Пролиферативная активность и задержка клеточного цикла лимфоцитов крови человека в отдаленные сроки хронического облучения
На правах рукописи
Маркина Татьяна Николаевна
ПРОЛИФЕРАТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ И ЗАДЕРЖКА КЛЕТОЧНОГО
ЦИКЛА ЛИМФОЦИТОВ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА В ОТДАЛЕННЫЕ СРОКИ
ХРОНИЧЕСКОГО ОБЛУЧЕНИЯ
03.01.01 - радиобиология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Москва, 2011 2
Работа выполнена на базе ФГУН – Уральского научно-практического центра радиационной медицины, г. Челябинск
Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор заслуженный деятель науки РФ, Аклеев Александр Васильевич
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Пелевина Ирина Ивановна доктор химических наук, профессор Серебряный Александр Маркович
Ведущая организация: Институт общей генетики им. Н.И.Вавилова.
г. Москва
Защита диссертации состоится «_2 »_июня_2011 г. в « 14.00_» на заседании диссертационного совета Д.501.001.65. в Московском государственном универ ситете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119991, г. Москва, ГСП-1, Ленинские горы, МГУ, биологический факультет, ауд.
С диссертацией можно ознакомиться в читальном зале библиотеки биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова Автореферат разослан «_» 2011 г.
Учный секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, Т.В. Веселова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Возрастающий риск облучения человека, связанный с бурно развивающейся атомной энергетикой и широким применением в медицине радиоизотопных методов диагностики и лечения приводит к необходимости исследо вания эффектов радиационного воздействия. После крупных радиационных инциден тов прошлых лет: атомной бомбардировки городов Хиросимы и Нагасаки, аварии на ЧАЭС, радиоактивного загрязнения вод р. Теча, ставшего результатом деятельности ПО «МАЯК», а также в связи с произошедшей в 2011 году радиационной аварией на Фукусиме-1, – особое место занимает проблема отдаленных эффектов радиационного воздействия на человека.
Известно, что ионизирующие излучение индуцируют комплекс цитогенетиче ских, биохимических и биофизических изменений в клетках организма животных и человека (Пелевина И. И. и др., 2003, Бурлакова Е. Б. и др., 1996), в том числе изме няет состояние клеточных защитных механизмов: систем антиоксидатной защиты, систем репарации, клеточного цикла (Пелевина И. И. и др., 2000, Серебряный А. М. и др., 2004). Один из основных механизмов «радиационной защиты» клетки направлен ных на предотвращение деления клеток с повреждениями ДНК - блок клеточного цикла (Кудряшов Ю. Б., 2004). В случае нарушения этого защитного механизма, по вреждения ДНК, возникающие при длительном облучении, могут быть реализованы в виде соматических мутаций, что, в конечном счете, может привести к продукции пула дефектных, структурно и функционально неполноценных клеток (Veremeyeva G.A. et.
al., 2010). Особенно актуально это в отношении радиочувствительных гемопоэтиче ских клеток красного костного мозга (ККМ).
В ряде экспериментальных работ показано, что у хронически облученных жи вотных выявлено изменение митотического цикла клеток ККМ (красного костного мозга) и их пролиферативной активности. Однако вопрос об экспрессии белка Chk (как маркера блока клеточного цикла) у хронически облученных людей ранее не рас сматривался.
У пострадавших при атомных бомбардировках в Японии (Kyoizumi S. et. al., 1990), ликвидаторов ЧАЭС (Замулаева И. А. и др., 2006), у работников атомной про мышленности (Смирнов и др. 2005;
Костюк С. В. и др. 2008) выявлено увеличение частоты мутаций в генах Т-клеточного рецептора (TCR). Но пока остатся неясным какова частота мутаций в генах TCR у хронически облученных людей в отдаленные сроки от начала радиационного воздействия (более 60 лет). В связи с этим особый ин терес может представлять изучение частоты лимфоцитов с блоком клеточного цикла (БКЦ), пролиферативной активности лимфоцитов периферической крови (ПК) и час тоты CD3-CD4+ лимфоцитов у облученных жителей прибрежных сел р. Теча, в отда ленные сроки. Район реки Теча является единственным регионом в мире, где, начиная с 1949 г., в результате производственной деятельности комбината "Маяк" сложились аварийные условия многолетнего облучения значительного по численности контин гента населения в широком диапазоне доз (Аклеев А. В., 2005). Особенно актуально, оценить данные параметры в период, когда большая часть облученных людей достиг ла пожилого возраста, характеризующегося снижением адаптационных резервов, ос лаблением систем контроля клеточного цикла, репарации, спонтанным увеличением частоты соматических мутаций.
