. torrentium 48 Лаборатория ---- 23.09. F1: C. p. molestus x C. torrentium 24 Лаборатория ---- 26.06. C. territans 48 г. Томск, коммунальный мост через р. Томь Е, О 24.08. C. modestus 48 г. Томск, коммунальный мост через р. Томь Е, О 24.08. Таблица 1 – Выборки комаров, использованные в работе Примечание. Тип водоема: Е – естественный;
И – искусственный;
О – открытый;
З – закрытый;
n – объем выборки;
РК – Республика Казахстан, ТО – Томская область 2.2. Методы При выполнении работы применялись следующие методы: выделение ДНК, RAPD – ПЦР, ПЦР со специфичными праймерами, электрофоретическое разделение продуктов амплификации, рестрикция, клонирование и секвенирование. Праймеры, использованные в работе, представлены в таблице 2. Для обработки полученных результатов использовали пакеты программ SeqMan™ 4.02, PrimerSelect™ 4.01, FinchTV 1.3.1, POPGENE©1.32, TreeView©1.6.6, STATISTICA©6.0, Adobe®Photoshop® 7.0.
Таблица 2 – Праймеры, использованные в работе Последовательность праймера, 5' 3' Праймер Продукт амплификации Специфичный RAPD – SCARcp1 CCCTTACGCACGGAGAAA фрагмент SCARcp2 CTAACAAAGTACTCCCTCAA (SCAR – маркер) Специфичный RAPD – SCARcp3 ATTTGGATTGGACTTTCTATTTA фрагмент SCARcp4 TTGAATTTTGACATGACGGTTTTT (SCAR – маркер) Участок митохондриального UEA9 GTAAACCTAACATTTTTTCCTCAACA гена субединицы I UEA10 TCCAATGCACTAATCTGCCATATTA цитохромоксидазы с 5.8S TGTGAACTGCAGGACACATG 28S ATGCTTAAATTTAGGGGGTA ITS2 регион рДНК 5.8Sa ATCACTCGGCTCGTGGATCGAT ACEpip GGAAACAACGACGTATGTACT Участок второго интрона ACEtorr TGCCTGTGCTACCAGTGATGTT гена ацетилхолинэстеразы B1246s TGGAGCCTCCTCTTCACGG 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 3.1. Использование молекулярно – генетических маркеров для идентификации представителей комплекса Culex pipiens 3.1.1. RAPD – маркеры Скрининг двадцати шести RAPD – праймеров показал, что для идентификации C. torrentium и C.
p. pipiens можно использовать фрагменты ДНК, амплифицирующиеся RAPD – праймерами OPB – 02 и OPA– 11. В спектре фрагментов ДНК, амплифицированных праймером OPB – 02 (5' – TGATCCCTGC – 3'), был выявлен мономорфный бэнд, размером 1183 п.н. (по данным секвенирования), идентифицирующий C. torrentium (Рисунок 1A).
А В Рисунок 1 – Результаты амплификации ДНК с использованием RAPD – праймеров OPB – 02 (A) и OPA – 11 (B) Примечание. Специфичные для C. torrentium фрагменты ДНК обозначены стрелками. Дорожки – 9 – C. torrentium. Дорожки 11 – 13 – C. p. pipiens;
дорожки 14 – 18 – C. p. molestus. Дорожки 1, 10, ДНК маркеры: 1kb (10, 8, 6, 5, 4, 3, 2.5, 2, 1.5, 1, 0.75, 0.5, 0.25 т.п.н.) (A), 100bp + 1,5kb (1.5, 1, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 0.1 т.п.н.) (B) На рисунке 1B представлены результаты амплификации с использованием праймера OPA – 11 (5' – CAATCGCCGT – 3'). В паттерне C. torrentium четко выявляется специфичный фрагмент ДНК, размером 680 п.н. (по данным секвенирования), отсутствующий в спектре амплифицированных фрагментов ДНК C. p. pipiens и C. p. molestus.
