Экология сульфатредуцирующих бактерий и их геохимическая деятельность в подземных водах палеогеновых отложений обь-томского междуречья
На правах рукописи
Лущаева Инна Владимировна Экология сульфатредуцирующих бактерий и их геохимическая деятельность в подземных водах палеогеновых отложений Обь-Томского междуречья 03.00.16 - Экология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Томск-2007
Работа выполнена на кафедре физиологии растений и биотехнологии в ГОУ ВПО «Томский государственный университет» и в секторе общей микробиологии ОСП «НИИ биологии и биофизики ТГУ»
Научный консультант: доктор биологических наук Карначук Ольга Викторовна
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Евдокимов Евгений Васильевич кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Тронова Татьяна Михайловна
Ведущая организация: Институт химии нефти СО РАН
Защита диссертации состоится «23» мая 2007 г. в 14-00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.267.10 в ГОУ ВПО «Томский государственный университет» по адресу: 634050, г.Томск, пр.Ленина, 36.
С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Томского государственного университета Автореферат разослан «_» апреля 2007 года
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Е.Ю.Просекина
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Проблемы геохимии подземных вод давно привлекают внимание исследователей. В.И.Вернадский отмечал, что среди химических соединений Земли вода занимает особое положение, а природные подземные воды являются сложными динамическими системами, которые находятся в тесной взаимосвязи с окружающей их средой (Вернадский, 1965).
Cодержание и активность микроорганизмов в подземной воде оказывает значительное влияние на ее геохимические и санитарно-гигиенические параметры (Younger, 2007). В последнее время в связи с глобальным загрязнением поверхностных вод централизованное водоснабжение все в большей степени ориентируется на подземные воды. Поэтому проблема низкого качества питьевой воды в настоящее время является одной из самых актуальных проблем окружающей среды. Месторождение подземной воды палеогеновых отложений Обь-Томского междуречья является основным источником питьевого водоснабжения г.Томска. В процессе его эксплуатации возникает вопрос о поддержании санитарно-эпидемиологической надежности данной системы. Проблема качества этих подземных вод связана с высоким содержанием железа и марганца (Шварцев, 1998). Кроме того, в подземной воде отмечается повышенное содержание ортофосфатов.
На территории Обь-Томского междуречья исследования микрофлоры подземной воды, в том числе и сульфатредуцирующих бактерий (СРБ), не проводились. СРБ играют важную роль в глобальных циклах серы и углерода (Иванов, Каравайко, 2004) и, таким образом, являются чрезвычайно важными элементами микробного сообщества. Кроме того, СРБ являются относительно удобными объектами для культивирования и, следовательно, они представляют хорошую модель для изучения экологии микроорганизмов, их распределения и деятельности в окружающей среде. Поэтому изучение распространения и геохимической деятельности сульфатредуцирующих бактерий в подземной воде необходимо как для оценки их влияния на санитарно-гигиенические характеристики питьевой воды, так и для понимания их роли в геохимических процессах, протекающих в системе вода-порода.
В связи с вышеизложенным целью исследования явилось изучение экологии сульфатредуцирующих бактерий подземных вод палеогеновых отложений Обь-Томского междуречья и ее участие в биогеохимических процессах, протекающих в подземной воде.
Задачи исследования состояли в следующем:
1. Изучить распространение и численность СРБ и аэробных сапрофитных микроорганизмов в подземных водах палеогеновых отложений Обь-Томского междуречья.
2. Изучить физиологию, филогению и кинетические характеристики роста на различных субстратах чистой культуры СРБ штамма S1, выделенной из подземных вод Обь-Томского междуречья.
3. Исследовать возможное участие природного сообщества СРБ из подземных вод и чистой культуры СРБ в процессах мобилизации растворимых ортофосфатов из нерастворимых соединений фосфора.
4. Исследовать способность природного сообщества СРБ из подземных вод и чистой культуры СРБ к мобилизации марганца из нерастворимых соединений марганца.
Научная новизна. Впервые исследованы распространение и численность сульфатредуцирующих и аэробных сапрофитных бактерий в подземной воде палеогеновых отложений Обь-Томского междуречья. Описана новая спорообразующая сульфатредуцирующая бактерия, выделенная из данных подземных вод. Определены возможные доноры и акцепторы электронов, которые могут быть использованы группой СРБ в экосистеме подземных вод.
Определена активность сульфатного дыхания сообщества СРБ. Показана роль микрофлоры подземных вод, и в частности природного сообщества СРБ, в мобилизации ортофосфата и марганца из нерастворимых соединений вмещающих пород. Чистая культура СРБ штамма S1, выделенная из исследованных подземных вод, также способна мобилизовать растворимые ортофосфат и марганец из нерастворимых соединений.
Практическая значимость. Полученные данные по численности микроорганизмов в подземной воде могут быть использованы для мониторинга загрязнения подземной воды. Полученные кинетические характеристики СРБ можно рекомендовать для моделирования процессов сульфатредукции в подземной воде палеогеновых отложений Обь-Томского междуречья. Показано, что СРБ способны мобилизовать ортофосфаты и марганец из нерастворимых соединений, что указывает на необходимость учитывать биологический фактор в геохимических процессах, протекающих в системе вода-порода.
Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на городской конференции молодых ученых и специалистов (Томск, 1999), на международной конференции по экологии и рациональному природопользованию (Томск, 2000), на II международном совещании «Экология пойм Сибирских рек и Арктики» (Томск, 2000), на международной конференции «Environment of Siberia, the Far East, and the Arctic» (Томск, 2001), на всероссийской научной конференции «Наука и образование» (Белово, 2002).