Цель исследования – оценить пролиферативную активность лимфоцитов пе риферической крови (ЛПК), частоту лимфоцитов с блоком клеточного цикла (БКЦ) и частоту CD3-CD4+ лимфоцитов у людей, проживавших в прибрежных селах р. Теча и подвергшихся хроническому радиационному воздействию В задачи работы входило:
1. Исследовать пролиферативную активность и частоту лимфоцитов с БКЦ методом проточной цитометрии (по экспрессии белков Chk2 и Ki-67), а также частоту CD3-CD4+ лимфоцитов у хронически облученных людей в отдаленные сроки после начала радиационного воздействия.
2. Оценить пролиферативную активность, долю лимфоцитов с БКЦ, и частоту CD3-CD4+ лимфоцитов у лиц, перенесших хроническую лучевую болезнь (ХЛБ).
3. Проанализировать пролиферативную активность и долю лимфоцитов с БКЦ, частоту CD3-CD4+ лимфоцитов у облученных людей, имеющих лейкопению в отдаленные сроки радиационного воздействия.
4. Оценить зависимость пролиферативной активности и доли лимфоцитов с БКЦ, частоты CD3-CD4+ лимфоцитов от дозы облучения ККМ и мощности дозы в период максимального радиационного воздействия.
Научная новизна исследования. Впервые у жителей прибрежных сел р. Теча, подвергшихся хроническому комбинированному облучению, в том числе у лиц, пере несших ХЛБ и имеющих лейкопению в отдаленный период радиационного воздейст вия, исследована пролиферативная активность ЛПК и частота клеток с блоком кле точного цикла, методом проточной цитометрии на основе анализа экспрессии белков ki-67 и Chk2.
Проведен анализ влияния дозы и мощности дозы облучения ККМ на пролифе ративную активность и частоту лимфоцитов с БКЦ, а также частоту CD3-CD4+ лим фоцитов у хронически облученных людей в отдаленный период после начала радиа ционного воздействия.
Впервые изучена зависимость между содержанием лейкоцитов, лимфоцитов в периферической крови и пролиферативной активностью, а также блоком клеточного цикла ЛПК у облученных людей в отдаленные сроки после радиационного воздейст вия.
Практическая значимость работы. Оценка пролиферативной активности и частоты клеток с БКЦ, позволит обосновать и разработать критерии формирования групп риска в отношении отдаленных гемопоэтических эффектов.
Разработанная методика оценки доли (%) ЛПК с блоком клеточного цикла, ме тодом проточной цитометрии на основе анализа экспрессии белка Chk2, совместно с исследованием пролиферативной активности ЛПК (белок Ki-67) рекомендуется для прогнозирования ответа системы гемопоэза на стимулирующее воздействие при ле чении цитопенического синдрома, с применением регенеративной терапии.
Положения, выносимые на защиту 1. В отдаленные сроки после хронического радиационного воздействия (дозы облучения ККМ составили 0,06-4,46 Гр;
среднее значение - 1,11±0,06 Гр) у лиц пожи лого и старческого возраста в периферической крови отмечено увеличение уровня CD3-CD4+ лимфоцитов на фоне повышения пролиферативной активности лимфоци тов и клеток с блоком клеточного цикла. Частота лимфоцитов с блоком клеточного цикла в периферической крови и пролиферативная активность лимфоцитов зависят от мощности дозы облучения ККМ в период максимального облучения. Частота клеток с блоком клеточного цикла после инкубации и -облучения зависит от дозы облучения ККМ.
2. У лиц, перенесших хроническую лучевую болезнь, не выявлено изменений пролиферативной активности лимфоцитов периферической крови, уровня клеток с блоком клеточного цикла, а также изменения частоты CD3-CD4+ лимфоцитов.
3. Наибольшее увеличение пролиферативной активности лимфоцитов и час тоты лимфоцитов с блоком клеточного цикла выявлено у людей имеющих признаки лейкопении в отдаленные сроки хронического радиационного воздействия.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы были доложены на th 12 International Congress of the International Radiation Protection Association (Buenos Aires, Argentina. 2008), 10th International Conferences on Health Effects of Incorporated Radionuclides. (Santa Fe, NM., 2009), на 54 th Annual Meeting of the Health Physics So ciety (Minneapolis, USA, 2009), на 5 международной научно-практической конферен ции, посвященной 10-летию создания Северского биофизического центра ФМБА России (Томск, 2010), на 1 международной научно-практической конференции «По стгеноные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (Мо сква, 2010), на IV международной конференции «Хроническое радиационное воздей ствие: эффекты малых доз» (г. Челябинск, 2010).
