Восьмигемовые нитритредуктазы из галоалкалофильных бактерий рода thioalkalivibrio: каталитические свойства, структура, механизм адаптации

на правах рукописи

Тихонов Алексей Владимирович

ВОСЬМИГЕМОВЫЕ НИТРИТРЕДУКТАЗЫ ИЗ ГАЛОАЛКАЛОФИЛЬНЫХ

БАКТЕРИЙ РОДА THIOALKALIVIBRIO: КАТАЛИТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА,

СТРУКТУРА, МЕХАНИЗМ АДАПТАЦИИ

Специальность 03.01.04 – биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва-2012

Работа выполнена в лаборатории инженерной энзимологии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук

Научный руководитель: член-корреспондент РАН, доктор химических наук, профессор Попов Владимир Олегович

Официальные оппоненты: Чеботарева Наталья Александровна доктор биологических наук Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук, ведущий научный сотрудник Демидкина Татьяна Викторовна доктор химических наук, профессор Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук, заведующая лабораторией

Ведущая организация: Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Московский государственный университет им. М.В.Ломоносова, Биологический факультет

Защита состоится «14» июня 2012 г. в 13.00 часов на заседании диссертационного совета Д 002.247.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук;

119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, строение 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН;

119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, строение 1.

Автореферат разослан «_» мая 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Орловский Александр Федорович Актуальность работы.

Мультигемовые цитохромы с широко распространены в прокариотических организмах и выполняют в них разнообразные функции, связанные с переносом электронов в окислительно-восстановительных реакциях. Эти белки обеспечивают превращение различных субстратов в энергетическом и пластическом обмене клетки, участвуют в создании трансмембранного протонного градиента, сопряженного с синтезом АТФ, выполняют защитную функцию, превращая токсичные продукты деятельности организма в безопасные и легко удаляемые из клетки вещества.

Пятигемовые цитохром с нитритредуктазы (NrfA), осуществляющие респираторную аммонификацию нитрита, были выделены из многих групп бактерий, где они являются конечным звеном в процессе создания трансмембранного протонного градиента в ходе диссимиляторного восстановления нитрата до аммония.

Также эти белки участвуют в детоксикации клетки от нитрита, гидроксиламина, оксида азота и пероксида водорода. Все выделенные и охарактеризованные аммонифицирующие нитритредуктазы являются высокогомологичными и обладают набором специфических признаков, позволяющих объединить их в отдельное семейство. К этим признакам относятся наличие пяти гемов с на мономер белка, присутствие в аминокислотной последовательности мотива СxxСК, связывающего каталитический гем, высокая консервативность остатков, образующих активный центр и каналы транспорта субстрата и продукта реакции, образование димерной формы с возможностью прямого переноса электронов между гемами субъединиц.

Объектом настоящего исследования являются два гомологичных восьмигемовых цитохрома с с уникальной структурой, выделенные из близкородственных хемотрофных галоалкалофильных гаммапротеобактерий рода Thioalkalivibrio и обладающие высокой нитритредуктазной активностью. Многие черты этих белков, такие как строение каталитического домена, наличие гем связывающего мотива CxxCK, устройство активного центра, способность аммонифицировать нитрит с высокой эффективностью без высвобождения промежуточных продуктов, указывают на их родство с ранее описанными респираторными пятигемовыми цитохром с нитритредуктазами. Однако другие детали: содержание восьми гемов с на субъединицу белка, образование стабильного гексамера и связанная с ним уникальная схема транспорта продукта реакции, образование дополнительной связи Tyr - Cys в активном центре, наличие уникального по структуре N-концевого домена позволяют выделить эти белки в отдельное семейство восьмигемовых нитритредуктаз.

Помимо значительного сходства с NrfA, оба белка имеют некоторые общие черты с другими восьмигемовыми оксидоредуктазами, осуществляющими, например, окисление гидроксиламина или восстановление тетратионата. Согласно современным представлениям, эти группы эволюционно связаны друг с другом и происходят от пятигемовых нитритредуктаз. Восьмигемовые нитритредуктазы, по-видимому, представляют переходное звено между данными семействами ферментов, соединяя в себе признаки, присущие разным группам.

В настоящее время, функции восьмигемовых нитритредуктаз в клетках Thioalkalivibrio не установлены. Предположение об их участии в респираторном восстановлении нитрита опровергается тем фактом, что обе бактерии не способны использовать нитрит в качестве акцептора электронов в бескислородном дыхании.

Так же представляется маловероятным участие белков в образовании аммония для клеточного синтеза, поскольку одна из двух бактерий не способна к росту на нитрите в качестве источника азота. Использование представителями рода Thioalkalivibrio разнообразных соединений серы в качестве доноров электронов с промежуточным накоплением значительных количеств элементарной серы в периплазме, позволяет предположить участие данных белков в катаболизме серы. Также возможно их участие в детоксикации клетки от экзогенного нитрита, образующегося в бактериальных сообществах соленых щелочных озер.

Изучение восьмигемовых нитритредуктаз позволит установить связь пространственной организации ферментов, их природной функции, эволюцию семейств гем с содержащих оксидоредуктаз, выявить связи циклов серы и азота в пределах одного организма. Отдельный интерес представляет исследование механизмов адаптации белков к экстремальным природным условиям обитания организмов в соленых щелочных озерах, поскольку для галоалкалофилов этот вопрос практически не изучен.

Ранее в лаборатории инженерной энзимологии Института биохимии РАН была охарактеризована восьмигемовая цитохром с нитритредуктаза TvNiR из бактерии Thioalkalivibrio nitratireducens. В настоящей работе мы впервые представляем данные о гомологичном белке (TvPaR) из бактерии Thioalkalivibrio paradoxus.

Целью работы является сравнительное структурно-функциональное исследование двух восьмигемовых нитритредуктаз из близкородственных галоалкалофильных бактерий рода Thioalkalivibrio, а также анализ структурных механизмов адаптации белков к функционированию в условиях двойного давления высоких концентраций солей и высоких рН. Особое внимание уделялось возможной функции восьмигемовых нитритредуктаз в клетке.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Выделить восьмигемовую нитритредуктазу TvPaR из бактерии Tv. paradoxus, и охарактеризовать е физико-химические и каталитические свойства;

2. Установить аминокислотную последовательность TvPaR;

3. Получить кристаллы свободной формы и бинарных комплексов TvPaR c субстратами и ингибиторами, пригодные для рентгеноструктурного анализа;

4. Определить пространственную структуру TvPaR методом рентгеноструктурного анализа и провести сравнительный анализ структур восьмигемовых нитритредуктаз из бактерий Tv. paradoxus и Tv. nitratireducens;

5. Охарактеризовать роль олигомерной структуры восьмигемовых нитритредуктаз в катализе и стабилизации молекулы;

6. Охарактеризовать экспрессию TvPaR и TvNiR в клетках на разных стадиях роста в различных условиях;

7. Проанализировать первичные структуры гомологичных восьмигемовых нитритредуктаз из галоалкалофильных и нейтрофильных бактерий с целью установления механизмов адаптации белков к экстремальным условиям функционирования.

Научная новизна Впервые выделена и охарактеризована восьмигемовая нитритредуктаза TvPaR из галоалкалофильной облигатно хемоавтотрофной гаммапротеобактерии Thioalkalivibrio paradoxus. Показано, что фермент обладает нитрит-, гидроксиламин и сульфитредуктазной активностью. Охарактеризовано влияние факторов, связанных с условиями обитания бактерий, на активность TvPaR.

Установлена первичная структура TvPaR. Получены кристаллы свободной формы и комплекса TvPaR с субстратом-сульфитом, пригодные для рентгеноструктурного анализа;

установлена пространственная структура свободной формы TvPaR и комплекса с сульфитом, проведен сравнительный анализ структур TvPaR и TvNiR.

