Интенсивность апоптоза лимфоцитов периферической крови у жителей прибрежных сел реки теча, подвергшихся хроническому радиационному воздействию
На правах рукописи
Блинова Евгения Андреевна
ИНТЕНСИВНОСТЬ АПОПТОЗА ЛИМФОЦИТОВ
ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ У ЖИТЕЛЕЙ ПРИБРЕЖНЫХ СЕЛ
РЕКИ ТЕЧА, ПОДВЕРГШИХСЯ ХРОНИЧЕСКОМУ
РАДИАЦИОННОМУ ВОЗДЕЙСТВИЮ
03.01.01 – «радиобиология»
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Москва-2011 2
Работа выполнена на базе Федерального государственного учреждения науки «Уральского научно-практического центра радиационной медицины»
Федерального медико-биологического агентства, г. Челябинск
Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ, Аклеев Александр Васильевич
Официальные оппоненты: доктор биологических наука, профессор Пелевина Ирина Ивановна доктор химических наук, профессор Серебряный Александр Маркович
Ведущая организация: Институт общей генетики им. И.Н.
Вавилова, г. Москва
Защита диссертации состоится « 16 » февраля 2012 г. в « » часов на заседании диссертационного совета Д.501.001.65. при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119899, г.
Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет, ауд.
С диссертацией можно ознакомиться в читальном зале библиотеки биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова Автореферат разослан « » 2011 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, Т.В. Веселова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. В современном мире человек неизбежно подвергается воздействию ионизирующего излучения вследствие контакта с разнообразными источниками излучения. Облучению подвергается не только узкая группа специалистов, работа которых непосредственно сопряжена с источниками излучения, например врачи рентгенологи, сотрудники атомных станций, космонавты, ликвидаторы последствий аварий, но и широкая группа населения, которая подвергается ионизирующему облучению в процессе диагностики и лечения ряда заболеваний. Кроме того, опыт прошлых десятилетий в области использования атомной промышленности, как в военных, так и в мирных целях, свидетельствует о высокой вероятности возникновения ситуаций, при которых облучаются многочисленных групп населения в широком диапазоне доз. Как правило, в такой ситуации, люди подвергаются в начальный период острому облучению, с последующим равномерным снижением мощности дозы облучения в течение длительного периода времени, что в итоге способствует развитию отдаленных последствий ионизирующего излучения.
Для реализации отдаленных последствий воздействия ионизирующего излучения на клетку, наряду с повреждением ДНК, важным является активация защитных механизмов клетки: репарации повреждений, регуляции клеточного цикла и апоптоза (Пелевина И.И. и др., 2000;
Бондарчук И.А., 2003;
Серебряный А.М. и др., 2004).
Согласно современным знаниям о реакции молекулярных структур клеток на повреждающие воздействие ионизирующего излучения, программируемая клеточная смерть является одним из главных механизмов поддержания постоянства генома (Мазурик В.К., 2005, Edinger A.E., 2004, Huang L., 2003, Jeggo P.A., 2009).
В случае возникновения генетических нарушений процесса апоптоза, развиваются патологические состояния, сопровождающиеся с одной стороны сохранением в организме клеток с неограниченным пролиферативным потенциалом, тем самым увеличивая вероятность развития онкопаталогии (Барышников А.Ю. и др. 2002, Ярилин А.А., 2006, Huang L. et al, 2003), а с другой стороны развитием дистрофических процессов, связанных с усиленной гибелью клеток (Квачева А.Ю., 2002, Afford S. et al, 2000).
У лиц, подвергшихся хроническому радиационному воздействию на реке Теча, одним из ранних эффектов облучения являлось развитие хронической лучевой болезни. У таких пациентов наблюдалось угнетение процессов гемопоэза, выражающееся в развитии лейкопений, нейтропений и тромбцитопений. В более поздние периоды, от начала радиационного воздействия, гематологические показатели улучшались, однако, после прекращения внешнего -облучения, в течение длительного времени сохранялась лейкопения и нейтропения, за счет поступления радионуклидов в организм (Аклеев А.В., 2000).
Кроме того, в отдаленные периоды наблюдается повышение уровня соматических мутаций в гене Т-клеточного рецептора, увеличение частоты хромосомных аберраций, увеличение числа клеток с блоком клеточного цикла (Veremyeva G.A. et al, 2010), а также отмечается повышенный риск развития таких соматических эффектов как рак и лейкоз (Косенко М.М. и др., 1999, Kristinina L.Yu. et al., 2005).
На данный момент остается открытым вопрос изменения интенсивности апоптоза у хронически облученных лиц пожилого и старческого возраста.
Проведенное нами исследование даст возможность оценить интенсивность апоптоза у обследованных лиц, подвергшихся длительному радиационному воздействию, усугубляющемуся инволюционными процессами, в силу которых происходит увеличение частоты возникновения целого ряда заболеваний связанных с апоптозом, таких как злокачественные опухоли, лейкозы, а так же различных дегенеративных процессов. В связи с этим исследование апоптоза как одного из основных барьерных механизмов, защищающих организм от генотоксического действия радиации, является актуальным.
Цель работы: исследовать влияние хронического радиационного воздействия на апоптоз лимфоцитов периферической крови (ЛПК) в отдаленные сроки у лиц, проживающих в прибрежных селах реки Теча.
Задачи исследования:
1. Сравнить интенсивность исходного уровня апоптоза ЛПК, а также после стандартных нагрузочных тестов ex vivo (облучение лимфоцитов в дозе Гр, инкубации 5 и 24 часа), у лиц, подвергшихся хроническому радиационному воздействию, в том числе перенесших хроническую лучевую болезнь (ХЛБ), и у необлученных лиц.