Публикации. По материалам работы опубликовано 14 печатных работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследова ния, обсуждения, выводов и списка литературы, приложения. Работа изложена на станицах, иллюстрирована 10 рисунками, и 32 таблицами. Библиографический указа тель содержит 210 источников литературы.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы работы Характеристика обследованного контингента. В результате сброса радиоак тивных отходов ПО «Маяк» в речную систему Теча-Исеть-Тобол с 1949 по 1956 гг.
население прибрежных сел р. Теча подвергалось хроническому низкоинтенсивному комбинированному облучению (внешнему и внутреннему). Наибольшая мощность дозы наблюдалась в первые 6 лет. Основной вклад в формирование внутренней дозы облучения приходился на 90Sr, поэтому ККМ стал критическим органом радиацион ного воздействия (Аклеев А. В. и др., 2001).
Исследование частоты клеток с БКЦ, пролиферативной активности лимфоци тов и частоты CD3-CD4+ лимфоцитов проводилось с 2007 по 2010 г.г. на базе Ураль ского научно-практического центра радиационной медицины. Было обследовано облученных жителей прибрежных сел р. Теча. Контрольную группу составили 61 че ловек с нормальным клеточным составом крови, проживающие на незагрязненных радионуклидами территориях. Среди обследованных облученных лиц были выделены 2 подгруппы – люди, имеющие изменения гемопоэза в ранний период – лица, пере несшие ХЛБ (25 человек), и в отдаленный период от начала облучения – лица, имею щие лейкопению (30 человек).
Возраст обследованных облученных людей в среднем составил 70 лет (58– года), в группе сравнения 67,1 лет (59–80 лет), в группе людей перенесших ХЛБ – 73,64 лет (58–83 года), и в группе облученных с лейкопений – 68,89 лет (59–81 год).
Во всех обследованных группах преобладали женщины.
Информацию об индивидуальных накопленных дозах была получена из базы данных УНПЦРМ TRDS-2009. Средняя доза облучения ККМ для группы всех облу ченных людей составила 1,11±0,06 Гр (0,06–4,46 Гр), средняя мощность дозы 0,28±0,02 Гр\год (0,03-1,25 Гр\год), у облученных лиц с лейкопе-нией 1,07±0,19 Гр (0,06–4,46 Гр), средняя мощность дозы 0,27–0,06 Гр\год (0,04–1,25 Гр\год). В группе лиц, перенесших ХЛБ, средняя доза и мощность дозы облучения ККМ была меньше и составила 0,87±0,10 Гр (0,23–2,70 Гр) и 0,24±0,04 Гр\год (0,04–0,88Гр\год) соответст венно.
Методы исследования. На первом этапе работы мы оценили уровень лейкоци тов периферической крови (ПК). Подсчет общего количества лейкоцитов ПК прово дили на гематологическом анализаторе Abacus Junior B (Австрия). Подсчет лейкоци тарной формулы проводился – в мазках, окрашенных по методу Романовского-Гимза (Меньшиков В. В, 1987).
Объект исследования – лимфоциты периферической крови (ЛПК) человека, выделяли на градиенте плотности в стерильных условиях по стандартной методике (Хейфец Л. Б.и др.,1973). Для оценки частоты лимфоцитов с БКЦ в периферической крови – оценивали исходный уровень клеток, экспрессирующих белок сверочных то чек – Chk2 (Nyberg K. A. et. al., 2002). Оценивали частоту лимфоцитов с БКЦ после инкубации с митогеном (ФГА), что позволяет судить о доле клеток, несущих скрытые повреждения ДНК, которые регистрируются белками сверочных точек только при прохождении клеток через точку рестрикции. Анализ частоты данного показателя по сле нагрузочного теста в виде острого -облучения в дозе 1 Гр, позволил судить об эффективности работы системы сверочных точек. Облучение культуры ЛПК прово дили в дозе 1 Гр на установке Игур-1 (60Со), (мощность дозы 0,75 Гр/мин.) через 22 ч.
инкубации, затем культуру ЛПК снова инкубировали на протяжении 2 ч. для накоп ления клеток с задержкой клеточного цикла.