Показано, что все основные структурные особенности TvNiR, отличающие ее от пятигемовых нитритредуктаз, оказались присущими и TvPaR.

Показано, что олигомеризация TvNiR (TvPaR) с образованием гексамера не влияет на активность, но повышает стабильность фермента. Максимальная стабилизация достигается в условиях высокой концентрации солей, что может иметь функциональное значение для ферментов, локализованных в периплазме галоалкалофильных бактерий Tv. nitratireducens и Tv. paradoxus.

Показано, что TvPaR и TvNiR синтезируются в клетках Tv. nitratireducens и Tv.

paradoxus в условиях анаэробного и аэробного культивирования. В обоих случаях TvNiR и TvPaR являются одним из основных растворимых белков клетки.

Анализ аминокислотных последовательностей гомологичных белков из галоалкалофильных и нейтрофильных негалофильных бактерий показал, что эти белки, обладающие высокой гомологией функциональных участков, представляют отдельное семейство восьмигемовых нитритредуктаз. Основным фактором адаптации структуры восьмигемовых нитритредуктаз к функционированию в условиях высоких рН и солености является снижение содержания лизина и повышение содержания кислых аминокислот.

Личный вклад автора Выделение, очистка и кристаллизация TvPaR, характеристика каталитических свойств TvNiR и TvPaR, исследование роли олигомерной структуры TvNiR и TvPaR, эксперименты с клетками, анализ механизмов адаптации выполнены автором.

Рентгеноструктурные эксперименты и расчет структур TvPaR выполнены к.ф.-м.н.

К.М. Поляковым и к.х.н. А.А. Трофимовым. Нуклеотидная последовательность гена TvPaR определена в НИЦ "Курчатовский институт" к.б.н. Ракитиной Т.В.

Научно-практическая значимость работы В настоящей работе в качестве объекта исследования выбраны ферменты из серуокисляющих, облигатно хемоавтотрофных бактерий рода Thioalkalivibrio, которые доминируют в бактериальных сообществах донных отложений гиперсоленых содовых озер с концентрацией ионов Na+ до 4 – 4,5 M и рН до 10,6. Одним из возможных механизмов адаптации бактерий к экстремальным условиям обитания является изменение свойств белков - ключевых компонентов метаболических путей бактерий, обеспечивающих более эффективное превращение субстратов – источников биомассы и энергии. Этот тип адаптации делает бактерии – экстремофилы источником белков с уникальными свойствами. Структурно-функциональное исследование белков из экстремофильных организмов, анализ механизмов адаптации на уровне первичной и пространственной структуры позволит создать теоретическую базу для конструирования генноинженерных ферментов, обладающих высокой активностью и стабильностью в экстремальных условиях (рН, соленость, температура). Кроме того, бактерии рода Thioalkalivibrio являются доминирующим компонентом в промышленных биореакторах Thiopaq, являющихся успешной альтернативой «грязных» химических технологий очистки промышленных и природных газов от соединений серы. Поэтому глубокое понимание их метаболизма на уровне ферментов помогает лучше понять функционирование этих природных биокатализаторов в биотехнологии.

Связь работы с государственными программами Работа выполнена при финансовой поддержке Государственного контракта № 14.740.11.0632 «Ферменты цикла азота и серы галоалкалофильных серуокисляющих бактерий рода Thioalkalivibrio: структура, функция, механизмы адаптации к экcтремальным условиям функционирования», выполняемого в рамках Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы».

Апробация работы Основные результаты диссертационной работы были представлены на следующих международных конференциях: "The 8th European Symposium of The Protein Society" (Zurich, Switzerland, 2009), "13th International conference on the Crystallization of Biological Macromolucules" (Dublin, Ireland, 2010), "3rd Latin American Protein Society Meeting" (Salta, Argentina, 2010).

Публикации По материалам диссертационной работы были опубликованы 3 статьи в рецензируемых журналах и 3 тезисов конференций.

Объем и структура работы Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 213 ссылок.

Работа изложена на 167 страницах, содержит 64 рисунка и 16 таблиц.

Основные результаты работы и их обсуждение 1. Выделение и очистка TvPaR. Восьмигемовая нитритредуктаза TvPaR была выделена из растворимой фракции гомогената клеток бактерии Thioalkalivibrio с использованием двухстадийной процедуры, включающей paradoxus анионообменную хроматографию и гель-фильтрацию.

Гомогенность препарата характеризовали с помощью электрофореза в денатурирующих условиях и гель-фильтрации. На гель-фильтрации TvPaR выходит одним пиком с объемом удерживания, соответствующим массе частицы 380 - кДа, что совпадает с массой гексамера TvNiR (рис. 1,a). На электрофорезе чистого образца TvPaR в денатурирующих условиях наблюдается одна полоса, соответствующая массе 62-65 кДа (рис. 1,b), что позволяет предположить, что TvPaR, как и TvNiR, является гомогексамером c молекулярной массой 390 кДа, образованным субъединицами с массой около 65 кДа.

10. Поглощение, mU - - 0 5 10 15 Объем, мл а b Рис. 1. Гель-фильтрация (a) и электрофорез в денатурирующих условиях (b) гомогенного препарата TvPaR.

2. Первичная структура TvPaR. Нуклеотидная последовательность гена TvPaR была установлена методом ПЦР с использованием праймеров, соответствующих нуклеотидным последовательностям гена TvNiR. Нуклеотидная последовательность гена TvPaR депонирована в базу данных GenBank (accession number HQ665012.1).

Последовательность содержит 553 аминокислотных остатка, включая 28 остатков сигнального пептида. Выравнивание аминокислотных последовательностей двух восьмигемовых нитритредуктаз, принадлежащих близкородственным организмам Tv.

paradoxus и Tv. nitratireducens (accession number AJ880678.2), показало 81 % идентичности.

Подобно TvNiR, аминокислотная последовательность TvPaR содержит восемь гем с связывающих мотивов: семь СxxСН и один СxxСК, характерный для гем с содержащих нитритредуктаз. Почти все аминокислотные остатки, ответственные за функциональные свойства TvNiR, включая остатки активного центра (Tyr303, His361, Arg131 и остаток Cys305, отсутствующий у NrfA и функционально значимый у TvNiR);

остатки, формирующие каналы транспорта субстрата и продукта, и остатки, отвечающие за координацию двух ионов Ca2+, совпадают в последовательностях обоих ферментов.

3. Кристаллизация и пространственная структура TvPaR.

Скрининг и оптимизация условий кристаллизации проводились методом диффузии в парах. Первичный скрининг условий кристаллизации проводили с использованием коммерческих наборов Crystal Screen фирмы «Hampton Research». Для последующей оптимизации были отобраны условия роста кристаллов с нижним пределом дифракции около 1,9 - 2,5. В результате проведенной оптимизации получены кубические кристаллы TvPaR с размерами до 200-400 мкм и пределом дифракции до 1,7 - 1,9.

Кристаллизация методом противодиффузии через границу раздела фаз проводилась в капиллярах. В качестве начальных, были использованы условия, оптимизированные методом диффузии в парах. Кубические кристаллы с размерами до 0,15 мм были получены с осадителями 1) 1,2 – 1,37 M сульфат лития, 0,5 M сульфат аммония, 0,1 M цитрат натрия, pH 5,6 и 2) 0,02 M хлорид кобальта (II), 0,1 M MES, pH 6,5;

2,5 -2,8 M сульфат аммония. Эти условия были использованы для кристаллизации свободной формы и комплексов TvPaR в условиях микрогравитации на Международной космической станции (рис. 2 a,b).

