Технологии получения комбинированных липосомальных препаратов доксорубицина

На правах рукописи

Безруков Денис Алексеевич Технологии получения комбинированных липосомальных препаратов доксорубицина 03.00.23 - Биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва – 2007

Работа выполнена на кафедре биотехнологии Московской Государственной Академии тонкой химической технологии имени М.В. Ломоносова.

Научный консультант:

доктор химических наук, профессор Каплун Александр Петрович

Официальные оппоненты:

доктор химических наук Чупин Владимир Викторович доктор химических наук, профессор Юркевич Александр Морисович

Ведущая организация: ГУ Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф.Гаузе РАМН

Защита диссертации состоится “” _ 2007 года в часов на заседании Диссертационного совета Д 212.120.01 при Московской Государственной Академии тонкой химической технологии имени М.В. Ломоносова по адресу: 119571, Москва, пр. Вернадского, 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.В. Ломоносова по адресу 119571, Москва, пр. Вернадского, 86.

С авторефератом диссертации можно ознакомится на сайте МИТХТ им. М.В. Ломоносова www.mitht.ru Автореферат разослан “” 2007 года.

Учёный секретарь Диссертационного Совета кандидат химических наук Лютик А.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

* Актуальность проблемы. Липосомы как потенциальные средства доставки лекарственных веществ рассматриваются еще с середины 60-х годов прошлого века по ряду причин: небольшой размер (минимальный -- около 25 нм), благодаря чему достигается эффект пассивного нацеливания (вплоть до 200 нм);

биосовместимость (липосомы состоят из фосфолипидов и холестерина — природных, не токсичных веществ);

способность к включению как гидрофильных, так и амфифильных и гидрофобных веществ;

защита инкапсулированного вещества от преждевременной деградации;

обеспечение внутриклеточной доставки. Однако наряду с положительными качествами у липосом есть и недостатки, в частности, сложность длительного хранения готовых липосомальных препаратов без лиофилизации и быстрое поглощение липосом макрофагами (без специальной модификации), и, как следствие, малое время циркуляции в кровотоке. Для увеличения времени циркуляции были разработаны т. н. стерически стабилизированные липосомы. Дополнительная гидрофильная оболочка подобных липосом (наиболее часто используется полиэтиленгликоль) ограничивает их распознавание и захват клетками ретикулоэндотелиальной системы, что приводит к аккумулированию липосом в опухолевой ткани за счет эффекта пассивного нацеливания. Важно, чтобы лекарственное вещество надежно удерживалось внутри липосом и вместе с тем выходило (желательно с регулируемой скоростью) из липосом при достижении ткани или органа-мишени. Данным свойством обладают липосомы с контролируемым высвобождением, к примеру, термо- и рН чувствительные липосомы имеют достаточно жесткую мембрану при нормальных (физиологических) условиях, но при повышении температуры (в случае термочувствительных липосом) или понижении рН среды (для рН-чувствительных) проницаемость мембраны таких липосом резко увеличивается. Термочувствительные липосомы состоят, как правило, из липидных смесей, имеющих температуру фазового перехода несколько выше нормальной температуры человеческого тела (M. H. Gaber et al., * Сокращения: АС – ангиостатин;

ГТ – гипертермия, Лс – липосомы;

ОРО – относительный размер опухоли;

ТЛ – термочувствительные липосомы;

УСПЖ – увеличение средней продолжительности жизни экспериментальных животных;

Chol – холестерин;

DOX – доксорубицин;

DPPC – дипальмитоилфосфатидилхолин;

DSPC – дистеароилфосфатидилхолин;

DSPE –дистеароилфосфатидилэтаноламин;

ePC – яичный фосфатидилхолин;

HBS (HEPES-buffered saline) – физиологический раствор, забуференный HEPES;

Mal – малеимид;

PEG – полиэтиленгликоль.

1995;

J. Wells et al., 2003), в состав рН-чувствительных липосом вводят липиды, форма молекул которых меняется при изменении рН (J. M. Kim et al, 2001).

Эффективное комбинирование различных подходов является одним из путей преодоления указанных недостатков, а разработка технологичных схем получения липосомальных препаратов позволит нарабатывать их для полномасштабных испытаний и, при положительном результате последних, для терапии.

Работа является частью научных исследований, проводимых на кафедре биотехнологии МИТХТ им. М. В. Ломоносова в рамках госбюджетной темы № 1Б-5-856 «Синтез новых фармакологически активных веществ, изучение их биологических свойств и методов направленного транспорта с целью создания противоопухолевых, противовирусных, антипаркинсонических средств», а также по грантам президента РФ по поддержке ведущих научных школ № НШ-2329.2003.4 и № РИ-112/001/609.

Цели работы 1. Разработка и оптимизация полупромышленного метода получения стерически стабилизированных термочувствительных липосом, загружаемых доксорубицином против градиента сульфата аммония. Исследования и биологические испытания in vitro и in vivo указанного препарата.

