Особенности экспрессии гена аполипопротеина a-i человека после его переноса в организм млекопитающего
На правах рукописи
АКИФЬЕВ
Борис Николаевич
ОСОБЕННОСТИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА АПОЛИПОПРОТЕИНА A-I
ЧЕЛОВЕКА ПОСЛЕ ЕГО ПЕРЕНОСА В ОРГАНИЗМ
МЛЕКОПИТАЮЩЕГО
Специальность 03.00.04 – Биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание учёной степени
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург 2004
Работа выполнена в отделе биохимии ГУ Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург (директор – академик РАМН Б. И. Ткаченко)
Научный руководитель:
доктор биологических наук, профессор Перевозчиков Андрей Петрович (ГУ НИИЭМ РАМН)
Официальные оппоненты:
Доктор биологических наук Иващенко Татьяна Эдуардовна Доктор биологических наук Казакова Татьяна Борисовна Ведущее учреждение Санкт-Петербургский государственный университет
Защита диссертации состоится «20» «января» 2005 г. в _ час на заседании Диссертационного совета Д001.022.03 при ГУ НИИ экспериментальной медицины РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, Каменноостровский пр., 69/71.
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГУ НИИ экспериментальной медицины РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул.
акад. Павлова, 12.
Автореферат разослан «_» «_» 2004 г.
Учёный секретарь диссертационного совета Д001.022.03, доктор биологических наук, профессор Л. В. Пучкова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы Сердечно-сосудистые заболевания, в частности ишемическая болезнь сердца (ИБС), широко распространены в развитых странах Европы и Америки и являются наиболее частой причиной смерти людей пожилого возраста. Атеросклероз - одна из главных причин ИБС – и его развитие, в свою очередь, обусловливается различными факторами риска.
Характерным показателем развития атеросклероза является снижение содержания в крови больных липопротеидов высокой плотности (ЛПВП) - «антиатерогенных» липопротеидов, и повышение содержания липопротеидов низкой плотности (ЛПНП) - «атерогенных»
липопротеидов. В работах А. Н. Климова с сотрудниками (cм. монографию (Климов А. Н.
и др., 1995)) впервые было уделено внимание антиатерогенным свойствам ЛПВП и рассмотрена возможность использования ЛПВП и их главной белковой составляющей – аполипопротеина A-I (apo A-I) в лечебных целях.
Антиатерогенные свойства человеческого apoA-I были убедительным образом продемонстрированы в экспериментах с трансгенными животными, которые приобретали устойчивость к атерогенным нарушениям стенок сосудов после трансплантации в геном человеческого гена apo A-I (Rubin E. M. et al., 1991a;
Rubin E. M. et al., 1991b;
Shemer R. et al., 1990;
Swanson M. E. et al., 1992;
Thompson L., 1992). Создание экспериментальной базы генотерапии ряда наследственных заболеваний человека и клиническая апробация этих подходов в ведущих мировых медико-биологических центрах позволили вплотную подойти к разработке аналогичных методов и для лечения других тяжёлых заболеваний, включая приобретаемые с возрастом сердечно-сосудистые болезни.
В круг проблем, общих для решения вопросов генотерапии, входит повышение эффективности и длительности работы в организме больного генетических конструкций, содержащих «лечащий» ген, а также устранение токсичности, иммуногенности, и иных побочных действий средств переноса «лечащих» генов пациенту (Culver K. W., 1994). По сути дела, решение этих проблем сводится к оптимизации используемых векторов экспрессии «лечащих» генов и к разработке эффективных средств доставки, лишенных указанных недостатков.
Эффективность генотерапевтического подхода к лечению атеросклероза путем доставки в организм млекопитающего гена apо A-I показана в исследованиях по переносу гена apo A I человека лабораторным животным с атеросклеротическими повреждениями сосудов, индуцированными холестериновой диетой (Luoma P. V., 1997;
Tsukamoto K. et al., 1997;
De Geest B. et al., 2000;
Benoit P. et al., 1999;
Tangirala R. K. et al., 1999;
Belalcazar L. M. et al., 2003). На основании полученных результатов разрабатываются схемы лечения больных атеросклерозом, находящиеся на стадии предклинических испытаний (Belalcazar L. M. et al., 2003).
Вместе с тем, следует отметить, что хотя широко используемые в настоящее время вирусные способы переноса «лечащих» генов (в рекомбинантных аденовирусах) наиболее эффективны, они не лишены побочных эффектов, главными из которых являются токсичность и иммуногенность рекомбинантных вирусов, ограничивающих их повторное использование для целей лечения. Невирусные средства доставки, несмотря на их низкую эффективность, лишены указанных недостатков и могут использоваться неоднократно, что весьма важно для лечения длительно текущих заболеваний, к которым относится и атеросклероз.
Таким образом, весьма актуальным является разработка таких подходов к генотерапии атеросклероза, при которых однократное воздействие имело бы оптимальный и продолжительный эффект и одновременно не исключало бы возможность повторения генотерапевтической процедуры. Подобный подход должен сочетать использование оптимизированных генетических конструкций и невирусных способов их доставки в организм больного.
Цель работы – сравнить различные невирусные способы переноса гена аполипопротеина A-I человека в клетки млекопитающих in vitro и in vivo и изучить особенности экспрессии гена apo A-I человека в чужеродном окружении в зависимости от его структурно функциональной организации.
Для достижения поставленной цели следовало решить следующие задачи:
1) исследовать возможности использования галактозилированного поли-L-лизина, а также катионных пептидов для переноса экспрессирующегося гена apo A-I человека в печень млекопитающих (крыс) и оценить эффективность работы этих носителей в сравнении с использовавшимися ранее;
2) применить для доставки плазмидных векторов экспрессии гена человеческого apo A-I в организм млекопитающих (мышей) метод гидродинамических инъекций «голой» ДНК и сравнить эффективность этого способа с доставкой ДНК в виде комплексов с молекулярными конъюгатами и катионными пептидами;
3) сравнить эффективность и длительность экспрессии гена человеческого apo A-I в печени мышей в зависимости от структурно-функциональной организации этого гена (наличия экзонно-интронной структуры и участков регуляции транскрипции).
Основные положения, выносимые на защиту 1. Перенос плазмидной ДНК в полиэлектролитном комплексе с галактозилированным поли-L-лизином – poly(L-lys)Gal в культивируемые клетки гепатомы человека HepG происходит рецептор-опосредованным эндоцитозом. Эффективность доставки плазмидных векторов экспрессии в комплексе с poly(L-lys)Gal в культивируемые клетки гепатомы человека HepG2 сравнима с эффективностью доставки плазмидных ДНК методом кальций-фосфатной копреципитации и зависит от молярного соотношения ДНК : poly(L-lys)Gal в комплексе.
2. Плазмидный вектор экспрессии кДНК apo A-I человека, инъецированный в комплексе с poly(L-lys)Gal в хвостовую вену крыс, доставляется в клетки печени и сохраняется в ядрах клеток в виде эписомы по меньшей мере в течение недели. Уровень apo A-I человека в крови крыс может быть повышен путём повторных внутривенных инъекций указанных комплексов.
3. Доставка векторов экспрессии гена apo A-I человека в печень мышей C57Bl/6 путём гидродинамических внутривенных инъекций соответствующих плазмидных ДНК обеспечивает высокое содержание человеческого apo A-I в сыворотке крови животных.
Уровень apo A-I человека в крови мышей может быть повышен повторными внутривенными инъекциями плазмидной ДНК.