По материалам диссертации опубликовано 7 работ, 2 из них в журналах, входящих в перечень ВАК.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, 5 глав, обсуждения, выводов и списка литературы из 12 отечественных и зарубежных источников. Материал диссертации изложен на 107 страницах, содержит 6 таблиц и 18 рисунков.
Список сокращений. ДНК –дезоксирибонуклеиновая кислота;
КОЕ – колонии-образующие единицы;
МПА – мясо-пептонный агар;
ПЦР – полимеразная цепная реакция;
рРНК – рибосомальная рибонуклеиновая кислота;
СРБ – сульфатредуцирующие бактерии;
PCA – Plate Count Agar;
T – время удвоения культуры.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объекты исследования.
Нами было исследовано микробное сообщество подземной воды палеогеновых отложений Обь-Томского междуречья (Томский водозабор).
Водозабор расположен в 10-15 км от Томска в пределах Западно-Сибирской плиты, фундамент которой погружается на глубину 0,2-0,5 км. Основные водоносные горизонты неоген-четвертичных и палеогеновых отложений сложены рыхлыми песчано-глинистыми образованиями, разделенными водоупором. Вследствие этого в палеогене развиты напорные воды, которые эксплуатируются 177 скважинами глубиной 60-100 м (Шварцев, 1998). Пробы воды отбирали непосредственно из эксплуатационных скважин Томского водозабора. В проведенных исследованиях в качестве объекта изучения также использовалась чистая культура спорообразующей сульфатредуцирующей бактерии штамма S1, выделенная О.В.Карначук и Ю.В.Толоковым из проб воды, взятой из скважин Томского водозабора.
Культивирование чистой культуры СРБ.
Культуру СРБ поддерживали на стандартной пресноводной среде Видделя с лактатом (Widdel, Bak, 1992). При таксономическом описании чистой культуры использовали традиционные для сульфатредукторов субстраты роста (доноры электронов и углерода) – органические кислоты (лактат, формиат, фумарат, сукцинат, малат, оксалат, пируват, бензоат), спирты (этанол), углеводы (глюкозу, фруктозу), жирные кислоты (ацетат), аминокислоты (цистеин, аланин), ароматические соединения (никотиновую кислоту). Все растворы субстратов роста готовили отдельно от основной среды, стерилизовали автоклавированием при 0,5 Атм 20 минут. Растворы вносили в основную питательную среду непосредственно перед посевом.
Конечная концентрация субстратов соответствовала концентрации, рекомендуемой Ф.Видделем и Ф.Баком (Widdel, Bak, 1992). Для каждого проверяемого вещества проводили не менее 5 пересевов культуры. О способности культуры использовать тот или иной субстрат в качестве донора электронов судили по наличию в пятом пересеве клеток по сравнению с контролем без добавления субстрата роста.
Определение филогенетического положения чистой культуры СРБ.
Бактерии выращивали до поздней экспоненциальной фазы на среде Видделя (Widdel, Bak, 1992) в 500мл сывороточных бутылях. Клетки осаждали центрифугированием при 5000 x g в течение 15 мин и лизировали щелочным раствором додецилсульфата натрия. Геномную ДНК выделяли как описано Самбрук с соавторами (Sambrook, Russel, 2001), а также с использованием PowerSoilTM DNA Isolation Kit (MO BIO Laboratories. Inc). Для амплификации последовательностей генов 16S рРНК использовали специфичные для Bacteria праймеры 8F (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) (Amann, Stahl, 1992) и 1492R (5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’) (Lane, 1990). ПЦР проводили в µл смеси, содержащей 50 – 100 нг матричной ДНК, 5 µл 10 x ПЦР буфера (ABgene, Epsom, UK), 1.75 mM MgCl2, 0.2 mM смеси dNTP, 1 µM каждого праймера, 1.25 U Red Hot polymerase (ABgene). Амплификатор (Thermo Hybaid PCR Express, Thermo Electron Corp., Basingstoke, UK) использовали для проведения следующих реакций: первоначальная 5-мин денатурация при 94o C, последующие 32 цикла денатурация при 94o C в течение 1 мин, элонгация праймеров при 45o C в течение 1 мин, отжиг праймеров при 72o C в течение 1мин. В конечном цикле инкубирование при 72o C составляло 7 мин. ПЦР продукт очищался и секвенировался коммерчески в DNA Sequencing Facility, Institute of Biotechnology, Helsinki University, Finland. Анализ последовательностей ДНК проводили с использованием программы BioEdit, а также инструмента BLAST GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) (Altschul et al., 1997). Последовательности выравнивали и проводили филогенетический анализ с использованием пакета ARB (http://www.arb-home.de).
Исходное филогенетическое дерево было построено методом ближайшего соседа (neighbor-joining). Bootstrapping analysis был основан на репликациях для установления доверительного уровня для каждого узла дерева.
Эксперименты по определению кинетических параметров роста.
Кинетические параметры роста бактерий штамма S1 (истинная удельная скорость роста без учета скорости отмирания и время удвоения культуры) определяли графоаналитически, используя данные, полученные при измерении концентрации белка в разных временных точках в период фазы экспоненциального роста (Варфоломеев, Гуревич, 1999). Опыты проводили в трех повторностях. Бактерии росли в пробирках объемом 30 мл на минеральной среде Видделя. В качестве донора электронов вносили лактат. Результаты снимали через 16 часов после начала эксперимента и затем каждые четыре часа. В пробах измеряли рН, количество сероводорода и белка.