Рис. 2. Кристаллы TvPaR, выросшие в невесомости в следующих условиях:

a. 1,37 M сульфат лития, 0,5 M сульфат b. 0,02 M хлорид кобальта (II), 0,1 M аммония, 0,1 M цитрат натрия, pH 5,6 MES, pH 6,5;

2,8 M сульфат аммония Проверка качества кристаллов показала, что все кристаллы, полученные на Земле как методом противодиффузии в капиллярах, так и диффузии в парах, были двойниками со степенью двойникования 25-50 %. Единственный монокристалл был получен в условиях невесомости и снят до разрешения 1,9 на синхротроне SPring- в Японии. Полученные данные были использованы для расчета пространственной структуры TvPaR (PDB:3SXQ).

С целью получения информации о характере связывания субстратов и ингибиторов в молекуле TvPaR, были получены кристаллы бинарных комплексов белка с субстратами и ингибиторами методами настаивания и сокристаллизации.

4. Пространственная структура TvPaR, сравнение со структурой TvNiR Мономеры TvPaR образуют в кристалле гексамер c точечной группой симметрии 32 (рис. 3), аналогичный ранее описанному гексамеру TvNiR. Последовательность аминокислотных остатков в структуре TvPaR полностью соответствует определенной нуклеотидной последовательности гена.

Структуры мономеров TvPaR и TvNiR почти идентичны: 95 аминокислотных замен в последовательности TvPaR по сравнению с TvNiR не приводят к изменениям вторичной структуры белка. Мономеры А свободных форм TvPaR и TvNiR (PDB:2OT4) могут быть совмещены по С-атомам 519 остатков со среднеквадратичным отклонением (rmsd) 0,49.

Рис. 3. Структура гексамера TvPaR.

Три пары кристаллографически независимых мономеров показаны зеленым, фиолетовым и желтым.

Пары субъединиц А1-B1, A2-B2 и А3 В3 покрашены одним цветом.

Гемовые группы показаны красным цветом и пронумерованы согласно их положению в аминокислотной последовательности.

Кристаллографическая ось третьего порядка расположена вертикально в плоскости рисунка, а одна из некристаллографических осей второго порядка – горизонтально.

Мономер TvPaR содержит 7 бис-гистидин-координированных гемов типа с (гемы 1-3 и 5-8) и один гем (гем 4), координированный в проксимальном положении аминогруппой остатка Lys188. Бис-гистидиновые гемы организованы в типичные для мультигемовых цитохромов с дигемовые мотивы. Гем 6 почти параллелен гему 4, находится от него на расстоянии 9,6 (Fe-Fe) и, возможно, образует с ним электронно-спаренный кластер, подобный тому, который образуют гемы в NrfA.

Расстояния Fe-Fe между другими соседними гемами в мономере TvPaR составляют 9 13, что допускает прямой перенос электронов между ними. В гексамерах TvPaR и TvNiR прямой перенос электронов между гемами возможен только между мономерами А и В, благодаря взаимодействию гемов 3 этих мономеров (расстояние Fe-Fe 13,2 ).

Структура гексамера TvPaR (рис. 3) также почти идентична TvNiR. Каждая субъединица А TvPaR образует по 40 водородных связей с другими субъединицами А и 15 связей с противолежащей субъединицей В, в TvNiR водородных связей - 44 и 19, соответственно. Таким образом, общий вклад водородных связей в стабильность гексамера оказывается приблизительно одинаковым в TvPaR и в TvNiR.

Активный центр TvPaR (рис. 4,a) идентичен, и может быть совмещен с активным центром TvNiR по атомам гема 4 и атомам боковых цепей каталитических остатков Tyr303, His361, Arg131 и остатка Lys188, который координирует каталитический гем с проксимальной стороны, с rmsd равным 0,09. CE2-атом каталитического остатка Tyr303 TvPaR, как и в TvNiR, связан ковалентной связью с атомом серы остатка Cys305 (длина связи ~ 1,67 ). Это - характерная особенность восьмигемовых нитритредуктаз, не обнаруженная у пятигемовых нитритредуктаз NfrA. В активном центре TvPaR присутствует ион кальция, расположенный в 10,5 от атома железа каталитического гема. Окружение кальция в TvPaR включает идентичные с TvNiR остатки Glu302, Tyr303, Lys358, Gln360 и две молекулы воды.

a b Рис. 4, а. Структура активного центра комплекса TvPaR с сульфитом. Показана карта электронной плотности для сульфит-иона (1 сигма). Ион железа гема и ион кобальта показаны коричневым, ион кальция и протопорфирин гема - серым.

Координационные и водородные связи показаны пунктиром.

b. Наложение структур свободных форм TvPaR (зеленый) and TvNiR (розовый) по атомам гема 6. Остатки Ser399 и Gln400 в TvNiR имеют две конформации.

Как и в TvNiR, активный центр TvPaR cвязан с поверхностью мономера двумя каналами с характерным распределением зарядов для эффективного транспорта противоположно заряженных молекул субстрата и продукта реакции (рис. 5).

Структура внутренней части канала транспорта субстрата одинакова в TvPaR и TvNiR. Небольшие изменения наблюдаются на входе в канал, где у TvPaR имеется два положительно заряженных остатка (Lys213 и Arg171), которые могут способствовать транспорту отрицательно заряженных нитрит-ионов в активный центр, в то время как у TvNiR таких остатков три (Arg316, Arg348 и Arg171). Канал транспорта продукта в обоих белках выходит во внутреннюю полость гексамера, в свою очередь, соединенную с растворителем через три отверстия размером 9 16.

Структуры каналов транспорта продукта в TvPaR и TvNiR почти идентичны.

Единственная замена обнаружена у выхода канала в полость внутри гексамера Leu88 в TvNiR замещен на Glu88 TvPaR. Остаток Glu88, наряду с другими отрицательно заряженными остатками канала (Glu83 и Glu115) и пропионатными группами гемов 6 и 7, может способствовать направленному транспорту продукта реакции – иона аммония из активного центра TvPaR.

В TvPaR, как и в TvNiR, помимо каналов транспорта субстрата и продукта, к активному центру ведет еще один узкий канал (рис. 5), функцией которого может быть перенос протонов к активному центру (шестиэлектронное восстановление нитрита до аммония сопровождается присоединением восьми протонов). Сам канал идентичен в обоих белках, вопрос о реальной роли канала пока остается открытым.

Рис. 5. Каналы транспорта субстрата (коричневый), продукта (желтый) и протонов (голубой) в структуре TvPaR. Показаны остатки, формирующие каналы;

гемы показаны серым, молекулы воды голубым, ион кальция серым, ионы кобальта коричневым.

Координационные связи показаны пунктиром.

Существенные различия в структурах TvPaR и TvNiR обнаружены в окружении гема 6 (рис. 4,b). Остатки Gln400 и Leu225 TvNiR заменены в TvPaR на пролин и валин, что приводит к повороту примерно на 30 имидазольного кольца гистидина 119, координирующего гем 6 в дистальном положении. Поворот происходит за счет плотного контакта ND1 и CE1 атомов His119 с CD и CG атомами Pro400.

Перестановки в окружении гема 6 могут изменить его электронные свойства в TvPaR, по сравнению с TvNiR. Поскольку гем 6 располагается рядом с каталитическим гемом, изменение его свойств может быть существенным для каталитической активности белка.