4. Гидродинамическое введение комплексов ДНК с катионным пептидом Tat приводит к заметному снижению эффективности переноса по сравнению с введением «голой» ДНК.
5. Человеческий белок apo A-I спустя 2 недели после инъекций гена мышам не стимулировал появления специфичных антител в крови животных.
6. Динамика экспрессии гена apo A-I человека в печени мышей не зависит от типа промотора, а определяется организацией структурной части гена. Сохранение экзонно интронной структуры гена apo A-I обеспечивает эффективную и более продолжительную (до 6 месяцев) экспрессию гена в сравнении с экспрессией его кДНК-копии.
Научная новизна работы Впервые была показана возможность доставки векторов экспрессии гена apo A-I человека в организм млекопитающего путём внутривенных инъекций комплексов плазмидной ДНК с poly(L-lys)Gal, причем было установлен факт продолжительного сохранения доставленной ДНК в клетках печени в виде эписомы. В результате гидродинамических внутривенных инъекций плазмидных векторов экспрессии гена apo A-I человека мышам C57Bl/6 оказалось возможным получить длительную и эффективную экспрессию перенесённого гена в клетках печени, а за счёт повторных инъекций добиться повышения уровня apo A-I человека в крови животных.
Продолжительность и уровень экспрессии гена apo A-I человека в клетках печени мышей (в чужеродном окружении) в значительной мере определяется не видом промотора (вирусоспецифический или клеточный), а экзонно-интронной структурой кодирующей части гена, что является абсолютно новым фактом, имеющим приоритетное значение.
Научно-практическая значимость работы Полученные результаты указывают на возможность использования различных катионных носителей как основы для эффективной доставки ДНК в клетки млекопитающих. Вместе с тем, отрицательные данные, полученные по доставке путём внутривенных инъекций в организм генов-маркеров и гена apo A-I человека в комплексе с немодифицированными катионными пептидами, указывают на существование определённых факторов, ограничивающих использование этого способа для практических задач генотерапии атеросклероза. Более перспективным является способ гидродинамических инъекций «голой» ДНК, который может быть адаптирован для целей генотерапии атеросклероза в дальнейшем. Весьма важно в каждом конкретном случае учитывать также структурно-функциональную организацию доставляемого в организм гена. В нашем случае важным для продолжительной и эффективной экспрессии оказалось сохранение экзонно-интронной структуры гена apo A-I человека.
Результаты настоящего исследования могут быть использованы при разработке и реализации проекта, направленного на лечение атеросклероза путем генетической коррекции соотношения антиатерогенных и атерогенных липопротеидов в крови пациентов.
Материалы диссертации используются в курсах лекций для бакалавров и магистров кафедр эмбриологии и биохимии Санкт-Петербургского государственного университета.
Личный вклад.
Основная часть экспериментов выполнена диссертантом. Культивирование и трансфекция клеток млекопитающих выполнялись совместно с вед. н. с., к. б. н. Э. Б. Диже.
Синтез галактозилированного поли–L-лизина производился совместно со ст. инж. Б. В.
Миссюлем.
Апробация работы По теме диссертации опубликовано 4 статьи и 10 тезисов докладов и сообщений на всероссийских и международных конференциях, симпозиумах и съездах. Результаты работы докладывались на международной конференции «Human Genome» (Australia, 1999), ежегодных итоговых конференциях ПП «Геном Человека» ГНТП РФ, съездах биохимического общества России (1997, 2002 гг.), международных конференциях «СПИД, рак и родственные проблемы» (1997, 1999 гг.), международной конференции "Рецепция и внутриклеточная сигнализация" (Пущино, 1998 г.), и других конференциях.
Структура и объём диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования и их обсуждения, выводов и списка литературы. Диссертация изложена на 105 страницах текста, иллюстративный материал содержит 20 рисунков и 1 таблицу. Список литературы содержит 224 наименования, из них 210 на иностранном языке.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Материалы и объекты исследований В работе использованы реактивы фирм «Sigma» (США), «Serva» (Германия), «Pharmacia» (Швеция), «Boehringer Mannheim» (Германия), а также отчественного производства, квалификации х. ч. и ч. д. а;
ферменты для генно-инженерных работ производства «Fermentas» (Литва) и НПО «СибЭнзим» (Новосибирск).
Изотопы: [32P]дезокси-ЦТФ НПО «ГИПХ» (Санкт-Петербург), [14C]хлорамфеникол «Amersham» (Англия).
Для экспериментов in vitro использованы гепатомные клетки человека HepG2, полученные из Американской коллекции клеточных культур (ATCC) Национальных институтов здоровья (NIH) США, мышиные фибробласты линии NIH 3T3 – из банка клеточных культур Института цитологии РАН.
Для экспериментов in vivo использовались крысы (самцы) линии Wistar (массой 110 125 г), мыши линии C57Bl/6 и межлинейные гибриды C57Bl/CBA (самцы, самки) полученные из питомника «Рапполово» РАМН (Санкт-Петербург).
кДНК –копия гена apo A-I человека (capoAI) и его хромосомный вариант в составе протяженного геномного локуса, включающего 5’-регуляторный район (геномный локус более чем 5000 п. н.) – pALg – были любезно предоставлены доктором L. Chan (Baylor College, Texas, USA).
Плазмиды pCMVlacZ, pCMVcat и pCMVсapoAI, представляющие собой векторы экспрессии соответственно бактериальных генов-маркеров lacZ, cat и кДНК apo A-I человека под контролем промотора раннего гена цитомегаловируса, сконструированы методами генной инженерии и описаны ранее (Перевозчиков А. П. и др., 1994;
Курышев В.
Ю. и др., 1994).
Протяженная 5’-концевая регуляторная последовательности (-2491…+173 п.н.) гена аполипопротеина A-I человека – APOAI, и её делеционные варианты, соответствующих промотору только с гепатоцитарным энхансером SmaI…SphI (-256…+173) и Sma…StuI ( 256…+71), были сцеплены с кДНК-геном-репортером – люциферазы светляка Photinus piralis – luc. В качестве источника гена-репортера использована плазмида pGL (“Promega”). Итоговые плазмидные векторы экспрессии обозначены соответственно pAPOAIluc, pAPOAISma-Sphluc, pAPOAISma-Stuluc. Эта работа была выполнена совместно с В. Ю. Курышевым, И. А. Лапиковым, Д. А. Могиленко в лаборатории регуляции липидного обмена НИИЭМ РАМН.
Лизин-богатый пептид - YKAK8WK (К8 ) (Gottschalk S. et al., 1996) - К8 и аргинин богатый фрагмент (47-57 а.о.) трансактиваторного белка Tat (ВИЧ-1) - YGRKKRRQRRR (Tat-пептид) – были синтезированы в отделе пептидного синтеза Института высокомолекулярных соединений РАН и любезно предоставлены С. В. Буровым.
Конъюгат поли-L-лизин - десиалированный орозомукоид - poly(L-lys)ASOR, синтезированный, как описано А. П. Перевозчиковым с соавторами (Перевозчиков А. П. и др., 1997), получен от М. М. Шавловского (отдел молекулярной генетики НИИЭМ РАМН).