Опыты по изучению мобилизации растворимых ортофосфатов и марганца из нерастворимых соединений чистой культурой.
Способность чистой культуры штамма S1 мобилизовать растворимый ортофосфат из природного нерастворимого апатита проверяли на бесфосфатной среде Видделя с лактатом. Природный апатит добавляли в количестве 80 мг на пробирку. Измерения начинали после 16-часовой лаг-фазы и затем фиксировали результат каждые четыре часа. В пробах измеряли рН, количество сероводорода, ортофосфата и белка.
Способность чистой культуры штамма S1 использовать Mn4+ из нерастворимого соединения MnO2 в качестве акцептора электронов проверяли на бессульфатной среде Видделя с лактатом. Оксид марганца MnO2 добавляли в количестве 200 мг на пробирку. Измерения начинали после 13-часовой лаг фазы и затем снимали результат каждые четыре часа. В пробах измеряли рН, количество сероводорода и биомассы клеток.
Нами была изучена способность накопительных культур СРБ осуществлять процессы мобилизации Mn2+ из нерастворимого оксида марганца.
Было поставлено 2 варианта опыта с тремя накопительными культурами 3, 28 и 163– на среде Видделя с сульфатом и без сульфата. В качестве субстрата роста добавляли лактат. Оксид марганца вносили в количестве 200 мг на пробирку.
Количество марганца измеряли в нулевой точке, после 72-часовой и 168 часовой инкубации при температуре 28-300 С.
Опыты с природной подземной водой.
Отбор проб подземной воды осуществляли непосредственно из эксплуатационных скважин в стерильную стеклянную посуду под плотно закрывающуюся пробку. Опыты с природной водой, взятой из скважин Томского водозабора, проводили в 30, 50 и 100 мл флаконах под резиновыми пробками и с закручивающимися крышками. Воду наливали во флаконы до верха и плотно закрывали резиновыми пробками. В качестве контроля во всех опытах служили подземная вода без внесения добавок. В опытные флаконы стерильными шприцами вносили различные стерильные добавки. Были заложены различные варианты опыта с внесением добавок. Для стимуляции деятельности сульфатредуцирующих бактерий во флаконы вносили 20 % раствор сульфата натрия в количестве 1,5 мл на 100 мл. Для ингибирования процессов сульфатредукции добавляли 10 % раствор натрия молибденовокислого в количестве от 10 до 40 мМ. В опытах использовали различные органические субстраты – 12 % раствор этанола (вносили в количестве 1 мл/100 мл), 4 % раствор лактата (1,6 мл/100 мл), 0,5 М раствор бензоата (1 мл/100 мл), 10 % раствор ацетата (1 мл/100 мл), 20 % раствор NH4Cl (1,25 мл/100 мл), 20 % раствор KH2PO4 (1 мл/100 мл), 10 % раствор Na2MoO (4,84 мл/100 мл). В опытах по мобилизации фосфатов из нерастворимых соединений использовали синтетический нерастворимый осадок Ca3(PO4)2 и природный апатит, которые вносили в 30 мл флаконы в количестве 50 мг. В опытах по изучению мобилизации марганца из нерастворимых соединений использовали MnO2, который вносили в количестве 50 мг на 30 мл флакон. Все опыты с природной водой проводили в 5 повторностях.
Определение численности микроорганизмов в подземной воде.
В пробах воды определяли общее содержание сульфатредуцирующих бактерий и аэробных сапрофитных микроорганизмов. Количество сапрофитов определяли методом высева 10-кратных разведений проб воды на плотные питательные среды «Plate Count Agar» (Difko, USA) и мясо-пептонный агар (МПА). Инкубировали посевы при температуре 28-30 0С в течении 2 недель.
Численность определяли подсчетом колоний микроорганизмов на чашках Петри.
Численность сульфатредуцирующих бактерий определяли методом предельных разведений на среде Видделя для пресноводных форм с добавлением лактата в качестве органического субстрата. Посевы инкубировали при температуре 28-30 0С в течении 4-6 недель. Численность определяли визуально по почернению среды вследствие образования сульфида железа. Использовали 7 последовательных разведений. Наиболее вероятное число бактерий рассчитывали с использованием таблиц Мак-Креди (Koch, 1994).
Исследование активности сульфатного дыхания сообщества СРБ.
Эксперименты, проводимые с подземной водой, взятой непосредственно из эксплуатационных скважин, наиболее достоверно отражают процессы, протекающие в микробном сообществе данной системы. Для стимуляции процессов сульфатредукции во флаконы добавляли сульфат натрия, а в качестве донора электронов – этанол. Всего было поставлено два аналогичных опыта – скважина 1 (25.09.2000) и скважина 14 (24.11.2000). Измерения рН, Еh и H2S проводили еженедельно в течение 5 недель.
Изучение потенциальных доноров и акцепторов электронов для природного сообщества СРБ.
Образование сероводорода природным сообществом СРБ при добавлении органических и неорганических субстратов роста (доноров электронов) исследовали на примере воды из разных скважин. В двух опытах (скважины 143 и 19) было поставлено по 9 вариантов, в каждом варианте по повторностей. В другом опыте (скважина 14) было поставлено 6 вариантов, в каждом варианте также по 5 повторностей.
В опыте проверяли возможность использования сульфата нерастворимых соединений PbSO4 и BaSO4, которые вносили в количестве 100 мг/100 мл, в качестве акцептора электронов для роста сульфатредуцирующих (СРБ) бактерий. В данном опыте исследовали воду из скважины № 14. Было поставлено 5 вариантов опыта. В следующем опыте дополнительно для стимуляции деятельности СРБ был внесен органический субстрат- этанол. В этом опыте также исследовали воду из скважины № 14.