При исследовании пролиферативной активности мы оценивали долю лимфоци тов в ПК, экспрессирующих белок Ki-67 (спонтанно пролиферирующие лимфоциты), что позволило выявить процессы нарушения пролиферации (Lopez F. et. al. 1991) и пролиферативный потенциал, оцененный по частоте лимфоцитов (экспрессирующих ki-67), ответивших на митогенной стимул.
Инкубацию клеток проводили по стандартной методике в культуральной среде с митогеном при 37С0, 24 ч. (для оценки клеток с БКЦ) и 42 ч. (для оценки пролифера тивной активности) (Lopez F. et. al. 1991). Суспензию клеток фиксировали с приме нением набора Cyto\Fix (Beckton Dickenson, США), и окрашивали по стандартной ме тодике (Prussin C. et.al., 1995). Для выявления клеток с БКЦ применяли первичные ан титела anti-Chk2 (Beckton Dickenson, США) и вторичные FITC-меченные антитела (Beckton Dickenson, США), а также PI/RNAsa (Beckton Dickenson, США). Для оценки пролиферативной активности набор anti-ki (Beckton Dickenson, США) и PI/RNAsa (Beckton Dickenson, США).
Частоту мутаций в генах TCR оценивали по количеству лимфоцитов с генотипом CD3-CD4+. Для этого лимфоциты периферической крови окрашивали с применением моноклональных антител CD3-FITC, CD4-PE, Ig 1-FITC\Ig 1-PE (Beckton Dickenson, США).
Анализ клеток экспрессирующих белки Chk2 и ki-67, а также CD3-CD4+ лимфо цитов проводили на проточном цитофлуориметре серии EPICS XL-MCL (аргоновый лазер 488 нм мощностью 15 мВт).
Статистическую обработку полученных результатов проводили при помощи паке тов прикладных программ Microsoft Excel, STATISTICA 6.0. Использовались обще принятые методы вариационной статистики с вычислением средней арифметической величины, ее стандартной ошибки (M±m), характер распределения величин (тест Колмогорова-Смирнова), степень достоверности различий (U-теста Манна и Уитни).
Зависимость от дозы и мощности дозы, а также зависимость между показателями оценивали с помощью методов регрессионного анализа для линейной модели (Y=a+bx) и многофакторного дисперсионного анализа (Гланц C., 1999).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 1. Блок клеточного цикла и пролиферативная активность лимфоцитов пе риферической крови, частота CD3-CD4+лимфоцитов у лиц, подвергшихся хро ническому радиационному воздействию У облученных людей в отдаленный период (через 59-61 год) после начала радиа ционного воздействия исходная доля лимфоцитов с БКЦ достоверно увеличена 0,60% (p=0,008), по сравнению с контролем – 0,39% (рис.1.).
* Рис. 1. Доля лимфоцитов с блоком клеточного цикла в группе облученных людей (%), *р – достоверные различия с контролем (p=0,008) Частота клеток с БКЦ после инкубации с ФГА увеличилась в обеих группах. Не смотря на более высокие значения в группе облученных лиц (3,08%) по сравнению с группой контроля (2,93%) достоверных различий между ними не выявлено. После ин кубации и дополнительного облучения культуры лимфоцитов мы также не отметили различий между группами облученных и необлученных людей по частоте клеток с БКЦ.
Увеличение частоты лимфоцитов с БКЦ в периферической крови у облученных лиц по сравнению с необлученными, вероятно, обусловлено повышением частоты клеток с дефектами ДНК (Nyberg K. A.et. al. 2002), о чем свидетельствует выявленное ранее увеличение частоты лимфоцитов с хромосомными аберрациями и клеток с мик роядрами (Аклеев А. В., 2005). Увеличение доли лимфоцитов в ПК с дефектами ДНК в отдаленный период после начала радиационного воздействия может быть обуслов лено нестабильностью генома гемопоэтических клеток ККМ (Пелевина И. И.и др., 1996;
Little J. B. et. al., 1998), а также, возможно, результатом дефектов ДНК долго живущих лимфоцитов (Галактионов В. Г., 1998).
У жителей прибрежных сел р. Теча, подвергшихся хроническому низкоинтен сивному облучению, частота лимфоцитов пролиферирующих в ПК достоверно выше (2,15%, p=0,02) значений у необлученных лиц (1,26%) (рис. 2).
* Рис. 2. Доля пролиферирующих лимфоцитов в группе облученных людей (%), * р – достоверные различия с контролем (p=0,02) После митогенной стимуляции и инкубации культуры лимфоцитов доля про лиферирующих ЛПК увеличилась в обеих группах. У облученных людей частота пролиферирующих ЛПК была ровна 13,49%, тогда как в группе контроля – 10,32%.