Синтез галактозилированного поли–L-лизина Галактозилированный поли-L-лизин -poly(L-lys)Gal, синтезировали по ранее описанной методике (Perales J. C. et al., 1994). К 2 мг гидробромида поли-L-лизина (средняя степень полимеризации 100) («Sigma», США, кат. № 7890), в 1 мл фосфатного буфера, pH 7,2, добавляли 85 мкг -D-галактопиранозилфенилизотиоцианата («Sigma»), а затем 0,1 мл 1 M Na2CO3, pH 9,0. Смесь инкубировали, периодически встряхивая, в темноте в течение 16 ч при комнатной температуре. Процент галактозилирования -аминогрупп в поли-L-лизине составил 3 – 5 %.
Трансформация бактериальных клеток, накопление и очистка плазмид, мечение препаратов ДНК Трансформацию бактериальных клеток E. coli K12 (штаммы HB101, XL1-blue) препаратами ДНК проводили методом электропорации, накопление и очистку плазмидных ДНК, мечение изолированных препаратов ДНК осуществляли в соответствии с методами, описанными Т. Маниатисом с соавторами (Маниатис Т. и др., 1984).
Образование комплексов ДНК - галактозилированный поли-L-лизин Титрование количества формирующегося комплекса ДНК - poly(L-Lys)Gal проводили следующим образом. К аликвотам плазмидной ДНК (1 мкг очищенной ультрацентрифугированием в градиенте CsCl), растворенной в 10 мкл 0,7 M NaCl, добавляли по каплям с тщательным перемешиванием возрастающие количества poly(L lys)Gal, растворенного в 0,7 M NaCl. Равные порции каждой пробы наносили в стартовые лунки дорожек 1%-ного агарозного геля и проводили электрофорез. Задержку комплексов ДНК - poly(L-lys)Gal в геле тестировали после электрофореза по стандартной методике (Wu G. Y. et al., 1987). Для трансфекции культивируемых клеток и для доставки ДНК in vivo комплексы ДНК/конъюгат готовили следующим образом: ДНК и конъюгат растворяли в равных объемах 0,4 M NaCl (концентрация ДНК- 0,5 мкг/мкл, необходимая концентрация конъюгата определяется электрофорезом) из расчета 10 мкг ДНК на растущие в чашке Петри (60 мм диаметр) клетки. Раствор конъюгата добавляли к раствору ДНК по 5-10 мкл каждые 5 минут с тщательным перемешиванием после каждого добавления для предотвращения выпадения осадка. Образовывался мутный раствор, к которому добавляли аликвоты 5M NaCl по 5-10 мкл каждые 5 мин. до концентрации 1,1 М, при этом происходило просветление раствора. Отсутствие агрегатов в растворе контролировали измерением оптического поглощения при 420 нм на спектрофотометре СФ26. Полученный комплекс использовали для трансфекции культивируемых клеток (как описано ниже), либо инъецировали внутривенно животным.
Трансфекция культивированных клеток и анализ экспрессии бактериальных генов маркеров в трансформированных клетках Клетки HepG2 и NIH 3T3 выращивали до заполнения 70% поверхности чашки Петри (диаметр 60 мм) в среде DMEM, с добавлением 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота («Gibco», США), при 37o C в CO2-инкубаторе. Трансфекцию клеток препаратами комплексов ДНК/poly(L-lys)Gal выполняли по собственной схеме (Перевозчиков А. П. и др., 1997) на основании методики, предложенной Эрбахером с соавторами (Erbacher P. et al., 1995).
Эффективность трансфекции оценивали на основании определения активности бактериальных ферментов - продуктов экспрессии генов lacZ и cat. Активность галактозидазы в клетках, трансфецированных генетической конструкцией pCMVlacZ, определяли с использованием хромогенных субстратов X-Gal или o–нитрофенил––D– галактопиранозида («Sigma») (Herbomel P. et al., 1984). Cat–тест проводили в соответствии с методикой, предложенной Горман (Горман К., 1988).
Конкурентное вытеснение адсорбированных на клеточной поверхности меченых комплексов ДНК – poly(L-lys)Gal избытками немеченого конъюгата Клетки HepG2 инкубировали в чашках Петри (диаметр 30 мм) в 1 мл среды DMEM в течение 2-х часов при 4оС с 32P-меченым комплексом poly(L-lys)Gal-pCMVlacZ в присутствии возрастающих количеств немеченых конъюгатов poly(L-lys)Gal или poly(L lys)ASOR. Через 2 часа среду удаляли из чашек, монослой клеток отмывали 1 раз чистой охлажденной средой DMEM, 3 раза DMEM с добавлением 0.5% BSA и 1 раз фосфатно солевым буфером. Во все чашки добавляли 1 мл 0.1 М NaOH и через 24 часа в аликвотах белковых экстрактов измеряли радиоактивность.
Внутривенные инъекции комплексов ДНК - poly(L-lys)Gal в хвостовую вену крысам Комплексы ДНК (pCMVcapoAI) с poly(L-lys)Gal, приготовленные как указано выше, инъецировали в хвостовую вену крыс (25 мкг ДНК на одну крысу). Умерщвление животных по окончания эксперимента проводили в соответствии с общепринятыми правилами обращения с животными (с применением анестезирующих средств).
Внутривенные инъекции плазмидной ДНК в хвостовую вену мышам Выделенные и очищенные равновесным ультрацентрифугированием в градиенте плотности CsCl плазмидные ДНК дополнительно очищали хроматографией на колонках “Minicolumn-D” (“Sigma”) и инъецировали с помощью тонкой иглы в хвостовую вену мышей, массой от 12 до 19 г (из расчета 10-20 мкг на мышь) медленно в 200 мкл растворе Рингера (или PBS), либо гидродинамическим способом: за 4-5 с в 1-3 мл раствора Рингера (в зависимости от веса мыши). Для гидродинамических инъекций непосредственно перед экспериментом отбирали группу мышей с массами ±1 грамм относительно среднего значения (mср.). Точный объем (V) вводимого раствора вычисляли по формуле, полученной на основании данных F. Liu с соавторами (Liu F. et al., 1999):
V(мл) = 0.057143 х mср + 0. Выделение ДНК из тканей животного и анализ чужеродных нуклеотидных последовательностей в составе ДНК крыс и мышей, ПЦР-анализ Ядра клеток печени выделяли центрифугированием гомогената клеток (2000хg, 20 мин, +4оC) в ступенчатом градиенте сахарозы (0,5 M- 2,2 M), осадок ядер суспендировали в гипотоническом буфере (20 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,4), низкомолекулярную ядерную (н.м.я.) ДНК изолировали по методу Хёрта, как описано Браун, Скот (Браун Э. М.
К. и др., 1989). Аликвоты н. м. я. ДНК использовали для ПЦР-анализа на содержание последовательностей, специфичных для гена apo A-I человека. Праймеры для ПЦР и ретро ПЦК подбирали с помощью программы “Primer”, разработанной В. Прутковским и О.
Сокур (НИИ гриппа РАМН, Санкт-Петербург). Внешние праймеры: прямой – 5’ CCTGGGATCGAGTGAAGGAC-3’, обратный -5’-CGTGCTCAGATGCTCGGTGG-3’ 620C);
(температура отжига внутренние (nested) праймеры: прямой - 5’ CGCCTTGGGAAAACAGCTAA-3’, обратный – 5’-GCTCCATCTCCTCCTGCCAC-3’ (температура отжига 57 C).
«Спасение» плазмидных ДНК из ядер клеток печени мышей Аликвоты н. м. я. ДНК использовали для электропорации компетентных бактериальных клеток (XL1-blue E. coli). Клоны, устойчивые к пенициллину, анализировали методом ПЦР на присутствие плазмид, содержащих ген apo A-I человека. Данные ПЦР подтверждали рестриктным анализом плазмидных ДНК, выделенных из клонов, давших положительный сигнал при ПЦР.
