Поиск структурного гена нехромосомного детерминанта [isp+] с помощью скрининга инсерционного банка генов у дрожжей saccharomyces cerevisiae

На правах рукописи

РОГОЗА

Татьяна Михайловна

Поиск структурного гена нехромосомного детерминанта [ISP+] с

помощью скрининга инсерционного банка генов у дрожжей

Saccharomyces cerevisiae

Специальность 03.02.07 - Генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2010 2

Работа выполнена в лаборатории физиологической генетики кафедры генетики и селекции Санкт-Петербургского государственного университета.

Научный руководитель: профессор, доктор биологических наук Людмила Николаевна Миронова кафедра генетики и селекции Санкт-Петербургского государственного университета, Санкт-Петербург

Официальные оппоненты: член-корреспондент РАН, профессор Михаил Давидович Тер-Аванесян НИИ Экспериментальной Кардиологии РКНПК, Москва профессор, доктор биологических наук Тыну Рихович Сойдла Институт Цитологии РАН, Санкт-Петербург Ведущее учреждение: Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии РАСХН, Пушкин

Защита диссертации состоится "_" _ 2010 г. в _ часов на заседании совета Д.212.232.12 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9, биолого-почвенный факультет, кафедра генетики и селекции, аудитория 1.

С диссертацией можно ознакомиться в центральной научной библиотеке им. М. Горького Санкт-Петербургского Государственного университета

Автореферат разослан "_" 2010 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета Д.212.232. кандидат биологических наук Л. А. Мамон

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Хорошо известно, что некоторые белки могут существовать in vivo в форме амилоидов – агрегатов фибриллярной формы. Образование амилоидов обусловлено полимеризацией молекул белка, сопровождающейся их конформационной перестройкой с формированием специфической «кросс- структуры». Амилоиды являются причиной амилоидозов – обширной группы заболеваний человека и животных. Особой разновидностью амилоидов являются прионы (от «proteinaceous infection»), отличающиеся от других амилоидов своей трансмиссибельностью. Прионы были открыты при изучении инфекционных губчатых энцефалопатий человека и животных. Оказалось, что эти заболевания обусловлены переходом в прионную форму клеточного белка PrP (Prusiner et al., 1984). Прион, возникающий на основе белка PrP, является примером инфекционного возбудителя, имеющего белковую природу.

Существенный прогресс в исследовании явления прионизации белков был достигнут, когда выяснилось, что некоторые белки дрожжей Saccharomyces cerevisiae также могут существовать в форме прионов. Однако есть существенное различие между прионами млекопитающих и прионами дрожжей. Прионы млекопитающих – это инфекционные агенты, а прионы дрожжей представляют собой цитоплазматические наследственные детерминанты. Обнаружение дрожжевых прионов позволило выявить новый механизм передачи информации в ряду клеточных поколений, в основе которого лежит наследование конформационно измененной белковой молекулы. Первыми были открыты три дрожжевых приона:

[PSI+], прионная форма белка Sup35 (Cox, 1965), [URE3], прионная форма белка Ure (Lacroute, 1971) и [PIN+], прионная форма белка Rnq1 (Derkatch et al., 1997). Эти прионы в настоящий момент наиболее хорошо изучены. Список дрожжевых прионов постоянно увеличивается;

за последние два года к нему добавлено еще четыре детерминанта: [SWI+] (Du et al., 2008), [MCA] (Nemecek et al., 2008), [OCT+] (Patel et al., 2009) и [MOT3+] (Alberti et al., 2009), которые являются прионными формами белков Swi1, Mca1, Cyc8 и Mot3, соответственно.

К настоящему моменту выяснены основные закономерности возникновения и поддержания прионов в клетке дрожжей, сформулированы критерии прионного наследования (Wickner, 1996). Считается, что основополагающим параметром в детерминации прионных свойств белков дрожжей является присутствие в них участков, обогащенных остатками аспарагина и/или глутамина. Анализ протеома дрожжей показал, что такие белки составляют примерно 1,7% от всех белков дрожжевой клетки (Michelitsch and Weissman, 2000). Это позволяет предполагать, что помимо уже известных прионов у дрожжей существуют и другие наследственные детерминанты, имеющие сходную природу. Нельзя исключить также, что подобными свойствами могут обладать и белки с другими особенностями первичной структуры, поскольку прионный белок млекопитающих, PrP, не содержит аспарагин/глутамин богатых последовательностей (Prusiner, 1998). Все это делает актуальным поиск новых прионов у дрожжей.

В нашей лаборатории ранее обнаружен детерминант, свойства которого сходны со свойствами прионов (Volkov et al., 2002). Фенотипически этот детерминант, обозначенный [ISP+], проявляется как антисупрессор, нейтрализующий проявление некоторых нонсенс-супрессорных мутаций в гене SUP35. Подобно другим дрожжевым прионам [ISP+] наследуется цитоплазматически, элиминируется при росте дрожжей на среде с гидрохлоридом гуанидина (GuHСl) и с высокой частотой возникает вновь после элиминации. Фенотип [ISP+] доминантен по отношению к фенотипу [isp-]. Вместе с тем, существенное отличие [ISP+] от уже найденных прионов дрожжей состоит в независимости его поддержания от шаперона Hsp104.

Для выяснения природы [ISP+] необходимо идентифицировать гены, от которых зависит присутствие [ISP+] в клетке. Среди этих генов должен быть и его структурный ген, то есть ген, кодирующий белок, прионной форме которого соответствует [ISP+].

В связи с этим целью исследования явилась идентификация структурного гена [ISP+] и изучение способности к прионизации белка, кодируемого этим геном.

В ходе работы решались следующие задачи: (1) поиск генов, инактивация которых приводит к элиминации [ISP+];

(2) характеристика влияния найденных генов на возникновение, проявление и поддержание [ISP+];

(3) выявление среди найденных генов кандидата на роль структурного гена детерминанта [ISP+];

(4) доказательство связи между этим геном и детерминантом [ISP+];

(5) изучение прионных свойств белка – продукта этого гена.

Научная новизна исследования. Получены генетические, биохимические и цитологические доказательства того, что обнаруженный ранее нехромосомный детерминант дрожжей [ISP+] представляет собой прионную форму белка Sfp1. Таким образом, это 8-й по счету наследственный детерминант дрожжей, имеющий белковую природу. Прион [ISP+] отличается по многим существенным свойствам от других прионов дрожжей, описанных к настоящему моменту. К числу таких свойств следует отнести ядерную локализацию, независимость поддержания от шаперона Hsp104, более высокую частоту спонтанного и индуцированного сверхэкспрессией гена SFP1 возникновения. Кроме того, прионизация белка Sfp1 не равнозначна последствиям делеции гена SFP1, что позволяет предполагать, что прионное превращение приводит не к потере функции белка Sfp1, а к ее модификации.

Полученные данные имеют приоритетный характер и расширяют представления о феномене прионного превращения белков у дрожжей и его функциональной и адаптивной роли.

Практическая ценность. Прионизация белка PrP человека и животных лежит в основе заболеваний, относящихся к инфекционным амилоидозам. Эти заболевания неизлечимы;

более того, существует возможность передачи инфекции от животных человеку. Кроме того, существует группа неинфекционных амилоидозов, среди которых такие заболевания как болезнь Альцгеймера и болезнь Хантингтона.