Маркеры не подвержены внутри – и межпопуляционной изменчивости, они представлены в спектрах RAPD – фрагментов у всех особей C. torrentium всех изученных популяций, но отсутствуют спектрах амплифицированных фрагментов ДНК C. p. pipiens и C. p. molestus, т.е., присутствие RAPD – маркера среди продуктов амплификации характеризует особей C. torrentium, а его отсутствие – особей C. p. pipiens и C. p. molestus. Таким образом, использование RAPD – маркеров позволяет надежно идентифицировать особей C. torrentium. Метод является простым и быстрым в исполнении. Любому исследователю необходим лишь навык в анализировании RAPD – спектров, остальные моменты RAPD – идентификации C. torrentium, не вызывают затруднений.
3.1.2. SCAR – маркеры Специфичные RAPD – бэнды были клонированы и секвенированы (данные не показаны).
Определение последовательности нуклеотидов позволило подобрать специфичные SCAR – праймеры.
Праймеры SCARcp1 и SCARcp2 (Таблица 2) были созданы на основе нуклеотидной последовательности фрагмента, размером 1183 п.н., амплифицированного RAPD – праймером OPB – 02. Праймеры SCARcp и SCARcp4 (Таблица 2) – на основе последовательности RAPD – фрагмента, размером 680 п.н. (RAPD – праймер OPA – 11);
Результатом использования SCAR – праймеров является амплификация одного специфичного фрагмента ДНК (SCAR – маркера).
В ходе SCAR – ПЦР с праймерами SCARcp1 и SCARcp2 у особей C. torrentium и гибридов между C. p. molestus и C. torrentium амплифицируется фрагмент ДНК, размером 1093 п.н.;
особи C. p.
pipiens и C. p. molestus характеризуются отсутствием амплификации фрагмента ДНК соответствующего размера (Рисунок 2A). Использование праймеров SCARcp3 и SCARcp4 приводит к амплификации фрагмента ДНК, размером 474 п.н. у особей C. torrentium и гибридов между C. p. molestus и C.
torrentium;
у особей C. p. pipiens и C. p. molestus данный фрагмент ДНК не амплифицируется (Рисунок 2B).
SCAR – маркеры являются специфичными, т.к. не подвержены внутри – и межпопуляционной изменчивости. Применение SCAR – маркеров позволяет усовершенствовать метод RAPD – идентификации C. torrentium, сделать его доступным широкому кругу исследователей, т.к. в случае использования SCAR – маркеров отпадает необходимость в анализе набора фрагментов ДНК разных размеров. Однако, эти маркеры А В Рисунок 2 – Результаты амплификации ДНК с использованием праймеров SCARcp1 и SCARcp (A), SCARcp3 и SCARcp4 (B) Примечание. Дорожки 2, 4, 6, 8, 11, 13, 15, 17 – C. torrentium;
дорожки 3, 5, 7 – C. p. pipiens;
дорожки 9, 12, 14, 16, 18 – C. p. molestus;
дорожки 19 – 21 – F1: C. p. molestus x C. torrentium.
Дорожка 23 – негативный контроль, дорожки 1, 10, 22 – ДНК маркеры: 1,5 kb + 100 bp (A) и 100 bp (1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100 п.н.) (B) не позволяют идентифицировать гибридов, т.к. гибридные особи от скрещивания C. p. molestus x C. torrentium идентичны по SCAR – маркерам особям C. torrentium.
3.1.3. ITS2 регионы рибосомальной ДНК По данным Виноградовой и Шайкевич (2005), размер ПЦР фрагментов ДНК C. torrentium и C. p.
molestus, полученных в результате амплификации с праймерами, фланкирующими ITS2 регион, составляет приблизительно 410 п.н. и 460 п.н., соответственно, т.е. различие между ними достигает п.н. На рисунке 3 представлены результаты амплификации ITS2 регионов рДНК с использованием праймеров 5.8S и 28S (Таблица 2). Размеры амплификатов равны около 410 п.н. у C. torrentium и около 460 п.н. у C. p. pipiens и C. p. molestus. В рДНК гибридных особей от скрещивания C. p. molestus x C. torrentium представлены оба варианта (материнский и отцовский) ITS2 регионов (Рисунок 3).