Статистическая обработка полученных результатов Значения ферментативных активностей представлены как среднее арифметическое не менее трёх паралелльных проб ± стандартная ошибка среднего. Достоверность различий определяли с помощью непарного t-теста. Различия рассматривались достоверными при p 0,05. Статистический анализ выполнялся с помощью программы Statistica 5.0, “StatSoft Inc”.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Использование галактозилированного poly-L-лизина для доставки ДНК в клетки гепатоцитарного ряда Применение молекулярных конъюгатов, состоящих из ковалентно связанных поликатионов, таких как поли-L-лизин или поли-L-аргинин (5-120 кД), с белками лигандами каких-либо рецепторов клеточной поверхности, основано на рецептор опосредованном эндоцитозном пути проникновения ДНК в клетки (см. обзор (Molas M. et al., 2003)). Для разработки системы доставки ДНК в клетки гепатоцитарного ряда в настоящей работе использован галактозилированный poly-L-лизин (poly(L-lys)Gal), способный специфически интернализоваться гепатоцитами через асиалогликопротеиновый рецептор (Perales J. C. et al., 1994). В работе использовали два конъюгата со степенью -аминогрупп замещения поли-L-лизина галактозными остатками 3% и 30% соответственно. Подбор молярных соотношений ДНК и poly(L-lys)Gal, необходимых для формирования комплекса, проводили методом гель-ретардации. Нейтрализация отрицательных зарядов ДНК положительными зарядами poly(L-lys)Gal достигалась при молярном соотношении ДНК : конъюгат 1 : 156. На рис. 1 представлены результаты переноса ДНК в клетки HepG2 в комплексах с poly(L-lys)Gal. Повышение степени галактозилирования поли-L-лизина с 3 до 30% не приводило к существенному возрастанию эффективности трансфекции (рис. 1а). Вместе с тем, комплексы, приготовленные в условиях избытка положительных зарядов, обеспечивали значительно более высокий уровень переноса (рис. 1а, б). На основании представленных результатов можно предположить, что увеличение молярной доли poly(L-Lys)Gal в комплексе с ДНК, приводящее к увеличению положительного заряда комплекса, способствует лучшим контактам последнего с отрицательно заряженной клеточной мембраной. Более того, в работе по изучению механизмов проникновения комплексов ДНК с катионными пептидами в клетки млекопитающих нами была предложена гипотеза, объясняющая действие избытка положительных зарядов защитой комплексов ДНК/поликатион от разрушения отрицательно заряженными протеогликанами клеточной поверхности (Ignatovich I. A. et al., 2003). Однако нам не удалось добиться ощутимой эффективности трансфекции мышиных фибробластов NIH 3T3, не имеющих асиалогликопротеиновых рецепторов, положительно заряженными комплексами pCMVlacZ/poly(L-Lys)Gal, что свидетельствует о важности лиганд-рецепторных взаимодействий для эффективной интернализации комплексов клетками. Поэтому кажется более вероятным, что эффективность трансфекции клеток HepG2 комплексами ДНК/poly(L-Lys)Gal зависит от нескольких причин - молярной доли галактозидов и наличия положительного заряда комплексов.
1, D420/мг*ч 0, 0, 0, 0, 1 5 6 :1 1 5 6 0 :1 4 6 8 0 : С о о тн о ш е н и е л и г а н д :Д Н К а б Рис. 1. Зависимость эффективности доставки генетических конструкций в клетки HepG2 в комплексе с молекулярным конъюгатом poly-L-lys-Gal от молярного соотношения конъюгат:
ДНК. Результаты измерения активности хлорамфениколацетитрансферазы (а) и -галактозидазы (б);
а: 1, 2- poly (L-lys)Gal c 3-5% замещения -аминогрупп галактозидом;
1- соотношение ДНК:конъюгат 1:1560 (положительно заряженный комплекс);
2- соотношение ДНК:конъюгат 1: (нейтральный комплекс);
3- poly(L-lys) c 30% замещения -аминогрупп галоктозидом (нейтральный комплекс);
Хф.- хлорамфеникол;
Ац. Хф.- ацетилированные формы хлорамфеникола;
б: poly (L lys)Gal c 3-5% замещения -аминогрупп галактозидом. Соотношения конъюгат : ДНК указаны на диаграмме.
Для доказательства специфичности связывания комплексов ДНК/poly(L-lys)Gal c асиалогликопротеиновыми рецепторами клеток HepG2 были проведены эксперименты по конкурентному вытеснению при 4oC ассоциированных с клеточной мембраной комплексов, содержащих 32P- меченую плазмидную ДНК, возрастающими избытками комплексов ДНК/ poly(L-lys)ASOR либо ДНК/poly(L-lys)Gal (рис. 2). Асиалоорозомукоид (ASOR) – типичный асиалогликопротеин, избирательно взаимодействующий с асиалогликопротеиновыми рецепторами (Wu C. H. et al., 1989;
Cristiano R. J. et al., 1995).
Предполагалось проверить способность комплексов на основе обоих конъюгатов связываться с одним и тем же типом рецепторов. В этих экспериментах использовали электрически нейтральные комплексы для предотвращения их неспецифической сорбции на отрицательно заряженной клеточной мембране. Представленные результаты Рис. 2. Специфичность связывания P-ДНК, имп/мин комплексов ДНК/конъюгат асиалогликопротеиновыми рецепторами клеток HepG2.
Треугольниками обозначена конкуренция с poly(L-lys)Gal, Квадратами обозначена конкуренция с poly(L-lys)ASOR.
0 20 40 60 80 100 120 140 Молярные избытки конъюгата свидетельствуют об эффективной конкуренции комплексов ДНК/poly(L-lys)Gal и ДНК/poly(L-lys)ASOR с меченым комплексом ДНК/poly(L-lys)Gal за связывание с клетками HepG2 и, таким образом, подтверждают специфичность взаимодействия комплексов ДНК/poly(L-lys)Gal с асиалогликопротеиновыми рецепторами клеток (Perales J. C. et al., 1994).
Возможность продолжительной экспрессии экзогенных генов после переноса в комплексах с poly(L-lys)Gal в печени лабораторных животных проверяли с помощью инъекций комплексов вектора экспрессии кДНК гена apo A-I человека под контролем промотора CMV (pCMVcapoAI) с poly(L-lys)Gal в хвостовую вену крыс линии Wistar. Трем группам крыс (по 5 штук) вводили обычной инъекцией в хвостовую вену комплексы pCMVcapoAI/poly(L-lys)Gal. Крысам первой группы проводили инъекцию однократно в начале эксперимента (на первый день);
крысам второй группы инъекции делали через день, всего 4 инъекции. Крысам третьей группы комплексы ДНК/конъюгат вводили на 6-й день эксперимента. В качестве контрольной группы использовались интактные крысы. Через дней после начала эксперимента животных забивали. Адресованная доставка комплексов в печень крысы подтверждалась анализом ДНК разных тканей крысы методом ПЦР.
Нуклеотидная последовательность гена apo A-I человека была идентифицирована в составе крысиной ДНК, выделенной из клеток печени, но не из клеток тонкого кишечника, легких или сердца. Об экспрессии гена apo A-I в клетках печени крыс судили по содержанию человеческого apo A-I в сыворотке крови 3-х групп животных (табл. 1). В результате однократной инъекции комплексов pCMVcapoAI/poly(L-Lys)Gal человеческий белок сохраняется в сыворотке крови крыс, по меньшей мере неделю, а скорее всего более продолжительное время, поскольку повторные инъекции приводили к повышению уровня apo A-I человека в крови крыс. Вместе с тем следует отметить, что уровень наведённого в крови apo A-I человека был невысоким, кроме того, наблюдались значительные различия в уровне apo A-I человека в сыворотках отдельных животных.
