Повышение резистентности организма животных путем применения препарата гумитон
На правах рукописи
Жилякова Татьяна Петровна ПОВЫШЕНИЕ РЕЗИСТЕНТНОСТИ ОРГАНИЗМА ЖИВОТНЫХ ПУТЕМ ПРИМЕНЕНИЯ ПРЕПАРАТА ГУМИТОН 03.00.13. Физиология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Томск – 2006
Работа выполнена в государственном научном учреждении Сибирском научно-исследовательском институте сельского хозяйства и торфа СО РАСХН в лаборатории биопрепаратов Научный руководитель доктор биологических наук, профессор Костеша Николай Яковлевич Официальные оппоненты доктор биологических наук, профессор Ксенц Степан Михайлович доктор медицинских наук, профессор Низкодубова Светлана Васильевна
Ведущая организация:
Сибирский государственный медицинский университет
Защита состоится « 27 » декабря 2006 г. в 12.00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.267.10 при Томском государственном университете (634050, г. Томск, пр. Ленина, 36)
С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Томского государственного университета Автореферат разослан 22 ноября 2006 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Просекина Е.Ю.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования.
Психоэмоциональные и информационные нагрузки, гиподинамия, появление новых факторов, в том числе токсических, к которым организм не имеет эволюционно выработанных мер защиты, – все это является причиной снижения неспецифической резистентности организма. При этом под резистентностью организма понимают его способность сохранять свою жизнедеятельность и основные, присущие ему свойства в различных условиях окружающей среды, а также противостоять воздействиям, которые могут привести к изменению этих свойств или гибели [Даренская, Короткевич, 2001]. Обычно для профилактики и лечения повреждающих эффектов стресса и повышения неспецифической резистентности организма используются препараты общеукрепляющего действия - адаптогены, витамины, препараты посредников и метаболитов стресс-лимитирующих систем. В экстремальных ситуациях, требующих включения защитно приспособительных реакций организма, природные вещества не уступают по своей активности синтетическим средствам и, зачастую, превосходят их.
В качестве таких стимуляторов перспективны препараты из торфа, в составе которых присутствует широкий спектр биологически активных веществ, в том числе гуминовые и фульвокислоты. Показано, что гуминовые соединения проявляют мембранотропное действие, способны усиливать активность обменных процессов в организме, повышать его сопротивляемость к неблагоприятным факторам внешней среды. Известны данные исследователей России, Китая, Германии, Польши о применении гуминовых препаратов в комплексе лечения глазных, сердечно – сосудистых, желудочно-кишечных болезней, а также для использования в онкологической практике в качестве иммуномодуляторов и радиопротекторов, однако в официальном реестре лекарственных средств препараты из торфа единичны.
Создание безвредных, но эффективных средств, способных влиять на уровень адаптационных возможностей организма - одна из ключевых проблем как современной медицины, так и ветеринарии. Отсюда весьма актуальна задача создания гуминового препарата из торфа, обладающего комплексными свойствами, сочетающего специфические и неспецифические эффекты - свойства стимуляторов роста, регуляторов резистентности и иммунитета.
Немаловажную роль в выборе объекта исследования играет и анализ сырьевой базы. Объемы запасов торфа в Томской области, оцениваемые в колоссальную цифру 32,8 млрд. тонн, составляют 20,9% российских ресурсов этого ценнейшего сырья [Болота Западной Сибири, 1998].
Целью данной работы является изучение возможности повышения неспецифической резистентности организма животных путем применения препарата гумитон.
Задачи исследования:
1. Исследовать химический состав гумитона и его токсикологические свойства;
2. На модели иммобилизационного стресса изучить влияние гумитона на состояние стресс-систем организма;
3. Изучить состояние критических систем организма в условиях применения гумитона:
- кроветворной системы животных при гипоплазии костного мозга, вызванной применением цитостатика циклофосфана;
- слизистой оболочки желудка при формировании язв различной этиологии, эвакуаторную функцию желудочно-кишечного тракта и одно из основных проявлений язвенной болезни – болевой синдром;
4. Выявить возможность повышения гумитоном устойчивости организма к тяжелой мышечной нагрузке;
5. Оценить эффективность применения гумитона в качестве кормовой добавки для повышения неспецифической резистентности цыплят бройлеров с использованием интегральных показателей - выживаемости и прироста живой массы цыплят.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
1. Анализ химического состава гумитона убедительно доказывает, что применение его на животном организме может влиять на биосинтетические и энергетические процессы. Гумитон относится к классу малоопасных веществ и не обладает токсичностью.
2. Профилактическое введение гумитона повышает устойчивость организма к действию стресс-факторов: защищает критические системы организма, характеризующиеся наиболее высокой скоростью клеточного обновления (кроветворную и желудочно-кишечный тракт).
3. Гумитон повышает резистентность организма при экстремальных физических нагрузках, стимулируя работоспособность животных и ускоряя темпы восстановления физической работоспособности;
4. Применение гумитона в птицеводстве может быть перспективно вследствие его способности повышать неспецифическую сопротивляемость организма.
Научная новизна.
Впервые проведен комплекс исследований нового препарата гумитон на основе гуминовых кислот торфа, полученного по оригинальной технологии.
В скрининговых экспериментах на лабораторных животных показан широкий спектр биологического действия препарата.