Комплекс TvPaR с сульфитом был получен настаиванием кристалла свободной формы TvPaR в течение 10 минут в противорастворе, содержавшем 50 мМ дитионит натрия. В структуре полученного комплекса (PDB: 3TTB) в активном центре был обнаружен ион сульфита (рис. 4,a). Атом серы образует координационную связь с атомом железа гема 4 (длина связи ~ 2,26 ), атом кислорода O2 сульфита связан водородной связью с ОН-группой Tyr303 и атомом азота His361. Атом O3 образует водородные связи с азотом NH2-группы Arg131 и с молекулой воды, связанной с ОН группой Tyr303. Атом кислорода О1 сульфита связан водородной связью с водой, соединенной водородной связью с пропионатными группами. Аналогичным образом сульфит связывается и в комплексе с TvNiR (PDB: 3FO3). Образование комплекса с сульфитом не вызывает в белке значительных структурных изменений, структуры свободной формы и комплекса могут быть совмещены по C-атомам аминокислотных остатков с rmsd равным 0,34.

В структурах свободной формы TvPaR и ее комплекса с сульфитом был обнаружен ион сульфата, располагающийся возле гема 1 субъединицы А. Сульфат образует водородную связь с ND1 атомом His18 - лиганда гема 1. Связывание отрицательно заряженного иона возле гема может привести к изменению его редокс потенциала и повлиять на ферментативные свойства белка. Сульфат, по-видимому, попадает в кристалл из противораствора, где содержится сульфат аммония.

В целом, кроме локальных отличий в окружении гема 6, все основные структурные особенности TvNiR, отличающие ее от NrfA, оказались присущими и TvPaR, в том числе: образование связи Tyr-Cys в активном центре ферментов;

гексамерная структура, приводящая к образованию полости внутри гексамера;

канал транспорта продукта, выходящий во внутреннюю полость гексамера, и дополнительный канал транспорта протонов.

5. Спектральные свойства TvPaR Спектральные характеристики TvPaR идентичны описанным ранее для TvNiR. УФ видимые спектры окисленной формы TvPaR имеют максимумы поглощения при 280, 353, 410 и 531 нм, восстановленной - при 423, 524 и 553 нм, что характерно для цитохромов c.

6. Каталитические свойства TvPaR;

сравнение с каталитическими свойствами TvNiR TvPaR и TvNiR, как и пятигемовые нитритредуктазы, катализируют реакции шестиэлектронного восстановления нитрита (1) и сульфита (2), а также двухэлектронного восстановления гидроксиламина (3). Реакции являются двухсубстратными (4). На первой стадии субстрат (S1) – донор электронов (гипотетический мультигемовый цитохром с в клетке или восстановленный метилвиологен (MV+) в стандартных условиях определения ферментативной активности) восстанавливает фермент (E), переводя его в каталитически активную форму (Е*), при этом каталитический гем переходит из Fe(III) в Fe(II)-форму. Второй субстрат (S2 – нитрит, сульфит или гидроксиламин) связывается с восстановленным каталитическим гемом, где протекает процесс мультиэлектронного восстановления с образованием промежуточных продуктов, которые в процессе реакции остаются связанными с каталитическим гемом.

NO2- + 6 MV+ + 8H+ = NH4+ + 6 MV2+ + 2H2O (1) HSO3- + 6MV+ + 6 H+ = HS- + 6MV2+ + 3 H2O (2) NH2OH + 2MV+ + 3H+ = NH4+ + 2MV2+ + H2O (3) +S E + S1 ES1 E* ES2 E + P2 (4) - P 6.1. Нитритредуктазная активность. Восстановление нитрита TvPaR описывается уравнением Михаэлиса-Ментен (рис. 6) v = Vm [S]/(Km + [S]), где v – измеряемая скорость реакции, Vm – кажущаяся максимальная скорость, Km – кажущаяся константа Михаэлиса и [S] – варьируемая начальная концентрация субстрата.

Каталитическую константу (kcat) рассчитывали делением Vm на концентрацию фермента. Кинетические константы, рассчитанные по этому уравнению, для TvPaR равны 0,10 ± 0,02 мМ (Кm) и 4160 ± 320 с-1 (kcat) (таблица 1). В отличие от TvPaR, для TvNiR при концентрациях нитрита выше 0,8 мМ наблюдалось существенное ингибирование субстратом (рис. 6).

Таблица 1. Кинетические параметры реакций восстановления нитрита и сульфита, катализируемого TvPaR, TvNiR и пятигемовыми нитритредуктазами Восстановление нитрита Восстановление сульфита Микрорганизм - kcat, c- kcat, c Km, kcat /Km, Km, kcat /Km, M-1c-1 M-1c- мМ мМ 4160 320 0,10 0,02 4,2 107 0,08 0,04a 7,5 Tv. paradoxus 0, (TvPaR) 0, 0,3a,b Tv. nitratireducens 3100±300 0,18±0,05 1,7 107 1,3 0, (TvNiR) 0, 3,6 105 8,4 D. desulfuricans 415 1140 0,63 0, 3,5 107 4,3 E. coli 769 0,022 0,03 0, NrfA S. deleyianum 962 0, W. succinogenes 380 0, D. vulgaris 639 0, D. desulfuricans 0,01-0, SiR D. vulgaris Hildenborough 0,05-0, a Ki для реакции восстановления нитрита.

b Данные получены методом вольтамперометрии в белковых пленках (PFV, protein film voltammetry).

Зависимость скорости реакции от концентрации субстрата описывалась уравнением v = Vm [S]/(Km + [S](1 + [S]/Ks )), где Ks - константа ингибирования субстратом.

Рассчитанные по этому уравнению кинетические константы восстановления нитрита TvNiR составили 0,18 0,05 мМ (Km), 2,5 0,5 мМ (Ks ) и 3100 ± 300 с-1 (kcat) (таблица 1). Для TvPaR ингибирования субстратом не наблюдается вплоть до концентраций нитрита 3 мМ.

Активность, моль/мин на мг белка Рис. 6. Зависимость скорости восстановления нитрита TvNiR (кривая 1) и TvPaR 2000 (кривая 2) от концентрации субстрата.

0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3, Нитрит, мМ Каталитическая константа (kcat) для TvPaR выше таковой для TvNiR приблизительно на 30 %. Это различие воспроизводится для разных препаратов обоих ферментов и, по-видимому, отражает более эффективный катализ нитритредуктазной реакции TvPaR. Наблюдаемые различия в активностях могут быть обусловлены структурными различиями, обнаруженными в окружении гема 6, расположенного на расстоянии 9,6 от каталитического гема 4 и образующего с ним кластер, выполняющий роль двухэлектронного переносчика. Редокс свойства этого кластера могут влиять на скорость переноса электронов на нитрит, а также на скорость внутримолекулярного транспорта электронов. Следует отметить, что нитритредуктазная активность TvPaR и TvNiR значительно превосходит таковую для пятигемовых нитритредуктаз - NrfA (Таблица 1).

Влияние рН и концентрации NaCl на нитритредуктазную активность TvNiR и TvPaR Подобно TvNiR, TvPaR является периплазматическим белком галоалкалофильной бактерии, для которой оптимальными условиями роста являются рН 10-10,2 и концентрация соли около 0,5 М (NaHCO3/Na2CO3, NaCl). Проверка влияния рН на скорость нитритредуктазной реакции (Vmax), катализируемой TvPaR, показала, что рН-оптимум реакции расположен в нейтральных – слабощелочных значениях рН 7, – 7,5 (Рис. 7,а). В щелочных средах (рН 9,5 – 10,5) активность составляет 15-20 % от исходной.

Увеличение концентрации NaCl в растворе до 1-2 М снижает нитритредуктазную активность TvPaR до 35-25 % от исходной (Рис. 7,b). Эффект может объясняться снижением в солевых растворах роли электростатических взаимодействий, существенных для транспорта заряженных молекул субстрата и продукта.

Уменьшение скорости нитритредуктазной реакции в средах с щелочными значениями рН может объясняться совокупностью нескольких причин:

стехиометрией реакции (шестиэлектронное восстановление нитрита сопровождается связыванием 8 протонов, концентрация которых уменьшается с ростом рН), менее эффективным транспортом незаряженной молекулы аммиака (pKa 9,3) по каналу транспорта продукта, депротонированием существенных для катализа остатков активного центра.