Для доказательства эписомной локализации гена apo A-I человека в печени инъецированных крыс мы провели эксперименты по «спасению» плазмид из низкомолекулярной ДНК, изолированной по методу Херта из ядер клеток печени инъецированных животных, в клетках E. coli. Ген apo A-I человека в составе плазмид, изолированных из бактериальных клонов, выросших после трансформации компетентных клеток E. coli н. м. я. ДНК определяли методом ПЦР с использованием специфичных праймеров (рис. 3). Как видно из представленных результатов, нуклеотидная последовательность, специфичная для гена apo A-I человека, присутствует в плазмидах, «спасенных» из ядер клеток печени инъецированных крыс. Следовательно, полученные данные свидетельствуют о длительном (по меньшей мере, в течение 8 дней) сохранении pCMVcapoAI в в эписомах. ядер клеток печени инъецированных крыс.
Таблица. 4. Иммуноферментное определение белка apo A-I человека в сыворотке крови крыс после введения им функционального гена apo A-I человека в комплексе с конъюгатом poly(L-lys)Gal Крысы №№ 1–5 6 – 10 11 – 15 16, I группа II группа III группа Число инъекций 1 4 1 Контроль (1-й день (1-й, 2-й, 4-й, 6-й дни (6-й день эксперимента) эксперимента) эксперимента) Apo A-I человека в сыворотке крови 10 - 50 70 – 120 20 – 60 крыс, нг/мл Рис. 3. Результаты PCR по определению содержания гена apo A-I человека (фракции, отмеченные стрелкой слева от электрофореграммы) в плазмидах, выросших после трансформации бактериальных клеток с помощью н. м. я.
ДНК, выделенной из печени опытных крыс: 1-10 – номера образцов плазмид, соответствующих номерам крыс. - ДНК фага, гидролизованная рестриктазой PstI, K- и K+ - отрицательный и положительный контроли ПЦР соответственно.
Использование лизин-богатых и аргинин-богатых пептидов для доставки ДНК в клетки млекопитающих В литературе имеются указания об использовании катионных пептидов (в частности, обогащенных L-лизином) для доставки генетических конструкций в клетки млекопитающих. В настоящей работе использовались два катионных пептида - лизин богатый – K8 и аргинин-богатый - Tat-пептид (см. раздел «Материалы и методы»).
Результаты по трансфекции культивуемых клеток гепатомы человека HepG2 комплексами плазмидных векторов экспрессии генов cat и lacZ c лизин-богатым пептидом K8 и аргинин богатым пептидом Tat представлены на рис. 4.
Рис. 4. Сравнение эффективности трансфекции клеток HepG2 комплексами 0, pCMVlacZ/катионный пептид в 0, зависимости от вида пептида и D420/мг*ч 0, соотношения электрических зарядов в 0, комплексах. По оси ординат – активность 0, продукта экспрессии гена lacZ 0, галактозидазы в клетках, 0, трансфецированных комплексами 0, ДНК/пептид. По оси абсцисс – варианты использованных пептидов (в скобках указано K (1:1) 8 K (1:5) 8 TA (1:1) T TA (1:5) T соотношение зарядов ДНК и пептида).
В обоих случаях эффективность трансфекции значительно увеличивалась при использовании комплексов, приготовленных в условиях пятикратного избытка положительных зарядов пептидов относительно отрицательных зарядов ДНК. Вместе с тем, в предыдущей работе мы показали, что максимально возможный избыток Tat-пептида в составе комплекса не превышает 1.7-кратного (Ignatovich I. A. et al., 2003). По-видимому, стимулирующее действие свободного Tat-пептида на эффективность трансфекции комплексами ДНК/Tat обеспечивается защитой комплексов от разрушения отрицательно заряженными протеогликанами клеточной поверхности, опосредованной свободным Tat пептидом. В наших дальнейших исследованиях было показано, что комплексы ДНК c катионными пептидами, инъецированные в хвостовую вену мышей обычным образом (медленно, в количествах до 20 мкг и в малых объёмах, не превышающих 100 мкл) не приводили к сколько-нибудь заметному появлению apo A-I человека в сыворотке крови животных (период наблюдения 12-72 ч). На основании полученных результатов можно прийти к заключению, что несмотря на высокую эффективность применения катионных пептидов для доставки ДНК в культивируемые клетки, эти катионные пептиды в обычных условиях не могут быть использованы для доставки ДНК in vivo, в кровяное русло.
Вероятно, эффективной доставке ДНК в комплексе с катионными пептидами в клетки печени, при инъкции комплексов в кровь препятствуют взаимодействие пептидов с белками крови, например, с сывороточным альбумином (Ignatovich I. A. et al., 2003).
Экспрессия гена apo A-I человека в печени после доставки его мышам методом внутривенных гидродинамических инъекций Наиболее эффективным невирусным средством доставки генов в организм млекопитающих из известных на сегодняшний день является метод гидродинамических инъекций (Liu F. et al., 1999). Мы воспользовались этим методом также ещё и потому, что благодаря высокой эффективности экспрессии в печени перенесённого этим методом гена, можно изучать особенности его регуляции и, в частности, провести оптимизацию вектора экспрессии гена apo A-I человека. Для гидродинамического переноса были испрользованы плазмидные ДНК, представляющих собой векторы экспрессии кДНК apo A-I, под контролем промотора CMV (pCMVcapoAI), либо природный хросомомный локус (хромосомный ген под собственным промотором APOAIapoA-I) – pAlg. На рис. 5 представлены результаты иммуноферментного определения в сыворотке крови мышей человеческого apo A-I после гидродинамических инъекций в хвостовую вену животным (мыши C57Bl/6) двух различных плазмидных векторов экспрессии apo A-I: pCMVсapoAI и pAlg. При инъекциях pCMVсapoAI человеческий apo A-I выявлялся в сыворотке крови мышей спустя сутки после инъекции, тогда как в случаях инъекции вектора экспрессии хромосомного гена (pAlg) человеческий белок появлялся не сразу, а лишь на третьи сутки.
Содержание человеческого apo A-I в сыворотке мышей (нг/мл) 1 2 3 5 7 9 14 Д ни после инъ екций Рис. 5. Динамика уровня apo A-I в крови мышей после внутривенных гидродинамических инъекций плазмидных векторов экспрессии: кДНК-гена apo A-I (pCMVсapoA1) или хромосомного гена apoA1 (pAlg) по 20 мкг на животное. Мыши– C57BL/6 (самцы). По оcи ординат – содержание в сыворотке apo A-I человека;
по оси абсцисс – дни измерений apo A-I человека в сыворотке мышей;
светлые столбцы – после инъекций pCMVcapoAI;
тёмные столбцы после инъекций pAlg.