Рисунок 3 – Результаты амплификации ITS2 регионов рДНК с использованием праймеров 5.8S и 28S Примечание. Специфичные продукты амплификации обозначены стрелками. Дорожки 2 – 9 – C.
torrentium;
дорожки 10 – 12 – F1: C. p. molestus x C. torrentium;
дорожки 14 – 16 – C. p. pipiens;
дорожки 17 – 21 – C. p. molestus;
дорожка 23 – негативный контроль;
дорожки 1, 13, 22 – 100 bp ДНК маркер Следует отметить, что размеры амплифицированных фрагментов не соответствуют размерам ITS2 регионов, т.к. в состав амплификатов входят также области генов 5.8S и 28S рРНК, фланкирующие ITS2 регионы. За вычетом фланкирующих участков, размер ITS2 регионов C. torrentium, C. p. pipiens и C. p. molestus из изученных мест сбора (г. Томск, Томская область и Республика Казахстан) составляет около 257 п.н., около 307 п.н. и около 307 п.н., соответственно, что согласуется с литературными данными (Miller, Crabtree, Savage, 1996).
Использование праймеров, фланкирующих ITS2 регионы, позволяет идентифицировать особей C. torrentium и C. p. pipiens или C. p. molestus, а также гибридов от скрещивания C. p. molestus x C.
torrentium. К сожалению, не удалось изучить наследование молекулярно – генетических маркеров у гибридных особей от скрещивания C. torrentium и C. p. molestus, т.к. не было получено потомков от такого типа скрещивания. Однако, можно предположить, что у этих гибридов, также как у гибридов от скрещивания C. p. pipiens и C. torrentium будут представлены два типа ITS2 регионов.
3.1.4. Участок гена субъединицы I цитохромоксидазы с Анализ последовательностей участка митохондриального гена субъединицы I цитохромоксидазы с (COI), проведенный Виноградовой и Шайкевич (2005), показал, что эти последовательности отличаются у C. torrentium и C. p. molestus шестью заменами нуклеотидов, которые не нарушают функции гена цитохромоксидазы I. Одна из замен расположена в сайте узнавания рестриктазы SspI (AATATT). Метод идентификации C. torrentium и C. p. molestus, предложенный этими авторами, заключается в обработке рестриктазой SspI амплифицированного участка гена COI, размером 311 п.н.
(Виноградова, Шайкевич, 2005).
Для амплификации участка гена COI использовали праймеры UEA9 и UEA10 (Otranto, Traversa, Guida et al., 2003) (Таблица 2). Амплифицированный участок ДНК, размером 311 п.н. после обработки рестриктазой SspI у C. torrentium оставался неизмененным, в то время как у C. p. pipiens и C. p. molestus он разрезался рестриктазой на два фрагмента, размером 220 и 90 п.н. (Рисунок 4), т.е., особи C. p. pipiens и C. p. molestus идентичны по этому маркеру, но отличаются от особей C. torrentium. У гибридных особей от скрещивания C. p. molestus x C. torrentium амплифицированный участок митохондриального гена COI расщепляется на два фрагмента, так же как у материнской формы (Рисунок 4).
Рисунок 4 – Результаты рестрикции амплифицированного участка гена COI рестриктазой SspI Примечание. Дорожки 2 – 7, 9, 10 – C. torrentium;
дорожки 11 – 13 – C. p. pipiens;
дорожки 14, – F1: C. p. molestus x C. torrentium;
дорожки 17 – 22 – C. p. molestus. Дорожки 1, 23 – ДНК маркер pUC19 / MspI (501 (489), 404, 331, 242, 190, 147, 110 (111), 67, 34 п.н.);
дорожки 8, 23 – 100 bp ДНК маркер Известно, что мтДНК наследуется, независимо от ядерного генома, в основном через цитоплазму женских гамет. К сожалению, в ходе работы не удалось получить гибридов от скрещивания C.
torrentium и C. p. molestus, но можно предположить с большой долей вероятности, что участок гена COI гибридных особей от такого типа скрещивания не будет разрезаться рестриктазой SspI, т.е. будет соответствовать типу C. torrentium (материнской форме). Учитывая характер наследования, следует ожидать, что у потомков от скрещивания C. p. pipiens и C. torrentium участок гена COI при обработке рестриктазой SspI будет расщепляться на два фрагмента, а у гибридных особей от скрещивания C. torrentium и C. p. pipiens – будет оставаться неизмененным. Участок гена COI гибридных потомков от скрещивания C. p. pipiens и C. p. molestus любого направления будет разрезаться рестриктазой SspI. Таким образом, вследствие материнского наследования мтДНК, метод не позволяет идентифицировать гибридных особей между C. torrentium и C. p. pipiens или между C. torrentium и C. p.
molestus.