Исследование прионов дрожжей позволяет разрабатывать простые модели для изучения механизмов амилоидогенеза, поиска агентов, способных предотвращать амилоидизацию белков или элиминировать амилоидную (прионную) форму белка из клеток.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на 22-й Международной конференции по генетике дрожжей и молекулярной биологии (Братислава, Словакия 2005), на 23-й Международной конференции по генетике дрожжей и молекулярной биологии (Мельбурн, Австралия, 2007), на конференции по белковому синтезу и трансляционному контролю (Гейдельберг, Германия 2007), на 3 й Международной конференции молодых ученых (Одесса, Украина 2007), на 12-м Международном конгрессе по дрожжам (Киев, Украина 2008), на конференции по трансляционному контролю (Колд Спринг Харбор, США 2008), на конференции, посвященной 90-летию кафедры генетики и селекции СПбГУ (СПб, Россия 2009), на 27-м Международном специализированном дрожжевом симпозиуме (Париж, Франция 2009), на конференции EMBO по транскрипции у дрожжей (Барселона, Испания, 2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 работ.

Структура и объем работы. Работа изложена на 146 страницах и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, выводы, список литературы (193 наименования). Работа содержит таблиц и 40 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Штаммы. Генотипы основных штаммов дрожжей, использованных в работе, приведены в таблице 1.

Таблица 1. Генотипы основных штаммов дрожжей Штамм Генотип Происхождение 5Б-П4513 МАТ ade1-14 his7-1 lys2-87 ura3 leu2- met13-A1 sup35-25 sup45-400 [ISP+] и [isp-] МАТa ade1-14 his7-1 lys2-87 ura3 leu2-1 thr4 25-25-2В B15 sup35-25 sup45-400 [ISP+] и [isp-] Volkov et al., П hsp104-25– МАТ ade1-14 his7-1 lys2-87 ura3 leu2- + 2В-П3982 thr4-B15 sup35-25 sup45-400 hsp104 [ISP ] Примечания. Аллели ade1-14, lys2-87 содержат нонсенс-мутацию UGA;

аллель his7-1 несет нонсенс-мутацию UAA;

ura3 - делеция гена URA3;

sup35-25 – рецессивная омнипотентная супрессорная мутация в гене SUP35, sup45-400 криптическая мутация в гене SUP45, не имеющая собственного проявления, но влияющая на фенотипическое проявление [ISP+].

Плазмиды. Инсерционный банк генов, содержащий инсерции транспозона mTn в открытые рамки считывания генома дрожжей, получен из Йельского Центра по Анализу Генома (Burns et al. 1994). Плазмиду pRSQ2-URA3 использовали для интеграции в транспозон mTn3 бактериального ориджина репликации. Плазмида pRS315-UPF1, содержащая аллель гена UPF1 дикого типа, получена на основе центромерного вектора pRS315 (Sikorski and Hieter, 1989). Плазмиды pRS425-SFP1 и pRS426-SFP1 получены при клонировании аллели гена SFP1 дикого типа в 2-m векторы pRS425 и pRS426, соответственно. Плазмиды pMT3193 и pMT содержат SFP1 и GFP-SFP1, соответственно, под контролем собственного промотора SFP1 (Jorgensen et al., 2004). Плазмида pRS315-SFP1 получена при клонировании открытой рамки считывания гена SFP1 плюс 799 н.п. до и 300 н.п. после рамки считывания из плазмиды pMT3193 в вектор pRS315. Плазмида pSFP-GFP содержит ген SFP1, открытая рамка считывания которого слита с 5’ концом гена GFP, под (Fingerman et al., 2003). Плазмида pLH105, контролем GAL1/10 промотора сконструированная на основе 2-m вектора, содержит ген HSP104 под контролем конститутивного GPD-промотора (Сhernoff et al., 1999). Плазмиду pCORE использовали для замещения генов UPF1 и SFP1 на кассету, содержащую ген URA (Storici et al., 2001).

Методы. Использовали стандартные методы генетики дрожжей и стандартные среды: YPD, полную синтетическую среду SMM, а также селективные среды, не содержащие отдельных компонентов среды SMM (Захаров и др., 1984;

Sherman et al., 1986). Кроме того, использовали среду на основе SMM, содержащую галактозу и раффинозу в качестве источника углерода. Элиминацию [ISP+] проводили на среде, содержащей гидрохлорид гуанидина (GuHCl). Тест на чувствительность к антибиотикам проводили, используя бумажные фильтры диаметром 0,5 см, на которые наносили по 4 мкл паромомицина в концентрации 1М или циклогексимида в концентрации 5мМ. Фильтры помещали на чашки, на которые высевали газоном штаммы дрожжей. На четвертый день проводили измерение зон ингибирования.

Качественную оценку эффективности нонсенс-супрессии осуществляли визуально по росту штаммов на средах SMM-His (his7-1) и SMM-Lys (lys2-87), с использованием последовательных разведений, что повышало разрешающую способность метода и позволяло регистрировать даже незначительные отличия в росте штаммов.

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР), рестрикционный анализ, выделение геномной и плазмидной ДНК, трансформацию дрожжей и E.coli, гель-электрофорез ДНК, иммуноблоттинг (с использованием моноклональных антител против GFP) проводили в соответствии со стандартными методиками (Sambrook et al., 1989;

Kaiser et al., 1994;

Gietz et al., 1992;

Inoue et al., 1990). Электрофорез белков в полиакриламидном геле с использованием холодного SDS (SDS-PAGE) осуществляли по методике, предложенной В.В.Кушнировым (Kushnirov et al., 2006).

Приготовление и фракционирование клеточных экстрактов проводили согласно протоколу, предложенному Ю.О.Черновым (Chernoff et al., 2002). Делеции генов UPF1 и SFP1 получали с помощью плазмиды pCORE (Storici et al., 2001).

Флуоресцентную микроскопию клеток, содержащих гибридный белок Sfp1-GFP проводили на микроскопе Leica DM6000B Leica Microsystems GmBH. Для обработки изображений использовали программу Leica QWin Standard (версия 3.2.0).