В активном центре TvPaR и TvNiR есть две группы, депротонирование которых протекает в области рН 7,0 – 10,0 и может влиять на эффективность катализа. Одной из таких групп является His361 с рКа 6,6 1,0. Второй группой, которая в активном центре TvNiR образует водородную связь с О1-атомом нитрита и также может участвовать в переносе протонов на субстрат, является Tyr303 (рКа Tyr в белках 10,3 1,2). Вследствие образования ковалентной связи между Tyr303 и Cys305, рКа гидроксила Tyr303 может снижаться на 0,5-1 единицу и составлять 9,3 1,2.

pKa точки перегиба правой ветви рН-зависимости составляет 8,5 - 8,6 и находится в интервале возможных значений рКа Tyr303. Роль Tyr303 как донора протонов подтверждается и наличием в структуре TvNiR и TvPaR канала, по которому протоны с поверхности белка могут передаваться гидроксильной группе остатка Tyr303 (рис.

5). В структурах пятигемовых нитритредуктаз данный канал отсутствует. Таким образом, участие в катализе TvPaR и TvNiR группы Tyr303, связанной с Cys305, позволяет расширить область рН, в которой ферменты проявляют высокую каталитическую активность, что может быть принципиально для ферментов из галоалкалофильной бактерий. Такое расширение рН оптимума можно рассматривать как адаптацию TvNiR и TvPaR к условиям обитания алкалофильных бактерий.

Активность (%) Активность, % 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 9,5 10,0 10, 0,0 0,5 1,0 1,5 2, pH NaCl, M b a Рис. 7. a. рН-Зависимость нитритредуктазной активности TvPaR;

реакция проводилась в 50 мМ буферных системах: () K-фосфат - Трис (pH 6,5-9,5), () Na-борат (8,0-10,5), () Na-карбонат (8,5-10,0). За 100% принята активность TvPaR при рН 7,0.

b. Зависимость максимальной скорости восстановления нитрита TvPaR от концентрации соли в реакции. Условия: 50 мМ К+-фосфатный буфер, рН 7,0. В обоих случаях концентрация нитрита 1 мМ, TvPaR 0,036 µг/мл, 6.2. Гидроксиламинредуктазная активность TvPaR катализирует двухэлектронное восстановление гидроксиламина.

Кинетические параметры реакции, рассчитанные по уравнению Михаэлиса-Ментен, равны 230 ± 50 мМ (Кm) и 2950 ± 440 с-1 (kcat). Очень низкое сродство TvPaR и TvNiR к гидроксиламину, вероятно, свидетельствует о том, что гидроксиламин не является физиологическим субстратом этих белков в природе.

6.3 Сульфитредуктазная активность, ингибирование сульфитом Максимальная скорость восстановления сульфита составляет для TvPaR и TvNiR 0,06 - 0,04 с-1 (таблица 1). Сульфитредуктазная активность TvNiR и TvPaR сравнима по величине с активностями NrfA из E. coli и специализированных сульфитредуктаз (SiR) из бактерий D. desulfuricans и D. vulgaris (таблица 1). Однако, соотношение нитрит- и сульфитредуктазных активностей TvNiR и TvPaR (6-7104) выше такового для пятигемовых нитритредуктаз (0,6-5,5103), что указывает на более тонкую настройку активного центра на восстановление именно нитрита, а не сульфита.

Для TvNiR и TvPaR показано, что сульфит и нитрит, будучи субстратами, связываются с каталитическим гемом активного центра, поэтому при измерении нитритредуктазной активности в присутствии сульфита, он будет выступать как конкурентный ингибитор. Зависимость скорости реакции от концентрации субстрата (v vs [S]) была измерена при разных концентрациях сульфита и линеаризована в координатах Лайнувера-Берка (1/v vs 1/[S]) (рис. 8, а). Пересечение прямых, соответствующих разным концентрациям сульфита, в левом верхнем квадранте указывает на смешанный тип ингибирования, близкий к конкурентному.

Кинетическая схема, описывающая смешанный тип ингибирования, приведена на рис. 9, b. Константа конкурентного ингибирования, Ki, характеризующая аффинность активного центра TvPaR к сульфиту, равна 0,08 0,04 мМ и сопоставима с константой Михаэлиса для нитрита (0,1 0,02 мМ). Таким образом, сульфит является эффективным ингибитором восстановления нитрита TvPaR и TvNiR. Этот факт может иметь важное значение для регулирования нитритредуктазной активности TvNiR и TvPaR в клетке. В условиях преобладающей концентрации сульфита в периплазме клетки нитритредуктазная активность может подавляться практически до нуля.

1/v, усл.ед.

-2 0 2 4 1/[нитрит], мМ - a b Рис. 8. Ингибирование нитритредуктазной активности TvPaR сульфитом.

a. Определение типа ингибирования в координатах Лайнувера – Берка. Условия проведения реакции: 50 мМ К+-фосфатный буфер, рН 7,0;

0,02 мкг TvPaR в реакции.

1- 0 мМ, 2-0,5 мМ, 3-1 мМ, 4-1,5 мМ сульфита.

b. Кинетическая схема, описывающая смешанный тип ингибирования, при котором существуют два сайта связывания ингибитора: один конкурентный по отношению к субстрату (константа диссоциации Ki) и второй – неконкурентный (Ki ). Схема описывается уравнением v = Vm[S]/ (Km (1 + [I]/Ki) + [S] (1 + [I]/ Ki ))..

Смешанный тип ингибирования указывает на наличие второго, помимо активного центра, сайта связывания сульфита, в котором сульфит связывается с уже образовавшимся комплексом белок-нитрит (рис. 8,b). Константа диссоциации сульфита для этого сайта, Ki, составляет 1,3 ± 0,3 мM. Обнаруженный в структурах TvPaR и TvNiR дополнительный сайт связывания сульфат- и сульфит-ионов вблизи гема 1 может соответствовать второму сайту связывания сульфита в показанном нами смешанном типе ингибирования нитритредуктазной реакции ионами сульфита.

Связывание сульфита с этим центром может влиять на скорость нитритредуктазной реакции только при высоких (миллимолярных) концентрациях сульфита.

6.4. Восстановление TvPaR в присутствии сульфида, сульфидоксидазная активность TvPaR.

Вопрос о функции TvNiR и TvPaR в клетках остается на сегодняшний день наименее изученным. TvNiR и TvPaR обладают сульфитредуктазной активностью, сравнимой со специализированными сульфитредуктазами (SiR) из бактерий рода Desulfovibrio (таблица 1), что позволяет предположить возможность участия TvNiR и TvPaR в процессах преобразования серусодержащих соединений. Для проверки способности TvPaR катализировать обратную реакцию окисления сульфида (одного из основных источников энергии используемых клеткой), была измерена способность белка восстанавливаться в присутствии сульфида без других доноров электронов.

0, 0, 0 min 0, Опт. плотность 2 min 0,30 7 min 12 min 0, 17 min 21 min 0, 0, 0, 0, 0, 350 400 450 500 550 600 длина волны, нм b a Рис. 9. a – Восстановление TvPaR в присутствии 5 мМ сульфида. b – Структура комплекса TvNiR c сульфид-ионом Эксперимент проводили в анаэробных условиях в предполагаемом физиологическом значении рН периплазмы (рН 9,0, 50 мМ Трис-HCl буфер), восстановление белка контролировали по изменению поглощения TvPaR в видимой области спектра. За 20 мин инкубации TvPaR с 5 мМ сульфидом гемы восстанавливаются почти полностью (90 %) (рис. 9,a). Как следует из структуры комплекса TvNiR с сульфидом (рис. 9,b), восстановлению предшествует связывание сульфида в активном центре TvNiR с образованием комплекса, в котором сульфид ион координирован с атомом железа каталитического гема и образует водородные связи с каталитическими остатками Tyr303, His361, пропионатом каталитического гема и молекулой воды. Возможность восстановления всех гемов путем переноса электронов от сульфида на каталитический гем и далее по цепи гемов на какой-либо акцептор указывает, что TvPaR может катализировать обратную реакцию – окисления соединений серы.