Было проведено секвенирование участка гена COI у особей C. p. pipiens и C. p. molestus.
Сравнение нуклеотидных последовательностей участка гена COI C. p. pipiens и C. p. molestus показало, что они идентичны между собой (данные не показаны).
3.1.5. Второй интрон гена ацетилхолинэстеразы Анализ последовательностей второго интрона гена ацетилхолинэстеразы 2 (ACE2), проведенный Смит и Фонсекой (Smith, Fonseca, 2004), позволил создать видоспецифичные праймеры для идентификации нескольких представителей рода Culex, включая C. torrentium и C. pipiens.
В результате мультипраймерной ПЦР с использованием праймеров ACEpip, ACEtorr и B1246s (Таблица 2), у особей C. torrentium амплифицируется фрагмент ДНК, размером 416 п.н., у особей C. p.
pipiens и C. p. molestus – 610 п.н.;
у гибридных особей от скрещивания C. p. molestus x C.
torrentium амплифицируются оба фрагмента (Рисунок 5).
Эти маркеры позволяют легко идентифицировать особей C. torrentium от C. p. pipiens и C. p.
molestus в выборках из любых природных популяций, включая смешанные. Кроме этого, данные маркеры применимы и для идентификации гибридных особей. Учитывая характер наследования, следует ожидать, что использование праймеров ACEpip, ACEtorr и B1246s, позволит выявлять гибридных особей от любого направления скрещивания C. p. molestus и C. torrentium, а также C. p.
pipiens и C. torrentium.
Рисунок 5 – Результаты амплификации ДНК с использованием праймеров ACEpip, ACEtorr и B1246s Примечание. Дорожки 2 – 9 – C. torrentium;
дорожки 10 – 12 – F1: C. p. molestus x C. torrentium;
дорожки 14 – 17 – C. p. molestus;
дорожки 18 – 20 – C. p. pipiens;
дорожки 1, 13, 21 – 100 bp ДНК маркер Секвенирование и сравнение нуклеотидных последовательностей участка второго интрона гена ACE2 у особей C. p. pipiens и C. p. molestus показало, что они идентичны между собой (данные не показаны).
В таблице 3 представлены все молекулярно – генетические маркеры, изученные в настоящей работе (полученные самостоятельно и предложенные другими авторами).
Выявлено соответствие результатов при использовании различных типов маркеров. Как следует из таблицы 3 все типы маркеров, рассмотренные в работе, позволяют надежно идентифицировать особей C. torrentium. Эти маркеры применимы к любой стадии развития организма. Известно, что личинки, куколки и самки C. torrentium и C. p. pipiens морфологически неразличимы;
C. torrentium и C.
p. pipiens различаются только по строению гениталий самцов, поэтому молекулярно – генетические маркеры для идентификации C. torrentium будут служить основой популяционно – генетических, эколого – фаунистических, фенологических исследований этого малоизученного вида. Особи C. p.
pipiens и C. p. molestus идентичны по всем изученным молекулярно – генетическим маркерам. Это свидетельствует о большей генетической близости C. p. pipiens и C. p. molestus и отдаленности от них C.
torrentium, что соответствует существующим представлениям о степени филогенетического родства представителей комплекса C. pipiens (Miller, Crabtree, Savage, 1996;
Виноградова, 1997). ITS2 регионы рДНК, гены мтДНК, интроны генов широко используются для создания диагностических маркеров в разных группах кровососущих комаров (Caterino, Cho, Sperling, 2000).Таблица 3 – Молекулярно – генетические маркеры для идентификации представителей комплекса Culex pipiens Размер продукта амплификации / рестрикции, п.н.
Праймер F1: C. p. molestus x C.