2. Создание и отработка методики, позволяющей получать на основе липосомальной дисперсии доксорубицина препараты с различными нацеливающими лигандами и маркерами, иммобилизованными на поверхность везикул в произвольном соотношении.

3. Получение комбинированных липосомальных препаратов на основе веществ, различающихся по природе проявляемой противоопухолевой активности. Оценка эффективности in vivo терапии злокачественных новообразований подобными препаратами.

Научная новизна работы Предложена схема полупромышленного получения стерически стабилизированных термочувствительных липосом, загружаемых доксорубицином против градиента сульфата аммония, позволяющая значительно упростить существующую технологию без ухудшения свойств препарата.

Предложена методика, позволяющая получать стерически стабилизированный липосомальный препарат, загружаемый доксорубицином против градиента сульфата аммония, с возможностью одновременной иммобилизации на интегрированных в мембрану липосом PEG-цепочках различных химерных белков, содержащих домен барназы.

Показано, что мочевина в концентрациях, не превышающих изотонические, увеличивает агрегационную устойчивость липосомальной дисперсии и может быть использована как криопротектор при лиофилизации.

Получен комбинированный липосомальный противоопухолевый препарат.

Продемонстрирована эффективность совместного применения липосомальных препаратов с различными действующими началами: цитотоксическим (доксорубицином) и антиангиогенным (ангиостатином) при терапии опухолей.

Практическая значимость работы.

Ранее при участии кафедры биотехнологии МИТХТ им. М. В. Ломоносова была разработана и внедрена на Харьковском предприятии «Биолек» технология производства доксорубицина*, липосомального который в настоящее время представлен на фармацевтическом рынке. Однако названному препарату присущи все недостатки характерные для дисперсий немодифицированных липосом. Данная работа направлена на создание технологии получения улучшенных липосомальных препаратов доксорубицина, одновременно обладающих преимуществами стерической стабилизации, активной загрузки лекарственной субстанции во внутренний объем липосом, наличия механизмов контролируемого высвобождения и активного нацеливания. Разработка методик, использующих комбинирование различных подходов, позволяет получить гибкий и эффективный инструмент для терапии, в том числе и направленной, онкологических заболеваний, а создание надежных и простых в применении систем нацеливания позволит, в перспективе, использование данных препаратов в условиях рядового стационара или амбулатории.

Использование в качестве базы уже существующих и одобренных к применению субстанций (в т.ч. и имеющих простые липосомальные формы) дает возможность значительно повысить эффективность лечения с одновременным снижением токсичности для организма за счет ставшего возможным (при увеличении селективности) уменьшения общей вводимой дозы.

В качестве лекарственной субстанции был выбран доксорубицин. С одной стороны, это один из самых эффективных противоопухолевых препаратов. С другой, его применение в липосомах оправдано необходимостью снизить его кардиотоксичность. Кроме того, его * Препарат «Липодокс», патенты Украины №№ 5664(1995), 6700 (1995), 10187 (1997) флуоресцентные свойства расширяют возможности проводить исследования свойств липосомальных дисперсий. Немаловажным фактором, определившим наш выбор, является также возможность концентрировать его внутри липосом активной загрузкой против градиента рН или сульфата аммония.

Положения, выносимые на защиту.

Полупромышленная технология получения стерически стабилизированных термочувствительных липосом, загружаемых доксорубицином против градиента сульфата аммония.

Методика получения препарата стерически стабилизированных термочувствительных липосом с доксорубицином, способных одновременно иммобилизировать в произвольном соотношении различные нацеливающие агенты и маркеры, содержащие домен барназы.

Использование мочевины для увеличения агрегационной устойчивости липосомальных дисперсий.

Разработка комбинированного липосомального препарата с различными действующими началами: цитотоксическим (доксорубицином) и антиангиогенным (ангиостатином) для терапии опухолей.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 3 статьи, тезисы 2 докладов на научных конференциях, 1 патент РФ, 1 заявка на патент РФ.

Апробация работы. Результаты работы доложены на: Открытом научном семинаре «Создание адресных лекарственных препаратов нового поколения методами нанобиотехнологии», проходящего в МИТХТ им. М. В. Ломоносова под руководством академика РАМН Швеца В.И.;

25-й Московской международной выставке «Образование и карьера – XXI век» в рамках круглого стола «Лекарства XXI века» (Москва 13-15 марта г.);

VI Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 21-23 марта 2007 г.).

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы. Работа изложена на _ страницах, содержит _ рисунков и _ таблиц. Список литературы включает _ источников.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ ОПТИМИЗАЦИЯ ПОЛУПРОМЫШЛЕННОГО МЕТОДА ПОЛУЧЕНИЯ СТЕРИЧЕСКИ СТАБИЛИЗИРОВАННЫХ ТЕРМОЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ АКТИВНО ЗАГРУЖЕННЫХ ДОКСОРУБИЦИНОМ ЛИПОСОМ В ходе данного исследования* были оптимизированы условия для получения стерически стабилизированных липосом, активно загруженных доксорубицином, причем особое внимание было уделено простоте и технологичности разрабатываемого метода, который позволял бы нарабатывать липосомальный препарат в количествах, необходимых для доклинических и клинических испытаний, а в перспективе и для терапии.