Значимых различий между группами облученных и необлученных людей не отмече но.
Анализ пролиферативной активности у облученных лиц выявил увеличение доли (%) пролиферирующих лимфоцитов в ПК на фоне нормального пролифератив ного ответа на митогенную стимуляцию (значения сопоставимы с контрольными).
Эти данные могут указывать на повышение концентрации факторов способных сти мулировать ЛПК к делению в периферической крови облученных людей. Такими факторами могут быть ИЛ-2 и ИЛ-6, концентрация которых в сыворотке облученных жителей прибрежных сел р. Теча повышена (Аклеев А. В., и др., 2009) В группе облученных людей мы также выявили достоверное увеличение часто ты CD3-CD4+ лимфоцитов (0,19%, p=0,01), по сравнению со значениями у необлу ченных людей (0,10%). Увеличение частоты лимфоцитов мутантных по генам TCR, может быть обусловлено нестабильностью генома гемопоэтических клеток ККМ (Бычковская И. Б. и др., 2005;
Цыб А. Ф.и др., 2005).
Мощность дозы облучения ККМ в период максимального радиационного воз действия может повлиять на изменение пролиферативной активности ЛПК, частоты лимфоцитов с БКЦ, а также на частоту CD3-CD4+ лимфоцитов в отдаленный период после радиационного воздействия. Однако методом регрессионного анализа не выяв лено линейной зависимости частоты лимфоцитов с БКЦ (r=-0,12;
p=0,12 – для исход ного уровня, r=-0,11;
p=0,23- после инкубация с ФГА, и r=-0,16;
p=0,07- после инкуба ции и -облучения) от дозы (0,06-4,46 Гр) и мощности дозы облучения ККМ (0,03 1,25 Гр\год) (r=-0,16;
p=0,16;
r=-0,14;
p=0,12 и r=-0,13;
p=0,14, соответственно). Также спонтанная пролиферативная активность ЛПК (r=-0,08;
p=0,45) и индуцированная (r= 0,05, p=0,62) не зависит от дозы, и мощности дозы облучения ККМ (r=0,009;
p=0,93;
r=0,06;
p= 0,58, соответственно). Частота CD3-CD4+ лимфоцитов, также не зависит (линейная модель) от дозы (r=0,34;
p=0,09) и мощности дозы облучения ККМ (r= 0,25;
p=0,08).
Таблица 1.
Зависимость пролиферативной активности и частоты лимфоцитов с БКЦ, частоты CD3-CD4+ лимфоцитов от дозы и мощности дозы облучения ККМ (в 1951 г) Мощность дозы об Доза облучения Показатель лучения ККМ в ККМ г.
Доля лимфо- исходный F=1,14;
p=0,3 F=2,91;
p=0, цитов с БКЦ уровень инкубация F=1,15;
p=0,2 F=1,24;
p=0, 24 ч.
инкубация + F=2,11;
p=0, F=2,90;
p=0, -облучение Доля пролифе- исходный F=2,12;
p=0,14 F=3,28;
p=0, рирующих уровень ЛПК инкубация F=1,2;
p=0,31 F=1,02;
p=0, 24 ч.
Частота CD3-CD4+ лимфоцитов F=2,42;
p=0,7 F=3,8;
p=0, Примечание: F- коэффициент дисперсии На основании результатов дисперсионного анализа установлено, что слабо коррелирует с дозой облучения только доля лимфоцитов с БКЦ после инкубации и дополнительного -облучения (F=2,90;
p=0,03) (таблица 1).
От мощности дозы облучения ККМ зависит исходная частота лимфоцитов с БКЦ (F=2,91;
p=0,03) и частота лимфоцитов пролиферирующих в ПК (F=3,28;
p=0,002).
Таким образом, в отдаленные сроки (более 60 лет) от начала радиационного воздействия у хронически облученных жителей прибрежных селах р. Теча (дозы облучения ККМ составили 0,06-4,46 Гр), пролиферативная активность ЛПК и частота CD3-CD4+ лимфоцитов не имеет линейной зависимости от дозы облучения ККМ. Но доза облучения ККМ влияет на частоту лимфоцитов с БКЦ после инкубации и допол нительного -облучения культуры ЛПК. Вероятно, облучение в период максимально го радиационного воздействия (индивидуальная мощность дозы облучения ККМ в исследуемой выборке достигала 0,6 Гр\год) привело к накоплению клеток с дефекта ми в ДНК. Последнее могло способствовать развитию нестабильности генома клеток ККМ в отдаленный период после радиационного воздействия, о чем свидетельствует в частности увеличение частоты мутаций в гене Тр53 ( Veremeyeva G. A. et. al., 2009), лимфоцитов с хромосомными аберрациями (Аклеев А. В., 2005).