7. Олигомерное состояние TvNiR и TvPaR как фактор адаптации к экстремальным условиям функционирования.

Анализ структурных данных показал, что TvNiR и TvPaR существуют в растворе в виде гомогексамеров, стабилизированных различными типами межсубъединичных взаимодействий, таких как водородные связи, солевые мостики и гидрофобные контакты.

Для исследования роли разных типов межсубъединичных взаимодействий в стабилизации гексамерной структуры было проверено влияние наиболее распространенных денатурирующих агентов на процесс диссоциации гексамера TvNiR. К таким агентам относятся детергенты, высокие и низкие концентрации солей, рН, хаотропные агенты (мочевина и гуанидинхлорид) (таблица 2).

Таблица 2. Диссоциация TvNiR под действием различных диссоциирующих агентов.

Диссоциирующий Тип взаимодействий в Диссоциация TvNiR* агент белках, на которые 2 часa 24 часa (условия), влияет данный агент H T M H T M концентрация Электростатические, NaCl 2-5 M 100 0 0 100 0 гидрофобные рН 4,7 Электростатические, 100 0 0 100 0 водородные связи рН 9,2 Электростатические, 100 0 0 100 0 водородные связи Додецил- Гидрофобные 100 0 0 100 0 мальтозид, 0,15 % Додецилсульфат Гидрофобные 100 0 0 90 0 натрия, 2 - 7,5 % Мочевина, 2-6 М Водородные связи 64 21 15 49 4 Гуанидинхлорид, Водородные связи, 8 9 83 3 0 электростатические 2-4,5 M *Результаты показаны в % содержания гексамера (Н), тримера (Т), мономера (М) для максимальной использованной концентрации агента. Первоначально все растворы содержали 100 % Н. Для определения содержания каждого из олигомеров реакционную смесь наносили на гель-фильтрационную колонку Superdex200, уравновешенную 50 мМ К+ фосфатным буфером, рН 7,0, содержавшим 0,2 M NaCl.

Из приведенных данных следует, что гексамерная структура TvNiR стабильна в условиях высоких концентраций солей и высоких значений рН. Оба этих показателя отличают условия природного распространения галоалкалофильных бактерий рода Thioalkalivibrio, таким образом, резистентность нативной структуры к высоким концентрациям соли и высоким рН может иметь функциональное значение для периплазматических ферментов.

Только добавки мочевины и гуанидинхлорида (ГХ), вызывающих разрушение водородных связей в белках, вызывали эффективную диссоциацию гексамерной формы TvNiR с образованием тримеров и мономеров (рис. 10). Образование димеров в процессе диссоциации зарегистрировано не было. Процесс диссоциации обратим:

после удаления денатурирующих агентов и концентрирования, белок агрегировал с образованием тех же олигомерных состояний (рис. 11): H T M.

Рис. 10. Диссоциация TvNiR под действием 3М ГХ (черная кривая) и Поглощение 280 нм, mU реассоциация мономеров после удаления ГХ и концентрирования раствора (красная кривая). (50 мМ К+ фосфатный буфер, рН 7,0). В обоих случаях олигомерный состав смеси определяли гель-фильтрацией на колонке Superdex 200, уравновешенной 50 мМ К+-фосфатным буфером, рН 8 10 12 14 16 18 7,0, содержавшим 0,2 М NaCl.

Объем удерживания, мл 7.1. Свойства олигомеров TvNiR Все олигомерные формы TvNiR имели приблизительно одинаковую каталитическую активность (таблица 3).

Таблица 3. Активность олигомеров TvNiR после удаления гуанидинхлорида.

Олигомер Гексамер Тример Мономер Реассоциирован ный гексамер Нитритредуктазная активность (µмоль/мин* мг) 220 205 185 Для сравнительной характеристики нативности структуры мономера и тримера, полученных обработкой ГХ, и исходного гексамера был использован метод кругового дихроизма (КД) (рис. 11).

Рис. 11. Спектры Молярная эллиптичность, кругового дихроизма олигомеров TvNiR:

(deg*cm2*dmol-1) черным цветом Длина волны, nm обозначен гексамер;

красным – тример;

200 210 220 230 240 250 синим – мономер.

Условия: 25 мМ К+ фосфатный буфер, рН - 7,0, 20оС.

- Тример полностью сохраняет вторичную структуру в процессе обработки ГХ, у мономера наблюдается сдвиг отрицательного максимума эллиптичности в область 204-205 нм, а также уменьшение максимума эллиптичности на 192 нм, что свидетельствует об увеличении доли неструктурированного белка, однако основные структурные особенности белка сохраняются. Стабильность мономеров TvNiR может обеспечиваться наличием 8 ковалентно связанных гемов с на полипептидной цепи, состоящей из 525 аминокислотных остатков (1 гем на 65,6 аминокислотых остатка).

Для оценки стабильности олигомерных форм TvNiR исследовали термостабильность полученных белков. Известно, что повышенная стабильность в условиях высокого содержания солей у галофильных белков зачастую коррелирует с ростом термостабильности, поскольку оба свойства обусловлены рядом общих структурных особенностей, таких как повышение внутренней гидрофобности, компактизация молекулы, оптимизация электростатических и гидрофобных взаимодействий на поверхности белковой глобулы и в межсубъединичных контактах.

Для оценки термостабильности олигомеров TvNiR проводили плавление олигомеров с контролем молекулярной эллиптичности на 222 нм (максимум эллиптичности для - спиральных структур) методом КД.

Анализ кривых плавления показал, что температура полуденатурации (50 % разворачивания) всех трех олигомерных форм (рис. 12,b) различается незначительно и составляет 67-71оС. Однако ход кривых различен: плавление исходного гексамера протекает в узком интервале температур (60-80оС). В случае тримера процесс денатурации протекает в более широком интервале температур: медленное разворачивание начинается уже при 37оС. В случае мономера на начальной стадии процесса (30-75o) наблюдается монотонный анфолдинг без выраженного фазового перехода.

a b Содержание денатурированного белка Содержание денатурированного белка 1, 1, 0, 0, H 0, 0, 0, 0, H 0, 1M NaCl 0, 0, 0, -0, 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 10 20 30 40 50 60 70 80 90 o Температура, C o Температура, C Рис. 12. Содержание денатурированной формы олигомеров TvNiR: (a) гексамер TvNiR:

черный – 25 мM К+-фосфатный буфер, pH 7,0;

красный – тот же буфер + 1 M NaCl;

(b) черным цветом обозначен гексамер TvNiR;

зеленым – тример;

синим – мономер;

красным реконструированный гексамер (все в 25 мM К+-фосфатном буфере, pH 7,0) Гексамер, собранный из мономеров после удаления ГХ, значительно стабильнее исходных мономеров, что дает основание предположить, что основная роль олигомеризации в случае TvNiR – это повышение стабильности белка.

Добавление NaCl в концентрации до 1 М приводит к стабилизации гексамеров (рис. 12,a) и тримеров TvNiR (данные не показаны), температура полуденатурации сдвигается в сторону более высоких значений на 15оС в случае гексамера и почти вдвое меньше (на 8оС) - тримера. Объяснение столь заметного эффекта NaCl на общую стабильность может быть связано с компактизацией молекулы, а также с усилением гидрофобных межсубъединичных контактов.