Выявлена способность гумитона повышать резистентность организма путем защиты критических систем – кроветворной и желудочно-кишечного тракта.
Доказана безопасность препарата для его практического применения. В производственных испытаниях подтверждена способность препарата повышать неспецифическую резистентность организма животных.
Практическая значимость работы. Результаты проведенного исследования позволяют рекомендовать гуминовый препарат гумитон в качестве кормовой добавки для повышения резистентности организма птицы, снижения падежа, увеличения продуктивности. Полученные результаты важны для решения задач, связанных с получением экологически чистой мясной продукции высокого качества. Проведенные исследования легли в основу «Рекомендаций по применению гуминовой кормовой добавки гумитон», комплекта документов для регистрации препарата (сертификат соответствия № РОСС RU. ФВ01.В12437) и разработки патентов для лечения железодефицитной анемии у животных. Препарат применяют в хозяйствах Томской и Оренбургской областей, Хакасии, КНР (провинция Ляонин).
Апробация работы. Основные положения работы представлены на Международной конференции «Современная гастроэнтерология и проблемы заболеваний органов пищеварения ХХI века», г. Томск, 1999;
IV Международной научно-практической конференции «Качество – стратегия ХХI века», г. Томск, 1999;
Первой научно-практической конференции «Промышенно-экономическое развитие Западно-Сибирского региона на базе местного природного органического сырья», Омск, 2000;
Международной научно- практической конференции «Высокие технологии добычи, глубокой переработки и использования озерно-болотных отложений», г. Томск, 2003;
Региональной научно-практической конференции «Современные проблемы и достижения аграрной науки в животноводстве, растениеводстве и экономике», Томск, 2006.
Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 18 печатных работ: 1 монография, 10 статей, 7 тезисов, получено 2 патента Российской Федерации на изобретение.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего источников, из них 177 отечественных и 31 зарубежных. Работа изложена на 134 страницах машинописного текста, содержит 17 таблиц и иллюстрирована 14 рисунками.
Диссертационная работа выполнена под научным руководством доктора биологических наук, профессора ТСХИ НГАУ Н.Я. Костеши, которому диссертант выражает признательность и благодарность. Автор благодарен доктору медицинских наук, профессору СГМУ С.Н. Удинцеву за неоценимое содействие в выполнении работы. Автор выражает благодарность доктору сельскохозяйственных наук Э.В Титовой за постоянную поддержку и помощь в работе. Автор также выражает благодарность сотрудникам СибНИИ торфа и НИИ фармакологии, принимавшим участие в совместной работе по изучению специфической активности гумитона.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Эксперименты выполнены на 247 крысах линии Wistar обоего пола массой 200-250 г, мышах массой 18-20 г в количестве 72 неинбредных, линии CBA, 76 линии Balb/c обоего пола и 4 беспородных собаках массой 5,5-10 кг. Животные получены из сертифицированного питомника «Рассвет», Томск. Содержание животных осуществлялось в соответствии с правилами, принятыми Европейской Конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и научных целей (Страсбург, 1986).
Производственные эксперименты проведены с использованием цыплят-бройлеров.
Объектом исследования являлась гуминовая кормовая добавка из торфа гумитон, представляющая собой жидкость темно-коричневого цвета со специфическим запахом, полученная по оригинальной технологии;
качественные показатели соответствуют техническим условиям на препарат ТУ 0392-017-00493929-2001: Добавка кормовая гуминовая из торфа гумитон.
В качестве препаратов сравнения использовали официнальные лекарственные средства природного или синтетического происхождения:
экстракт элеутерококка жидкий, индометацин, пирацетам, пелоидин.
Гумитон и препараты сравнения лабораторным животным вводили внутрижелудочно с помощью зонда, цыплятам-бройлерам с водой или кормом. В скрининговых экспериментах для уменьшения объема вводимого препарата использовали концентрированный гумитон, дозы указаны в мг препарата по сухому веществу на 1 кг веса животного. Расчет эффективных доз препаратов для мышей и крыс производился с учетом специальных коэффициентов по таблицам Freireich E. J. (1966), для цыплят согласно соотношениям, принятым в ветеринарии [Мозгов, 1985;
Уша и др., 2003].
Исследование состава препарата гумитон проведено по стандартным методикам. Определение сухого остатка препарата гумитон проведено по ГОСТ 11306-83, содержание гуминовых и фульвокислот - по схеме Понаморевой-Николаевой согласно методическим указаниям [МУ по определению содержания и состава гумуса, 1975], содержание аминокислот и витаминов методом ИК-спектрометрии [Методика современных химических исследований, 1998], массовая доля элементов – методом инструментального нейтронно-активационного анализа.
Определение микробиологических показателей, наличия патогенной микрофлоры выполнено в соответствии с «Правилами бактериологического исследования кормов» утвержденных ГУВ МСХ СССР 10.06.75.
ИК-спектры высушенных образцов препарата сняты в вазелиновом масле на приборе SPECORD-М-80 в области частот 500-4000 см-1. Для анализа ИК-спектров использовались данные корреляционных таблиц, указывающих характер поглощения различных функциональных групп [Гордон, Форд, 1976].
Содержание кислых групп в гумитоне определено методом потенциометрического титрования [Современные методы исследования, 1984].