Повреждение ДНК, как правило, ингибирует пролиферативную активность клеток, вызывая блок клеточного цикла (Kara K. A. et. al. 2002). Поэтому увеличение доли лимфоцитов с БКЦ может оказать влияние на количество пролиферирующих лимфоцитов. Однако статистический анализ не выявил зависимости между долей лимфоцитов пролиферирующих в ПК и долей лимфоцитов с БКЦ (r=0,04, при p=0,7).
Увеличение частоты TCR-мутантных лимфоцитов и доли лимфоцитов с БКЦ может быть следствием, в том числе и нестабильности генома гемопоэтических кле ток ККМ (Little J. B. et. al., 1998), поэтому между этими параметрами возможна кор реляционная зависимость. Однако проведенный статистический анализ не выявил за висимости между этими параметрами (r=0,14;
p=0,6).
2. Блок клеточного цикла и пролиферативная активность лимфоцитов пе риферической крови, частота CD3-CD4+лимфоцитов у лиц, перенесших ХЛБ Группу людей, перенесших ХЛБ, принято считать группой развития риска от даленных последствий облучения, что обусловлено, в том числе наличием цитопений в ранний период облучения (максимального радиационного воздействия) (Аклеев А.
В. и др., 2001). Из группы облученных людей без ХЛБ и группы лиц, перенесших ХЛБ, были исключены лица, имеющие лейкопению в отдаленный период.
Для людей, перенесших ХЛБ, мы не отметили значимых изменений абсолют ного количества клеток периферической крови по сравнению с контролем (таблица.
2.) Таблица 2.
Количественный состав лейкоцитов периферической крови в группе облученных лиц, перенесших ХЛБ, (M± SE (min-max), 109\л) Показатель Группы лейко- лимфо- нейтро- моно- базофи эозино циты циты филы циты лы филы Люди, пе- 6,15±0,35 2,10±0,17 3,35±0,36 0,45±0,05 0,03±0,01 0,22±0, ренесшие (4,73–9,90) (0,87–3,12) (0,24–6,30) (0,11–0,99) (0–0,13) (0–0,84) ХЛБ n= Облучен- 6,14±0,19 2,07±0,08 3,37±0,12 0,37±0,02 0,08±0,008 0,19±0, ные без (3,05–11,3) (0,75–4,09) (1,26–8,13) (0,06–1,31) (0,03–0,26) (0–1,19) ХЛБ n= Необлучен 6,82±0,23 2,25±0,11 3,94±0,17 0,39±0,07 0,03±0,005 0,21±0, ные люди (4,38–11,6) (0,82–4,16) (2,1–7,19) (0,05–0,98) (0–0,16) (0–0,77) n= * Рис. 3. Доля лимфоцитов с блоком клеточного цикла в группе облученных людей, перенесших ХЛБ (%), *p – достоверные различия с контролем (p=0,005) Одной из причин угнетения гемопоэза в ранний период радиационного воздей ствия, которое отмечалось у лиц, перенесших ХЛБ, было нарушение процессов про лиферации, клеточного цикла гемопоэтических клеток ККМ, увеличение доли му тантных клеток ККМ (Аклеев А. В. и др., 2007). Поэтому, актуальным было оценить данные показатели в отдаленный период у лиц, перенесших ХЛБ.
Исходная доля лимфоцитов с БКЦ в группе людей, перенесших ХЛБ, статисти чески не отличается от таковой в группе контроля. Тогда как у облученных людей без ХЛБ мы отметили статистически достоверное увеличение исходной доли лимфоцитов с БКЦ (0,62%, p=0,005) по сравнению с контролем (0,39%) (рис. 3.).
Инкубация культуры лимфоцитов с ФГА способствовала увеличению доли клеток с БКЦ в изучаемых группах. Достоверных различий между показателями лиц, перенесших ХЛБ, и облученных людей без ХЛБ не выявлено. Также не отмечено ста тистически значимых различий между показателями у облученных людей и у необлу ченных людей. Не выявлено статистически значимых различий по доле лимфоцитов с БКЦ между людьми, перенесших ХЛБ, облученными без ХЛБ и необлученными по сле инкубации и дополнительного -облучения (1Гр) культуры лимфоцитов.