В качестве базовой была выбрана методика загрузки с использованием градиента сульфата аммония (NH4)2SO4 (G. Haran et al., 1993). Первоначально использовалась схема, по которой спиртовой раствор липидов смешивается с водным раствором сульфата аммония, после чего спирт удаляется на роторном испарителе, в результате формируется исходная дисперсия мультиламеллярных везикул. При очевидной простоте недостатком такого подхода является необходимость заранее добавлять некоторый избыток воды, так как спирт испаряется в виде азеотропной смеси. Кроме того, некоторая часть спирта при использовании такого метода может сохраняться в липосомальной дисперсии, что неконтролируемым образом негативно влияет на степень загрузки целевого вещества. Для дисперсий, полученных с использованием данного подхода, степень загрузки колебалась от 18% до 60% при весовом соотношении субстанция/липиды 0.14. Кроме того, стабильность липосомальной дисперсии неудовлетворительна (образование агрегатов, видимых невооруженным глазом, происходит в течение первых суток хранения).

Анализ возможных причин плохой воспроизводимости методики привел к использованию следующей схемы получения исходной дисперсии. Из раствора липидов в хлороформе на роторном испарителе формируется липидная пленка, которая впоследствии высушивается в вакууме (0.04-0.05 мбар) для удаления остатков органического растворителя.

Недостаточное высушивание, как и в описанном выше случае, приводит к снижению степени загрузки целевого вещества до значений ~40%.

Использование серии циклов замораживания-оттаивания, хотя и описывается в классических методиках получения липосом как процедура, увеличивающая * В руководстве работой принимала участие доктор фармацевтических наук, академик РАЕН, проф. Оборотова Наталья Александровна. Работа выполнена совместно с лабораторией разработки лекарственных форм, НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей, ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН монодисперсность, а для некоторых веществ и эффективность включения (V. Torchilin, V.

Weissig, 2003), является при получении сравнительно больших объемов трудоемким и нетехнологичным этапом. В серии экспериментов мы показали, что в данном случае отсутствие указанной стадии не влияет ни на величину загрузки, ни на стабильность дисперсии.

Гидратацию липидной пленки проводили 250 мМ раствором сульфата аммония при механическом встряхивании выше температуры фазового перехода используемой смеси липидов (50°С). Образующаяся дисперсия однородна и легко экструдируется при нагревании выше температуры фазового перехода через ядерные поликарбонатные фильтры с размером пор 200 нм.

С целью создания градиента концентрации сульфата аммония часто используются методы, основанные на удалении невключившейся в липосомы соли, такие, как гель фильтрация и диализ, но эти процедуры требуют значительного времени. Увеличение времени отделения от невключившейся соли естественным образом снижает концентрацию соли внутри липосом за счет утечки. Гораздо более простым способом создания градиента является разбавление дисперсии моноламеллярных липосом соответствующим буфером.

Если концентрация липидов после гидратации 250 мМ раствором сульфата аммония в 20 раз превышает требуемую концентрацию в готовом препарате, то сформированный в результате двадцатикратного разбавления градиент концентрации соли составит не менее 237.5 мМ.

Сравнение эффективности загрузки показало, что для липосом данного состава применение гель-фильтрации (степень загрузки 64%) менее эффективно по сравнению с используемым методом (степени загрузки 69-72%).

Важным фактором, требующим контроля и во многом определяющим степень загрузки, является рН среды. Для разбавления дисперсии моноламеллярных везикул и проведения собственно активной загрузки брали слабощелочной буфер (10 мМ HEPES, доведенный до требуемого значения pH раствором гидроксида натрия), поскольку с уменьшением кислотности буфера увеличивается доля молекул доксорубицина, находящихся в непротонированной форме и, как следствие, способных к более легкому проникновению через липидный бислой. Однако непротонированный доксорубицин существенно хуже растворим в воде, поэтому при слишком высоком pH может выпадать в осадок, делая дальнейшую загрузку невозможной. Наиболее стабильные результаты получены для указанного буфера при pH 8.4 (т.к. для доксорубицина pKА 8.3 (D. J. Adams, 2005), при рН 8.4 более 50% субстанции будет находиться в неионизированной форме). Степень загрузки в данной серии экспериментов составила от 85% до 92% при массовом соотношении субстанция/липиды 0.2.

Заключительным этапом получения готового препарата является лиофильная сушка, поэтому в используемый буфер добавляли криопротектор (лактоза). Было показано, что присутствие лактозы снижает степень загрузки доксорубицина. Минимальное содержание этого криопротектора, которое обеспечивает качественную регидратацию данного липосомального препарата – 5%. Использование изотонического раствора лактозы (10%) снижает степень загрузки на 7-10%.

Выбор температурного режима загрузки диктовался следующими соображениями.