2. Оценить зависимость частоты апоптоза лимфоцитов от дозы и мощности дозы облучения красного костного мозга (ККМ), дозы и мощности дозы облучения всего тела, а также пола, национальности и возраста на время обследования.
3. Исследовать взаимосвязь интенсивности апоптоза лимфоцитов с частотой соматических мутаций, блоком клеточного цикла, а также биохимическими и иммунологическими показателями, у лиц, подвергшихся хроническому радиационному воздействию.
Научная новизна исследования. Впервые у жителей прибрежных сел реки Теча, подвергшихся хроническому радиационному воздействию, была исследована интенсивность апоптотической гибели ЛПК на ее ранней стадии и стадии фрагментации ДНК с использованием метода проточной цитометрии.
Было выявлено повышение количества клеток с ранней стадией апоптоза у облученных лиц, как на исходном уровне, так и после дополнительных нагрузок ex vivo. Проведен анализ влияния факторов радиационной и нерадиационной природы на интенсивность апоптоза ЛПК у облученных лиц. Показано сочетанное влияние дозы облучения и возраста на частоту апоптотической гибели ЛПК. Впервые у хронически облученных лиц изучена взаимосвязь апоптотической гибели ЛПК с иммунологическими и биохимическими параметрами, а также частотой клеток с мутациями Т-клеточного рецептора и блоком клеточного цикла.
Теоретическая и практическая значимость. Результаты исследования дополняют имеющиеся данные о состоянии защитных механизмов клеток и вносят вклад в понимание механизма развития отдаленных эффектов облучения у людей, подвергшихся хроническому неравномерному радиационному воздействию в диапазоне доз на ККМ от 0,09 до 4,23 Гр на реке Теча.
Полученные данные можно учитывать при оценке индивидуальной радиочуствительности людей к хроническому радиационному воздействию.
Разработанный комплекс методик определения апоптоза ЛПК с использованием проточной цитометрии может быть использован в курсе практических занятий на кафедре радиационной биологии биологического факультета Челябинского государственного университета.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. В отдаленные сроки после хронического радиационного воздействия (дозы облучения ККМ от 0,09 до 4,23 Гр, среднее значение 1,05±0,06 Гр) у лиц преимущественно пожилого и старческого возраста отмечено увеличение интенсивности исходного уровня апоптотической гибели ЛПК на ранней стадии, а также повышение частоты апоптотической гибели клеток на ранней стадии, после дополнительных нагрузочных тестов ex vivo.
2. У лиц, подвергшихся хроническому радиационному воздействию, в отдаленные сроки, выявлена зависимость изменения количества CD95+ клеток от дозы и мощности дозы облучения ККМ и всего тела. Активация апоптотической гибели ЛПК обусловлена комплексом факторов радиационной и нерадиационной (возраст) природы.
Апробация работы: Материалы диссертационной работы были доложены на 12th International Congress of the International Radiation Protection Association (Buenos Aires, Argentina, 2008), 10th International Conferences on Health Effects of Incorporated Radionuclides (Santa Fe, NM., 2009), на 54th Annual Meeting of the Health Physics Society (Minneapolis, USA, 2009), на международной научно-практической конференции, посвященной 10-летию создания Северского биофизического центра ФМБА России (Томск, 2010), на международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (Москва, 2010), на IV международной конференции «Хроническое радиационное воздействие:
эффекты малых доз» (Челябинск, 2010), на 56th Annual Meeting of the Health Physics Society (West Palm Beach, USA, 2011).
Публикации: по материалам работы опубликовано 17 печатных работ, из них 3 в изданиях, рекомендованных ВАК.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав посвященных результатам собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы включающего 40 отечественных и иностранных источников.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы Характеристика обследованных лиц. Исследование интенсивности апоптоза проводилось у лиц, проживающих в прибрежных селах реки Теча, подвергшихся хроническому радиационному воздействию в результате сбросов радиоактивных отходов производственным объединением «Маяк» в речную систему Теча-Исеть-Тобол-Иртыш-Обь с 1949 по 1956 гг. Население прибрежных сел подверглось комбинированному внешнему - и внутреннему и Основным дозообразующим радионуклидом являлся -излучению.
остеотропный Sr, тканями-мишенями которого был слой остеогенных клеток, выстилающих поверхности скелета, и клетки красного костного мозга.
Длительный период полураспада 90Sr привел к облучению тканей в течение длительного периода времени с постепенно снижающейся мощностью дозы (Аклеев А.В. и др., 2000, Tolstykh E.I. et al., 2011).
Кроме того значимый вклад в формирование дозы внес 137Cs и 89Sr, но благодаря короткому периоду полураспада 89Sr и быстрому выведению из организма 137Cs, облучение за счет этих радионуклидов реализовывалось в первые 5 лет после их поступления (Аклеев А.В., 2000). В настоящее время радиационное воздействие на организм человека обусловлено, прежде всего, инкорпорацией остеотропного Sr (Degteva M.O. et al, 2000, Tolstykh E.I. et all, 2011).
Исследования апоптотической гибели клеток проводились с 2008 по гг. на базе Уральского научно-практического центра радиационной медицины.
Была обследована группа облученных лиц, состоявшая из 144 человек проживающих на прибрежных территориях реки Теча. Среди облученных была выделена подгруппа облученных лиц перенесших ХЛБ (35 человек).
Контрольную группу составили 78 необлученных лиц проживающих в сходных социально-экономических условиях на незагрязненной территории.
Средний возраст облученных людей составил 70 лет (58-83 года), в группе облученных с ХЛБ средний возраст составил 71 год (68-83 года), в группе необлученных лиц средний возраст составил 68 лет (56-81 год).