Изучение возможной мобилизации марганца и ортофосфата из нерастворимого соединения сообществом СРБ.
В опыте по изучению мобилизации Mn(II) использовали воду из скважины. Проводили опыт в 30 мл флаконах, в которые вносили по 50 мг MnO2. Первоначальный рН 7,2. Всего было поставлено 15 вариантов опыта, в каждом варианте по 5 повторностей. После 6-недельной инкубации при комнатной температуре измеряли количество сероводорода, Mn(II) и рН.
Было проведено несколько опытов по изучению возможной мобилизации ортофосфатов из нерастворимых соединений под действием микроорганизмов подземной воды. В первом опыте использовали подземную воду из скважины № 19. Первоначальный рН составлял 7,8, содержание фосфата – 1,09 мг/л.
Синтетический растворимый осадок Ca3(PO4)2 вносили в 30 мл флаконы в количестве 50 мг на флакон. Было поставлено 13 вариантов опыта, в каждом варианте по 5 повторностей. В следующем опыте, кроме Ca3(PO4) использовали природные апатит1 и апатит 2, которые вносили во флаконы в количестве 50 мг на флакон. В данном опыте исследовали воду из скважины № 14, рН воды равнялась 7,72, количество ортофосфата – 0,614 мг/л. Было поставлено 11 вариантов опыта, в каждом варианте по 5 повторностей. Все посевы инкубировались в течение 6 недель при комнатной температуре, после чего измеряли количество сероводорода и ортофосфата в образцах.
Аналитические методы. Определение содержания сероводорода проводили колориметрическим методом по Pachmayer (Pachmayer, 1960) на спектрофотометре КФК-2МП при 590 нм.
Количество белка определяли по методу Лоури (Lowry et al., 1951) с использованием фенольного реактива Фолина. Данный метод сочетает в себе биуретовую реакцию (т. е. реакцию на пептидные связи) и реакцию Фолина (на тирозин и триптофан). Метод Лоури является наиболее чувствительным и точным из всех существующих методов количественного определения белка.
Определение содержания ортофосфатов проводили колориметрически на КФК-2МП при 670 нм. Принцип метода основан на реакции с молебдатом аммония в кислой среде. Образующаяся при этом желтая гетерополикислота под действием восстановителя хлорида олова превращается в интенсивно окрашенное синее соединение. Предел обнаружения ортофосфатов 0,01 мг/л (Новиков и др., 1990).
Определение содержания марганца проводили колориметрически на КФК-2МП при 640 нм. Метод определения марганца основан на окислении его соединений до иона MnO4- (перманганат-ион) в кислой среде персульфатом аммония или калия в присутствии ионов серебра в качестве катализатора.
Интенсивность появляющегося розового окрашивания пропорциональна содержанию марганца (Новиков и др., 1990).
Измерение pH проб проводили рН-метром фирмы Piccolo марки ATC HI 1280 amplified electrode. Измерение Еh проводили рН-метром фирмы Hanna H 9025 electrode.
Статистическую обработку данных проводили в статистических пакетах Microsoft Exsel version 5.0 и Statistica for Windows version 5.0.
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Численность микроорганизмов в подземной воде палеогеновых отложений Обь-Томского междуречья.
В подземной воде палеогеновых отложений Обь-Томского междуречья нами было определено общее количество СРБ и аэробных сапрофитных микроорганизмов. Как известно, жизнеспособность микроорганизмов в глубинных средах зависит от физико-химических факторов окружающей среды и большинство микроорганизмов в подземных водах – сапрофиты (Miettinen et al., 1997). Сапрофитные микроорганизмы развиваются за счет использования легкоразлагаемых органических субстратов и быстро реагируют на загрязнение местообитания. Поэтому численность данной группы микроорганизмов используют как показатель загрязнения природных экосистем (Гидрохимические показатели, 2000).
По нашим данным сульфатредуцирующие бактерии являются довольно многочисленной группой микроорганизмов, распространенной в подземных водах палеогеновых отложений Обь-Томского междуречья. Их количество в различных скважинах колебалось от 10 до 106 кл/мл. Определенное нами количество аэробных сапрофитных бактерий в пробах подземной воды из разных скважин в 2000-2001 годах составило от 1,5*102 до 7,2*108 КОЕ/мл (таблица 1). По нашим данным в период 1992-1993 г.г. численность аэробных сапрофитов в пробах воды из скважин Томского водозабора колебалась от до 9,9*103 КОЕ/мл. Полученные данные свидетельствуют об увеличении количества аэробных сапрофитных бактерий в пробах воды из разных скважин Томского водозабора.
По нашим данным в подземной воде Томского водозабора за изученный период с 1991 по 2000 годы произошло снижение концентрации неорганических форм азота (иона аммония, нитрата и нитрита) и увеличение содержания иона РО43-, что отражает смену типа лимитирования развития микроорганизмов в данной системе с фосфорного на азотный. Таким образом, наряду с увеличением содержания органического вещества в подземной воде произошло и увеличение численности сапрофитных микроорганизмов.