Для измерения площади клеток штаммы выращивали в среде YPD до стадии раннего стационара, затем клетки помещали в камеру Горяева и фотографировали в режиме проходящего света на микроскопе Leica DM LS, оборудованном объективом FLUOTAR 20х/0,40 и камерой Leica DFC 320. Измерение площади клеток проводили с помощью программы Image J 1,34 (http://rsb.info.nih.gov/ij/). Различия средних значений площади клеток были оценены с помощью t-критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ 1. Скрининг инсерционного банка генов дрожжей S.cerevisiae Для поиска структурного гена детерминанта [ISP+] мы применили подход, основанный на использовании инсерционной библиотеки генов. Этот подход позволяет разрушать хромосомные копии генов вставкой транспозона, таким образом может быть разрушен и структурный ген [ISP+]. Исходный штамм 25-25-2В-П [ISP+] несет мутации his7-1, lys2-87 и sup35-25 и имеет фенотип His-Lys- (в дальнейшем обозначаемый как Sup-), поскольку в присутствии [ISP+] нонсенс супрессорный эффект мутации sup35-25 не проявляется. Инактивация структурного гена [ISP+] должен приводить к элиминации этого детерминанта, вследствие чего проявится супрессорный эффект мутации sup35-25, то есть фенотип штамма изменится на His+Lys+ (Sup+). Однако изменение фенотипа может быть связано не только с элиминацией [ISP+], но и с маскировкой его проявления вследствие того, что инсерция транспозона в какой-либо ген теоретически может приводить к самостоятельному (скорее всего, рецессивному) эффекту нонсенс-супрессии, не связанному с эффектом sup35-25. Различить эти два события можно путем скрещивания интегрантов с тестерными штаммами [ISP+] и [isp-]. Вследствие того, что фенотип [ISP+] доминирует над фенотипом [isp-] (Volkov et al., 2002), скрещивание интегрантов, утративших [ISP+], с тестером [ISP+] должно приводить к образованию диплоида Sup-, а скрещивание таких интегрантов с тестером [isp-] должно давать диплоиды с фенотипом Sup+. В случае маскировки проявления [ISP+] в обоих скрещиваниях должны появляться диплоиды Sup-.

С другой стороны, известно, что прионизация нарушает функции белков и, следовательно, может приводить к таким же последствиям, как и инактивация гена, кодирующего этот белок. Если дизрупция структурного гена имеет такой же эффект, как и прионизация, исходный штамм [ISP+] после интеграции транспозона не изменит свой фенотип. К таким же последствиям (сохранение фенотипа Sup-), будет приводить интеграция транспозона в какие-то другие участки генома. Чтобы различить эти два типа интегрантов, необходимо скрестить их со штаммом [isp-].

Если интегранты содержат дизрупцию гипотетического гена ISP, то полученные гибриды (ISP:: mTn//ISP sup35-25//sup35-25 [isp-]) будут иметь фенотип Sup+. Далее с помощью гибридологического анализа необходимо подтвердить, что элиминация [ISP+] обусловлена инсерцией транспозона в геном, а не является случайным событием.

В результате трансформации штамма [ISP+] инсерционным банком генов было получено более 730 тысяч интегрантов, среди которых было обнаружено интегранта, проявляющих фенотип Sup+. Остальные интегранты, не изменившие свой фенотип, были скрещены со штаммом [isp-], в результате чего было отобрано 157 гибридов, проявляющих фенотип Sup+. Однако гибридологический анализ (тетрадный анализ и случайная выборка аскоспор) этих диплоидов не выявил ни одного гибрида, у которого наблюдалась бы корреляция между вставкой транспозона и элиминацией [ISP+]. Это говорит о случайной элиминации [ISP+] у этих интегрантов.

Для того чтобы выявить среди 1484-х интегрантов, проявляющих фенотип Sup+, штаммы, потерявшие [ISP+], проводили их скрещивание с тестерными штаммами [ISP+] и [isp-]. Для дальнейшего анализа было отобрано 105 интегрантов, гибриды которых от скрещивания со штаммами [ISP+] и [isp-] имели фенотип Sup- и Sup+, соответственно. Среди них с помощью тетрадного анализа и случайной выборки аскоспор были выявлены 32 интегранта, у которых потеря детерминанта [ISP+] коррелировала со вставкой транспозона.

Затем была проведена идентификация точки инсерции транспозона у этих 32-х интегрантов. Участки дрожжевой ДНК, содержащие вставку транспозона, у семи интегрантов, были секвенированы. Было обнаружено, что инсерция транспозона у одного интегранта произошла в ген SFP1, у четырех – в ген UPF1 и еще у двух – в ген UPF2. Оставшиеся 25 интегрантов были проанализированы ПЦР с использованием праймеров к генам SFP1, UPF1 и UPF2, для того чтобы исключить из анализа интегрантов, содержащих вставки транспозона в уже выявленные гены, и найти интегрантов со вставками транспозона в другие гены. Однако все интегрантов содержали вставки в какой-то из трех уже найденных генов. Три интегранта несли вставку в гене SFP1, 10 других – в гене UPF1 и еще 12 – в гене UPF2. Далее подробно изучалась связь между этими генами и детерминантом [ISP+].

2.Изучение связи между генами UPF1 и UPF2 и [ISP+] На предыдущем этапе мы показали, что инсерция транспозона в гены UPF1 и UPF2 приводит к изменению фенотипа штаммов, содержащих детерминант [ISP+], с Sup- на Sup+. Судя по результатам предварительного генетического анализа, в нашем случае такое изменение фенотипа обусловлено элиминацией [ISP+]. Белки Upf1 и Upf2 входят в состав системы NMD, обеспечивающей избирательную деградацию нонсенс-содержащих мРНК (Wang et al., 2001). Влияние UPF1, как ключевого компонента системы NMD, на стабильность [ISP+] было проанализировано более подробно.

Для ответа на вопрос, действительно ли дизрупция/делеция гена UPF1 приводит к исчезновению детерминанта [ISP+], или при скрининге банка мы отобрали интегрантов, у которых одновременно с инсерцией транспозона в ген UPF произошла спонтанная потеря [ISP+], были получены 10 штаммов, содержащих детерминант [ISP+] и несущих делецию хромосомной копии UPF1, а также компенсаторную плазмиду с геном UPF1. Это позволило оценить количественно частоту потери [ISP+] при потере компенсаторной плазмиды. Для потери плазмиды штаммы трижды пассировали на полной среде, в результате чего все 10 штаммов изменили фенотип с Sup- на Sup+. Однако популяция клеток этих штаммов может быть гетерогенной и содержать, наряду с клетками [isp-], какую-то долю клеток [ISP+]. Для количественной оценки частоты потери [ISP+] производили рассевы штаммов, потерявших компенсаторную плазмиду, и анализировали фенотип выросших клонов. Как следует из таблицы 2, для клонов, утративших плазмиду, характерна высокая, хотя и варьирующая от штамма к штамму, частота потери [ISP+].

Таким образом, можно сделать вывод, что делеция гена UPF1 приводит к потере детерминанта [ISP+], а не к маскировке его проявления.

При дальнейшей работе со штаммами, утратившими [ISP+], вследствие инактивации генов UPF1 или UPF2, мы обнаружили, что такие штаммы фенотипически нестабильны. После хранения этих штаммов в течение месяца при +4оС и последующего клонирования значительная часть клонов изменяет фенотип с Sup+ на Sup-. Скрещивание ауксотрофных по лизину клонов с тестерными штаммами [ISP+] и [isp-] приводит к образованию диплоидов Sup- (рис.1а), а пассирование на среде, содержащей 5мМ GuHCl, - к изменению фенотипа этих диплоидов на Sup+ (рис.1б). Таким образом, инактивация генов UPF1 и UPF2 приводит к временной элиминации [ISP+]. Возможность повторного возникновения [ISP+] в штаммах с дизрупцией генов UPF1 и UPF2 свидетельствует о том, что эти гены не являются структурными генами прионоподобного детерминанта [ISP+], но участвуют каким-то образом в контроле его поддержания.