Информация об индивидуальных накопленных дозах была получена из базы данных УНПЦРМ TRDS-2009. Средняя доза облучения ККМ для всех облученных лиц составила 1,05±0,06 Гр (0,09-4,23 Гр), средняя мощность дозы ККМ составила 0,26±0,02 Гр/год (0,03-1,20 Гр/год), средняя доза облучения на все тело составила 0,06±0,007 Гр (0,0001-0,46 Гр), средняя мощность дозы на все тело составила 26,0±4,0 мГр/год (0,1-241,5 мГр/год). Средняя доза облучения ККМ для группы облученных лиц перенесших ХЛБ составила 1,06±0,1 Гр(0,09-2,87 Гр), средняя мощность дозы ККМ составила 0,22±0, Гр/год (0,04-0,88 Гр/год), средняя доза на все тело - 0,05±0,02 Гр (0,004-0,46 Гр), средняя мощность дозы облучения на все тело - 23±9 мГр/год (2-241,5 мГр/год).
Методы исследования. В работе использовались методы определения апоптоза ЛПК, позволяющие оценить раннюю стадию апоптоза по содержанию белка фосфатидилсерина (ФС) на внешней поверхности мембраны;
позднюю стадию апоптоза, определенную по показателю фрагментации ДНК, а также количество клеток несущих на своей поверхности активационный рецептор смерти CD95 (Vermes I. et al. 2000, Lamm G.M. et al., 1997, Wilkins R.C. et al., 1999). Кроме того, нами было определено количество клеток погибших путем некроза, а также количество CD3-CD4+ клеток.
Схема эксперимента. В качестве объекта исследования был выбран лимфоцит периферической крови, выделенный в стерильных условиях, на градиенте плотности фиколл-урографин (Хейфец Л.Б. и др., 1973).
Была проведена оценка исходного уровня апоптоза ЛПК и после дополнительных нагрузок ex vivo. В качестве дополнительных нагрузок применялась инкубация 5 и 24 часа, а также облучение in vitro в дозе 1Гр на исследовательской гамма-установке ИГУР-1, мощность экспозиционной дозы 0,75 Гр/мин, источник - 60Co, с последующей инкубацией 5 и 24 часа. Клетки инкубировались при 37 С0 в среде RPMI-1640 (4мл) в присутствии сыворотки крупного рогатого скота (1 мл) с добавлением глютамина и смеси антибиотиков (Lopez et. al. 1991).
Анализ частоты апоптотических клеток после дополнительных нагрузок позволит судить об адаптационных возможностях облученных клеток.
Суспензию клеток для определения фосфатидилсерина и некротических клеток окрашивали по стандартной методике (Wilkins et al. 2002) с использованием набора Annexin V-FITC Kit (Becton Dickinson, США).
Суспензию клеток для определения фрагментации ДНК пермобилизировали 4% парофармольдегидом, фиксировали 70% этиловым спиртом и окрашивали по стандартной методике TUNEL Apo-Direct Kit (Becton Dickinson, США) (Vermes I. et al. 2000).
Частоту клеток с рецептором CD95 определяли с помощью моноклональных антител IgG1-PE изотипический контроль, CD95-PE (Becton Dickenson, США).
Частоту мутаций в генах TCR оценивали по количеству лимфоцитов с генотипом CD3-CD4+. Для этого лимфоциты периферической крови окрашивали с применением моноклональных антител CD3-FITC, CD4-PE, Ig 1 FITC\Ig 1-PE (Becton Dickenson, США).
Анализ апоптотических клеток с белком фосфатидилсерин, фрагментацией ДНК, рецептором CD95, а также CD3-CD4+ лимфоцитов проводили на проточном цитофлуориметре серии EPICS XL-MCL (аргоновый лазер 488 нм мощностью 15 мВт).
Статистический метод. Закон распределения полученных данных определялся тестом Колмогорова-Смиронова. По результатам теста, для сравнения полученных выборок, использовался непараметрический U-тест Манна-Уитни. Для описания выборок использовались медианы и 25- процентиль. Связь между дозовыми показателями и частотой апоптоза, а также связь между нерадиационными показателями и частотой апоптоза определяли с помощью ранговой корреляции по Спирману. Определение вида зависимости показателей апоптотической гибели от дозы и мощности дозы проводилось с использованием регрессионного анализа. Для аппроксимации зависимости применялись линейная, кубическая и экспоненциальная регрессионные модели.
Влияние факторов радиационной и нерадиационной природы оценивали с помощью факторного анализа (анализ главных компонент с использованием вращения по методу Варимакса). Во всех случаях нулевую гипотезу отклоняли при р0,05. Для оценки влияния пола, возраста и национальности на показатели апоптотической гибели клеток использовался многомерный дисперсионный анализ. На основании критерия «След Пиллая» нулевая гипотеза отклонялась в том случае, если между всеми возрастными группами не наблюдалось различий ни для одной из зависимых переменных (р=0,002) (Реброва О.Ю., 2002, Таганов Д.Н., 2005, Sokal R.R. et al., 1995). Статистический анализа проводили в программных пакетах Statistica 7.0, SPSS Statistic 17.0, KyPlot Portable 2.0.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Оценка исходного уровня апоптоза ЛПК у лиц подвергшихся хроническому радиационному воздействию В таблице 1 представлены данные исходного уровня апоптотической и некротической гибели лимфоцитов, а также количество клеток с рецептором CD95. Количество клеток на ранней стадии апоптоза, определенных по содержанию белка ФС на поверхности мембраны, у всех облученных лиц и лиц без ХЛБ статистически значимо выше, по сравнению с группой не облученных лиц, что составляет 3,11% (р=0,01) против 0,52%. Напротив, в группе облученных лиц с ХЛБ не наблюдается статистически значимого увеличения исходного уровня апоптоза, по сравнению с группой облученных без ХЛБ и группой лиц, не подвергшихся облучению.