C. torrentium C. p. pipiens C. p. molestus torrentium _ _ OPB - 02 1183 _ _ OPA - 11 680 SCARcp1 _ _ 1093 SCARcp SCARcp3 _ _ 474 SCARcp 5.8S 410 460 460 410, 28S 5.8Sa 460 510 510 460, 28S UEA UEA10 311 220, 90 220, 90 220, + рестрикция SspI ACEpip ACEtorr 416 610 610 416, B1246s Примечание. «_» – отсутствие амплификации Однако, учитывая значительное сходство C. p. pipiens и C. p. molestus по этим участкам ДНК, мы считаем, что наиболее быстрым способом получения молекулярно – генетических маркеров для идентификации C. p. pipiens и C. p. molestus, является поиск специфичных RAPD – маркеров и создание на их основе SCAR – маркеров. Гибридных особей от скрещивания C. torrentium и C. p. molestus можно выявить, как в ходе анализа размеров ПЦР – фрагментов ITS2 регионов, так и при использовании праймеров ACEpip, ACEtorr и B1246s.
3.2. Генетическая дифференциация популяций C. p. pipiens, C. p. molestus и C. torrentium умеренных широт Полиморфизм по RAPD – маркерам был изучен в десяти популяциях C. torrentium, пяти популяциях C. p. molestus и трех популяциях C. p. pipiens из г. Томска, Томской области (ТО) и Республики Казахстан (РК). Для оценки генетической изменчивости использовался RAPD – праймер OPA – 01 (5' – CAGGCCCTTC – 3'), амплифицирующий наибольшее число полиморфных фрагментов ДНК.
Генетическую дифференциацию популяций оценивали, используя величину генетического расстояния по Нею (DNei) (Nei, 1978), которая отражает среднее число замен аллелей в каждом локусе, произошедших за время раздельной эволюции двух популяций. Величина DNei варьирует от нуля (максимальное сходство) до бесконечности (максимальное различие).
На рисунке 6 представлены средние значения генетических расстояний ( D Nei) между популяциями: а) C. p. pipiens ( D Nei = 0,068 ± 0,003);
б) C. p. molestus ( D Nei = 0,036 ± 0,008);
в) C.
torrentium ( D Nei = 0,047 ± 0,003);
г) C. p. pipiens и C. p. molestus ( D Nei = 0,102 ± 0,007);
д) C. p. pipiens и C. torrentium ( D Nei = 0,136 ± 0,007);
е) C. p. molestus и C. torrentium ( D Nei = 0,165 ± 0,005).
Средние значения генетических расстояний между популяциями C. p. pipiens и C. p. molestus (г) больше D Nei между популяциями C. p. pipiens (а) и между популяциями C. p. molestus (б). D Nei между популяциями C. p. pipiens и C. torrentium (д) больше, чем средние значения генетических расстояний между популяциями C. p. pipiens (а) и между популяциями C. torrentium (в). Средние значения генетических расстояний между популяциями C. p. molestus и C. torrentium (е) значительно превышают генетические расстояния между популяциями C. p. molestus (б) и между популяциями C. torrentium (в).
Выявленные различия статистически достоверны, о чем свидетельствуют не перекрывающиеся доверительные интервалы средних значений DNei (Рисунок 6).
0, 0, Генетическое расстояние, D Nei 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, Среднее ±0,95 дов. интервал 0, а б в г д е Рисунок 6 – Средние значения генетических расстояний между популяциями C. p. pipiens, C. p.
molestus, C. torrentium Примечание. Средние значения генетических расстояний между популяциями: а) C. p. pipiens;
б) C. p. molestus;
в) C. torrentium;
г) C. p. pipiens и C. p. molestus;
д) C. p. pipiens и C. torrentium;
е) C. p.
molestus и C. torrentium UPGMA – дендрограмма, основанная на коэффициентах генетического сходства по Нею (1978) показывает, что все изученные популяции разделяются на три отчетливых кластера: в одном представлены популяции C. p. molestus, в другом – C. p. pipiens, в третьем – C. torrentium (Рисунок 7).