Анализ пролиферативной активности ЛПК показал, что в отдаленные сроки от начала радиационного воздействия у лиц, перенесших ХЛБ, доля пролиферирующих лимфоцитов в ПК не отличается от значений контроля. Однако у облученных людей без ХЛБ мы отметили значимое увеличение пролиферирующих клеток (2,05%, p=0,04) по сравнению с контролем (1,08%).
* Рис. 4. Доля пролиферирующих лимфоцитов в группе людей, перенесших ХЛБ (%), *р – достоверные различия с контролем (p=0,04).
Пролиферативный потенциал, оцененный по доле пролиферирующих ЛПК по сле их инкубации в культуре с митогеном, в группе людей, перенесших ХЛБ, также статистически не отличался от значений контроля. Сравнение групп облученных лю дей с ХЛБ и без ХЛБ не выявило различий между ними как по доле спонтанно про лиферирующих ЛПК, так и по доле митогенстимулированных ЛПК.
Статистический анализ частоты CD3-CD4+ лимфоцитов не выявил изменения частоты мутаций в генах TCR как в группе людей, перенесших ХЛБ (0,24±0,09%), так и у облученных лиц без ХЛБ (0,16±0,03%) по сравнению с показателями необлучен ных людей (0,10±0,01%). Также не отмечено различий по данному показателю между группами облученных людей.
Таким образом, у людей перенесших ХЛБ в ранний период радиационного воз действия не выявлено изменений показателей клеточного цикла и частоты CD3-CD4+ лимфоцитов по сравнению со значениями у необлученных людей и у облученных лиц без ХЛБ.
3. Блок клеточного цикла и пролиферативная активность лимфоцитов пе риферической крови, частота CD3-CD4+лимфоцитов у облученных лиц, имею щих лейкопению.
Облученные люди с лейкопенией претерпели наибольшие изменения со сторо ны гемопоэза. Дефицит зрелых клеток ПК у этих людей может быть результатом бло ка и \или нарушения клеточного цикла гемопоэтических клеток ККМ, и как следствие их пролиферации, поэтому анализ показателей клеточного цикла и частоты CD3 CD4+ лимфоцитов в данной группе представляет особый интерес.
У облученных людей в отдаленный период от начала радиационного воздейст вия (59-61 год) снижение уровня лейкоцитов (3,81109\л, p=0,0001), обусловлено снижением количества как лимфоцитов (1,50109\л, p=0,0001), так и нейтрофилов пе риферической крови (1,93109\л, p=0,0001) (таблица 3).
Также выявлено снижение абсолютного количества моноцитов 0,27109\л, (p=0,002), и эозинофилов 0,08109\л (p=0,0007).
Проведенный анализ доли лимфоцитов с БКЦ выявил ряд особенностей в груп пе облученных людей с лейкопенией (рис.5.). У облученных людей с лейкопенией отмечено статистически значимое увеличение исходной доли лимфоцитов с БКЦ по сравнению с группой контроля (1,30%, p=0,05). В группе облученных людей без лей копении данный показатель также увеличен по сравнению с контрольными значения ми (0,39%), и составил 0,52% (p=0,02).
Причем, у облученных людей, имеющих лейкопению, частота клеток с БКЦ достоверно выше, чем у облученных лиц без лейкопении (1,30%, p1=0,003, и 0,52%, соответственно). Также у людей с лейкопенией частота лимфоцитов с БКЦ в исход ном уровне достоверно превышает (1,30%, р=0,02) значения людей, перенесших ХЛБ (0,46%).
Таблица 3.
Количественный состав лейкоцитов периферической крови в группах облученных лиц и необлученных лиц Группы\ M± SE (min-max), 109\л параметр лейко- лимфо- моно- базофи нейтрофилы эозинофилы циты циты циты лы Облученные 1,50±0,07 1,93±0,06 0,27±0,02 0,02±0,06 0,08±0, 3,81±0, люди с лей- (3,17-4,01) (0,75-2,54) (1,26-2,45) (0,07-0,58) (0-0,15) (0-0,32) копенией, p=0,0001 p=0,0001 p=0,0001 p=0,002 p=0, n=30 p1=0,0001 p1=0,0001 p1=0,0001 p1=0,001 p1=0, Облученные 6,62±0,17 2,12±0,08 3,50±0,13 0,41±0,02 0,04±0,005 0,21±0, люди без (4,43-11,3) (0,85-4,09) (1,26-8,13) (0,07-1,19) (0-0,23) (0-1,19) лейкопении, p=0, n= Необлучен- 6,82±0,23 2,25±0,11 3,94±0,17 0,39±0,07 0,03±0,005 0,21±0, ные люди, (4,38-11,6) (0,82-4,16) (2,1-7,19) (0,05-0,98) (0-0,16) (0-0,77) n= Примечание: p- достоверные различия с необлученными людьми;
p1-достоверные различия с группой «облученные без лейкопении»
* ** Рис. 5. Доля лимфоцитов с БКЦ в группе облученных людей с лейкопенией (%), *р – достоверные различия с контролем (р=0,05), **р – достовер ные различия с контролем (р=0,02) и достоверные различия с группой облученных лиц без лейкопении (р1=0,003).