3. Идентификация гена SFP1 в качестве структурного гена [ISP+] Третьим из генов, выявленных в результате скрининга инсерционного банка, был ген SFP1. Этот ген кодирует белок, обогащенный аспарагином и глутамином, и входит в список потенциально прионогенных белков. Таким образом, SFP изначально был наиболее вероятным кандидатом на роль структурного гена [ISP+].

Чтобы выяснить, действительно ли ген SFP1 является структурным геном [ISP+], был проведен всесторонний анализ роли этого гена в возникновении и поддержании детерминанта [ISP+].

3.1 Делеция SFP1 приводит к необратимой потере [ISP+] Мы показали, что дизрупция гена SFP1 приводит к проявлению фенотипа Sup+ (рис.2) и потере [ISP+]. Кроме того, штаммы с дизрупцией этого гена стабильны, то есть в них не происходит повторного возникновения [ISP+], в отличие от штаммов [isp-], полученных при обработке штаммов [ISP+] 5мМ GuHCl. Чтобы получить дополнительные доказательства того, что инактивация гена SFP1 приводит к потере [ISP+], а не к маскировке его проявления, был получен штамм с делецией гена SFP1 sfp1-25-25-2В-П3982. Затем делеция гена SFP1 в этом штамме была компенсирована копией гена SFP1 на плазмиде pRS315-SFP1. Из 559-и отобранных в этом эксперименте трансформантов 556 сохранили фенотип Sup+. Этот факт свидетельствует о том, что изменение фенотипа штамма sfp1 проиcходит вследствие потери [ISP+], а не в результате маскировки его проявления.

Таблица 2. Частота потери [ISP+] клонами, несущими компенсаторную плазмиду pRS315-UPF1, и клонами, утратившими эту плазмиду.

Сегрегант Количество Из них Частота Количество Из них клонов, потерявших потери клонов, потеряв + + потерявших [ISP ] [ISP ] сохранивших ших [ISP+] плазмиду плазмиду 1-7-П4635- 466 126 0,27 289 UPF1::pCORE 2-7- 858 819 0,95 305 3-7- 756 729 0,96 257 4-7- 106 88 0,83 295 6-7- 1415 948 0,67 300 1-8-П4635- 807 492 0,61 345 UPF1::pCORE 2-8- 234 149 0,63 361 5-8- 1078 842 0,78 276 6-8- 614 256 0,41 334 7-8- 1291 1231 0,95 268 Рисунок 1. Анализ клонов upf1, повторно изменивших фенотип с Sup+ на Sup-. а – рост гибридов от скрещивания клонов Sup с тестерными штаммами 5Б-П4513 [isp-] (1) и [ISP+] (2);

3,4 – контрольное скрещивание исходного штамма [isp-]. б – рост клонов Lys- до (два верхних ряда) и после (два нижних ряда) пассирования на среде, содержащей 5мМ GuHCl SMM-Lys SMM-Lys SMM-Lys SMM-His SMM Рисунок 2. Делеция гена SFP + [ISP ] приводит к изменению фенотипа штаммов [ISP+] с Sup- на Sup+ sfp 3.2. Сверхэкспрессия SFP1 приводит к индукции [ISP+] Известно, что увеличение продукции прионогенных белков индуцирует возникновение соответствующих прионов de novo (Wickner et al., 1996). Мы показали, что сверхэкспрессия гена SFP1 в штамме [isp-] у 99,6% трансформантов приводит к изменению фенотипа с Sup+ на Sup-. Важно при этом, что потеря плазмиды pRS426-SFP1, с которой осуществлялась сверхэкспрессия, у большинства клонов не приводит к изменению фенотипа с Sup- на Sup+ (было исследовано клонов, потерявших плазмиду, 1389 из них сохранили фенотип Sup-). Это может свидетельствовать об индукции [ISP+], или аналогичного ему по проявлению детерминанта, при сверхэкспрессии SFP1.

Фенотип Sup-, обусловленный присутствием этого детерминанта, проявляет [isp-]. При обработке доминантность в скрещивании с тестерным штаммом + штаммов GuHCl происходит изменение их фенотипа на Sup (рис.3, 4). Это говорит о том, что изменение фенотипа трансформантов связано не с проявлением эффекта сверхэкспрессии SFP1, а с индукцией антисупрессорного детерминанта. Помимо эффекта антисупрессии этот детерминант проявляет и другие свойства, сходные со свойствами [ISP+] (рис.3).

Ранее было показано (Volkov et al., 2002), что детерминант [ISP+] не зависит от действия шаперона Hsp104. Для того чтобы получить еще одно доказательство того, что при сверхэкспрессии гена SFP1 индуцируется именно [ISP+], мы проверили влияние делеции и сверхэкспрессии HSP104 на поддержание детерминанта, возникающего в результате сверхэкспрессии SFP1. Для этого штамм hsp104-25–2В П3982 [isp-] трансформировали плазмидой pRS426-SFP1. 141 из 156-и трансформантов (~90%) проявляли фенотип Sup-. При этом потеря плазмиды не приводила к изменению фенотипа с Sup- на Sup+. Таким образом, можно сделать вывод, что делеция гена HSP104 не препятствует индукции антисупрессорного детерминанта, возникающего при сверхэкспрессии Sfp1.

Кроме того, было изучено влияние сверхэкспрессии гена HSP104 на поддержание детерминанта, индуцированного сверхэкспрессией SFP1. Для этого тестерный штамм [ISP+], а также штамм, в котором был индуцирован [ISP+]-подобный детерминант, были трансформированы плазмидой pLH105, содержащей ген HSP под конститутивным GPD-промотором. 3168 из 3177-и трансформантов штамма 25 25-2В-П3982, а также все 340 трансформантов тестерного штамма [ISP+], сохранили фенотип Sup-. Таким образом, сверхэкспрессия гена HSP104 не влияет на проявление и поддержание детерминанта, индуцированного сверхэкспрессией гена SFP1. Все эти факты позволяют считать, что при сверхэкспрессии SFP1 в штамме [isp-] происходит эффективная индукция [ISP+].

Известно, что прионизация белков приводит к образованию амилоидных агрегатов (Wickner et al., 2001). Чтобы доказать присутствие агрегатов белка Sfp1 в клетках [ISP+], была использована конструкция SFP1-GFP, в которой последовательность полноразмерной копии гена SFP1 слита с последовательностью гена GFP – зеленого флуоресцентного белка (green fluorescence protein).

Предварительно необходимо было проверить, не препятствует ли GFP возникновению и поддержанию [ISP+]. Для этого мы использовали центромерную плазмиду pMT3453. Этой плазмидой был трансформирован штамм sfp1-25-25-2В П3982, имеющий стабильный фенотип Sup+. В митотическом потомстве трансформантов появлялись клоны с фенотипом Sup- с частотой, соответствующей частоте спонтанного возникновения [ISP+] (~10-4 на клетку на генерацию) (Volkov et al., 2002). Таким образом, GFP не мешает спонтанному возникновению [ISP+].