Динамика содержания человеческого белка в крови также существенно зависела от вида инъецируемых плазмид. Гидродинамические инъекции pCMVсapoAI вели к выявлению максимальных значений человеческого apo A-I в сыворотке крови мышей на первые сутки с последующим постепенным снижением его содержания практически до нулевых значений к концу второй недели. В то же время, содержание apo A-I человека в крови мышей, после инъекций pAlg, постепенно нарастало, достигая максимальных значений на 5-7 сутки и затем постепенно снижалось. Максимальный уровень человеческого apo A-I в сыворотке крови мышей, индуцированный при внутривенных инъекциях pAlg, был достоверно сопоставим и даже превышал таковой, при инъекциях мышам конструкции pCMVcapoAI (рис. 5). Повторные инъекции pCMVсapoAI с интервалом в двое-трое суток ненадолго поддерживают уровень Apo A-I человека в крови мышей, но не способствуют повышению этого уровня (рис. 6a). Напротив, повторные инъекции pAlg, вводимого в небольших количествах (по 10-20 мкг на мышь), ведут к постепенному повышению уровня человеческого белка apo A-I в сыворотке крови мышей (рис. 6б). Способность pAlg, в 2, Содержание apo A-I человека в Содержание apoA1 человека в 2, сыворотке мышей, мкг/мл сыворотке мышей, мкг/мл 1, 1, 1 0, 0, 1 2 1 2 а б Рис. 6. Эффект повторных гидродинамических инъекций в хвостовую вену мышей C57BL/ pCMVcapoAI (а) и pAlg (б) на содержание ApoA-I человека в сыворотке крови крыс;
а- 1- одна инъекция, анализ через 24 ч;
2- две инъекции с интервалом трое суток, анализ через 24 ч;
3- одна инъекция, анализ через 12 суток;
б- 1– одна инъекция;
2- две инъекции (с интервалом через три дня), анализ через трое суток после последней инъекции;
3- три инъекции (с интервалом двое суток), анализ через трое суток после последней инъекции.
отличие от pCMVсapoAI, длительное время обеспечивать высокий уровень экспрессии гена apo A-I определяется либо сохранением экзон-интронной структуры гена в случае pAlg, либо использованием в pAlg собственных регуляторных районов, в отличие от вирусного промотора CMV.
С целью прояснения этого вопроса мы провели гидродинамические инъекции мышам генетических конструкций pSmaluc и pSmaStuluc, содержащих ген-репортер, кодирующий люциферазу, под контролем 5’-регуляторной области гена apo A-I человека.
Использованные генетические конструкции отличались лишь протяженностью 3’-концевых участков регуляторной области apo A-I. Результаты экспериментов приведены на рис. 7.
Оказалось, что активность люциферазы в гомогенатах печени всех инъецированных животных максимальна на первые сутки после инъекций и уже на третьи сутки после инъекций падает в сто раз. Следовательно, собственный промотор гена apo A-I, включающий гепатоцитарный энхансер, не в состоянии обеспечить длительную экспрессию в печени сцепленной с ним кДНК –копии гена люциферазы - luc. Полученные результаты указывают на роль экзонно-интронной структуры в поддержании продолжительной экспрессии гена после переноса гидродинамическим методом в переживающих (неделящихся) клетках, к каким относятся клетки печени млекопитающих.
Рис. 7. Активность люциферазы в печени мышей 1 000 000, после переноса векторов экспрессии 1 сутки люциферазы под контролем промотора гена apo 3 суток 100 000, A-I человека гидродинамическим методом: серые 10 000, столбцы отображают активность люциферазы через RLU 24 ч после инъекций мышам pAPOAISma-Stuluc 1 000, (pSmaStuluc) и pAPOAISma-Stuluc (pSmaluc);
белые 100, столбцы отображают активность люциферазы через 10, 72 ч после инъекций мышам тех же генетических конструкций.
1, pSmaStuluc pSmaluc Нельзя исключить, что полученные результаты могут объясняться не только угнетением экспрессии кДНК-гена люциферазы (под контролем промотора APOAI) или кДНК apoA-I (под контролем промотора CMV), но также и элиминацией (деградацией) собственно плазмидных векторов экспрессии вследствие особенностей их конструкций (отсутствия экзонно-интронной структуры) (De Geest B. et al., 2000). Для прояснения вопроса были проведены эксперименты по выявлению плазмид двух указанных типов в составе низкомолекулярной ядерной ДНК (не входящей в состав хромосом) гепатоцитарных ядер после инъекции мышам плазмид pCMVcapoAI и pAlg. На рис. 8 представлены результаты выявления гена apo A-I человека в низкомолекулярной ДНК, выделенной из ядер печени инъецированных мышей (рис. 8а), а также рестриктного анализа плазмидной ДНК, выделенной из бактериального клона, полученного в результате экспериментов по «спасению» инъецированных генетических конструкций (см. «Материалы и методы») (рис.
8б). Видно, что сигнал, соответствующий присутствию копии гена apo A-I человека в низкомолекулярной ДНК ядер мыши, которой была инъецирована pCMVcapoAI, по истечению 50 дней уже отсутствует, в то время как он выявляется в составе низкомолекулярных ядерных ДНК мыши, инъецированной pAlg (рис. 8а). Рестриктный анализ «спасённых» плазмид подтверждает сохранение pAlg в эписомном состоянии в ядрах печени мышей (рис. 8б).
Таким образом, на основании выполненной работы можно заключить следующее:
• Использование невирусных средств доставки гена аполипопротеина A-I человека в клетки млекопитающих, таких как компактный молекулярный конъюгат галактозилированный poly(L-Lys) и катионные пептиды (K8 и Tat) позволяет прийти к выводу, что если in vitro они имеют сравнимый эффект в доставке генов, то in vivo эффективным оказывается лишь галактозилированный poly(L-Lys)Gal, обеспечивающий поглощение комплексов ДНК/poly(L-Lys)Gal клетками печени рецептор-опосредованным эндоцитозом.
а б Рис. 8. Эписомная локализация гена apo A-I человека в ядрах гепатоцитов мышей после гидродинамических инъекций pAlg в хвостовую вену мышей: a- ПЦР-анализ н. м. я. ДНК, выделенных из печени мышей через 50 дней после инъекций: 1- ДНК фага, гидролизованная PstI (маркер молукулярных масс);
2- ПЦР с pAlg (положительный контроль);
3- ПЦР с н. м. я. ДНК, выделенной из ядер клеток печени интактной мыши (отрицательный контроль);
4- ПЦР с н. м. я.
ДНК, выделенной из ядер клеток печени мыши, :инъецированной pAlg, через 50 дней после инъекции;
5- ПЦР с н. м. я. ДНК, выделенной из ядер клеток печени мыши, инъецированной pCMVcapoAI, через 50 дней после инъекций. Стрелкой отмечен специфический фрагмент, соответствующий геномной последовательности гена apo A-I человека;
б- рестриктный анализ «спасенной» в бактериальных клетках плазмидной ДНК, выделенной из ядер клеток печени мыши, инъецированной pAlg, через 50 дней после инъекции. Стрелками отмечены фрагменты, соответствующие расщеплению pAlg ферментом EcoRI.
• В сравнении с использованным в ранних работах молекулярным конъюгатом poly(L-Lys)ASOR, галактозилированный poly(L-Lys)Gal обусловливает продолжительное сохранение в ядрах гепатоцитов генетических конструкций, хотя в наших условиях уровень человеческого аполипопротеина A-I был выше в случае применения poly(L-Lys)ASOR, чем в случае применения poly(L-Lys)Gal (Перевозчиков и др., 1997). Дальнейшая оптимизация этого способа доставки может привести к более значимым результатам, что даст возможность использовать его для генетической коррекции атеросклероза.