Исследования токсичности препарата гумитон проведены в соответствии с «Требованиями к доклиническому изучению общетоксического действия новых фармакологических веществ» (Москва, 1984). Исследования острой токсичности проведены на двух видах животных – беспородных мышах и крысах линии Wistar. Препарат вводили внутрижелудочно, однократно в дозах 2000 и 5000 мг/кг. Исследование эмбриотоксичности проведены в двух сериях экспериментов на крысах линии Wistar. Препарат вводили через зонд 1 раз в сутки в утренние часы в дозе 500 мг/кг (субтоксическая доза) 250 (промежуточная доза) и 50 мг/кг (фармакологически эффективная) в первой серии опытов, и в дозе 240 мг/кг во второй серии опытов в разные сроки беременности. В опытах по изучению влияния препарата на постнатальное развитие гумитон вводили крысам самкам линии Wistar в течение всего периода беременности в дозе 500 мг/кг.
Исследование хронической токсичности гумитона проводили на двух видах животных: беспородных крысах и 4 взрослых беспородных собаках. Крысы получали гумитон в дозах 50, 250 и 1000 мг/кг. Препарат вводили ежедневно в течение 6 месяцев, кроме воскресных дней. Контрольные животные получали в эти же сроки и эквиобъемное количество дистиллированной воды. Собакам весом 5,5-10 кг гумитон скармливали с пищей в дозе 800 мг на собаку.
Стресс-регулирующую активность гумитона изучали на модели имобилизационного стресса, вызванного подвешиванием мышей за шейную складку в течение 22 часов. Мыши получали гумитон в течение 6 дней до начала эксперимента, седьмое введение осуществляли за 1 час до подвешивания. В конце опыта определяли массу селезенки, тимуса, надпочечников, подсчитывали число изъязвлений в слизистой оболочке желудка. Выраженность стресса у иммобилизованных животных рассчитывали в баллах по методике, разработанной Ю.И. Добряковым (1978).
Исследования влияние гумитона на кроветворную систему проведены в соответствии с требованиями одобренных Фармкомитетом МЗ России (Москва, май 1991) рекомендаций, вступивших в силу с 1992 г.
Использовали модель гипоплазии костного мозга в результате применения цитостатика циклофосфана. Гумитон в дозе 100 мг/кг вводили животным ежедневно в течение 10 суток, циклофосфан в дозе 100 мг/кг вводили на 4 и 7-е сутки от начала введения гумитона. Оценку эффективности лечебных воздействий проводили на 11-е сутки эксперимента. Подсчет форменных элементов периферической крови, миелокариоцитов костного мозга осуществляли по стандартным методикам [Лабораторные методы исследования, 1987]. Клонирование клеток-предшественников эритропоэза и грануломоноцитопоэза (культура тканей in vitro) производили, как описано у Е.Д. Гольдберга с соавторами (1992).
О влиянии гумитона на желудочно-кишечный тракт судили по противоязвенной активности исследуемого препарата, изменении моторики ЖКТ и анальгезирующей активности. Фармакологически эффективная доза для мышей составила 100 мг/кг, для крыс 50 мг/кг.
Исследование противоязвенной активности гумитона проведено с использованием 5 экспериментальных моделей. В качестве моделей «острых» язв использовали нейрогенную [Заводская, Морева, 1981], резерпиновую [Барнаулов и др., 1983], ацетилсалициловую [Оболенцева и др.,1974], по методу H.Shay [Shay et al., 1945]. Хроническую ацетатную язву моделировали по С.Н. Буданцевой (1973).
Перед воспроизведением экспериментальных язв желудка животных лишали пищи за 24 часа или 48 часов в зависимости от модели язвообразования при свободном доступе к воде. В конце экспериментов животных умерщвляли методом дислокации шейного отдела позвоночника либо эфирным наркозом, желудки извлекали, вскрывали по малой кривизне, промывали холодным физиологическим раствором и макроскопически с помощью лупы при ярком освещении определяли число и площадь деструкций, которые дифференцировали на точечные (менее 1 мм), крупные (более 1 мм) и полосовидные. Учет язвенных поражений проводили по схеме, предложенной Г.В. Оболенцевой и Я.И Ходжай [Оболенцева и др.,1974].
Подсчитывали среднее количество изъязвлений на одно животное в группе (степень изъязвления), процент животных с язвами. Индекс Паулса определяли как интегральный показатель количества деструкций по формуле:
индекс Паулса = степень изъязвления х % животных с язвами Противоязвенную активность препаратов определяли как отношение индекса Паулса в контрольной группе к индексу Паулса в опытной группе.
Исследуемое средство считали активным, если противоязвенная активность составляла 2 и более единиц [Pauls et al., 1947].
Для морфологического исследования кусочки желудка фиксировали в 12% растворе формалина и заливали в парафин. Депарафинированные срезы толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилин-эозином по Ван-Гизону, реактивом Шиффа – на нейтральные полисахариды и альциановым синим – на кислые гликозаминогликаны.
Для оценки влияния гумитона на моторно-эвакуаторную функцию желудочно-кишечного тракта применяли метод «меток» [Сoopman, Кennis, 1977], при изучении обезболивающего действия использовали метод «уксусных» корчей [Сashik еt al., 1977].
Влияние препарата гумитон на физическую работоспособность организма изучали на мышах с использованием метода принудительного плавания до полного утомления (прекращение двигательной активности) в модификации Суслова Н.И. с соавт.(1990).