Чтобы изучить возможность индукции [ISP+] при сверхэкспрессии конструкции SFP1-GFP, мы трансформировали штамм [isp-] плазмидой pSFP1-GFP, экспрессирующей эту конструкцию под контролем индуцируемого промотора GAL1/10. Среди 674-и клонов, отобранных в митотическом потомстве десяти трансформантов, 577 клонов изменили фенотип с Sup+ на Sup- на индукторной среде, содержащей галактозу, и сохранили этот фенотип, когда были перенесены на среду, содержащую глюкозу. Мы показали также, что фенотип Sup- этих трансформантов доминантен, а их обработка GuHCl приводит к восстановлению фенотипа Sup+.

Таким образом, сверхпродукция Sfp1-GFP индуцирует появление [ISP+]. В совокупности эти данные позволяют использовать конструкцию SFP1-GFP для изучения агрегации Sfp1 в клетках [ISP+].

Рисунок 3. Сверхэкспрессия гена SFP1 приводит к индукции детерминанта, сходного по SMM-Ura-Lys SMM-Ura проявлению с [ISP+]. (1) – фенотип типичного трансформанта, сверхэкспрессирующего SFP1;

SMM-Lys SMM (2) – сохранение фенотипа Sup- того же штамма после потери мультикопийной плазмиды pRS426SFP1;

(3) – восстановление супрессии после пассирования на GuHCl;

(4) - контроль – штамм [isp-] Рисунок 4. Фенотип Sup-, вызванный временной 5Б-П 1 сверхэкспрессией гена SFP1 доминантен.

2 Гибриды от скрещивания тестерного штамма 5Б-П [isp-] 3 с клонами, полученными в результате 4 сверхэкспрессии SFP1 (1-3);

со штаммом 25-25-2В-П [ISP+] (контроль) (4);

со штаммом 25-25-2В-П3982 [isp-] SMM-Met-Thr-Lys (контроль) (5).

3.3. Биохимические доказательства агрегации белка Sfp1-GFP Полученный при сверхэкспрессии SFP1-GFP штамм [ISP+] был использован для изучения агрегации гибридного белка Sfp1-GFP. Экстракт клеток этого штамма анализировали с помощью SDS-PAGE с использованием холодного SDS и последующего вестерн-блота с антителами против GFP. Суть этого метода состоит в том, что холодный SDS разрушает только неамилоидные комплексы, в то время как при кипячении в SDS-содержащем буфере белок из агрегатов переходит в мономерную фракцию. Если изучаемый белок содержится в клетке в виде агрегатов, то в некипяченых пробах он входит в гель хуже, чем мономерная фракция того же белка, поэтому его количество снижено (Kushnirov et al., 2006). Мы обнаружили, что количество Sfp1GFP в кипяченых пробах штамма [ISP+] существенно превышает его количество в некипяченых пробах (рис.5). Поскольку кипяченая и некипяченая пробы содержат одинаковое количество тотального белка, разница в количестве Sfp1 GFP очевидно связана с тем, что в штамме [ISP+] этот белок находится в агрегированной форме.

1 2 Рисунок 5. Белок Sfp1-GFP агрегирует в клетках [ISP+].

o o RT 95 (А) - Вестерн-блот некипяченой, RT – room temperature (1) и кипяченой, 95oC (2) проб экстрактов клеток A штамма sfp1-25-25-2В-П3982, сверхэкспрессирующего SFP1GFP гибридную конструкцию SFP1-GFP. (3) – контроль, кипяченая проба экстракта клеток штамма 25-25-2В П3982 [isp-], не содержащего конструкцию SFP1-GFP. В Б эксперименте использовали моноклональные антитела против GFP.

(Б) - контроль нанесения – мембрана, окрашенная Coomassie G Вместе с тем, в этом эксперименте нам не удалось детектировать Sfp1-GFP в штаммах, продуцирующих этот белок под контролем промотора SFP1, поэтому агрегация Sfp1-GFP была дополнительно изучена с помощью дифференциального центрифугирования клеточных экстрактов и последующего вестерн-блота.

Использовали два варианта штамма [ISP+]: один был получен при сверхэкспрессии конструкции SFP1-GFP в штамме sfp1-25-25-2В-П3982, а во втором [ISP+] возник спонтанно при экспрессии SFP1-GFP под контролем собственного промотора гена SFP1. Кроме того, использовали штамм [isp-], также экспрессирующий SFP1-GFP под контролем промотора гена SFP С помощью дифференциального центрифугирования мы показали, что клетки [isp-] содержат гибридный белок Sfp1-GFP только в надосадочной фракции, в то время как клетки [ISP+] содержат часть белка также и в осадочной фракции (рис.6).

Рисунок 6. Гибридный белок Sfp1-GFP образует агрегаты в клетках [ISP+], но не в клетках [isp-]. Детекция белка Sfp1-GFP с помощью вестерн-блота в осадочной (Р) и надосадочной (S) фракциях экстрактов клеток, экспрессирующих конструкцию SFP1-GFP под контролем собственного 1 2 3 4 5 промотора гена SFP1 (1 и 2), промотора GAL1/10 (5 и 6), и в клетках [isp-] (3 и 4). В эксперименте использовали моноклональные антитела против GFP.

Наличие белка в осадочной фракции подтверждает наличие агрегатов в клетках штаммов [ISP+].

3.4. Цитологические доказательства агрегации Sfp1-GFP, внутриклеточная локализация агрегатов Дополнительное доказательство агрегации Sfp1-GFP было получено с помощью флуоресцентной микроскопии. Сравнивали характер свечения GFP в клетках штаммов [isp-] и [ISP+]. Как и в предыдущем эксперименте, использовали два варианта штаммов [ISP+]: один был получен при сверхэкспрессии конструкции SFP1-GFP в штамме sfp1-25-25-2В-П3982, а во втором [ISP+] возник спонтанно при экспрессии SFP1-GFP под контролем собственного промотора гена SFP1.

В шести независимых клонах штамма [isp-] мы наблюдали слабое свечение, распределенное между ядром и цитоплазмой, при этом более сильное свечение наблюдалось в ядре (рис.7). Сходное распределение свечения для Sfp1-GFP отмечали и другие авторы (Marion et al., 2004, Jorgensen et al., 2004).

В штаммах [ISP+] видны ярко светящиеся гранулы Sfp1-GFP, сходные с гранулами, образуемыми другими прионами. Такие гранулы наблюдаются в ~5-7% клеток. Гранулы присутствуют как в клетках, сверхэкспрессирующих SFP1-GFP, так и в клетках экспрессирующих SFP1-GFP под контролем собственного промотора гена SFP1 (рис.7).

В отдельных экспериментах была проведена внутриклеточная локализация агрегатов Sfp1GFP в клетках [ISP+]. Для визуализации ДНК использовали окрашивание DAPI. Мы обнаружили, что в подавляющем большинстве клеток агрегаты Sfp1-GFP локализуются в клеточных ядрах (рис.8).

Таким образом, биохимические и цитологические данные, в совокупности, свидетельствуют в пользу агрегации белка Sfp1GFP в клетках штаммов [ISP+]. Более того, впервые показана локализация прионной формы белка в ядрах дрожжевых клеток.