Увеличение количества клеток на стадии фрагментации ДНК, во всех обследованных группах облученных людей, было приблизительно равным и статистически незначимым, относительно группы необлученных лиц.
Содержание клеток, с активационным рецептором CD95 на поверхности лимфоцитов периферической крови, статистически значимо не различается в группах «облученные с ХЛБ» и «облученные без ХЛБ» как между собой, так и с группой необлученных лиц.
Таблица 1 - Частота (%) апоптотических и некротических клеток в группе облученных лиц CD95+клетки Группы Ранний Фрагментация Некроз апоптоз ДНК Медиана Медиана Медиана Медиана (25%-75%) (25%-75%) (25%-75%) (25%-75%) Все 3,11 0,15 4,1 0, облученные (1,24-5,36) (0,06-0,47) (0,10-24,2) (0-0,01) p=0, Облученные 3,11 0,15 2,05 0, без ХЛБ (1,32-5,17) (0,06-0,39) (1,05-4,51) (0-0,01) р=0, Облученные с 2,37 0,16 1,96 0, ХЛБ (0,10-5,54) (0,06-0,79) (1,13-6,48) (0-0,05) Необлученные 0,52 0,11 3,77 0, (0,04-2,34) (0,04-0,36) (0,05-13,8) (0-0,02) Примечание: р – статистически значимые различия с группой «Необлученные»
Количество клеток погибших путем некроза, во всех обследованных группах, составило минимальный процент - 0,01.
Увеличение апоптотической гибели ЛПК на ранней стадии может быть объяснено реакцией наиболее чувствительной фракции лимфоцитов на выделение из периферической крови. Отсутствие значимого увеличения апоптотической гибели на поздней стадии апоптоза может быть связано с тем, что апоптотическая гибель регистрировалась сразу после выделения, тем самым стадия фрагментации ДНК еще не реализовалась. Кроме того, известно, что начавшийся процесс апоптоза не всегда завершается фрагментацией ДНК с последующим образованием апоптотических телец. На ранних стадиях апоптотической гибели, в результате ряда причин, возможно переключение, посредством биохимических процессов, с апоптотической гибели клеток на некротическую или гибель путем аутофагии (Edinger A.E. et al., 2004 Scott R.C.
et al., 2007).
Оценка апоптоза ЛПК при дополнительных нагрузках у лиц, перенесших хроническому радиационному воздействию.
В таблице 2 представлено количество апоптотических клеток, определенных по наличию белка фосфатидилсерина на мембране ЛПК. При сравнении лиц, подвергшихся хроническому радиационному воздействию, с необлученными лицами было выявлено статистически значимое повышение частоты гибели клеток на ранней стадии апоптоза после 5 ч (р=0,001) и 24 ч (р=0,005) инкубации, а также, после дополнительного облучения культуры лимфоцитов в дозе 1 Гр, с последующей инкубацией 5 ч (р=0,001).
В группе облученных лиц без ХЛБ также наблюдалось статистически значимое повышение апоптотических клеток, при всех видах стрессовых воздействий, по сравнению с группой необлученных лиц (p0,05).
В группе облученных лиц с ХЛБ, несмотря на увеличение апоптотической гибели клеток относительно контрольной группы, отсутствовала статистическая значимость.
Таблица 2 - Частота апоптоза (%) при дополнительных нагрузках (ранняя стадия апоптоза) Группы Исходный 5ч Облучение 24 ч Облучение уровень инкубации 1 Гр + 5 ч инкубации 1 Гр + 24 ч инкубации инкубации Медиана Медиана Медиана Медиана Медиана (25%-75%) (25%-75%) (25%-75%) (25%-75%) (25%-75%) Все 3,11 6,11 5,21 27,69 26, облученные (1,24-5,36) (3,87-10,42) (3,63-10,5) (16,52-35,0) (17,7-36,95) р*=0, р=0,01 р=0,001 р=0,001 р=0, * р**=0, р =0, р**=0, Облученные 3,11 6,21 6,39 27,69 23, без ХЛБ (1,32-5,17) (4,13-11,69) (4,58-14,27) (16,52-32,9) (18,04-36,3) р=0,007 р=0,001 р=0,001 р=0,004 р=0, * * р*=0, р =0,01 р =0, р**=0,005 р**=0, Облученные с 2,73 3,79 2,94 36,85 29, ХЛБ (0,10-5,54) (2,3-6,9) (1,17-4,46) (9,64-56,35) (0,43-40,6) р*=0,001 р*=0, р**=0,002 р**=0, Необлученные 0,52 0,68 0,61 14,25 18, (0,04-2,34) (0,36-0,86) (0,38-1,30) (4,62-18,2) (10,4-25,9) р*=0,001 р*=0, р**=0,001 р**=0, Примечание: p - статистически значимые различия с группой «Необлученные»
р* - статистически значимые внутригрупповые отличия от исходного уровня апоптоза р** - статистически значимые внутригрупповые отличия от 5 часов инкубации / 5 часов инкубации с предварительным облучением.
При анализе изменения количества апоптотических клеток после нагрузок с исходным уровнем и сравнение между собой количества апоптотических клеток после инкубации 5 и 24 часа, а также сравнение между собой после облучения в 1 Гр и инкубации 5 и 24 часа внутри выделенных групп, был выявлен ряд особенностей.
У облученных людей как с ХЛБ, так и без ХЛБ частота апоптотической гибели клеток, после 24 часов инкубации, статистически значимо выше в сравнении с 5 часами инкубации и исходным уровнем. Кроме того в этих же группах частота апоптоза после 24 ч инкубации с предварительным облучением, по сравнению с 5 ч инкубации с предварительным облучением и исходным уровнем, также статистически значимо выше.