Влияние гумитона на продуктивность цыплят-бройлеров исследовали в трех экспериментах на базе птицефабрики «Томская» Томского района и в Сибирском НИИ птицеводства РАСХН. Контрольные и опытные группы цыплят содержали по общепринятой технологии, цыплята получали одинаковое количество кормов с соблюдением необходимых профилактических и лечебных мероприятий. Падеж учитывался ежедневно.
Гумитон применяли в профилактической и лечебной дозах (6 и 25 мг/кг).
Основными критериями оценки эффективности применения добавки являлись снижение падежа птицы и повышение показателя живой массы.
Статистическую обработку результатов проводили с помощью методов параметрической (критерий Стьюдента) и непараметрической (критерии Вилкоксона-Манна-Уитни и угловое преобразование Фишера) статистики [Гублер, Генкин, 1978, Попов и др., 2000]. Достоверными считались различия при достигнутом уровне значимости р0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Гумитон, изготовленный на основе торфов Томской области, содержит комплекс соединений, обладающих высокой биологической активностью.
85% сухого вещества составляют гуминовые и фульвокислоты. В его состав входят также карбоновые кислоты, 16 аминокислот (включая семь незаменимых), до 40 макро- и микроэлементов, витамины группы В, A, Е.
Методами ИК-спектроскопии подтверждено наличие в гумитоне активных групп органических соединениях типа карбоновых кислот, фенолов, аминокислот, солей органических кислот, спиртов. Причем содержание карбоксильных групп в гумитоне достигает 4,8 мг-экв/г, а фенольных гидроксилов - 5,1 мг-экв/г сухого вещества, что, соответственно, в 5,3 и раза превышает их содержание в гумате натрия, полученном из того же сырья.
Анализ состава гумитона позволяет предположить, что применение его на животном организме может влиять на биосинтетические и энергетические процессы.
Исследования токсичности препарата гумитон проведены на трех видах животных – мышах, крысах и собаках. Показано, что гумитон относится к классу малоопасных веществ, не обладает острой и хронической токсичностью, не оказывает эмбриотоксического и тератогенного действия.
В условиях иммобилизационного стресса препарат из торфа гумитон показал высокую степень стресс-регулирующей активности, сравнимой с элеутерококком. Основное протекторное действие было направлено на снижение степени поражения слизистой оболочки желудка (рис. 1).
Рис. 1. Влияние гумитона и элеутерококка на язвообразование в слизистой оболочке желудка мышей при стрессе Примечание: * - различия достоверны по сравнению с группой «Стресс-контроль», Р0, При этом отмечено также повышение массы тимуса на 16-21% по сравнению со стресс-контролем, что может оказывать положительное влияние на процессы кроветворения и иммунитет животных, а тем самым и на их устойчивость к заболеваниям и неблагоприятным факторам среды.
Эффективная доза для дальнейших исследований составила 100 мг/кг.
Общая реакция организма при действии экстремальных факторов во многом зависит от состояния критических систем организма. В работе изучено влияние гумитона на критические системы организма, характеризующиеся большой скоростью клеточного обновления – кроветворную и желудочно-кишечный тракт.
Влияние растительных экстрактов, повышающих резистентность организма, трудно оценить на здоровых животных без экстремальных нагрузок. Как показали наши эксперименты, введение гумитона здоровым животным способствовало незначительному (3,5-8,5%) увеличению количества форменных элементов в периферической крови и стимуляции костномозгового кроветворения. Все эти изменения были в пределах нормы, хотя и наблюдалась выраженная тенденция к стимуляции данным препаратом. Поэтому в качестве тест-системы для выявления гемомодулирующей активности гумитона использовали модель циклофосфановой гипоплазии костного мозга. Наиболее выражено действие циклофосфана в тканях с быстроделящимися клетками [Машковский, 1991;
Химиотерапия злокачественных опухолей, 1977].
Нами показано, что введение мышам цитостатика приводит к развитию значительной гипоплазии костного мозга. Резко тормозятся процессы клеточного деления: значительно снижается число эритроидных (в 4,5 раза) и гранулоцито-макрофагальных (в 2,7 раза) клеток- предшественников, то есть элементов, за счет которых происходит восстановление подавленного кроветворения. В 1,6 раза по сравнению с интактными животными снижается общее количество миелокариоцитов. В периферической крови развивается лейкопения, эритропения и ретикулоцитопения. На фоне циклофосфановой гемодепрессии гумитон достоверно (Р 0,05) стимулировал выход как эритроидных, так и гранулоцитарно-макрофагальных клониеобразующих единиц. Активно идет процесс пролиферации, о чем свидетельствует увеличение общей клеточности костного мозга (18,2±1,3 против 12,0±0, клеток х 106 при применении циклофосфана, Р 0,05), а также усиление дифференциации – достоверное увеличение количества зрелых гранулоцитов и эритроидных клеток, практически до уровня фона Применение гумитона способствовало более быстрым темпам восстановления содержания клеток периферической крови: на 4-е сутки после повторного введения циклофосфана содержание форменных элементов достигало 51-72% от фона против 38-45% в контроле (рис. 2).