3.5. Влияние прионизации Sfp1 на его функции Принято считать, что прионизация приводит к нарушению функций соответствующих белков, вследствие этого фенотипические эффекты прионизации и инактивации соответствующего приону гена совпадают. Однако, прионизация белка Sfp1 приводит к фенотипу Sup-, в то время как делеция гена SFP1 в нашем случае приводит к фенотипу Sup+.

Совме Sfp1GFP DAPI РН щенные а а б в б г Рисунок 7. Визуализация агрегатов белка Sfp1GFP Рисунок 8. Ядерная локализация с помощью флуоресцентной микроскопии. Клетки агрегатовSfp1-GFP в клетках [isp-] (а) и [ISP+] (б), экспрессирующие SFP1-GFP штамма [ISP+]. (а) – клетки [ISP+], сверхэкспрессирующие под контролем собственного промотора гена SFP1.

(в) - Клетки штамма [ISP+], полученного при SFP1-GFP (б) – клетки сверхпродукции Sfp1-GFP в штамме [isp-]. (г) – экспресссирующие SFP1-GFP штамма [ISP+], клетки полученного при под контролем собственного сверхпродукции Sfp1-GFP в штамме sfp1-25-25- промотора гена SFP 2В-П Известно, что делеция гена SFP1 приводит к уменьшению размера клеток, снижению устойчивости к антитрансляционным антибиотикам циклогексимиду и паромомицину и скорости роста штаммов (Fingerman et al., 2004). Мы провели сравнение штаммов [ISP+], [isp-] и штаммов с делецией гена SFP1 по этим признакам. Для этого были использованы [ISP+], [isp-] варианты штамма 25-25-2В П3982, а также производные этих штаммов, несущие делецию гена SFP1.

В результате измерения площади 100 клеток каждого штамма были получены средние значения, представленные в таблице 3.

Различия средних значений площади клеток были оценены с помощью t-критерия Стьюдента. Показано, что различия между штаммами [ISP+] и sfp1 – достоверны:

t(diff)=32,14. Таким образом, прионизация Sfp1 не приводит к уменьшению размера клеток, в отличие от делеции гена SFP1.

На следующем этапе эти же штаммы сравнивали по устойчивости к циклогексимиду и паромомицину. Наиболее устойчивым к обоим антибиотикам оказался штамм [ISP+], наиболее чувствительными - оба штамма, несущих делецию гена SFP1, а штамм [isp-] показал промежуточный результат (табл.4).

Таблица 3.Средние значения площади клеток штаммов [ISP+], [isp-] и штаммов, несущих делецию гена SFP1.

Средняя площадь клетки, мкм Штамм 25-25-2В-П3982 [ISP+] 32,3+0, 25-25-2В-П3982 [isp ] 31,8+0, sfp1-25-25-2В-П3982* 14,5+0, sfp1-25-25-2В-П3982** 14,4+0, * делеция гена SFP1 получена у штамма 25-25-2В-П3982 [ISP+] ** делеция гена SFP1 получена у штамма 25-25-2В-П3982 [isp-] Таблица 4. Штаммы [ISP+], [isp-] и sfp1 проявляют различную устойчивость к антибиотикам, ингибирующим трансляцию.

Антибиотик Зона ингибирования, мм [ISP+] [isp-] sfp1* sfp1** Циклогексимид 23,2±0,28 26,3±0,40 31,7±0,13 31,6±0, Паромомицин 11,4±0,23 14,2±0,20 23,3±0,07 23,4±0, * делеция гена SFP1 получена у штамма 25-25-2В-П3982 [ISP+] ** делеция гена SFP1 получена у штамма 25-25-2В-П3982 [isp-] Таким образом, прионизация Sfp1 приводит к увеличению устойчивости к паромомицину и циклогексимиду по сравнению со штаммом [isp-], а делеция – к уменьшению.

Сравнение скорости роста штаммов [ISP+], [isp-] и sfp1 показало (рис.9), что штамм [ISP+] растет быстрее, чем штаммы [isp-], а штаммы, несущие делецию гена SFP1, растут гораздо медленнее.

[ISP+] [isp-] Рисунок 9. Кривые роста [ISP+], [isp-] и sfp1 вариантов штамма 25-25-2В-П sfp1* sfp1** T, часы Итак, по всем трем критериям (размер клеток, устойчивость к антитрансляционным антибиотикам и скорость роста штаммов) штамм [ISP+] существенно отличается от штаммов, несущих делецию гена SFP1. На основании этих данных можно предположить, что прионизация Sfp1 ведет не к потере, а к модификации функции этого белка.

ОБСУЖДЕНИЕ Разработанная в ходе настоящей работы методика скрининга инсерционного банка генов дрожжей, направленного на идентификацию генов, контролирующих проявление и поддержание прионоподобного детерминанта [ISP+], позволила выявить три гена, инактивация которых приводит к изменению фенотипа штаммов [ISP+] с Sup- на Sup+. Это гены UPF1, UPF2 и SFP1. Такое изменение фенотипа может быть следствием не только элиминации [ISP+], но и следствием маскировки его проявления в результате нарушения функции этих генов.

Тем не менее, генетический анализ показал, что инактивация всех трех выявленных в скрининге генов приводит к элиминации [ISP+], эффективность которой приближается к 100%. В то же время элиминация [ISP+] у штаммов с инактивированными генами UPF1 и UPF2 носит обратимый характер: после непродолжительного хранения в этих штаммах вновь начинают накапливаться клетки [ISP+]. Это говорит о том, что гены UPF1 и UPF2 не являются структурными генами [ISP+], хотя и участвуют в контроле поддержания [ISP+].

Причины временного исчезновения [ISP+] из клеток, в которых инактивированы гены UPF1 и UPF2, пока непонятны. Возможно, это связано с тем, что мы имеем дело с системой взаимодействующих белков, в состав которой входят белки Upf1 и Upf2, факторы терминации трансляции eRF1 и eRF3, на фоне изменения которых проявляется [ISP+], и белок, прионной формой которого является [ISP+]. Нарушение функции одного из компонентов этой системы может приводить к изменению состояния других компонентов (в нашем случае, к элиминации [ISP+]) и, соответственно, к изменению фенотипа. Однако это изменение носит временный характер и быстро компенсируется за счет повторного возникновения [ISP+].

Наиболее существенные результаты работы связаны с третьим геном, выявленным в ходе скрининга инсерционного банка, SFP1. Этот ген изначально был наиболее вероятным кандидатом на роль структурного гена [ISP+], поскольку белок, кодируемый этим геном, подобно другим прионным белкам дрожжей, обогащен аспарагином и глутамином (Michelitsch and Weissman, 2000).

Мы получили исчерпывающие генетические, биохимические и цитологические доказательства того, что [ISP+] действительно представляет собой прионную форму белка Sfp1. В соответствии с критериями прионного наследования, сформулированными Р. Викнером (Wickner, 1996), делеция гена SFP1 приводит к необратимой элиминации [ISP+], а сверхэкспрессия эффективно индуцирует возникновение антисупрессорного детерминанта, все свойства которого идентичны свойствам [ISP+]. Подобно [ISP+], этот детерминант излечивается при воздействии GuHCl и возникает вновь с высокой частотой;

его поддержание в ряду клеточных поколений, как и поддержание [ISP+], не зависит от шаперона Hsp104. Фенотип Sup-, обусловливаемый этим детерминантом, проявляет доминантность в скрещивании со штаммом [isp-], имеющим фенотип Sup+.