В таблице 3 представлена частота апоптотических клеток, на стадии фрагментации ДНК.
Таблица 3 - Частота (%) апоптоза при дополнительных нагрузках (фрагментация ДНК) Группы Исходный 5ч Облучение 24 ч Облучение уровень инкубации 1 Гр + 5 ч инкубации 1 Гр + 24 ч инкубации инкубации Медиана Медиана Медиана Медиана Медиана (25%-75%) (25%-75%) (25%-75%) (25%-75%) (25%-75%) Все 0,15 0,43 0,53 0,56 0, облученные (0,06-0,47) (0,12-0,86) (0,15-1,15) (0,24-1,73) (0,24-1,98) р*=0,01 р*=0,01 р*=0,01 р*=0, р**=0,04 р**=0, Облученные 0,15 0,36 0,46 0,56 0, без ХЛБ (0,06-0,39) (0,13-0,79) (0,12-1,12) (0,26-1,50) (0,29-2,13) р*=0,01 р*=0,01 р*=0,01 р*=0, р**=0,04 р**=0, Облученные с 0,16 0,50 0,72 0,49 0, ХЛБ (0,06-0,79) (0,10-1,09) (0,22-1,85) (0,14-2,30) (0,18-1,45) р*=0,01 р*=0, Необлученные 0,11 0,58 0,54 0,32 0, (0,04-0,36) (0,19-1,24) (0,23-1,49) (0,08-1,72) (0,19-3,02) р*=0,01 р*=0,01 р*=0,01 р*=0, Примечание: р* - статистически значимые внутригрупповые отличия от исходного уровня апоптоза р** - статистически значимые внутригрупповые отличия от 5 часов инкубации / 5 часов инкубации с предварительным облучением.
Во всех исследованных группах облученных лиц, при различных дополнительных нагрузках, отсутствуют статистически значимые различия, по сравнению с контрольной группой по критерию фрагментации ДНК.
Важно отметить, что при проведении внутригрупповых сравнений изменения интенсивности апоптотической гибели на стадии фрагментации ДНК, выявлено некоторое отличие от изменения ранней апоптотической гибели.
У всех облученных, облученных без ХЛБ и необлученных лиц наблюдается статистически значимое повышение апоптотической гибели клеток после всех видов нагрузок, по сравнению с исходным уровнем. При этом, в этих группах максимальное количество клеток погибших путем апоптоза регистрируется спустя 24 часа инкубации с предварительным облучением лимфоцитов в дозе Гр. Кроме того, у облученных людей без ХЛБ частота апоптотической гибели клеток после 24 часов инкубации в сравнении с 5 часами инкубации, а также после 24 ч инкубации с предварительным облучением по сравнению с 5 ч инкубации с предварительным облучением, статистически значимо выше. В группе облученных лиц перенесших ХЛБ, несмотря на повышение клеток гибнущих апоптозом после дополнительных нагрузок, статистически значимые изменения, относительно исходного уровня, наблюдаются только после предварительного облучения и последующей инкубацией 5 и 24 часа. В том случае, если применялась только инкубация, доля ЛПК погибших апоптозом после 5 ч и 24 ч была одинаковой.
Таким образом, у облученных лиц как с ХЛБ, так и без ХЛБ наблюдается увеличение апоптотической гибели клеток по показателю белка фосфатидилсерина на поверхности мембраны относительно необлученных лиц после дополнительных нагрузок. Это может свидетельствовать о некотором истощении репарационного потенциала и более высокой вероятности возникновения de novo повреждений генома у облученных лиц. В данном случае не стоит также исключать влияние факторов нерадиационной природы, в частности возраста, на вероятность возникновения повреждений в геноме.
При сравнении ранней и поздней стадий апоптоза, обращает на себя внимание ускоренное завершение апоптотической гибели клеток у необлученных лиц. При этом у облученных без ХЛБ нарастание клеток на ранней стадии и стадии фрагментации ДНК происходит постепенно, достигая максимума к 24 часам инкубации. В тоже время, после предварительного облучения in vitro у необлученных лиц максимум апоптотических клеток по показателю фрагментации ДНК приходиться на 24 часа, как и у облученных.
По-видимому, изменения в скорости гибели клеток у обследованных лиц могу быть связаны с тем, что часть клеток гибнет сразу после действия стрессовых факторов, а часть уходит в задержку клеточного цикла (Endlich B. et al., 2000) и гибнет путем апоптоза в более поздние сроки, о чем свидетельствуют предварительные результаты проведенного нами исследования по увеличению белка Chk2, после дополнительных нагрузок, в два и более раз, по сравнению с исходным уровнем.
Влияние факторов радиационной и нерадиационной природы на апоптоз лимфоцитов периферической крови в группе облученных лиц.
При исследовании зависимости апоптотической гибели ЛПК от дозы и мощности дозы облучения ККМ и всего тела, регрессионным анализом с использованием линейной, квадратичной и кубической моделей были выявлены: слабая зависимость количества клеток с рецептором CD95 от мощности дозы облучения ККМ (y=3,36+2,14D+5,02D2;
R2=0,068;
р=0,01), а также слабая зависимость от дозы на все тело (y=3,194+40,991*D 354,541*D2+753,061*D3;
R2=0,185;
р=0,001) и мощности дозы на все тело (y=0,054*D+2,969;
R2=0,164;
p=0,001).
При исследовании регрессионным анализом зависимости апоптотической гибели ЛПК на ранней стадии и стадии фрагментации ДНК от дозы и мощности дозы не было выявлено статистически значимых зависимостей.