Таблица 1.- Содержание бактерий в подземных водах палеогеновых отложений Обь-Томского междуречья Номер Дата отбора Численность сапрофитных Численность скважины проб бактерий на разных средах, СРБ, кл/мл КОЕ/мл PCA МПА 4,3*10 ±0,2*10 2,2*104±0,1* 4 143 15.03. 8,6*106±0,4*106 3,8*106±0,2*106 37 13.04. 7,2*108±0,7*108 5,0*108±0,4*108 19 08.06. 7,0*104±0,2*104 4,6*104±0,3*104 1 25.09. 3,9*105±0,3*105 2,5*105±0,2*105 14 19.10. 4,4*105±0,2*105 1,5*105±0,4* 83 15.11.00 4 4 5 7,2*10 ±1,1*10 4,2*10 ±0,1* 73 15.11.00 5 5 5 6,2*10 ±0,4*10 2,1*10 ±0,2* 14 15.11. 7,6*105±0,3*105 2,3*105±0,1*105 1 15.11. 6,6*105±0,3*105 9,5*104±2,1* 48 15.11.00 5,8*105±1,0*105 3,1*105±0,2* 144 27.11.00 4,2*105±0,8*105 6,1*105±0,8*105 98 27.11. 8,9*105±0,7*105 6,9*105±0,6* 106 27.11.00 6 6 5 2,0*10 ±0,6*10 8,7*10 ±0,9* 113 27.11.00 5 5 5 3,8*10 ±0,2*10 2,9*10 ±0,2* 127 27.11.00 2 2 2 2,9*10 ±0,1*10 1,5*10 ±0,1* 129 24.04. 1,6*102±0,2*102 2,9*102±0,1*102 158 24.04. 2,3*102±0,1*102 4,9*102±0,2*102 159 24.04. Характеристики чистой культуры S1.
Филогенетический анализ показывает, что штамм S1 относятся к роду Desulfotomaculum отдела Firmicutes (рисунок 1). Ближайшим из валидно описанных родственников является Desulfotomaculum aeronauticum с гомологией последовательностей гена 16S рРНК 99.2%. Однако, в отличие от D. aeronauticum штамм S1 может использовать в качестве конечного электрона сульфат. Несмотря на высокую гомологию последовательностей гена 16S рРНК, штамм S1 вероятно является новым видом рода Desulfotomaculum.
Рисунок 1. – Филогенетическое положение штамма Desulfotomaculum sp.
S1, определенное методом ближайшего соседа (neighbor-joining). Масштаб показывает 10% расхождения последовательностей.
Данный штамм представлен палочковидными спорообразующими микроорганизмы с оптимальной температурой роста 370С. Было определено, что СРБ штамма S1 в качестве донора водорода используют лактат, этанол, глюкозу, малат и пируват. Фенотипические характеристики штамма S спорообразующей СРБ определяют его таксономическое положение как Desulfotomaculum sp. Динамика роста данной культуры на стандартной среде Виделя с лактатом соответствует классической кривой роста бактерий (рисунок 2). Удельная скорость роста культуры S1 равна 0,057 час-1 (T = 11,6 часа).
300 1, 250 1, 1, Белок, г/л H2S, мг/л 1, 0, 100 0, 0, H2S 0, Белок 0 0 16 20 24 28 32 36 40 44 Время, час Рисунок 2. – Динамика образования сероводорода и белка культурой Desulfotomaculum sp. S1 на среде Видделя с лактатом Образование сероводорода природным сообществом СРБ.
Мы изучали образование сероводорода природным сообществом СРБ в подземной воде на различных субстратах в условиях микрокосма. Очень часто ограниченность моделируемых условий эксперимента объясняется неспособностью подлинно воспроизвести естественные условия в лаборатории.
Поэтому, экстраполяция лабораторных результатов к реальным ситуациям часто критикуется, если проверка правильности данных не выполнена in situ. В так называемых микрокосмах обеспечиваются условия изучения микробных реакций в наиболее близких к естественным условиям (Mandelbaum et al., 1997). Эксперименты, проводимые с подземной водой, взятой непосредственно из эксплуатационных скважин, наиболее достоверно отражают процессы, протекающие в микробном биоценозе данной системы.
В экспериментах с подземной водой, взятой из разных эксплуатационных скважин Томского водозабора (скважины 143,19,14), было показано, что донором электронов для сульфатредукции в подземных водах может служить этанол (рисунок 3). Внесение других добавок и субстратов (лактат, бензоат, ацетат) не стимулировало образования H2S. Эти варианты опыта не отличаются достоверно от контрольного варианта. В качестве акцепторов электронов в отсутствии растворимого сульфата СРБ могут использовать сульфат малорастворимых соединений – BaSO4. Потенциальная активность сульфатного дыхания сообществом СРБ в подземной воде, рассчитанная по прибыли сероводорода, была равна 4,23 мг/л в сутки.
±станд.отклонение ±станд.ошибка 9 среднее H2S, мг/л - 1 2 3 4 5 6 7 8 СУБСТРАТ Рисунок 3. - Влияние субстратов роста (1 – контроль без внесения добавок;
2 - Na2SO4;
3 - Na2SO4 + Na2MoO4;
4 - Na2SO4 + NH4Cl;
5 - Na2SO4 + KH2PO4;
6 - Na2SO4 + этанол;
7 - Na2SO4 + лактат;
8 - Na2SO4 + ацетат;
9 Na2SO4 + бензоат) на образование сероводорода в изолированных пробах подземной воды, взятой из скважины 19.
Мобилизация ортофосфатов из нерастворимых соединений СРБ.
В исследованной нами системе подземных вод палеогеновых отложений Обь-Томского междуречья отмечено повышенное содержание растворимого ортофосфата, в некоторых скважинах значительно превышающих рекомендованный государственный стандарт. Одной из причин увеличения содержания растворимого ортофосфата в данной системе мы предполагаем активизацию процессов его мобилизации из нерастворимых соединений вмещающих пород под действием микрофлоры, и в частности СРБ.