Таким образом, характеристика стабильности и активности олигомеров TvNiR свидетельствует о том, что образование гексамерной структуры приводит к стабилизации фермента, причем эффект максимален в присутствии высоких концентраций соли, т.е. в условиях, аналогичных условиям существования белка в клетке. Значительная стабилизация гексамера TvNiR в присутствии высоких концентраций соли указывает на ключевую роль гидрофобных взаимодействий в поддержании нативной структуры белка.

8. Восьмигемовые цитохром с нитритредуктазы TvNiR и TvPaR на разных стадиях роста.

Для установления роли TvNiR и TvPaR в живых клетках, неспособных к респираторному восстановлению нитрита (Tv. paradoxus также неспособна использовать оксиды азота в пластическом обмене), было проведено сравнение динамики роста аэробных культур Tv. paradoxus и Tv. nitratireducens (таблица 4).

Таблица 4. Динамика аэробного роста клеток Tv. nitratireducens (штамм ALEN2) и Tv.

paradoxus (штамм ARh1).

Образец Сера S2O32- Белок, Время Нитрит- Содержание* роста, час мМ мг/мл редуктазная TvNiR (TvPaR) активность, мг/мг белка (%) µмоль/мин на мг белка Tv. nitratireducens 0,82±0,05 2,4 ± 0, 68 al1 +++ 26 0,012 (1,2) 1,6 ± 0,2 19 ± 93 al2 + 0 0,095 (9,5) Tv. paradoxus 1,7 ± 0,5 2,1 ± 0, 44 ar1 +++ 10 0,007 (0,7) 2,4 ± 0,6 4,9 ± 0, 54 ar2 ++ 0 0,016 (1,6) 5,0 ± 0,4 6,0 ± 1, 68 ar3 + 0,020 (2,0) 5,2± 0,1 6,7 ± 1, 76 ar4 + 0,022 (2,2) 5,5 ± 0,9 6,9 ± 0, 93 ar5 + 0,023 (2,3) *Приблизительное содержание TvNiR (TvPaR) в мг на мг белка в гомогенате было рассчитано с учетом активности чистых препаратов ферментов, измеренной в тех же условиях, что и активность гомогенатов.

В образцах определяли содержание тиосульфата (респираторного донора электронов) и элементарной серы (промежуточного продукта окисления тиосульфата). В растворимой фракции гомогената контролировали удельную нитритредуктазную активность.

Для выявления присутствия других нитритредуктаз в гомогенате гели, полученные неденатурирующим электрофорезом гомогенатов, окрашивали по активности (рис.

13,a). В качестве контроля использовали чистые препараты обоих ферментов. В условиях неденатурирующего электрофореза гексамерная форма TvNiR (TvPaR) диссоциирует с образованием тримеров и мономеров, поэтому в гелях гомогенных белков присутствуют три полосы, обладающие нитритредуктазной активностью (рис.

13,a). Те же полосы присутствуют и в гомогенатах. TvPaR и TvNiR присутствуют в клетке на всех стадиях роста, Увеличение нитритредуктазной активности коррелирует с уменьшением содержания элементарной серы, достигая максимального значения в образцах, содержащих уже незначительные количества серы. Других белков, обладающих заметной нитритредуктазной активностью кроме TvPaR и TvNiR, в гомогенатах Tv. paradoxus и Tv. nitratireducens не обнаружено.

Максимальное содержание TvPaR и TvNiR, рассчитанное из удельной активности чистого препарата, составляет около 2-2,5 и 9,5 % от общего белка. Таким образом, TvPaR и особенно TvNiR являются одним из основных растворимых белков клеточного гомогената, что подтверждается окрашиванием гелей SDS электрофорезов гомогенатов по белку (рис. 13,b).

a b Рис. 13.а - Электрофорез в неденатурирующих условиях растворимой фракции гомогенатов Tv. nitratireducens и Tv. paradoxus, выращенных в аэробных условиях (табл.4). Гель покрашен по нитритредуктазной активности;

b – Электрофорез тех же фракций в денатурирующих условиях с окрашиванием по белку.

TvPaR – дорожка, содержащая чистый TvPaR.

В клетках Tv. nitratireducens, выращенных анаэробно с тиосульфатом в качестве донора электронов и нитратом в качестве акцептора и источника азота, TvNiR также является одним из основных белков клеточного гомогената. Окрашивание гомогената по нитритредуктазной активности показало, что других нитритредуктаз в гомогенате либо нет, либо их активность значительно ниже, чем TvNiR (рис. 14).

Нитритредуктазная активность гомогената составляла 5,7 мкмоль/мин на мг суммарного белка, что соответствует содержанию TvNiR в гомогенате около 3 %. Это ниже содержания TvNiR в гомогенате al2 аэробно выращенной культуры Tv.nitratireducens (ок. 9,5 %). Однако это можно объяснить тем, что в анаэробной культуре клетки на момент отбора образцов находились на начальной стадии развития, т.к. еще содержали значительное количество элементарной серы. Таким образом, TvNiR (как, по-видимому, и TvPaR) является конститутивным белком, его содержание не изменяется существенно в зависимости от условий роста: в присутствии нитрата или кислорода в качестве основного акцептора электронов в респираторных процессах. Это свидетельствует о том, что TvNiR не участвует в нитратном дыхании клетки.

Интересно, что TvNiR – единственный белок в гомогенате, проявляющий сульфитредутазную активность (рис. 14), что подтверждает наше предположение о его участии его в превращении соединений серы. Как и следовало ожидать, при росте Tv. nitratireducens в анаэробных условиях с нитратом в качестве респираторного акцептора электронов, в клетке синтезируется набор нитратредуктаз.

Рис. 14. Электрофорез в неденатурирующих условиях растворимой фракции гомогената Tv. nitratireducens, выращенной в анаэробных условиях с нитратом в качестве акцептора электронов. Гели покрашены по активности в присутствии различных субстратов (NO2-, SO32-, NO3-), а также в отсутствие субстрата (минус контроль). Цифрами обозначены дорожки: 1 –гомогенат Tv. nitratireducens, содержащий 20 µг суммарного белка, 2 -50 µг суммарного белка, 3 – чистый образец TvNiR 1 µг, 4 - маркеры молекулярной массы.

Анализ последовательностей гомологичных белков, адаптация 9.

аминокислотного состава белков из галоалкалофильных организмов В базах данных UniProt Knowledgebase обнаружены гены еще 16 белков, имеющих гомологию более 40 % с TvNiR и TvPaR (таблица 5).

Во всех транслированных последовательностях присутствуют семь мотивов СххСН, отвечающих за связывание гемов с и уникальный для цитохром с нитритредуктаз мотив СххСК. Выравнивание аминокислотных последовательностей с совмещением гем-связывающих мотивов показало, что во всех присутствуют:

консервативные каталитические остатки, соответствующие остаткам активного центра TvNiR и TvPaR, остатки, участвующие в TvNiR и TvPaR в формировании полости активного центра и ответственные за связывание иона Са2+, обнаруженного во всех пяти- и восьмигемовых нитриредуктазах. Рядом с каталитическим остатком Tyr303 во всех последовательностях был обнаружен остаток Cys305, характерный только для восьмигемовых нитритредуктаз. Приведенные данные позволяют выделить эти белки, обладающие высокой гомологией функциональных участков, в отдельное семейство восьмигемовых нитритредуктаз.