Затем в группе облученных лиц нами были сформированы дозовые подгруппы для проведения анализ зависимости апоптотической гибели клеток на стадии фрагментации ДНК от дозы и мощности дозы на ККМ и все тело.
А В Рис. 1 - Зависимость изменения апоптотической гибели клеток с фрагментацией ДНК от дозы облучения ККМ (А), и мощности дозы облучения ККМ (В).
Примечание: Здесь и далее указана медиана и интервал в 25-75 процентилей Изменение частоты апоптоза, от дозы облучения ККМ (рис. 1А), характеризуется повышением уровня апоптотической гибели клеток в диапазоне доз от 0 до 0,7 Гр, с последующим спадом в дозе 1 Гр. В диапазоне доз от 0,5 до 0,8 Гр количество апоптотических клеток статистически значимо выше, по сравнению с группой необлученных (р=0,04) и группой с диапазоном доз от 2 до 2,5 Гр (p=0,04).
Зависимость изменения частоты апоптотических клеток от мощности дозы облучения на ККМ представлена на рисунке 1В. Количество апоптотических клеток постепенно возрастает, при мощности дозы менее 0, Гр/год, относительно контрольной группы и достигает максимальных значений в дозовой подгруппе с интервалом мощности дозы от 0,1 до 0,2 Гр/год (р=0,05), а затем наблюдается снижение частоты апоптотической гибели до уровней в контрольной группе.
А В Рис. 2 - Зависимость изменения апоптотической гибели клеток с фрагментацией ДНК от дозы на все тело (А), и мощности дозы на все тело (В) Интересным представляется изменение частоты апоптоза, на стадии фрагментации ДНК, в зависимости от дозы и мощности дозы облучения всего тела, представленных на рисунке 2. При малых дозах облучения всего тела наблюдается статистически значимое повышение частоты апоптотических клеток в дозе 0,01 Гр (р=0,03), относительно группы необлученных лиц. После чего, повышение сменяется спадом в диапазоне доз до 0,1 Гр, в дальнейшем наблюдается некоторое увеличение количества апоптотических клеток, за которым следует статистически значимый спад интенсивности апоптотической гибели клеток в диапазоне доз от 0,2 Гр до 0,4 Гр, по сравнению с количеством апоптотических клеток в диапазоне доз от 0,01 до 0,05 Гр (р=0,03).
При изучении динамики изменения апоптотической гибели клеток, в зависимости от мощности дозы облучения всего тела, в выделенных дозовых подгруппах не наблюдается статистически значимых различий.
Отсутствие четких зависимостей «доза-эффект» в отдаленные сроки, по видимому, является следствием многолетнего воздействия различных факторов нерадиационной природы на организм обследованных людей. В пожилом возрасте усугубляющимися инволюционными процессами, проявляющимися в накоплении стареющих клеток с неэффективно работающими механизмами контроля генетической полноценности клетки. В связи с этим было предпринято исследование влияния комплекса радиационных и нерадиационных факторов на апоптоз ЛПК.
Таблица 4 - Зависимость частоты апоптотической гибели клеток (фрагментация ДНК) от факторов радиационной и нерадиационной природы Факторы Исходный 24 ч инкубации Облучения уровень 1 Гр + 24 ч инкубации Национальность p=0,4;
F=0,47 p=0,7;
F=0,1 p=0,9;
F=0, Пол p=0,5;
F=0,46 p=0,3;
F=0,16 p=0,2;
F=1, Возраст p=0,05;
F=2,76 p=0,001;
F=8,83 p=0,02;
F=3, Доза на ККМ p=0,1;
F=2,02 p=0,001;
F=6,41 p=0,05;
F=2, Доза на все тело p=0,4;
F=1,7 p=0,2;
F=1, p=0,005;
F=3, Мощность дозы на ККМ р=0,3;
F=1,25 р=0,9;
F=0,2 р=0,7;
F=0, Мощность дозы на все p=0,002;
F=5,37 р=0,9;
F=0,15 р=0,9;
F=0, тело Доза на ККМ+Возраст p=0,4;
F=1,1 p=0,001;
F=7,39 p=0,004;
F=4, Доза на все тело+Возраст p=0,001;
F=3,17 p=0,6;
F=0,79 p=0,3;
F=1, Примечание: F – коэффициент дисперсии;
По результатам дисперсионного анализа (таб. 4) было выявлено влияние фактора возраста (p=0,05;
F=2,76), дозы на все тело (p=0,005;
F=3,55), мощности дозы на все тело (р=0,002;
F=5,37), а также сочетанное влияние дозы на все тело и возраста (p=0,001;
F=3,17) на исходный уровень апоптоза. На уровень апоптотической гибели клеток после дополнительных нагрузок (инкубация 24 часа с облучением и без облучения) влияют такие факторы как возраст, доза на ККМ, а также сочетанное влияние возраста и дозы на ККМ.
Полученные результаты могут быть объяснены тем, что интенсивность апоптоза, с одной стороны, определяется возрастными изменениями, проявляющимися в накоплении генетических повреждений и как следствие увеличением частоты апоптотической гибели (Schmitz A., et al., 2003), а с другой стороны, повреждениями в генетической структуре зрелых лимфоцитов, вызванными дозовой нагрузкой в течение всего периода циркуляции клеток в кровотоке. Повреждения ДНК, которые возникли в стволовых клетках, о чем свидетельствует влияние дозы облучения ККМ на апоптотиечскую гибель, могут приводить к срыву адаптационных механизмов после стрессовых воздействий.
Кроме того, нами была проанализирована взаимосвязь показателей оксидативного стресса и ряда цитокинов с частотой апоптотических клеток, представленная в таблице 5.