Важнейшим доказательством того, что [ISP+] – это прионная форма белка Sfp1, является обнаружение агрегатов Sfp1 в клетках [ISP+], в то время как в клетках [isp-] такие агрегаты не выявлены. В этих экспериментах использовали гибридный белок Sfp1-GFP. Мониторинг его состояния проводили как с помощью антител на белок GFP, так и с помощью флуоресцентной микроскопии. Важно отметить, что в предварительных экспериментах было показано, что гибридный белок не препятствует возникновению и поддержанию [ISP+]. Биохимически агрегаты были выявлены с помощью двух методов – метода дифференциального центрифугирования клеточных экстрактов штаммов [ISP+] и [isp-] и метода SDS PAGE c использованием холодного SDS. На следующем этапе присутствие агрегатов в клетках [ISP+] было подтверждено цитологически, с помощью флуоресцентной микроскопии, показавшей наличие светящихся гранул в клетках, содержащих как спонтанно возникший [ISP+], так и индуцированный сверхпродукцией гибридного белка. Примечательно, что присутствие агрегированной формы белка зарегистрировано в ядрах клеток [ISP+], но не в их цитоплазме. Это первый случай ядерной локализации прионного детерминанта у дрожжей.

Как уже упомянуто, белок Sfp1 обогащен аспарагином и глутамином. Известно, что участки, обогащенные этими аминокислотами, являются ключевыми компонентами прион-формирующих доменов. Как правило, такие домены находятся на N- или С-конце белковой молекулы. В случае Sfp1 вероятным кандидатом на роль прион-формирующего домена является последовательность, находящаяся в центральной части молекулы и не содержащая участков, существенных с функциональной точки зрения, таких как сайты фосфорилирования или цинковые пальцы, обнаруженные в составе этого белка. Однако пока это только предположение, которое нуждается в экспериментальной проверке.

Идентификация [ISP+] в качестве прионной формы белка Sfp1 интересна с нескольких точек зрения. Этот белок представляет собой глобальный регулятор транскрипции, участвующий в контроле экспрессии около 10% дрожжевого генома.

Это уже пятый транскрипционный фактор дрожжей, который, наряду с белками Ure2, Swi1, Cyc8 и Mot3, способен переходить в прионное состояние. При этом функции Swi1, Cyc8, Mot3 и Sfp1 носят глобальный характер. Возможно, таким образом, что прионизация играет существенную роль в регуляции экспрессии генов у дрожжей и представляет собой гибкий адаптивный механизм, позволяющий обратимо изменять уровень экспрессии большого количества генов без изменения уровня экспрессии самого транскрипционного фактора.

Еще один аспект, открывшийся благодаря сравнению свойств штаммов [ISP+] и [isp-], состоит в том, что прионизация Sfp1 приводит к другим фенотипическим эффектам, нежели делеция гена SFP1. Это отличает [ISP+] от других дрожжевых прионов, поскольку считается, что прионизация приводит к инактивации соответствующего белка. Соответственно штаммы, содержащие прион, должны быть идентичны по фенотипу штаммам, несущим делецию соответствующего гена.

Однако штаммы с делецией гена SFP1 проявляют фенотип Sup+, в отличие от штаммов [ISP+], проявляющих фенотип Sup-. Кроме того, штаммы [ISP+] отличаются sfp1 по скорости роста, размеру клеток и устойчивости к от штаммов антибиотикам-ингибиторам трансляции. Эти факты можно рассматривать как свидетельство того, что прионизация не инактивирует Sfp1, а модифицирует его функции, хотя возможны и другие объяснения (можно предположить, например, что прионизация Sfp1 влияет на статус каких-то других белков, вызывая специфические изменения фенотипа). Этот аспект также требует дальнейших исследований.

Обращает на себя внимание и тот факт, что штаммы, содержащие [ISP+], характеризуются более высокой скоростью роста, большей устойчивостью к антибиотикам, большим размером клеток. Это говорит о том, что наличие приона может давать преимущество штаммам дрожжей.

Ядерная локализация позволяет высказать некоторые предположения, объясняющие некоторые свойства [ISP+] и его отличия от других известных дрожжевых прионов.

1. Высокая частота спонтанного и индуцируемого сверхэкспрессией SFP возникновения [ISP+]. Помимо того, что Sfp1 выполняет свои функции в ядре, регулируемые им гены располагаются кластерами и, возможно, их транскрипция происходит в какой-то определенной области ядра. Такая компартментализация дает большую возможность для агрегации сравнительно небольшого количества молекул Sfp1, присутствующих в клетке.

2. Низкая эффективность цитодукции. Эффективность передачи прионов при цитодукции в случае [URE3] и [PSI+] близка к 100%, в то время как эффективность цитодукции для [ISP+] составляет всего 17% (Volkov et al., 2002). Такие различия могут быть связаны с тем, что [URE3] и [PSI+] локализуются в цитоплазме, а [ISP+] в ядре, в результате его передача при цитодукции может происходить только случайно.

3. Независимость от шаперона Hsp104. Ядерная локализация [ISP+] позволяет предположить, что именно это обстоятельство определяет его независимость от Hsp104, поскольку данные об активности Hsp104 в ядре отсутствуют. Вместе с тем, это не объясняет излечиваемость [ISP+] гидрохлоридом гуанидина, поскольку в основе механизма излечивания под действием GuHCl других дрожжевых прионов лежит ингибирование этим агентом активности ГТФ-азного домена Hsp104. В этой связи можно предположить, что GuHCl ингибирует активность каких-либо других шаперонов, работающих в ядре. С другой стороны, нужно отметить, что элиминация [ISP+] под действием GuHCl связана не только с излечиванием, но и с селекцией против клеток [ISP+], более чувствительных к GuHCl, нежели клетки [isp-]. Известно, что GuHCl является агентом, вызывающим стресс, который может, в частности, служить причиной выхода Sfp1 из ядра в цитоплазму, что предотвращает образование новых прионных агрегатов.

Таким образом, нехромосомный детерминант [ISP+] может рассматриваться в качестве нового дрожжевого приона, отличающегося по некоторым, весьма существенным, свойствам от уже известных прионов дрожжей. Это позволяет заключить, что современные представления о механизмах и последствиях прионного превращения белков еще далеко не окончательны, и делает перспективными дальнейшие исследования этого явления.

ВЫВОДЫ 1. Скрининг инсерционного банка генов дрожжей выявил три гена, инактивация которых приводит к элиминации детерминанта [ISP+]. Это гены SFP1, UPF1 и UPF2.

2. Роль генов UPF1 и UPF2 в поддержании [ISP+], очевидно, не существенна, поскольку их инактивация приводит лишь к временной элиминации этого детерминанта.

3. Инактивация гена SFP1 приводит к необратимой элиминации [ISP+], а его сверхэкспрессия эффективно индуцирует возникновение [ISP+], что позволило предположить, что SFP1 является структурным геном [ISP+].