В экспериментах нами была изучена способность мобилизовать растворимые ортофосфаты из нерастворимых соединений фосфора (синтетического осадка Ca3(PO4)2 и природных соединений - апатита I (Кольский п-ов) и апатита II (Хакасия)) под действием сульфатредуцирующих бактерий подземных вод (таблица 2). При добавлении различных источников доноров водорода наблюдалось образование растворимого ортофосфата в количестве от 19,9 до 27,8 мг/л из синтетического нерастворимого осадка Ca3(PO4)2. В то же время при добавлении молибдата натрия в качестве ингибитора процесса сульфатредукции также в пробах фиксировался растворимый ортофосфат в количестве от 8,3 до 24,4 мг/л. Это свидетельствует о том, что в мобилизации ортофосфата, наряду с СРБ, принимают участие и другие группы микроорганизмов.
Таблица 2. - Образование сероводорода и мобилизация ортофосфата из нерастворимого осадка Ca3(PO4)2 в микрокосмах с подземной водой при добавлении различных субстратов и ингибитора сульфатредукции Содержание Содержание Субстрат сероводорода, мг/л ортофосфата, мг/л 1,22 ± 0,05 7,96 ± 0, Контроль без внесения субстрата 4,20 ± 1,28 14,39 ± 1, Этанол 1,97 ± 1,42 34,54 ± 1, Ацетат 0,31 ± 0,16 27,68 ± 0, Бензоат 0,21 ± 0,12 25,61 ± 0, Лактат 33,84 ± 0,62 19,94 ± 1, Na2SO4 + этанол 2,39 ± 0,94 25,43 ± 1, Na2SO4 + ацетат 23,82 ± 2, Na2SO4 + бензоат 2,14 ± 1,61 27,86 ± 0, Na2SO4 + лактат 0,02 ± 0,01 8,27 ± 0, Na2SO4 + Na2MoO4 + этанол 0,45 ± 0,08 15,09 ± 0, Na2SO4 + Na2MoO4 + ацетат 0,08 ± 0,03 11,27 ± 1, Na2SO4 + Na2MoO4 + бензоат 0,22 ± 0,05 24,38 ± 0, Na2SO4+Na2MoO4+ лактат В опытах с природными нерастворимыми соединениями фосфора (апатитами I и II) отмечено, что в варианте с добавлением этанола и сульфата натрия мобилизовалось меньше растворимого ортофосфата, чем в варианте с добавлением только сульфата натрия. При этом в вариантах с добавлением к апатитам I и II сульфата натрия сероводород образовывался в незначительных количествах, не отличающихся статистически достоверно от контрольного варианта без внесения добавок. При добавлении к пробам воды с апатитом I и II этанола с сульфатом натрия интенсивно идет образование сероводорода, что свидетельствует о росте сульфатредуцирующих бактерий. Возможным объяснением результатов опыта является предположение, что на процесс мобилизации фосфата из нерастворимых соединений влияют не только СРБ, но и в большей степени другие группы микроорганизмов. Возможно также, что весь образовавшийся фосфат используется на нужды клеток.
Нами были поставлены эксперименты по изучению способности мобилизовать ортофосфаты из нерастворимых соединений под действием чистой культуры Desulfotomaculum sp. штамма S1, выделенной из подземной воды Томского водозабора. При росте культуры штамма S1 в бесфосфатной среде с добавлением природного нерастворимого апатита происходит мобилизация растворимого ортофосфата (рисунок 4). При этом обнаружение ортофосфата в культуральной среде связано с образованием сероводорода и ростом биомассы бактерий. Также на протяжении всего эксперимента рН среды существенно не изменялся (от 7,56 в нулевой точке до 7,45 в конце эксперимента). Следовательно, на выщелачивание ортофосфатов из апатита рН среды существенно не влияет.
0,9 4, H2S*100, мг/л, Белок, г/л Сероводород 0,8 Белок 0,7 3, Ортофосфат (PO4), мг/л 0,6 0,5 2, 3 0,4 0,3 1, 0,2 0,1 0, 0 0 24 28 32 36 40 44 48 52 Время, час Рисунок 4. - Динамика образования сероводорода, белка и мобилизация ортофосфата культурой Desulfotomaculum sp. S1 при росте на среде Видделя с добавлением апатита Наши эксперименты подтверждают возможность мобилизовать растворимые ортофосфаты из нерастворимых соединений фосфора СРБ.
Многими авторами было показано, что для мобилизации фосфата из нерастворимого осадка требуется избыток сероводорода (De Groot, 1991;
Golterman, 1995a). По всей видимости, в нашем случае возможно мобилизация ортофосфата происходит по этому же пути. Либо в качестве механизма мобилизации возможно предположить связывание ионов Са2+ хелотирующими лигандами, образующимися при росте СРБ, такими, как, например, ацетат. Но, наряду с СРБ, в процессах мобилизации иона PO43- из нерастворимых соединений фосфора вмещающих пород исследованных подземных вод, принимают участие и другие группы микроорганизмов.
Мобилизация марганца из нерастворимых соединений сообществом СРБ.