Таблица 5 -Коэффициенты корреляции Спирмана для изучаемых параметров Некоторые параметры Исходный уровень CD95+ клетки апоптоза (фрагментация ДНК) Нитрит-ион (NO2-) -0,38 Нитрат-ион (NO3-) 0,362 Оксид азота (NO) -0,263 ФНО 0,25 0, ИЛ1 - 0, ИЛ2 - -0, ИЛ4 - -0, Примечание: для всех параметров рассчитаны коэффициенты корреляции по Спирману, р0,05 (2-х сторонняя).
Исходный уровень апоптоза умеренно положительно коррелирует с нитрат-ионом, фактором некроза опухоли и отрицательно умеренно коррелирует с нитрит-ионом и оксидом азота.
Клетки, несущие на своей поверхности рецептор CD95, положительно и умеренно коррелируют с содержанием в сыворотке фактора некроза опухоли и ИЛ1. С ИЛ2 и ИЛ4 данные клетки имеют отрицательную умеренную корреляционную связь.
Известно, что оксид азот может выступать как в качестве проапоптотического фактора, так и антиапоптотического фактора (Chen Y. Et al., 2001). ИЛ-2 является ингибитором апоптотической гибели клеток, а фактор некроза опухоли, напротив, способствует Fas-опосредованному пути апоптотической гибели, что подтверждается полученными результатами корреляционного анализа (Барышников А.Ю. и др., 2002, Kuida K. et al., 2000, Rabinowich H. et al., 1998).
При воздействии длительное время малыми мощностями дозы облучения в клетках возникают повреждения, которые репарируются, при этом у части клеток повреждения ДНК настолько велики, что клетки гибнут, а у части клеток поражения, вероятно, репарируются достаточно быстро, благодаря чему такие клетки способны дать клоногенное потомство. В том случае, когда репарация прошла неэффективно, возникают совместимые с жизнью структурные и функциональные дефекты в геноме стволовых кроветворных клеток, передающиеся их дифференцированным потомкам и реализующиеся в отдаленные эффекты облучения (Ярмоненко С.П., 2004, Little J.B. et al., 2003, Nagar S. Et al., 2005).
В связи с этим, нами было проанализировано изменение количества клеток с мутациями в гене Т-клеточного рецептора, а также изменение количества клеток с задержкой клеточного цикла и апоптотической гибелью клеток у облученных лиц в одинаковых дозовых подгруппах (рис. 3).
А В С Рис. 3 - Зависимость показателей частоты клеток с блоком клеточного цикла (А), доли CD3-CD4+ клеток (В), доли исходного уровня апоптотических клеток (С) от дозы облучения ККМ Согласно графику распределения частоты апоптотической гибели клеток, в зависимости от значения дозы облучения ККМ, наблюдается активация апоптоза в диапазоне доз от 0 до 0,8 Гр. Вместе с тем, мутации в гене Т клеточного рецептора так же нарастают, но достигают максимального значения в диапазоне доз от 0 до 0,5 Гр (р=0,02), с последующим спадом. Спад апоптотической гибели клеток в диапазоне доз от 1 Гр до 2 Гр сопровождается ростом CD3-CD4+ клеток. При этом количество клеток с блоком клеточного цикла значимо не изменяется в зависимости от дозы. Однако наблюдается тенденция к увеличению и последующему спаду количества клеток с блоком клеточного цикла в тех же дозовых диапазонах, что и изменения апоптотической гибели.
ВЫВОДЫ У лиц, проживающих в прибрежных селах реки Теча, в отдаленный 1.
период после начала хронического радиационного воздействия, средняя доза облучения красного костного мозга 1,05±0,06 Гр, диапазон индивидуальных значений от 0,09 до 4,23 Гр, выявлено статистически значимое повышение исходного уровня апоптоза на ранней стадии, по сравнению с необлученными лицами. Частота исходного уровня апоптоза по критерию фрагментации ДНК, клеток с рецептором CD95+ и некротических клеток статистически значимо не отличаются от группы необлученных лиц.
У лиц, подвергшихся хроническому радиационному воздействию, апоптоз 2.
лимфоцитов периферической крови, после дополнительных стандартных нагрузок in vitro (острое облучение в дозе 1 Гр и инкубация), по критерию ранней апоптотической гибели достоверно выше, по сравнению с необлученными лицами. По критерию фрагментации ДНК облученные лица статистически значимо не отличаются от группы необлученных лиц.
У жителей прибрежных сел реки Теча установлена зависимость 3.
увеличения количества клеток с рецептором CD95+ от увеличения дозы и мощности дозы облучения всего тела и мощности дозы облучения красного костного мозга. Полученная зависимость описывается линейной, квадратичной и кубической моделями.
У лиц, подвергшихся хроническому радиационному облучению, в 4.
отдаленные сроки после начала воздействия, отмечено сочетанное влияние факторов радиационной природы (доза облучения красного костного мозга и всего тела) и нерадиационной природы (возраст) на интенсивность апоптоза лимфоцитов периферической крови.
5. У облученных лиц, проживающих в прибрежных селах реки Теча, выявлена разнонаправленная корреляционная связь интенсивности апоптотической гибели клеток на стадии фрагментации ДНК с показателями оксидативного стресса (положительная с уровнем нитрат иона, отрицательная с уровнем нитрит-иона и оксидом азота в сыворотке крови), а также положительная корреляционная связь количества CD95+ клеток с TNF и ИЛ1 и отрицательная корреляционная связь с уровнем сывороточных ИЛ2 и ИЛ4.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАНЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК 1. Veremeyeva G., Akushevich I., Blinova E., Varfolomeyeva T., Ploshchanskaya O., Khudyakova O., Vozilova A., Kozionova O., Akleyev A.. Long –term cellular effects in humans chronically exposed to ionizing radiation // Health Physics. – 2010. – Vol.