4. Это предположение подтверждено биохимическими и цитологическими данными, в соответствии с которыми белок Sfp1 образует агрегаты в клетках, содержащих [ISP+], а в клетках [isp-] находится в растворимом состоянии.

5. Показано, что агрегаты белка Sfp1 локализуются в ядрах клеток [ISP+].

6. Штаммы [ISP+] существенно отличаются по своим свойствам от штаммов, несущих делецию гена SFP1. Это дает основание предполагать, что прионизация белка Sfp1 приводит не к потере, а к модификации его функций.

7. Характер различий в свойствах штаммов [ISP+] и [isp-] подтверждает гипотезу, согласно которой прионизация белков у одноклеточных эукариот может представлять собой эффективный механизм, обеспечивающий адаптацию клеточной популяции к меняющимся внутриклеточным и внешним условиям.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи:

1) Rogoza T., Goginashvili A., Rodionova S., Ivanov M., Viktorovskaya O., Rubel A., Volkov K., Mironova L. Non-Mendelian determinant [ISP+] in yeast is a nuclear-residing prion form of the global transcriptional regulator Sfp1 // PNAS. 2010. V. 107. № 23. Р.

10573-10577.

2) Рогоза Т.М., Викторовская О.В., Родионова С.А., Иванов М.С., Волков К.В., Миронова Л.Н. Поиск генов, влияющих на поддержание антисупрессорного прионоподобного детерминанта [ISP+] у дрожжей, с помощью инсерционной библиотеки генов // Молекулярная биология. 2009. Т. 43. № 3. С. 1-8.

Тезисы:

1) Rogoza T., Goginashvili A., Mironova L. Unusual properties of [ISP+], the prion form of the global transcriptional regulator Sfp1. EMBO Conference on Gene Transcription in Yeast (San Feliu de Guixols, Spain, June 19-24, 2010) – Book of Abstracts, P. 96.

2) Rogoza T., Goginashvili A., Mironova L. The non-Mendelian determinant [ISP+] is a prion form of Sfp1 transcription factor, which co-localizes with nucleus. 27th International Specialized Symposium on Yeasts (Paris, France, August 26-29, 2009) - Book of Abstracts, P. 53.

3) Goginashvili A., Rogoza T., Matveenko A., Mironova L. Prion conversion does not disturb the Sfp1 function. 27th International Specialized Symposium on Yeasts (Paris, France, August 26-29, 2009) - Book of Abstracts, P. 225.

4) Rogoza T., Goginashvili A., Ivanov M., Mironova L. Nonsense Suppression Efficiency is Yeasts Depends on the Level of SFP1 Expression. CSHL Meeting on Translational Control (Cold Spring Harbor, USA, September 3-7, 2008) - Book of Abstracts, P. 277.

5) Rogoza T., Goginashvili A., Volkov K., Mironova L. The SFP1 gene is a likely candidate to a role of structural gene encoding the prion-like determinant [ISP+]. 12th International Congress on Yeasts (Kyiv, Ukraine, August 11-15, 2008) - Book of Abstracts, P. 148.

6) Goginashvili A., Rogoza T., Volkov K., Mironova L. Over-expression of RPS24A increases the rate of the prion-like determinant [ISP+] appearance. 12th International Congress on Yeasts (Kyiv, Ukraine, August 11-15, 2008) - Book of Abstracts, P. 144.

7) Rogoza T., Viktorovskaya O., Volkov K., Mironova L. Identification of genes influencing manifestation and propagation of the prion-like determinant [ISP+] in Saccharomyces cerevisiae, using yeast insertion library. Materials of 3 International Young Scientists conference “Biodiversity. Ecology. Adaptation. Evolution dedicated to anniversary from birth of famous Ukrainian lichenologist Maria Makarevych” (Odessa, Ukraine, May 15-18, 2007) – Book of Abstracts, P. 218.

8) Viktorovskaya O., Rogoza T., Volkov K., Mironova L. Manifestation of the yeast prion-like determinant [ISP+] depends on genes controlling nonsense-mediated mRNA decay in yeast Saccharomyces cerevisiae. Materials of 3 International Young Scientists conference “Biodiversity. Ecology. Adaptation. Evolution dedicated to 100 anniversary from birth of famous Ukrainian lichenologist Maria Makarevych” (Odessa, Ukraine, May 15-18, 2007) – Book of Abstracts, P. 232.

9) Mironova L., Rogoza T., Volkov K., Viktorovskaya O., Ivanov M.The SFP1 gene encodes a potential new yeast prion involved in regulation of translation termination efficiency. Materials of the XXIIIrd International Conference on Yeast Genetics and Molecular Biology, Melbourne, Australia, July 1-6, 2007 - Book of Abstracts, P. 10) Rogoza T.M., Viktorovskaya O.V., Volkov K.V., Ivanov M.S., Mironova L.N. Sfp is involved in the control of stop codons read-through efficiency in yeast. Materials of EMBO conference on protein synthesis and translational control (Heidelberg, Germany, September 5-11, 2007) – Book of Abstracts, P. 11) Рогоза Т.М., Викторовская О.В., Волков К.В., Миронова Л.Н. Использование инсерционной библиотеки генов для поиска генов, влияющих на поддержание прионоподобного детерминанта [ISP+], у дрожжей Saccharomyces cerevisiae// материалы международной школы-конференции, посвященной 100-летию со дня рождения М.Е.Лобашева «Системный контроль генетических и цитогенетических процессов, Санкт-Петербург 10-13 ноября, 2007, - Сборник тезисов, С. 12) Викторовская О.В., Волков К.В.,Родионова С.А., Рогоза Т.М., Миронова Л.Н.

Идентификация генов, влияющих на поддержание и проявление детерминанта [ISP+] дрожжей Saccharomyces cerevisiae, с использованием инсерционной библиотеки генов// Материалы Международной Конференции «Генетика в России и мире», посвященной 40-летию Института общей генетики им.Н.И.Вавилова, Россия, Москва, 28 июня- 2 июля 2006., - Сборник тезисов, С.32.

13) Рогоза Т.М., Родионова С.А., Волков К.В., Миронова Л.Н. Влияние продуктов генов системы деградации нонсенс-содержащих мРНК (NMD) на поддержание и проявление детерминанта [ISP+] дрожжей Saccharomyces cerevisiae// Материалы Международной Конференции «Генетика в России и мире», посвященной 40-летию Института общей генетики им.Н.И.Вавилова, Россия, Москва, 28 июня- июля 2006, - Сборник тезисов, С.167.

14) Rodionova S., Rogoza T., Volkov K., Mironova L. The SFP1 is a potential host gene for yeast prion-like determinant [ISP+]// 22-nd international conference on yeast genetics and molecular biology (Bratislava, Slovakia, August 7-12, 2005) – Book of Abstracts, P.130.

15) Волков К.В., Аксенова А.Ю., Родионова С.А., Гиль Ю.П., Рогоза Т.М., Бурдаева Я.В., Миронова Л.М. Характеристика генетической системы, контролирующей поддержание и проявление дрожжевого приона [ISP+]// ІІІ съезд ВОГиС. Россия, Москва, 6-12 июня 2004, - Сборник тезисов, С58.