Нами были проведены эксперименты по изучению способности сульфатредуцирующих бактерий мобилизовать двухвалентный марганец из нерастворимого оксида марганца (таблица 3). В опыте с сообществом микроорганизмов подземной воды палеогеновых отложений Обь-Томского междуречья было показано, что наибольшее количество Mn2+ (377,5 мг/л) образовывалось в варианте с добавлением лактата в качестве донора электронов. При этом отмечено и наибольшее количество сероводорода (9, мг/л), что свидетельствует об интенсивном росте СРБ. В то же время значительное количество Mn2+ (303,5 и 89,4 мг/л) зафиксировано соответственно в вариантах опыта с добавлением молибденовокислого натрия в качестве ингибитора деятельности сульфатредукторов. Образование сероводорода в этих вариантах не наблюдалось. Следовательно, можно предположить, что наряду с сульфатредуцирующими бактериями в природных сообществах в мобилизации марганца (II) из нерастворимых соединений принимают участие и другие группы микроорганизмов. Это подтверждается и литературными данными. Нельсон и Саффарини (Nealson, Saffarini, 1994) отмечали, что диссимиляционная редукция марганца встречается в некоторых организмах, включая сульфатредуцирующие бактерии и факультативные аэробы.
Мобилизация марганца чистой культурой и накопительными культурами.
Подземные воды палеогеновых отложений Томского водозабора являются системой, лимитированной по сульфату, содержание которого, как правило, не превышает единиц миллиграммов на литр. В подобных условиях вероятным является вариант использования СРБ альтернативных акцепторов электронов, одним из которых является четырехвалентный марганец. Для подтверждения предположения о способности СРБ использовать марганец в качестве акцептора электронов нами были проведены эксперименты по изучению способности чистой культурой Desulfotomaculum sp. штамма S1 и накопительными культурами СРБ осуществлять процессы мобилизации марганца в раствор.
Таблица 3. - Образование сероводорода и мобилизация марганца из нерастворимого MnO2 в микрокосмах с подземной водой при добавлении различных субстратов роста и ингибитора сульфатредукции Субстрат роста Содержание Содержание сероводорода, мг/л марганца, мг/л 0,67 ± 0,42 23,28 ± 15, Контроль без внесения субстрата 1,19 ± 0,64 23,28 ± 7, Na2SO 0,05 ± 0,04 8,73 ± 7, Na2SO4 + Na2MoO 3,12 ± 1,07 24,74 ± 7, Na2SO4 + этанол 9,38 ± 6, Na2SO4 + лактат 237,69± 62, 0,12 ± 0,07 22,31 ± 10, Na2SO4 + бензоат 0,03 ±0,01 5,82 ± 3, Na2SO4 + ацетат 0,64 ± 0,34 24,25 ± 9, Na2SO4 + КН2РО 0,25 ± 0,21 42,45 ± 9, Na2SO4 + NH4Cl 1,54 ± 1,05 8,25 ± 7, Na2SO4 + Na2MoO4 + этанол 0,24 ± 0, Na2SO4 + Na2MoO4 + лактат Na2SO4 + Na2MoO4 + бензоат 0 0,27 ± 0,24 1,46 ± 1, Na2SO4+Na2MoO4 + ацетат 56,27 ± 20, Na2SO4+Na2MoO4 + КН2РО4 191,12 ± 76, Na2SO4+Na2MoO4 + NH4Cl Было показано, что под действием Desulfotomaculum sp. штамма S1, выделенной из подземных вод палеогеновых отложений Обь-Томского междуречья, в бессульфатной питательной среде происходит мобилизация Mn2+ из нерастворимого соединения MnO2. Восстановление марганца в начале опыта связано с ростом биомассы бактерий, а затем, после наступления стационарной фазы роста и фазы отмирания, происходит накопление растворимого марганца в культуральной среде до 42,5 мг/л. Это свидетельствует о том, что в отсутствии сульфатов СРБ способны использовать в качестве акцептора электронов марганец.
В опытах с накопительными культурами использовали накопительные культуры СРБ, выделенные из проб воды эксплуатационных скважин NN 3, и 163 Томского водозабора. Выделение Mn2+ в культуральную среду составляло от 15 до 40 мг/л в разных вариантах опыта и носило разный характер на средах с сульфатом и без него. Полученные результаты могут свидетельствовать о различном механизме мобилизации марганца в вариантах опыта. По всей видимости, на среде с сульфатом происходит абиологическая редукция марганца. Сульфатредуцирующие бактерии в процессе своего роста образовывали H2S, который в свою очередь восстанавливал Mn4+ в результате химической реакции:
3Н++ MnO2+ HS- Mn2+ + S0 + 2H2O (Burdige, Nealson, 1986).
На среде без сульфата появление Mn2+ можно рассматривать как результат использования Mn4+ культурами СРБ в качестве акцептора электрона.
Вероятно, отсутствие H2S, являющегося сильным восстановителем, в среде без сульфата приводит к позднейшему окислению его на 7-сутки или осаждению в виде MnCO3 (родохорозита).
Таким образом, нами было доказано, что СРБ способны мобилизовать марганец из нерастворимых соединений. В отсутствии сульфата сульфатредуцирующие бактерии используют марганец из нерастворимых соединений в качестве акцептора электронов. В природных средах, в частности в подземных водах, мобилизация марганца из нерастворимых соединений также осуществляется под действием других групп микроорганизмов либо абиологическим путем.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ Полученные нами данные можно использовать для мониторинга санитарно-гигиенического состояния подземных вод. Группу СРБ можно рекомендовать в качестве индикаторной группы микроорганизмов, так как они относительно удобны и просты в культивировании. Данные по активности сульфатного дыхания сообществом СРБ в подземных водах и кинетические характеристики чистой культуры Desulfotomaculum sp. можно использовать при моделировании процессов сульфатредукции в подземных водах.