Максимальная гомология, обнаруженная для белков из галоалкалофильных бактерий разных таксономических групп: Tv. paradoxus, Tv. nitratireducens, Tv.

thiocyanoxidans, D. alkaliphilus и D. bacterium MLMS1, дает основание предполагать структурную адаптацию этих белков к существованию в условиях повышенных рН и солености. Согласно существующим в настоящее время представлениям, повышение содержания кислых аминокислот на поверхности молекулы (+DE-стратегия) является одним из основных факторов адаптации белков из гало- и алкалофилов.

Таблица 5. Сравнительный анализ аминокислотного состава гомологичных восьмигемовых цитохромов с.

(Аминокислотные остатки обозначены однобуквенным кодом) Организм Гомо Содержание аминокислотных pI логия остатков (%) (%) DE K R Tv. paradoxus 100 5,95 13,5 4,0 6, Галоалкалофи Tv. nitratireducens 81 5,91 13,5 3,8 6, Tv. thiocyanoxidans ARh 4 100 5,95 13,5 4,0 6, лы Desulfurivibrio alkaliphilus, strain 54 6,6 12,5 5,9 5, DSM deltaproteobacterium MLMS-1 53 5,63 14 4,2 6, Geobacter sulfurreducens 47 9,0 12,2 10,5 4, Geobacter sulfurreducens, strain 47 9,0 12,2 10,5 4, DL- Негалофильные нейтрофилы Pelobacter propionicus, strain DSM 47 8,93 11,8 6,6 7, Geobacter sp., strain M21 46 8,95 12,6 11,3 4, Geobacter sp., strain FRC-32 45 8,86 12,9 10,2 5, Geobacter lovleyi, strain ATCC 48 9,15 11,1 11,1 3, BAA- Geobacter uraniireducens, strain Rf4 46 9,01 13,6 11,9 4, Geobacter bemidjiensis, strain Bem 45 9,03 12,3 11,5 3, Calditerrivibrio nitroreducens, strain 43 8,89 11,2 10,1 3, DSM Sutterella wadsworthensis 3_1_45B 41 8,96 9,3 7,7 4, Parasutterella excrementihominis 43 8,34 9,5 7,3 3, YIT Burkholderiales bacterium 1_1_47 45 8,17 11,8 8,3 4, Дополнительными факторами адаптации у галофилов являются: уменьшение содержания Lys, а также уменьшение общего содержания гидрофобных аминокислот с одновременной заменой объемных гидрофобных остатков (Ile+Leu+Met+Phe) на небольшие (Gly+Ala+Val). У алкалофилов дополнительной стратегией адаптации является замещение остатков Lys и Asp на Arg и Glu (-DK+ER), соответственно.

Сравнительный анализ аминокислотного состава гомологичных восьмигемовых цитохромов с показал, что содержание и относительный состав гидрофобных остатков приблизительно одинаков для всех рассматриваемых гомологичных белков.

Последовательности пяти нитритредуктаз из галоалкалофилов характеризуются небольшим (1-2 %) повышением содержания кислых аминокислотных остатков Asp+Glu, которое сопровождается более чем двукратным уменьшением содержания Lys по сравнению с белками из негалофильных бактерий, что приводит к снижению pI в среднем на 3 единицы (таблица 5). Таким образом, именно снижение содержания Lys является основным механизмом адаптации в рассматриваемой группе белков.

Снижение содержания Lys сопровождается небольшим (около 1,5 %) увеличением содержания Arg, т.е. реализуется стратегия адаптации (-DK+ER), характерная для белков из алкалофилов.

Известно, что вследствие высокой гидрофобности алифатической части боковой группы лизина уменьшение его содержания в галофильных белках – ключевой фактор уменьшения экспонированной в растворитель гидрофобной поверхности, что приводит к стабилизации и снижению агрегации белков в солевых растворах. В случае галоалкалофилов, вклад этого механизма в адаптацию может возрасти, так в щелочных условиях (рН 9-10,5) аминогруппы боковых остатков лизина депротонированы и гидрофобность боковых остатков возрастает.

Выводы 1. Выделена и охарактеризована восьмигемовая нитритредуктаза TvPaR из галоалкалофильной облигатно хемоавтотрофной -протеобактерии Thioalkalivibrio paradoxus. Показано, что фермент проявляет нитрит-, гидроксиламин- и сульфитредуктазные активности. Охарактеризовано влияние факторов, связанных с условиями обитания бактерий, на активность TvPaR.

2. Установлена пространственная структура свободной формы TvPaR и комплекса с сульфитом методом рентгеноструктурного анализа. Сравнительный анализ структур TvPaR и TvNiR показал, что все основные структурные особенности TvNiR, отличающие ее от ранее описанных пятигемовых нитритредуктаз, оказались присущими и TvPaR, в том числе: образование связи Tyr-Cys в активном центре ферментов;

гексамерная структура, приводящая к образованию полости внутри гексамера;

канал транспорта продукта, выходящий во внутреннюю полость гексамера.

3. Олигомеризация TvNiR (TvPaR) с образованием гексамера не влияет на активность, но повышает стабильность фермента. Максимальная стабилизация достигается в условиях высокой концентрации солей, что может иметь функциональное значение для ферментов, локализованных в периплазме галоалкалофильных бактерий Tv.

nitratireducens и Tv. paradoxus, и может рассматриваться как один из факторов адаптации.

4. TvPaR и TvNiR являются конститутивными белками в клетках Tv. nitratireducens и Tv. paradoxus. Синтез TvNiR не связан с нитратным дыханием в анаэробных условиях культивирования Tv. nitratireducens.

5. Анализ аминокислотных последовательностей гомологичных восьмигемовых нитритредуктаз из галоалкалофильных и нейтрофильных негалофильных бактерий показал, что основным фактором адаптации к функционированию в условиях высоких рН и солености является снижение содержания лизина и повышение содержания кислых аминокислот.

Список публикаций по теме диссертации 1. Trofimov A.A., Polyakov K.M., Boyko K.M., Tikhonova T.V, Safonova T.N., Tikhonov A.V., Popov A.N., Popov V.O. (2010) Structures of complexes of octahaem cytochrome c nitrite reductase from Thioalkalivibrio nitratireducens with sulfite and cyanide. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 66, 1043-1047.

2. Trofimov A.A., Polyakov K.M., Tikhonova T.V., Tikhonov A.V., Safonova T.N., Boyko K.M., Dorovatovskii P.V., Popov V.O. (2012) Covalent modifications of the catalytic tyrosine in octahaem cytochrome c nitrite reductase and their effect on the enzyme activity. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 68, 144-153.

3. Тихонова Т.В., Тихонов А.В. (2010) Влияние условий культивирования и фазы роста клеток на синтез нитрат-, нитрит- и сульфитредуктазных активностей.

Современные проблемы науки и образования, №6, 29.

4. Alexey Tikhonov, Konstantin Polyakov, Konstantin Boyko, Tamara Tikhonova and Vladimir Popov (2009) Structure and stability of different oligomeric states of octaheme cytochrome c nitrite reductase. VIII European Symposium of the Protein Society, 14- June, Zurich/Switzerland.

Abstract

Book, p 174.

5. Tikhonov A.V., Polyakov K.M., Chernousova M.N., Tikhonova T.V., Popov V.O..

Structure-functional study of the octaheme cytochrome c from haloalkaliphilic thiocyanate-oxidizing bacterium Thioalkalivibrio paradoxus. In Abstract book of the 3d Latin American Protein Society Meeting (LAPSM), Argentina, 2010, p.384.

6. Tikhonov A.V., Polyakov K.M., Chernousova M. N, Tikhonova T.V., Popov V.O.

Crystallization and X-Ray Diffraction Study of Multiheme Cytochrome c from Haloalkaliphilic Bacterium Thioalkalivibrio paradoxus. In Abstract book of the 13th International conference on the Crystallization of Biological Macromolucules, Ireland, 2010, p. 204.