Рис. 2. Влияние препарата гумитон на показатели периферической крови мышей на фоне применения цитостатика циклофосфана (ЦФ) Примечание: * - различия достоверны по сравнению с группой ЦФ, Р0, Защитное действие гумитона связано, вероятно, со способностью гуминовых препаратов уменьшать как генетические, так и функциональные нарушения клеточного деления [Горовая, 1993]. В литературе отмечается ослабление повреждающего влияния ряда цитостатиков на кроветворную ткань и тонкий кишечник при совместном применении этих препаратов с адаптогенами [Пашинский и др., 2005;
Пашинский, Воронова, 1982;
Разина и др, 1987;
Удинцев, Яременко, 1986;
Jin et al., 1994;
Matsunaga et al., 1994;
Zee Cheng, 1992]. Эффект связан с тем, что адаптогены усиливают соответствующие процессы репаративной регенерации в вышеназванных активно пролиферируемых нормальных тканях, в первую очередь повреждаемых цитостатиками. Механизм стимулирующего действия адаптогенов обусловлен и содержанием в растительных экстрактах комплекса биологически активных веществ, обладающих антиоксидантной активностью [Пашинский и др., 2005]. Показано, что гуминовые кислоты обладают выраженной антиоксидантной активностью, сравнимой с эффектом аскорбиновой кислоты и дигидрокверцетина [Федько и др., 2005].
Преинкубация крови с гуминовыми кислотами способна полностью нивелировать окислительный стресс, вызванный пероксидом водорода [Аввакумова, 2006]. Как было показано ранее, при иммобилизационном стрессе гумитон препятствует снижению массы тимуса, что может, оказывать стимулирующее влияние на процессы костномозгового кроветворения. Т лимфоциты являются основным источником ИЛ-3 и могут продуцировать ИЛ-1, необходимые для непосредственной стимуляции начала активной пролиферации ранних гемопоэтических прекурсов [Ноздрачев и др., 2001;
Шерстобоев, 1999].
В исследованиях по изучению стресс-регулирующей активности гумитона было установлено, что повышение резистентности организма в стрессовой ситуации под действием данного препарата обусловлено его защитным действием на ЖКТ. Поэтому были проведены более полные исследования состояния ЖКТ при стрессе.
В настоящее время доказана роль стресса как главного или вспомогательного фактора язвенных поражений слизистой желудка [Меерсон, 1981]. На модели нейрогенной язвы, вызванной иммобилизационным стрессом, количество животных с язвами в контроле достигает 83%. Профилактическое введение гумитона в 1,8 раза уменьшило число животных, имеющих язвы, среднее число изъязвлений в опытной группе достоверно снизилось в 3,5 раза (рис.3).
Рис. 3. Влияние гумитона на язвообразование в слизистой оболочке желудка мышей при стрессе в сравнении с элеутерококком Примечание: * - различия достоверны по сравнению с группой «Стресс-контроль», Р0, Противоязвенная активность гумитона оказалась выше 6 единиц что свидетельствует о возможном включении препарата в нейрогенные механизмы возникновения язвенных поражений слизистой желудка.
Согласно концепции Г. Селье (1960), возможным инициатором развития язвенной болезни при стрессе является хроническое перенапряжение центральной нервной системы, приводящее к изменению ее нормального функционирования. Воздействие стрессора на кору головного мозга посредством патологических импульсов передается в подкорковые структуры, где формируется очаг застойного возбуждения, индуцирующий дисбаланс корково-подкорковых взаимосвязей, нарушению функций высшей нервной системы, гормональному дисбалансу. На дальнейшем этапе развивается нарушение всех видов метаболизма, микроциркуляции, моторной и секреторной активности гастродуоденальной зоны и снижение ее резистентности к различным воздействиям, в результате чего процесс язвообразования становится практически неизбежным [Комаров и др, 1984;
Горшков, 1996, Зуева и др,2003;
Аnand, Graham, 1999].
Возможно, гастропротекторное действие гумитона и, соответственно, повышение неспецифической резистентности, объясняется его способностью снижать степень эмоциональной реакции, следствием которой является формирование язв слизистой оболочки желудка, а также оказывать регулирующее воздействие на энергетический обмен в организме, и, в частности, в стенке желудка. О последнем свидетельствует высокая степень противоязвенной активности (23 балла) на модели резерпинового повреждения желудка (рис. 4). По мнению И.С. Заводской и Е.В. Моревой (1981), причиной повреждающего действия резерпина является его непосредственное действие на ткань желудочной стенки, в основе которой – дискоординация процессов энергообразования.
Рис. 4. Развитие резерпиновой язвы желудка при лечении гумитоном и пелоидином Примечание: * - различия достоверны по сравнению с группой контроль, Р0, При введении резерпина мышам контрольной группы в 89% случаев возникали язвенные дефекты в слизистой оболочке желудка.
Применение гуминового препарата существенно уменьшило выраженность язвенного процесса (Р0,05): язвы отмечены у 33% животных, степень изъязвления снизилась в 9 раз, площадь изъязвления в 12 раз по сравнению с контролем. Полностью отсутствовали крупные и полосовидные язвы, а число точечных язв уменьшилась в 8 раз.