Проницаемость бислоя значительно увеличивается при температуре фазового перехода Tm (Рис. 1) гель–жидкий кристалл (D. Papahadjopoulos et al., 1973), однако проведение активной загрузки при этой температуре нецелесообразно, так как и скорость истечения сульфата аммония в этом случае максимальна, что приводит к быстрому уменьшению движущей силы процесса.

Проницаемость мембраны Tm Температура Жидкий Гель кристалл Рис. 1. Фазовый переход в липидном бислое (D. Needham et al., 2001).

Таким образом, представляется целесообразным проводить загрузку при температуре несколько выше температуры фазового перехода. Дисперсию липосом, загруженных сульфатом аммония, используемый для разбавления буфер и раствор доксорубицина следует нагреть до температуры загрузки (50°С), чтобы, как было указано, исключить утечку сульфата аммония из липосом в момент прохождения точки максимума проницаемости мембраны.

Флуоресцентные свойства доксорубицина позволяют оценивать высвобождение субстанции из липосом: поскольку в результате активной загрузки концентрация доксорубицина в липосомах превышает концентрацию самотушения, его высвобождение должно приводить к увеличению интенсивности флуоресценции.

Разницу в скорости высвобождения доксорубицина из термочувствительных и обычных липосом мы наблюдали в следующем эксперименте. Дисперсию отделенных от невключившегося доксорубицина липосом медленно (0.5°С/мин.) нагревали от 36°С до 45°С, фиксируя изменение интенсивности флуоресценции (Ex/Em 475 нм/590 нм) во времени, причем заметное увеличение скорости истечения доксорубицина происходит при 42.5°С (Рис. 2). Далее сравнивали интенсивность выхода доксорубицина из термочувствительных липосом, термостатируя дисперсию при 37°С или 43°С. Относительное изменение интенсивности флуоресценции через 10 мин составило 28 и 118 условных единиц по шкале прибора соответственно (Рис. 3). Таким образом, при 43°С изменение интенсивности флуоресценции дисперсии термочувствительных липосом, активно загруженных доксорубицином, более чем в 4 раза превышает изменение данного параметра при 37°С.

В контрольном эксперименте было показано, что скорость и степень высвобождения доксорубицина из нетермочувствительных липосом (ePC/Chol 7:3) при 37°С и 43°С существенным образом не отличались.

Рис. 2. Изменение интенсивности флуоресценции дисперсии термочувствительных липосом при нагревании со скоростью 0.5°С/мин.

Прямое флуориметрическое количественное определение высвободившегося доксорубицина затруднено рассеянием света в липосомальной дисперсии, а также возможной частичной ассоциацией доксорубицина с поверхностью бислоя липосом.

Определение количества вышедшего при термостатировании доксорубицина проводили с помощью колоночной гель-хроматографии. В течение 10 мин при 43°С липосомы, полученные по предложенной методике, высвобождают в раствор 31% включенной субстанции.

Рис. 3. Изменение интенсивности флуоресценции дисперсий термочувствительных липосом, термостатируемых при 43°С (а) или 37°С (б).

Средний размер термочувствительных липосом в полученной дисперсии составлял после активной загрузки доксорубицином 230-250 нм и существенно не изменялся в течение последующих двух суток, что дает достаточно времени для проведения лиофилизации.

Табл. 1. Основные характеристики полученного липосомального препарата доксорубицина.

Свойства препарата Липидный состав DPPC:DSPC:

DSPE-PEG-2000:Chol (9:1:0.02:0.2) Размер липосом 230-250 нм Размер липосом после регидратации 240-270 нм лиофилизированного препарата Концентрация доксорубицина 0.4 мг/мл Степень включения доксорубицина 85-92% Степень включения доксорубицина не менее 80% после регидратации лиофилизированного препарата Соотношение субстанция/липид 0. Регидратацию лиофилизированной липосомальной дисперсии проводили 0.9% раствором хлорида натрия. Показано, что после регидратации полученного по разработанной технологии (Рис. 4) лиофилизированного препарата размеры липосом увеличиваются незначительно и степень включения доксорубицина существенным образом не изменяется (Табл. 1).

Биологические испытания* полученной липосомальной дисперсии in vitro проводили на двух линиях клеток опухолей мышей (карциноме Эрлиха линии ELD и меланоме В-16), эффект оценивали по уменьшению скорости роста клеток. Испытания in vivo проводили на полученных из этих клеток перевиваемых опухолях, в данном случае критериями оценки служили изменение объема опухоли и продолжительность жизни животных.

Рис. 4. Схема получения препарата стерически стабилизированных термочувствительных липосом, загруженных доксорубицином.

Термолипосомы с доксорубицином оказались эффективными по критерию соотношения поражения клеток и опухолей в обычных условиях (при 37°С) и при * Биологические испытания проводились в ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН.

проведении сеанса гипертермии (42.5-43°С в течение 40-60 мин), что указывает на повышение селективности воздействия доксорубицина.