• Более перспективным для этих целей может оказаться способ гидродинамических инъекций «голой» ДНК, представляющей собой плазмидный вектор экспрессии гена apo A-I, поскольку существуют модификации этого метода, использующие инъекции генов при локальном повышении давления. Однократная инъекция плазмидного вектора экспрессии pAlg приводила к появлению apo A-I человека в сыворотке крови мышей в концентрации 5-20 мкг/мл. Мы установили, что повторные инъекции повышают уровень apo A-I в крови вследствие продолжительной работы генетической конструкции в клетках печени. Полученные в нашей работе результаты указывают на важность экзонно-интронной структуры гена apo A-I для эффективной и продолжительной экспрессии этого гена. Нельзя исключить роли в этих процессах также и участков 5’-регуляторной последовательности гена apo A-I, хотя вариант этой 5’-регуляторной последовательности включающий гепатоцитарный энхансер, сцепленный с кДНК гена-маркера, не в состоянии обеспечить продолжительную экспрессию этого гена в печени мышей. Полученные результаты поднимают вопрос о роли пост транскрипционного созревания в экспрессии генов эукариот и в частности его роли в формировании полноценного продукта экспрессии гена apo A-I. Результаты доставки векторов экспрессии гена человеческого аполипопротеина A-I лабораторным животным методом гидродинамических внутривенных инъекций дают в руки исследователя новый инструмент для исследования in vivo условий эффективной и продолжительной экспрессии гена в чужеродном окружении, определяемой свойствами самой генетической конструкции. Свободные от каких бы то ни было средств доставки, плазмидные векторы экспрессии работают в клетках без помех, создаваемых в результате реакции клеток на носители этих конструкций.
ВЫВОДЫ 1) Перенос плазмидной ДНК в полиэлектролитном комплексе с галактозилированным поли-L-лизином - poly(L-lys)Gal, в культивируемые клетки гепатомы человека HepG происходит рецептор-опосредованным эндоцитозом.
2) Эффективность доставки плазмидных векторов экспрессии генов в комплексе с poly(L lys)Gal в клетки HepG2 зависит от молярного соотношения конъюгата и ДНК в комплексе.
3) Плазмидный вектор экспрессии кДНК apo A-I человека в комплексе с poly(L-lys)Gal, инъецированный в хвостовую вену крыс, переносится в клетки печени и сохраняется в ядрах этих клеток в виде эписомы по меньшей мере в течение недели.
4) Доставка «голых» плазмидных векторов экспрессии гена apo A-I человека в печень мышей C57Bl/6 с помощью гидродинамических инъекций плазмидных ДНК в хвостовую вену мышей приводит к наиболее высокому содержанию человеческого apo A-I в сыворотке крови животных. Уровень apo A-I человека в сыворотке мышей после первоначальной инъекции также может быть повышен повторными гидродинамическими инъекциями плазмидных векторов экспрессии этого гена.
5) Перенос плазмидных векторов экспрессии гена apo A-I в комплексе с катионным пептидом - копией катионного фрагмента белка Tat вируса иммунодефицита человека (Tat-пептида) путем инъекций комплексов в хвостовую вену мышей C57Bl/6, выполненных гидродинамическим методом, ведет к более низким значениям apo A-I человека в сыворотке в сравнении с тем, что достигается при гидродинамических инъекциях аналогичных «голых» плазмид, в то время как инъекция указанных комплексов, выполненная обычным способом, дает отрицательный результат.
6) Продолжительная экспрессия гена apo A-I человека в клетках печени мыши (до месяцев) обусловливается сохранением экзонно-интронной структуры этого гена, но не типом промотора (клеточный или вирусоспецифический), контролирующего его экспрессию.
7) Человеческий белок apo A-I спустя две недели после инъекций плазмидного вектора экспрессии гена мышам C57Bl/6 не стимулировал появления специфичных к нему антител в крови животных.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Перевозчиков А. П., Диже Э. Б., Шавловский М. М., Курышев В. Ю., Парфенова Н. С., Баранов Д. Н., Акифьев Б. Н., Суконина В. Е., Лапиков И. А., Асеев М. В.
Адресованная доставка генов в культивируемые гепатомные клетки и в печень крысы // Материалы 5-й международной конференции "СПИД, рак и родственные проблемы", 25-30 мая 1997 г., г. Санкт-Петербург, Россия // Русский журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы, 1997, Т. 1, № 1, С. 256.
2. Перевозчиков А. П., Шавловский М. М., Диже Э. Б., Парфенова Н. С., Суконина В. Е., Синогеева Н. И., Курышев В. Ю., Акифьев Б. Н., Денисенко А. Д. Экспрессия гена аполипопротеина A-I человека и бактериальных генов-маркеров, доставленных в культивируемые гепатомные клетки и в печень крысы в виде комплексов с молекулярными конъюгатами // Тезисы сообщений, II-го съезда биохимического общества РАН, 19-23 мая 1997, Москва, Пущино, 1997, часть I, С. 153.
3. Шавловский М. М., Синогеева Н. И., Перевозчиков А. П., Диже Э. Б., Акифьев Б. Н., Баранов В. С., Баранов А. Н., Остапенко О. В., Гайцхоки В. С. Белки-лиганды клеточных рецепторов и тканеспецифическая доставка экспрессируемых рекомбинантных генов // Международная конференция "Рецепция и внутриклеточная сигнализация", 21-25 сентября 1998 г, Пущино. Сборник трудов, 1998, С. 169-171.
4. Перевозчиков А. П., Диже Э. Б., Шавловский М. М., Серов С. М., Баранов Д. Н., Миссюль Б. В., Акифьев Б. Н., Синогеева Н. И., Кидготко О. В., Суконина В. Е., Лапиков И. А. Направленная доставка антиатерогенного гена аполипопротеина A-I человека in vivo в печень экспериментальных животных и in vitro в культивируемые клетки гепатомы человека. // Тезисы 9-ой итоговой конференции "Геном человека-99", 2-5 февраля 1999 г., г. Черноголовка, М., 1999, С. 126-127.
5. Perevozchikov A. P., Dizhe E. B., Shavlovski M. M., Missuil' B. V., Akif'ev B. N., Kidgotko O. V., Sinogeeva N. I., Sukonina V. E., Bogdanova M. A. Receptor-mediated human apolipopritein A-I gene delivery into a rat liver by intravenous injections of soluble DNA molecular conjugate complexes // Human Genome Meeting, Brisbane, Australia, March 27-30, 1999, Abst. №. 192.
6. Perevozchikov A. P., Dizhe E. B., Shavlovskij M. M. Missyuil’ B. V. Akif'ev B. N., Kidgotko O. V., Orlov S. V., Sukonina V. E., Bogdanova M. A. Продолжительная экспрессия гена аполипопротеина A-I, доставленного в печень крысы путем внутривенной инъекции комплексов: ДНК-молекулярный коньюгат // Материалы 7-й международной конференции "СПИД, рак и родственные проблемы", 24-28 мая 1999 г., г. Санкт Петербург, Россия // Русский журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы, 1999, Т. 3, № 1, С. 174-175.
7. Sinogeeva N. I., Shavlovskij M. M., Baranov V. S., Baranov A. N., Ostapenko O. V.
Perevozchikov A. P., Dizhe E. B., Akifiev B. N., Gaitskhoki V. S. Tissue specific administration of reporter genes by injecting complexes of protein conjugates with DNA. // Bone Marrow Transplantation (supplement), 1999, p. 89-90.