Полученные данные подтверждаются положительными результатами применения препарата на моделях индукции острых язы с помощью аспирина и перевязке привратника по методу Н. Shay. За счет достоверного снижения количества полосовидных и точечных язв гумитон снизил площадь поражения слизистой желудка мышей, подвергшихся введению токсических доз ацетилсалициловой кислоты (2,1±0,3 против 3,9±0,6 мм2 в контроле, Р 0,05), а также степень изъязвления, количество крупных (на 30%) и точечных (на 47%) язв при перевязке привратника. Особенностью применения гумитона является то, что при неизменной секреции отмечено повышение рН с 3 до 4,8 ед. что свидетельствует в пользу снижения агрессивности желудочного сока крыс с язвенной патологией.
Снижение выраженности язвенного процесса при введении гумитона возможно как за счет описанного выше механизма формирования повышенной сопротивляемости к различного рода повреждающим факторам, так и в результате непосредственного протекторного действия на слизистую желудка, связанного с поверхностно-активными свойствами гуминовых веществ [Попов, 2005]. Известны также адсорбирующие, вяжущие и обволакивающие свойства полисахаридов, входящих в состав препарата.
Присутствие в гумитоне специфических фенольных соединений, обладающих свойством уменьшать проницаемость и увеличивать прочность клеточных и сосудисто-тканевых барьеров, также следует рассматривать как один из механизмов протекторного действия препарата.
Наиболее адекватная информация о действительной эффективности исследуемых препаратов может быть получена на модели хронического патологического язвенного процесса, сопровождающегося активацией процесса перекисного окисления липидов (ПОЛ) в органах системы пищеварения, почках, сыворотке крови. Одной из причин снижения репаративных возможностей слизистой оболочки желудка при язвенной болезни является способность продуктов ПОЛ тормозить процессы пролиферации [Дегтярева, Харченко, 1995]. Следовательно, усиление антиоксидантной защиты является важным фактором повышения неспецифической резистентности организма.
Гуминовые кислоты по химическому строению можно рассматривать как полифенолы. Известна способность полифенолов оказывать антиоксидантное действие как путем непосредственного захвата свободных радикалов, так и участвуя в восстановлении других антиоксидантов [Федько и др., 2005;
Чернов и др., 2004, Юдина и др. 1998]. Описана также антиоксидантная активность липидной фракции торфов и гуминового комплекса [Кураколова и др.,1990, Юдина, Писарева, 1998]. О наличии антиоксидантного действия изучаемого гуминового препарата свидетельствует выраженная митотическая активность по краям язвы и в сохранившемся эпителии. На модели хронической язвы желудка гистологическими и гистохимическими исследованиями было показано, что и гумитон и пелоидин увеличивали число митозов, содержание ДНК и РНК в дне и краях язвы. Так число митозов в крае язвы при применении пелоидина на 7-е сутки было больше, чем в контроле в 1,5 раза, при применении гумитона - в 8 раз. Уже на 14 сутки после операции площадь язвы у крыс, принимавших гумитон, была почти в 2 раза меньше, чем у животных, леченных пелоидином. Менее выражен отек слизистой, фундальные железы не расширены, увеличено количество добавочных клеток фундальных желез и стимулируется выработка их секрета. Очищение язвы от некротических масс наступило раньше, чем в контроле, на 7 суток. На 21-е сутки после индуцирования язвы ее площадь у контрольных крыс уменьшилась в 3,3 раза, а под действием гумитона - в 7 раз.
Обращает на себя внимание выраженный анальгезирующий эффект гумитона. Важно подчеркнуть, что гумитон, не обладая острой токсичностью, в 2,6 раза активнее устранял болевой синдром, чем индометацин (рис.5).
Рис. 5. Анальгезирующая активность Гумитона в сравнении с индометацином.
Примечание: * - различия достоверны по сравнению с группой контроль, Р0, Снижению болевого синдрома способствует усиление слизистого барьера за счет стимуляции препаратом выработки гликозаминогликанов.
Кроме того, обезболивающий эффект от применения гумитона объясняется, вероятно, как снижением концентрации соляной кислоты, так и сокращением времени ее действия на болевые рецепторы дна язвы за счет ускорения (на 28%) моторики желудочно-кишечного тракта.
Таким образом, гумитон показал высокую степень противоязвенной и антистрессовой активности. Репаративные свойства гумитона проявляются в ускорении заживления хронического язвенного дефекта как за счет усиления образования защитных компонентов (нейтральных и кислых гликозаминогликанов), снижения кислотно-пептической агрессии, так и благодаря возрастанию числа самих добавочных (слизистых) клеток, и более активному созреванию грануляционной ткани.
При изучении механизма действия адаптогенов выявлено, что их защитные свойства проявлялись только на фоне тех или иных нагрузок на организм [Яременко, 1990]. В качестве нагрузки было выбрано принудительное плавание с грузом до полного утомления. Гумитон активнее увеличивал время первого и повторного плавания по сравнению с пирацетамом во все дни эксперимента. Применение гумитона на фоне максимальных физических нагрузок способствует повышению массы животных до 10 % к исходной массе при неизменной в контроле, препятствует чрезмерному утомлению организма, обеспечивает полное восстановление сил за короткий отрезок времени (рис. 6).
Рис. 6. Влияние гумитона и пирацетама на показатели работоспособности мышей (среднее из двух плаваний) Примечание: * - различия достоверны по сравнению с группой контроль, Р0, Способности гумитона повышать неспецифическую сопротивляемость организма различного рода повреждающим факторам как за счет снижения степени эмоциональной реакции на стрессы, регулирующего воздействия на энергетический обмен в организме, стимуляции кроветворения, так и благодаря непосредственному протекторному действию на желудочно кишечный тракт делает перспективным его применение в сельском хозяйстве.