Полученные данные (Рис. 5, Рис. 6) свидетельствуют, что термочувствительные липосомы с доксорубицином обеспечивают наибольшее различие в поражении клеток in vitro при 37 и 42.5°С. Этот эффект сохраняется и in vivo, при внутривенном введении термочувствительных липосом животным с асцитной карциномой Эрлиха линии ELD (Рис. 7) и привитой меланомой В-16 (Рис. 8, Рис. 9);

действие липосомального препарата было оценено как по динамике роста опухолей, так и по продолжительности жизни животных.

Концентрация доксорубицина, мкг/мл 0,1 1 10 Липосомы Пролиферативная активность клеток, Доксорубицин в липосомах Доксорубицин % от контроля Липосомы (42.5°C) Доксорубицин (42.5°C) Доксорубицин в липосомах (42.5°C) Рис. 5. Эффективность in vitro термочувствительных липосом. На графике показано угнетение пролиферативной активности клеток мышиной карциномы Эрлиха линии ELD под воздействием ТЛ с или без доксорубицина при 37°С и при гипертермии (42.5°С) в течение 1 ч.

Как видно из Рис. 9, животные, которым ввели лиофилизированные термолипосомы без проведения сеанса гипертермии, погибли к 22-му дню после эксперимента, показав меньшую токсичность для клеток опухоли даже по сравнению с раствором доксорубицина, в то время как 4 из 7 животных, которых после введения термолипосом подвергли гипертермии, еще живы через месяц после эксперимента.

Показано также, что указанные термочувствительные липосомы сохраняют эффективность после лиофилизации (Рис. 8).

Концентрация доксорубицина, мкг/мл 0 1 10 Доксорубицин, Количество клеток/колонию 37°С Доксорубицин в,% липосомах, 37°С Доксорубицин, 42.5°С, 1 ч Доксорубицин в липосомах, 42.5°С, 1 ч Рис. 6. Относительное уменьшение пролиферативной активности клеток меланомы В 16 мышей под воздействием термочувствительных липосом с доксорубицином при гипертермии (42.5°С) в течение 1 ч.

Vt/V 100, 10, Доксорубицин ТЛ с доксорубицином ГТ, 43°C, 30 мин 1, ТЛ с доксорубицином + ГТ Контроль Доксорубицин + ГТ 0, 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Дни после гипертермии Рис. 7. Относительный рост асцитной карциномы Эрлиха линии ELD мышей после внутривенного введения доксорубицина (5 мг/кг массы тела мышей), термочувствительных липосом с доксорубицином в сочетании с гипертермией (43оС, 30 мин). V0 – исходный объем опухоли, Vt – объем опухоли на день t после сеанса гипертермии.

100, Vt/V 10, ТЛ с доксорубицином + ГТ 1, Доксорубицин Гипертермия, 43°C, 30 мин ТЛ с доксорубицином Контроль 0, 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Дни после гипертермии Рис. 8. Относительный рост меланомы В-16 мышей после однократного внутривенного введения свободного доксорубицина в дозе 4 мг/кг массы тела или в составе регидратированных лиофилизированных термочувствительных липосом с последующей гипертермией. V0 – исходный объем опухоли, Vt – объем опухоли на день t после сеанса гипертермии.

Рис. 9. Динамика гибели мышей с меланомой В-16 после локальной гипертермии (43°С, 30 мин) на фоне внутривенного введения термочувствительных липосом с доксорубицином (Д). Доза вводимого доксорубицина во всех вариантах опыта составляла 4 мг/кг. Контроль – физраствор.

СОЗДАНИЕ И ОТРАБОТКА МЕТОДИКИ ПОЛУЧЕНИЯ СТЕРИЧЕСКИ СТАБИЛИЗИРОВАННЫХ ЛИПОСОМАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ ДОКСОРУБИЦИНА С ВОЗМОЖНОСТЬЮ ИММОБИЛИЗАЦИИ ХИМЕРНЫХ БЕЛКОВ С ДОМЕНОМ БАРАНАЗЫ Препарат липосом, полученный по приведенной в предыдущем разделе технологии, обладает всеми преимуществами, связанными со стерической стабилизацией и применением механизмов контролируемого высвобождения. Следующим шагом для увеличения его эффективности может быть использование т.н. активного нацеливания, которое достигается присоединением к поверхности липосом «молекулярного адреса» — молекулы, для связывания с которой клетка-мишень имеет соответствующие рецепторы.

Существуют различные стратегии для присоединения подобного молекулярного адреса к поверхности липосом. Молекула может быть присоединена к гидрофобному якорю как непосредственно, так и через спейсер. Строение и длина спейсера очень важны, и выбираются таким образом, чтобы исключить препятствия к взаимодействию с маркером со стороны полимерных цепей, осуществляющих стерическую стабилизацию липосомы.

Широкие возможности представляют конструкции, в которых к ПЭГ-цепи присоединяют молекулу, способную образовывать прочный комплекс с соответствующим партнером, например, авидин-биотин (T. M. Allen et al., 1998) или барстар-барназа (S. M.

Deyev et al., 2003). Весьма привлекательной в этом плане является пара барстар-барназа.