97. –No. 3. – P. 337-346.
2. Маркина Т.Н., Веремеева Г.А., Блинова Е.А., Аклеев А.В. Блок клеточного цикла и активность апоптоза лимфоцитов периферической крови (ЛПК), частота мутаций в генах TCR в отдаленные сроки у людей, подвергшихся хроническому радиационному воздействию // Вопросы радиационной безопасности. – 2011. – № 1. – С. 41- 3. Блинова А.В., Веремеева Г.А., Аклеев А.В. Апоптоз лимфоцитов периферической крови и мутации в гене Т-клеточного рецептора у лиц перенесших хронической радиационное воздействие // Вопросы радиационной безопасности. – 2011. – № 4. – С. 38- Другие публикации 4. Блинова Е.А., Веремеева Г.А. Апоптоз лимфоцитов периферической крови человека при хроническом радиационном воздействии // Вестник Челябинского государственного университета: Серия Биология. – 2008. – № 4. – С. 99-102.
5. Аклеева А.В., Почухайлова Т.Н., Блинова Е.А. Пролиферация, клеточный цикл и апоптоз лимфоцитов крови человека в отдаленные сроки после хронического радиационного воздействии // Медицинская наука и образование Урала. – 2009.
– Т. 10. – № 3. – С. 52-54.
6. Veremeyeva G.A., Akushevich I.V., Ukraintseva S.V., Yashin A.I., Epifanova S.B., Blinova E.A., Akleyev A.V. A new approach to individual prognostication of cancer development under conditions of chronic radiation exposure // Int. Journal of Low Radiation. – 2010. – Vol.7. – No. 1. – P. 53-80.
7. Веремеева Г.А., Блинова Е.А., Почухайлова Т.Н., Аклеев А.В. Влияние хронического облучения на апоптоз лимфоцитов периферической крови человека // Материалы международной научно-практической конференции Чернобыльские чтения. – 2008. – С. 52-57.
8. Veremeyeva G., Varfolomeyeva T., Vozilova A., Blinova E., Pochukhailova T., Pushkaryov S., Akleyev A. Genomic instability at late time after chronic radiation exposure // Poster presentation at the 12th International Congress of the International Radiation Protection Association. –19-24 October 2008. – Buenos Aires, Argentina, 2008. – P. 92-93.
9. Veremeyeva G., Akushevich I., Blinova E., Pochukhailova T. and A. Akleyev. The Role of Apoptosis in the Development of Radiation-Induced Genome Instability under Chronic Radiation Exposure // Radioprotection. – 2008. – Vol. 43. – No.5., – P.
10. Veremeyeva G., Akushevich I., Pochukhailova T., Blinova E., Varfolomeyeva T., Ploshchanskaya O., Khudyakova O., Vozilova A., Kozionova O, Akleyev A.
Frequency of genomic abnormalities and peculiarities of physiological processes in blood cells under chronic radiation exposure in man: Bridging the Experimental and Epidemiologic Divide // Georgetown University Hotel & Conference Center. – 4- May 2009. – Washington, USA, 2009. – P. 37.
11. Veremeyeva G., Akushevich I., Pochukhailova T., Blinova E., Varfolomeyeva T., Ploshchanskaya O., Khudyakova O., Vozilova A., Kozionova O, Akleyev A. Long term Cellular Effects in Humans Chronically Exposed to Ionizing Radiation // Presentation at 10th International Conferences on Health Effects of Incorporated Radionuclides. – 10-14 May 2009. – Santa Fe, USA, 2009. – P.101.
12. Akleyev A.V., Pochukhailova T., Blinova E. Proliferation. Cell cycle and Apoptosis in Blood Lymphocytes at Late Time after Chronic Radiation Exposure in Man // 54th Annual Meeting of the Health Physics Society. – 12–16 July 2009. – Minneapolis, USA, 2009. – P. 13. Веремеева Г.А., Акушевич И.В., Маркина Т.Н., Блинова Е.А., Площанская О.Г., Варфоломеева Т.А., Худякова О.И., Аклеев А.В. Особенности внутриклеточных процессов при хроническом облучении человека // Тезисы докладов IV международной конференции «Хроническое радиационное воздействие: эффекты малых доз». 9-11 ноября 2010г. – Челябинск, 2010. – С. 14. Блинова Е.А., Веремеева Г.А., Аклеев А.В. Особенности апоптоза лимфоцитов у хронически облученных лиц, в том числе лиц, перенесших хроническую лучевую болезнь // Тезисы докладов IV международной конференции «Хроническое радиационное воздействие: эффекты малых доз». 9-11 ноября 2010г. – Челябинск, 2010. – С. 15. Блинова Е.А., Аклеева А.В., Веремеева Г.А. Апоптоз лимфоцитов крови человека в отдаленные сроки после хронического радиационного воздействия // Материалы 5 международной научно-практической конференции, посвященной 10-летию создания Северского биофизического центра ФМБА России. – 13- апреля 2010. – Томск, 2010. – С. 75- 16. Димов Г.П., Маркина Т.Н., Блинова Е.А., Веремеева Г.А., Аклеев А.В. Оценка показателей клеточного цикла лимфоцитов периферической крови как метод прогнозирования ответа системы гемопоэза на регенеративную терапию // Материалы 1 международной научно-практической конференции постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине. – 17- ноября 2010. – Москва, 2010. – С. 17. Площанская О.Г., Веремеева Г.А., Блинова Е.А. Частота мутаций в гене Тр53 и интенсивность апоптоза лимфоцитов периферической крови у людей, подвергшихся хроническому радиационному воздействию // Материалы международной научно-практической конференции постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине. – 17-19 ноября 2010. – Москва, 2010. – С.