Влияние гумитона на цыплят-бройлеров исследовали в терапевтической (25 мг/кг) и профилактической (6 мг/кг) дозах в предварительном и производственных экспериментах Применение гумитона в терапевтической дозе при высоком уровне заболеваемости обеспечило максимальную сохранность цыплят (90% при 67% в контроле (рис. 7) в предварительном эксперименте. За счет высокой сохранности суммарная живая масса цыплят данной группы в конце эксперимента была больше контрольной на 31%.
Рис.7. Снижение падежа цыплят-бройлеров под влиянием гумитона Примечание: * - различия достоверны по сравнению с группой контроль, Р0, Выпаивание гуминовой кормовой добавки в дозе 25 мг/кг в производственном эксперименте на птицефабрике на 28000 цыплятах бройлерах повысило сохранность цыплят в опытной группе до 82%.
Благодаря увеличенному (на 27%) среднесуточному приросту цыплята, получавшие гумитон, раньше достигали убойной массы, что позволило сократить количество кормодней с 78 до 72. Применение гуминовой кормовой добавки привело к увеличению суммарной живой массы цыплят на 21% по сравнению с уровнем контроля.
Применение профилактической дозы гумитона в предварительном опыте позволило увеличить сохранность на 6,6%,а суммарную живую массу – на 14,7%.
Эффективность препарата в дозе 6 мг/кг была подтверждена в условиях экспериментального хозяйства на 700 цыплятах–бройлерах. Эксперимент отличался высоким уровнем сохранности поголовья и в контрольной (98%) и в опытной (98,6%) группах. Гумитон способствовал лучшему перевариванию и усвоению питательных веществ кормов. Несмотря на достаточно высокие показатели среднесуточного прироста живой массы в контрольной группе, выпаивание гумитона позволило увеличить прирост на 5% (49,4 г и 51,8 г соответственно за 35 дней выращивания). При этом расход корма на единицу прироста живой массы за период выращивания составил 1,67 кг или на 5,2% ниже, чем в контрольной группе Введение в рацион гуминовой кормовой добавки положительно влияет на качество получаемой продукции: увеличивается уровень витаминов А, В в печени и мясе, содержания золы, кальция и фосфора в костяке.
Эффективность производства в условиях применения гумитона с учетом снижения расхода корма на единицу прироста живой массы, увеличения сохранности и весовых показателей бройлеров составила 7,1%.
Таким образом, результаты, полученные в экспериментах и в ходе производственных испытаний, свидетельствуют о способности препарата гумитон повышать неспецифическую резистентность организма животных, что может быть использовано при выращивании сельскохозяйственных животных.
ВЫВОДЫ 1. Препарат гумитон содержит макро и микроэлементы, витамины, гуминовые и фульвокислоты, 16 аминокислот из 20 существующих.
Методами ИК-спектроскопии показано наличие аминов и аминокислот, углеводов, алифатических и ароматических карбоновых кислот, фенольных соединений. Гумитон относится к классу малоопасных веществ, не обладает острой и хронической токсичностью, не оказывает эмбриотоксического и тератогенного действия.
2. Гумитон оказывает защитное действие на кроветворную ткань при циклофосфановой гемодепрессии: стимулирует эритроидный и миелоидный росток гемопоэза, способствует быстрым темпам восстановления содержания клеток периферической крови.
3. Гуминовый препарат обладает выраженными гастрозащитными свойствами как при профилактическом введении животным, так и при лечении хронического язвенного процесса. Репаративные свойства гумитона проявляются в ускорении заживления язвенного дефекта за счет усиления образования защитных компонентов (нейтральных и кислых гликозаминогликанов), возрастания числа добавочных (слизистых) клеток, активации созревания грануляционной ткани, снижения кислотно пептической агрессии. Препарат значительно снижает восприятие болевых раздражений и ускоряет эвакуацию гастродуоденального содержимого.
4. Применение гумитона повышает физическую выносливость и работоспособность животных при тяжелых физических нагрузках, причем животные, получавшие гумитон перед физическими нагрузками, набирают массу тела на 10% большую в отличие от контрольных.
5. При выращивании высокопродуктивных кроссов бройлеров применение гумитона приводит к повышению сохранности поголовья и способствует повышению живой массы птицы на 5% при снижении расхода корма на единицу прироста живой массы на 5,2%, что приводит к интегральному повышению рентабельности на 7,1%.
Список научных работ, опубликованных по теме диссертации 1. Влияние биостимулятора из торфа на продуктивность цыплят-бройлеров // Торф и сельское хозяйство: Сб. науч. трудов / РАСХН СО, СибНИИТ. Томск, 1994. С. 119-127 (соавт. Панина О.П., Касимова Л.В., Панов А.Н.).
2. Опыт применения оксидата торфа для повышения жизнеспособности и интенсивности роста цыплят-бройлеров и поросят-сосунов // Совершенствование ведения сельскохозяйственного производства в степной зоне Сибири: Материалы науч.-прак. конф. / РАСХН СО, НИИАПХ. - Новосибирск, 1996. С. 118-119 (соавт. Панина О.П., Касимова Л.В., Панов А.Н.).