Барстар (~10 кДа) – ингибитор рибонуклеазы барназы (~12 кДа), образующий с ней комплекс с константой связывания порядка 1014 М-1. В лаборатории проф. С.М.Деева (ИБХ им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова) созданы генно-инженерные конструкции, позволяющие нарабатывать как эти белки сами по себе, так и химерные, включающие наряду с аминокислотными последовательностями указанных белков последовательности одноцепочечных антигенсвязывающих фрагментов (scFv), гены репортерных бeлков (зеленого или красного флуоресцирующих белков) и т. п. Применение данного подхода позволяет создать систему доставки с высокой степенью универсальности, так как к уже готовой липосомальной дисперсии можно добавлять различные полученные генноинженерными методами белковые "молекулярные адреса" и маркеры в требуемом количественном соотношении.

Целью данной части работы была разработка технологии получения стерически стабилизированных термочувствительных липосом, загруженных доксорубицином, с блоком "универсального причаливания" – барстаром, присоединенным к липосомам через пегелированный фосфатидилэтаноламин. В дальнейшем к таким липосомам планируется присоединять фьюжн-белки: барназа-scFv к рецептору Her2-neo (сверхэкспрессия которого характерна для 60% опухолей молочной железы), барназа-флуоресцирующий белок, барназа наночастицы золота (Рис. 10).

Рис. 10. Возможные функции, присоединяемые к липосоме через комплекс барстар барназа.

Однако усложнение конструкции липосом приводит к тому, что получение липосомального препарата становится нетривиальной задачей, требующей поэтапного решения. Более того, дополнительные ограничения накладывает выбранный способ загрузки лекарственного вещества.

Высокая лабильность барстара в кислых условиях раствора (NH4)2SO4 (pH 5.5), который используется для создания градиента, обеспечивающего активную загрузку, не позволяет вводить белково-липидный конъюгат на этой стадии получения липосом. Кроме того, и на следующей стадии активной загрузки его введение невозможно. Дело в том, что основным компонентом термочувствительных липосом является DPPC, температура фазового перехода которого составляет 41.5°С. Активная загрузка возможна при температуре выше фазового перехода, однако нагревание барстара приводит к потере активности белка.

Для решения возникших проблем была выбрана следующая схема. Первоначально экструзией получают липосомы, содержащие сульфат аммония. После отделения невключившейся соли, в инертной атмосфере при нагревании к липосомальной дисперсии добавляется раствор доксорубицина и раствор, содержащий мицеллы PEG(2000)-DSPE и малеимидного производного PEG(3400)-DSPE. Таким образом, одновременно производится активная загрузка действующего вещества и инкорпорация в бислой липосом липидов с полиэтиленгликолевыми цепочками (т. н. метод "post-insertion"), осуществляющих стерическую стабилизацию и являющихся спейсером для нацеливающего белка. Важным преимуществом выбранного нами подхода является то, что белок присоединяется к соответствующим спейсерам только на следующей стадии, практически полностью оказываясь на внешней поверхности липосомального бислоя. Если же белково-липидный конъюгат вводится на стадии формирования липосом, значительная его часть (до 50%) может встроиться в бислой с внутренней стороны липосомы, тем самым делая бесполезными соответствующие молекулы ценного белка.

Следующим этапом является присоединение SH-группы белка к малеимидному производному (Рис. 11) в соответствии с методикой (T. P. Derksen et al., 1985). Белок добавляют к липосомам в деоксигенированном HBS (10 мМ HEPES-Na, 135 мМ NaCl, pH 7.4) в соотношении белок – Mal-PEG(3400)-DSPE 1:10 по молям и перемешивают 12 ч при комнатной температуре под аргоном. Непрореагировавшие малеимидные группы блокируют реакцией с избытком 2 мМ -меркаптоэтанола в течение 30 мин при комнатной температуре.

Рис. 11. Схема образования белково-липидного конъюгата на поверхности липосом.

Табл. 2. Основные характеристики полученного препарата стерически стабилизированных термочувствительных загруженных доксорубицином липосом с возможностью иммобилизации химерных белков, содержащих домен барназы.

Свойства препарата Липидный состав DPPC:

Chol:

DSPE-PEG-2000:

DSPE-PEG-3400-Mal (0.65: 0.3: 0.045: 0.005) Размер липосом 230-260 нм Концентрация доксорубицина 0.6 мг/мл Степень включения доксорубицина 98% Соотношение субстанция/липид 0. Для оценки количества связанных с липосомой молекул барстара использовали препарат коллоидного золота, в котором барназа была иммобилизована на поверхность частиц. Электронные микрофотографии (Рис. 12)* показывают значительное количество связанных с липосомой молекул барстара, однако их число меньше расчетного, что объясняется, по-видимому, как не 100% выходом реакции конъюгации, так и характерным для данного метода визуализации не полным связыванием мембранного комплекса «DSPE PEG(3400)-барсар» с комплексом «барназа-наночастицы золота».

Рис. 12. Электронная микрофотография липосомы с присоединенными мишенями (в качестве мишеней – частицы коллоидного золота, связанные с барназой).