Анализ генетического полиморфизма RAPD – маркеров позволяет сделать вывод о значительной дифференциации популяций C. p. pipiens, C. p. molestus и C. torrentium в районе проведенных исследований. Вывод базируется на следующих положениях: 1) генетические расстояния (DNei) между популяциями разных подвидов Рисунок 7 – Дендрограмма генетического сходства популяций C. torrentium, C. p. pipiens и C. p.
molestus, построенная с использованием метода иерархического кластерного анализа (UPGMA) по результатам RAPD – анализа (RAPD – праймер OPA – 01) Примечание. Популяции: A – с. Моряковский Затон, ТО (2003г.);
B – г. Алматы, РК (1999г.);
С – г. Семипалатинск, РК (2004 г.);
D – г. Томск, ул. Короленко, 15 (2004 г.);
E – г. Томск, ул. Тимакова, (2003г.);
F – г. Томск, ул. Алтайская, 78/2 (2004 г.);
G – г. Томск, ул. Иркутский тр., 104 (2004 г.);
H – г.
Сарышаган, РК (2005 г.);
I – с. Моряковский Затон, ТО (2003 г.);
J – Керамический завод, ТО (2003 г.);
K – Керамический завод, ТО (2004 г.);
L – г. Алматы, РК (1999 г.);
M – с. Науалы, РК (2003 г.);
N – с.
Аксаковка, РК (2003 г.);
O – г. Алматы 1, РК (2004 г.);
P – г. Алматы 2, РК (2004 г.);
Q – г. Томск, ул.
Короленко, 15 (2005 г.);
R – г. Томск, ул. Короленко, 15 (2004 г.) или вида достоверно превышают генетические расстояния между популяциями в пределах одного подвида или вида, 2) дендрограмма генетического сходства показывает, что все изученные популяции разделяются на три отчетливых кластера: в одном представлены популяции C. p. molestus, в другом – C.
p. pipiens, в третьем – C. torrentium, 3) не получены прямые или косвенные подтверждения, свидетельствующие о существовании природной гибридизации между C. p. pipiens и C. torrentium или между C. p. molestus и C. torrentium;
гибридные особи не выявлены ни в одной из изученных популяций, включая смешанные выборки. По всей видимости, генетическая дифференциация, наблюдаемая между популяциями C. p. pipiens, C. p. molestus и C. torrentium умеренного климата, обусловлена как пре– так и постзиготическими механизмами репродуктивной изоляции. К ним относятся отличия, касающиеся жизненных циклов, полового поведения, а также, разобщенность местообитаний и цитоплазматическая несовместимость.
3.3. Распространение C. torrentium и C. p. pipiens на территории Томской области и Республики Казахстан При проведении настоящей работы было собрано тринадцать выборок комаров из открытых водоемов (предпочтительные местообитания личинок C. p. pipiens и C. torrentium) Томской области (ТО) и Республики Казахстан (РК) (Таблица 1). Только одна выборка была представлена особями C. p. pipiens (г. Семипалатинск, РК, 2004 г.), в состав двух выборок входили, как особи C. p. pipiens, так и C.
torrentium (г. Алматы, РК, 1999 г. и с. Моряковский Затон, ТО, 2003 г.), остальные десять выборок состояли только из особей C. torrentium (шесть выборок в Томской области и четыре в Республике Казахстан). В смешанных сборах на долю C. torrentium приходилось 56,25 % особей (г. Алматы, РК, 1999 г.) и 52,08 % (с. Моряковский Затон, ТО, 2003 г.). Таким образом, показано, что в открытых личиночных биотопах в районе проведенных исследований доминирует C. torrentium. Что касается Республики Казахстан, то встречаемость там C. torrentium зарегистрирована неоднократно разными авторами (Дубицкий, 1970;
Лопатин, 2000). В Томской области этот вид был описан Шингаревым в г. под именем C. pavlovsky (Шингарев, 1928;
Штакельберг, 1937) и это единственное упоминание о встречаемости C. torrentium на территории Томской области. Существует два возможных объяснения:
1) C. torrentium был и ранее широко распространен на территории Томской области, но ошибочно принимался за C. p. pipiens, по причине значительного морфологического сходства C. p.
pipiens и C. torrentium;
известно, что единственный морфологический признак, отличающий C. p. pipiens от C. torrentium, касается деталей строения гипопигия самцов, а именно формы дорзальных склеритов эдеагуса (Service, 1968;
Onyeka, 1982;
Dahl, 1988;
Виноградова, 1997);
2) в течение какого – то времени C. torrentium вытеснил C. p. pipiens на территории Томской области.