8. Перевозчиков А. П., Диже Э. Б., Миссюль Б. В., Акифьев Б. Н., Шавловский М. М., Орлов С. В., Кидготко О. В,, Суконина В. Е. Направленная доставка гена аполипопротеина А-I человека в клетки млекопитающих in vito и in vivo // Сборник отчетов программы «Геном человека» за 1999 г., М., ВИНИТИ, 2000, С. 171-174.
9. Ignatovich I. A., Dizhe E. B., Burov S. V., Akifiev B. N., Perevozchikov A. P. Suicide effect of herpesvirus thymidine kinase gene delivered into human hepatoma cells in complex with oligopeptides // Nature Genetics, 2001, V. 27, P. 61.
10. Диже Э. Б., Акифьев Б. Н., Миссюль Б. В., Орлов С. В., Кидготко О. В., Суконина В. Е., Денисенко А. Д., Перевозчиков А. П. Рецептор-опосредованный перенос комплексов ДНК-галактозилированный поли-L-лизин в клетки млекопитающих in vitro и in vivo // Биохимия, 2001, Т. 66, №1, С. 71-79.
11. Акифьев Б. Н., Олейникова Г. Н., Буров С. В., Денисенко А. Д., Перевозчиков А. П., XII. Влияние способа доставки и свойств генетической конструкции на уровень и продолжительность экспрессии гена аполипопротеина A-I человека в организме мышей // Тезисы докладов III съезда Всероссийского биохимического общества 26. 06-01. 2002 г, СПб,, 532.
12. Игнатович И. А.,. Диже Э. Б, Акифьев Б. Н., Буров С. В., Боярчук Е. А., Перевозчиков А. П. Доставка «суицидного» гена тимидинкиназы вируса герпеса в комплексе с катиоными олигопептидами в опухолевые клетки человека // Цитология, 2002, Т. 44, №.
5, С. 455-462.
13. Ignatovich I. A., Dizhe T. B., Pavlotskaya A. V., Akifiev B. N., Burov S. V., Orlov S. V., Perevozchikov A. P., Complexes of plasmid DNA with basic domain 47-57 of the HIV-1 Tat protein are transferred to mammalian cells by endocytosis-mediated pathways // J. Biol.
Chem., 2003, V. 278, N 43, P. 42625- 14. Акифьев Б. Н., Диже Э. Б., Ефремов А. М., Могиленко Д. А., Олейникова Г. Н., Лапиков И. А., Жданова О. Ю., Кидготко О. В., Орлов С. В., Перевозчиков А. П.
Перенос гена аполипопротеина A-I человека мышам методом гидродинамических инъекций: факторы, влияющие на эффективность и продолжительность экспрессии гена в печени животного // Мол. биол., 2004, Т. 38, № 6, С. 1-10.
ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА 1. Браун, Э. М. К., М. Р. Д. Скотт. 1989. Ретровирусные векторы, в книге Новое в клонировании ДНК.
Методы, под ред. Д. Гловер, Мир, Москва. С. 272-307.
2. Горман, К. 1988. Высокоэффективный перенос генов в клетки млекопитающих, в книге Клонирование ДНК. Методы под ред. К. Гловер, Мир, Москва С. 409-463.
3. Климов А. Н., Никульчева Н. Г. 1995. Липиды, липопротеиды и атеросклероз. Питер Пресс, СПб.
4. Курышев В. Ю., Драпчинская Н. Л., Царапкина Е. В., Савинова О. В., Воробьев Е. В., Диже Э. Б., Денисенко А. Д., Перевозчиков А. П. 1994. Бюлл. эксп. биол. мед. 118:479-482.
5. Маниатис, Т., Э. Фрич, Дж. Сембрук. 1984. Молекулярное клонирование. Методы генетической инженерии. Мир, Москва.
6. Перевозчиков А. П., Курышев В. Ю., Арредуани М., Парфенова Н. С., Шавловский М. М., Суконина В. Е., Диже Э. Б., Орлов С. В., Денисенко А. Д., Гайцхоки В. С., Климов А. Н. 1997.
Доклады РАН 352:571-574.
7. Перевозчиков А. П., Серов С. М., Насонкин И. О., Курышев В. Ю., Царапкина Е. В., Балоян Л. Н., Диже Э. Б., Мазуров В. И.. 1994. Доклады РАН 335:646-649.
8. Belalcazar L. M., Merched A., Carr B., Oka K., Chen K. H., Pastore L., Beaudet A., and Chan L. 2003.
Circulation 107:2726-2732.
9. Benoit P., Emmanuel F., Caillaud J. M., Bassinet L., Castro G., Gallix P., Fruchart J. C., Branellec D., Denefle P., and Duverger N. 1999. Circulation 99:105-110.
10. Cristiano R. J. and Roth J. A. 1995. J Mol Med 73:479-486.
11. Culver K. W. 1994. Gene Therapy, Handbook for Phisicians. M.-A. Liebert Publ, 12. De Geest B., Stengel D., Landeloos M., Lox M., Le G., Holvoet P., and Ninio E. 2000.
Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol. 20:E68-E 13. De Geest B., Van Linthout S., Lox M., Collen D., and Holvoet P. 2000. Hum.Gene.Ther. 11:101-112.
14. Erbacher P., Roche A. C., Monsigny M., and Midoux P. 1995. Bioconjug Chem 6:401-410.
15. Gottschalk S., Sparrow J. T., Hauer J., Mims M. P., Leland F. E., Woo S. L., and Smith L. C. 1996. Gene Ther 3:48-57.
16. Herbomel P., Bourachot B., and Yaniv M. 1984. Cell 39:653-662.
17. Ignatovich I. A., Dizhe E. B., Pavlotskaya A. V., Akifiev B. N., Burov S. V., Orlov S. V., and Perevozchikov A. P. 2003. J Biol Chem 278:42625-42636.
18. Liu F., Song Y., and Liu D. 1999. Gene Ther 6:1258-1266.
19. Luoma P. V. 1997. Pharmacol.Toxicol. 81:57-64.
20. Molas M., Gomez_Valades A. G., Vidal_Alabro A., Miguel_Turu M., Bermudez J., Bartrons R., and Perales J. C. 2003. Curr Gene Ther 3:468-485.
21. Perales J. C., Ferkol T., Beegen H., Ratnoff O. D., and Hanson R. W. 1994. Proc Natl Acad Sci U S A 91:4086-4090.
22. Rubin E. M., Ishida B. Y., Clift S. M., and Krauss R. M. 1991a. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 88:434-438.
23. Rubin E. M., Krauss R. M., Spangler E. A., Verstuyft J. G., and Clift S. M. 1991b. Nature 353:265-267.
24. Shemer R., Walsh A., Eisenberg S., Breslow J. L., and Razin A. 1990. J.Biol.Chem. 265:1010-1015.
25. Swanson M. E., Hughes T. E., Denny I. S., France D. S., Paterniti J. R., Tapparelli C., Gfeller P., and Burki K. 1992. Transgen.Res. 1:142-147.
26. Tangirala R. K., Tsukamoto K., Chun S. H., Usher D., Pure E., and Rader D. J. 1999. Science 258:744-746.
27. Tsukamoto K., Hiester K. G., Smith P., Usher D. C., Glick J. M., and Rader D. J. 1997. J. Lipid Res.
38:1869-1876.
28. Wu C. H., Wilson J. M., and Wu G. Y. 1989. J Biol Chem 264:16985-16987.
29. Wu G. Y. and Wu C. H. 1987. J Biol Chem 262:4429-4432.
Данное исследование поддержано грантом РФФИ №04-04-48683.