3. Биологическая активность стимуляторов роста из торфа и составляющих его фракций // Торф и сельское хозяйство: Сб. науч. трудов / РАСХН СО, СибНИИТ. - Томск, 1997. С. 67-74 (соавт. Филиппова Т.А., Касимова Л.В.).
4. Perspectives of the usage of peat and Sphagnum in medicine and veterinary medicine // The Spirit of Peatlands /Proceedings of the International Peat Symposium 30 years of the International Peat Society. Iyvaskula, Finland, 7- Sept. 1998. – Finland, 1998. – P. 125-126 (соавт. O. Panina, L. Kasimova).
5. Increase of productivity of farm animals with the help of oxidate, a peat humic preparation // Peat Therapy on it’s Way into the next Millenium / International Symposium, Kissingen Spa, Germany, Okt. 21-24, 1999. – Germany, 2000. – Р.
233-245 (соавт. O. Panina).
6. Торфотон – перспективный противоязвенный препарат // Сибирский журнал «Гастроэнтерология и гепатология» - 1999. - № 8-9. - С. 108- (соавт. Панина О.П., Ратахина Л.В., Зуева Е.П., Крылова С.Г., Разина Т.Г., Амосова Е.Н.).
7. Биостимуляторы из торфа как кормовые добавки для получения экологически чистой животноводческой продукции // Качество – стратегия 21 века: Материалы 4 Международ. научно-практич. конф. – Томск: Изд-во НТЛ, 1999. С. 63-64 (соавт. Панина О.П., Ратахина Л.В., Касимова Л.В.).
8. Перспективные биостимуляторы природного происхождения // Проблемы стабилизации и развития сельского хозяйства Казахстана, Сибири и Монголии: Материалы 3 Международ. науч.-прак. конф. – Новосибирск, 2000. С. 170 (соавт. Ратахина Л.В., Панина О.П.).
9. Биостимулирующая кормовая добавка из торфа для телят молочного периода // Актуальные проблемы диагностики, профилактики и терапии животных в современных экологических условиях: Материалы межрегиональной науч.-прак. конф. – Барнаул, 2001. С. 25-28 (соавт.
Касимова Л.В., Бледнов В.А., Никитина М.М., Панов А.Н.).
10. Оксидат торфа как биостимулирующая кормовая добавка для телят молочного периода // Торф в сельском хозяйстве: Сб. науч. трудов / РАСХН СО, ГНУ СибНИИТ. – Томск. 2002. С. 121-125 (соавт. Панина О.П., Ратахина Л.В., Бледнов В.А., Никитина М.М., Панов А.Н., Касимова Л.В.).
11. Использование гуминового препарата «Торфотон» в качестве адаптогенного и противоязвенного средства // Высокие технологии добычи, глубокой переработки и использования озерно-болотных отложений: Материалы Международ. науч.-прак. конф. - Томск, 2003. С.
130-131 (соавт. Панина О.П.).
12. Влияние химических свойств торфов на состав щелочного экстракта // Химия растительного сырья. – 2003. - №3. - С. 35-39. (соавт. Касимова Л.В.).
13. Использование гуминового препарата «Торфотон» в качестве противоязвенного средства // Гуминовые вещества в биосфере. Труды Международной конф. - М., из-во Моск. ун-та, 2004. С. 182-185. (соавт.
Панина О.П., Касимова Л.В.).
14. Результаты применения в ветеринарной практике нового энтеросорбента из торфа ЭСТ-1 // Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. – 2004. - №1. –С.66-70. (соав. Касимова Л.В., Удинцев С.Н.) 15. Гуминовая кормовая добавка из торфа «Гумитон». Рекомендации по применению. (Сокращ.) // Томский агровестник. – 2005. - № 3 (06). – С.
53-56. (соавт. Касимова Л.В., Корнев В.В., Панина О.П., Панов А.Н., Сибагатов В.А., Титова Э.В., Удинцев С.Н.).
16. Перспективы применения торфа и продуктов его переработки в животноводстве – Томск: Изд-во ТПУ, 2006. - 92 с. (соавт. Л.В. Касимова, Э.В. Титова, А.Н. Панов, С.Н. Удинцев, В.А. Сибагатов, Н.М. Белоусов) 17. Применение гуминовой кормовой добавки гумитон в птицеводстве // Современные проблемы и достижения аграрной науки в животноводстве, растениеводстве и экономике:Сб. тр. региональной науч-прак. конф. – Томск: Изд-во UFO Print, 2006. Вып. 9. С. 84-87. (соав. Костеша Н.Я.) 18. Влияние препарата гумитон на состояние желудочно-кишечного тракта и процессы формирования язв различной этиологии на фоне развития стресс-реакции в эксперименте // Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. – 2006. - №7. –С. 61-65. (соав. Касимова Л.В., Удинцев С.Н.) Патенты на изобретение 1 Способ получения железосодержащего препарата для лечения и профилактики железодефицитной анемии у животных: Патент № РФ, МКИ С 07F 15/02, А61К 35/295. от 27.11.2002 (соав. Панина О.П., Касимова Л.В.) 2 Способ получения железосодержащего препарата для лечения и профилактики железодефицитной анемии у животных: Патент РФ, МКИ А61К 35/295, А 61 Р 7/06 от 20.11.2004 (соав. Касимова Л.В.)