Численность аэробных сапрофитов используют как показатель загрязнения природных экосистем. По нашим данным микроорганизмы широко распространенны в подземных водах палеогеновых отложений Обь-Томского междуречья. За последнее десятилетие их количество выросло в несколько раз.
Как показали наши исследования, деятельность микроорганизмов в подземной воде ведет к увеличению важного биогенного вещества –ортофосфата, который является лимитирующим элементом для большинства сапрофитных микроорганизмов. Учитывая тот факт, что антропогенная нагрузка на данную систему подземных вод не изменилась, а скорее даже уменьшилась, то увеличение численности сапрофитных микроорганизмов можно связать с увеличением содержания органического вещества и ортофосфата в подземной воде.
ВЫВОДЫ 1. Численность сульфатредуцирующих бактерий, определенная по росту на пресноводной среде Видделя с лактатом, в изученных пробах подземной воды палеогеновых отложений Обь-Томского междуречья составляет от 10 до 106 кл/мл. Численность сапрофитных бактерий, определенная по росту на двух питательных средах, в исследованной подземной воде составляет от 1,5*102 до 7,2*108 КОЕ/мл.
2. Анализ последовательностей гена 16S рРНК помещает штамм S1, выделенный из подземных вод палеогеновых отложений Обь-Томского междуречья, в род Desulfotomaculum отдела Firmicutes. Бактерия может использовать этанол, лактат, глюкозу, малат и пируват в качестве доноров электронов для сульфатредукции. Удельная скорость роста на лактате составляет 0,057 час-1 (T = 11,6 часа).
3. В исследованных подземных водах палеогеновых отложений наблюдается увеличение содержания растворимого ортофосфата. Сообщество СРБ и чистая культура Desulfotomaculum sp. способны мобилизовать растворимые ортофосфаты из апатита и синтетического осадка Ca3(PO4)2.
4. Сообщество СРБ и чистая культура Desulfotomaculum sp. способны мобилизовать Mn2+ из нерастворимого MnO2. На среде с сульфатом возможным механизмом мобилизации является восстановление 4-валентного марганца сероводородом, образующимся при росте СРБ.
5. Потенциальная активность сульфатного дыхания сообщества СРБ подземных вод, рассчитанная по прибыли количества сероводорода, составляет 4,23 мг/л в сутки. Этанол является предпочтительным донором электронов для восстановления сульфата в подземных водах Обь-Томского междуречья. В мобилизации растворимых ортофосфатов и марганца из нерастворимых соединений принимают участие группы микроорганизмов, отличные от СРБ.
Список работ, опубликованных по материалам диссертации.
1. Романенко И.В. (Лущаева), Карначук О.В. Возможное участие сульфатредуцирующих бактерий в мобилизации Mn(II) в подземных водах Обь Томского междуречья // Экология и рациональное природопользование на рубеже веков. Итоги и перспективы: Материалы научной конференции, т.III. Томск, 2000.- с.97-98.
2. Романенко И.В. (Лущаева) Мобилизация марганца из нерастворимых соединений сульфатредуцирующей бактерией Desulfotomaculum sp.S1 // Региональные проблемы экологии и природопользования: Материалы городской конференции молодых ученых и специалистов.- Томск, 2000.- с.30 31.
3. Карначук О.В., Максимова Н.М., Романенко И.В. (Лущаева), Ванина Ю.Н. Мобилизация ортофосфата в подземных водах палеогеновых отложений Обь-Томского междуречья // Экология пойм Сибирских рек и Арктики: Труды II совещания.- Томск: “STT”, 2000.- с.160-167.
4. Карначук О.В., Романенко И.В. (Лущаева), Максимова Н.М., Вагина С.Э. Эволюция биогенных элементов в водах палеогеновых отложений Обь Томского междуречья // Экология пойм Сибирских рек и Арктики: Материалы международной конференции.- Томск, 2001.- с. 121-125.
5. Романенко И.В. (Лущаева), Карначук О.В. Способность сульфатредуцирующих бактерий мобилизовать ортофосфат в подземных водах Обь-Томского междуречья // Наука и образование: Материалы Всероссийской научной конференции (12-13 апреля 2002 г.): В 2 ч. ч.2.- Белово: БИ(Ф) КемГУ, 2002.- с.363-366.
6. Романенко И.В. (Лущаева), Карначук О.В. Мобилизация фосфора и марганца из нерастворимых соединений под действием чистой культуры сульфатредуцирующих бактерий // Вестник Томского государственного университета. Общенаучный периодический журнал. Бюллетень оперативной научной информации, № 30.- Июнь 2004.- с.129-133.
7. Романенко И.В. (Лущаева), Карначук О.В. Распространение сульфатредуцирующих бактерий в подземных водах палеогеновых отложений Обь-Томского междуречья и их возможное участие в мобилизации ортофосфата и марганца // Вестник Томского государственного университета. Общенаучный периодический журнал. Бюллетень оперативной научной информации, № 30. Июнь 2004.- с.134-140.
Автор выражает благодарность научному руководителю д.б.н. Карначук О.В. и сотрудникам кафедры физиологии растений и биотехнологии Томского государственного университета за неоценимую помощь при проведении исследований и написании диссертации. Также глубокую признательность сотрудникам муниципального предприятия «Томскводоканал» Вагиной С.Э. и Коневой Е.Г. за доброжелательное отношение и помощь в отборе проб воды.
Автор также выражает благодарность сотрудникам НИИ биологии и биофизики ТГУ за помощь при проведении исследований.