Для выяснения действительной картины распространения C. p. pipiens и C. torrentium, а также, характера их взаимоотношений в Томской области, необходимо проведение широких эколого – фаунистических и фенологических исследований. В настоящей работе констатируется лишь факт преимущественной встречаемости личинок C. torrentium в открытых водных биотопах в районе проведенных исследований.
ВЫВОДЫ 1. Проведен анализ ДНК – маркеров у трех представителей комплекса Culex pipiens – Culex torrentium, C. p. pipiens, C. p. molestus 2. Выявлены, идентифицирующие Culex torrentium, специфичные фрагменты ДНК, амплифицирующиеся RAPD – праймерами OPB – 02 и OPA – 3. Определение нуклеотидных последовательностей мономорфных RAPD – фрагментов позволило подобрать видоспецифичные SCAR – праймеры. Результатом использования SCAR – праймеров является амплификация специфичных фрагментов ДНК (SCAR – маркеров), позволяющих надежно идентифицировать особей C. torrentium и C. p. pipiens в природных популяциях 4. Показано, что рестрикционный анализ участка митохондриального гена COI, анализ размеров ПЦР фрагментов ITS2 регионов рДНК, а также маркеры, основанные на последовательности второго интрона гена ACE2, позволяют идентифицировать особей C. torrentium 5. Выявлено, что нуклеотидные последовательности участка митохондриального гена COI и участка второго интрона гена ACE2 идентичны у C. p. pipiens и C. p. molestus 6. Анализ изменчивости RAPD – маркеров в популяциях представителей комплекса Culex pipiens из г. Томска, Томской области и Республики Казахстан показал, что C. torrentium, C. p. pipiens и C. p.
molestus умеренного климата генетически дифференцированы, природная гибридизация между ними отсутствует 7. Показано, что в открытых личиночных биотопах (Томская область и Республика Казахстан) доминантным видом является C. torrentium;
личинки C. p. pipiens встречаются с небольшой частотой Список работ, опубликованных по теме диссертации:
1. Храброва Н.В., Сибатаев А.К. Анализ генетической изменчивости комаров Culex pipiens (Diptera: Culicidae) с использованием микросателлитного локуса CQ46 в качестве маркера // Эволюционная биология: Материалы II Международной конференции «Проблема вида и видообразование» / Под ред. В.Н. Стегния. – Томск: Томский государственный университет, 2002. – Т.
2. – С. 392 – 393.
2. Храброва Н.В., Сибатаев А.К. Молекулярные маркеры для идентификации комаров Culex pipiens pipiens и C. p. pipiens f. molestus (Diptera: Culicidae) // Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития: Материалы III съезда ВОГиС. – Москва, 2004. – Т.1. – С. 35.
3. Храброва Н.В., Сибатаев А.К., Стегний В.Н. RAPD – маркеры для идентификации представителей рода Culex – переносчиков вируса западнонильской лихорадки // Вестник Томского гос.
ун – та. Приложение. – 2004. – № 10. – С. 128 – 130.
4. Храброва Н.В., Сибатаев А.К., Стегний В.Н. SCAR – маркер для идентификации Culex pipiens pipiens (Diptera: Culicidae) // Вестник Томского гос. ун – та. – 2004. – № 30. – С. 146 – 149.
5. Храброва Н.В., Сибатаев А.К., Стегний В.Н. Генетическая идентификация комаров группы Culex pipiens (Diptera: Culicidae) методом RAPD – анализа // Доклады РАН. – 2005. – Т. 401, № 3. – C.
125 – 126.
6. Храброва Н.В., Сибатаев А.К., Стегний В.Н. Таксономический статус комаров Culex pipiens L.
и Culex molestus F. // Эволюционная биология: Материалы III Международной конференции «Проблема вида и видообразования» / Под ред. В.Н. Стегния. – Томск: Томский государственный университет, 2005. – Т. 3. – С. 275 – 299.