* Электронные микрофотографии получены д.б.н. В.И.Попенко (ИМБ РАН им. В. А. Энгельгардта).

Таким образом, разработанная технология (Рис. 13) позволяет получать термочувствительные стерически стабилизированные липосомы, загруженные доксорубицином и способные присоединяться к субстанциям, несущим барназу.

Рис. 13. Схема получения термочувствительных стерически стабилизированных липосом, загруженных доксорубицином и способных присоединяться к субстанциям, несущим барназу.

ПОЛУЧЕНИЕ КОМБИНИРОВАННЫХ ЛИПОСОМАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ ВЕЩЕСТВ, РАЗЛИЧАЮЩИХСЯ ПО ПРИРОДЕ ПРОЯВЛЯЕМОЙ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТИ Еще одним методом увеличения эффективности является комбинированное применение препаратов различной природы и/или механизма действия. Перспективным, по нашему мнению, может быть одновременное применение цитотоксических и антиангиогенных субстанций. В качестве цитотоксической составляющей использовался доксорубицин, в качестве антиангиогенной — белок ангиостатин. Применение этого белка существенно замедляет рост опухоли и вызывает устойчивую ремиссию, но отмена терапии может привести к рецидиву заболевания и повторному развитию опухоли. Однако использование ангиостатина затруднено недостаточным временем жизни белка в кровеносном русле. Учитывая преимущества пассивного нацеливания и защиты от преждевременной деградации, которую обеспечивают липосомы, идея использовать липосомальный препарат ангиостатина совместно с липосомальным препаратом доксорубицина кажется привлекательной.

В рамках совместных исследований с Институтом Экологической Медицины испытывались липосомальные препараты с ангиостатином и доксорубицином для сравнения их активности с активностью растворов этих веществ in vivo.

Для биологических испытаний были приготовлены липосомальные препараты:

• Ангиостатин в липосомах: концентрация липидов 25 мг/мл, размер частиц 100 нм, концентрация ангиостатина 6 мг/мл;

• Доксорубицин в липосомах: концентрация липидов 50 мг/мл, размер частиц 100 нм, концентрация доксорубицина 0.95 мг/мл;

• Контроль – пустые липосомы, концентрация липидов 25 мг/мл, размер частиц 100 нм.

Липидный состав для всех образцов — ePC/Chol 7/3. Липосомы с доксорубицином получали активной загрузкой против градиента сульфата аммония. Дисперсию мультиламеллярных везикул получали гидратацией липидной пленки 250 мМ раствором сульфата аммония. Моноламеллярные везикулы получали экструзией через мембрану с диаметром пор 100 нм. Необходимый для загрузки градиент концентрации соли формировали гель-фильтрацией на колонке NAP 5.

Липосомы с ангиостатином получали экструзией через такие же мембраны дисперсии мультиламеллярных везикул, полученных гидратацией липидной пленки водным раствором белка.

Совместное применение двух липосомальных препаратов, полученных раздельно, предпочтительно с нескольких точек зрения:

1) Различия в методиках получения липосомальных препаратов, вызванные природой загружаемых веществ, могут существенно усложнить технологию получения препарата, частицы которого будут одновременно содержать обе субстанции.

2) Решается проблема возможной химической несовместимости действующих веществ.

3) Более гибкая методика применения, позволяющая варьировать соотношение применяемых субстанций в каждом конкретном случае.

4) Мишени используемых субстанций могут иметь различную локализацию в опухоли.

Эффективность включения веществ в липосомы определяли через сутки после получения.

Табл. 3. Эффективность включения вещества в липосомы.

Образец, срок хранения Эффективность включения, % Лс с DOX, сутки Лс с АС, сутки Испытания противоопухолевой активности полученных липосомальных препаратов проводились на мышах C57Bl/6 с привитой меланомой линии B16*. Препараты вводили внутривенно, один раз в неделю, начиная с 10-го дня после прививки опухоли. Результаты испытаний приведены в Табл. 4.

Табл. 4. Противоопухолевая активность липосомальных форм доксорубицина и ангиостатина в отношении солидных опухолей меланомы линии В16 у мышей.

ОРО, % УСПЖ, % 24 день 35 день контроль (физ. раствор) 100 100 – контроль (ненаполненные липосомы) 109.6 106.4 3. доксорубицин 59.4 64.8 24. липосомальный доксорубицин 24.0 38.9 38. липосомальный доксорубицин и 14.7 30.1 49. липосомальный ангиостатин доксорубицин и ангиостатин 46.2 60.1 31. Таким образом, на 38 день эксперимента объем опухоли у животных, для лечения которых применялся раствор доксорубицина совместно с раствором ангиостатина, на 12% меньше, чем в случае применения только доксорубицина;

тогда как объем опухоли у животных, для лечения которых применялся липосомальный доксорубицин совместно с липосомальным ангиостатином, на 30% меньше, чем в случае применения только липосомального доксорубицина (Рис. 14).

* Эксперименты проводились в Институте Экологической Медицины.

Рис. 14. Влияние исследуемых препаратов на динамику развития солидных опухолей меланомы В16 у мышей.

ВЛИЯНИЕ МОЧЕВИНЫ НА СТАБИЛЬНОСТЬ ЛИПОСОМАЛЬНОЙ ДИСПЕРСИИ Агрегационная устойчивость является актуальной проблемой при получении липосомальных дисперсий. Даже если предполагается хранение препарата в виде лиофилизата, необходимо чтобы за время, которое в производственном цикле липосомальная дисперсия ожидает лиофилизации, агрегация липосом была минимальной.

Нами было обнаружено, что использование для гидратирования липидов при получении липосом водного раствора, содержащего мочевину в концентрации от 0.1% до 5%, позволяет повысить агрегационную устойчивость формируемой липосомальной дисперсии.

Агрегационную устойчивость оценивали по относительному изменению оптической D1 D плотности = образца липосомальной дисперсии на длине волны 650 нм до (D1) и D после (D2) центрифугирования при 11000g в течение 10 мин (Табл. 5.). Очевидно, что чем меньше относительное изменение оптической плотности образца, тем более агрегационно устойчива оцениваемая дисперсия.

Табл. 5. Влияние мочевины на агрегационную устойчивость липосомальных дисперсий.

D1 D Срок Содержание = № Липидный состав D хранения мочевины, % 1 ePC/Chol 7:3 — 0. 1ч 1.5 0. 2 ePC/Chol 7:3 — 0. 3 сут 1.5 0. 3 DPPC/DSPC/Chol 9:1:0.2 — 0. 1ч 1.62 0. Кроме того, если существует необходимость лиофилизировать полученную липосомальную дисперсию, мочевина может выполнять роль криопротектора (J. P. Costanzo et al., 2005). Липосомы состава DPPC/DSPC/Chol (9:1:0.2) успешно лиофилизируются при содержании мочевины в дисперсии 1.62%.

ВЫВОДЫ 1. Разработана схема полупромышленного получения стерически стабилизированных термочувствительных липосом, загружаемых доксорубицином против градиента сульфата аммония с эффективностью не менее 85% при массовом соотношении субстанция/липиды 0.2.

2. Разработана методика, позволяющая получать стерически стабилизированный липосомальный препарат с эффективностью загрузки доксорубицина 98% при массовом соотношении субстанция/липиды 0.06 и возможностью иммобилизации на поверхности липосом в произвольном соотношении различных химерных белков, содержащих домен барназы.

3. Показано, что мочевина в концентрациях, не превышающих изотоническую, повышает агрегационную устойчивость липосомальных дисперсий различного состава, а также может быть использована в качестве криопротектора.

4. Получен комбинированный липосомальный противоопухолевый препарат. Продемонстрирована эффективность совместного применения липосомальных препаратов с различными действующими началами:

цитотоксическим (доксорубицином) и антиангиогенным (ангиостатином) при терапии опухолей.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Быков В.А., Безруков Д.А., Дигтярь А.В., Каплун А.П., Красильникова В.В., Луценко Е.В., Фельдман Н.Б., Швец В.И. Ингибитор ангиогенеза, антиангиогенная фармацевтическая композиция на его основе и способ лечения злокачественных новообразований // Патент РФ №2287341 от 01.03.2005.

2. Безруков Д.А., Баландин Т.Г., Деев С.М., Попенко В.В., Каплун А.П., Возможные подходы к конструированию сложных липосомных систем доставки лекарственных препаратов, Вестник МИТХТ. – 2006. – т. 1. – с. 14-18.

3. Безруков Д.А., Королева А.И., Каплун А.П., Ланцова А.В., Орлова О.Л., Оборотова Н.А., Оптимизация метода получения стерически стабилизированных термочувствительных липосом с активной загрузкой доксорубицином // Российский биотерапевтический журнал. – 2006. – №4. – т. 5. – с. 79-84.

4. Безруков Д.А., Королева А.И., Каплун А.П., Орлова О.Л., Оценка высвобождения доксорубицина из термочувствительных стерически стабилизированных липосом, Материалы VI Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты», Москва, 21-23 марта 2007 г. // Российский биотерапевтический журнал. – 2007. – №1. – т. 6. – с. 72.

5. Безруков Д.А., Королева А.И., Каплун А.П., Орлова О.Л., Игнатьева Е.В., Ланцова А.В., Оборотова Н.А., Модификация метода получения стерически стабилизированных термочувствительных липосом с активной загрузкой доксорубицином, Материалы VI Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты», Москва, 21 23 марта 2007 г. // Российский биотерапевтический журнал. – 2007. – №1. – т. 6. – с. 72.

6. Каплун А.П., Безруков Д.А., Родина А.В., Попенко В.И., Швец В.И., Современная наномедицина // «Наномедицина». – Специальный выпуск журнала «Нанотехника». – 2007. – приложение к №9. – с.132-145.

7. Королёва А. И., Безруков Д. А., Михайлова Н. А., Каплун А. П., Швец В. И., Способ получения липосом // Заявка на патент РФ №2007114169 от 17.04.2007.

Для заметок