Не выявлено статистически значимых различий по доле лимфоцитов с БКЦ по сле инкубации с митогеном при сравнении групп облученных людей (с лейкопенией и без) с группой контроля, а также при сравнении значений групп облученных людей между собой. Также не отмечено статистически значимых различий по данному пока зателю между исследуемыми группами после инкубации и дополнительного облучения культуры лимфоцитов.
Таким образом, для облученных лиц, имеющих наиболее выраженные измене ния со стороны гемопоэза (снижение абсолютного количества нескольких типов лей коцитов) отмечена наибольшая частота лимфоцитов с БКЦ. Данный факт может ука зывать на то, что БКЦ, возникающий в ответ на повреждение ДНК (в том числе след ствие нестабильности генома), может быть одной из причин дефицита клеток в пери ферической крови.
У облученных людей, имеющих лейкопению в отдаленный период после ра диационного воздействия, уровень спонтанно пролиферирующих лимфоцитов (3,72% p=0,009) был достоверно выше значений контроля (1,26%) (рис.6.). Значимое увели чение данного показателя отмечено и для группы облученных лиц без лейкопении (2,03%, p=0,04). Однако не выявлено различий между группами облученных людей между собой по частоте пролиферирующих лимфоцитов.
Не выявлено достоверных различий между спонтанной пролиферативной ак тивностью ЛПК у облученных лиц с лейкопенией (3,72%) и у лиц, перенесших ХЛБ (1,60%). Частота пролиферирующих ЛПК после митогенной стимуляции в группе об лученных лиц с лейкопенией статистически не отличается от значений облученных лиц без лейкопении, облученных, перенесших ХЛБ и необлученных людей (рис. 6).
* ** Рис. 6. Доля пролиферирующих лимфоцитов в группе облученных людей с лейкопенией (%), *р – достоверные различия с контролем (p=0,009), **р – достоверные различия с контролем (p=0,04) Таким образом, у облученных лиц на фоне снижения абсолютного количества лейкоцитов ПК выявлено увеличение частоты лимфоцитов, пролиферирующих в ПК.
Полученные результаты подтверждают выдвинутое предположение о компенсатор ном увеличении пролиферативной активности ЛПК в ответ на снижение абсолютного количества лейкоцитов в периферической крови. В пользу данного предположения свидетельствует тот факт, что в группе людей, перенесших ХЛБ, в которую были включены люди без признаков угнетений гемопоэза (лейкопении и лимфопении) в отдаленный период, не выявлено увеличение доли спонтанно пролиферирующих ЛПК.
У облученных людей, имеющих в отдаленный период лейкопению, не выявле но изменения частоты CD3-CD4+ лимфоцитов (0,14±0,02%) по сравнению со значе ниями у облученных лиц без лейкопении (0,18±0,03%) и у необлученных лиц (0,10±0,01%). Сравнительный анализ полученных данных по частоте СD3-CD4+ лим фоцитов для разных групп облученных людей также не выявил статистически значи мых различий между ними.
У лиц, имеющих лейкопению в отдаленный период, не выявлено зависимости пролиферативной активности лимфоцитов от дозы (r=0,19, p=0,3) и мощности дозы облучения ККМ (r=0,21, p=0,4), а также частоты лимфоцитов с БКЦ от дозы (r=0,25, p=0,4) и мощности дозы (r=0,28, p=0,4). Не установлена линейная зависимость от до зы (r=-0,23, p=0,7) и мощности дозы облучения ККМ для лимфоцитов (r=-0,25, p=0,9), мутантных по генам TCR.
4. Зависимость абсолютного количества лимфоцитов и лейкоцитов от аб солютного количества клеток с БКЦ и абсолютного количества пролиферирую щих лимфоцитов у облученных и необлученных людей.
У облученных людей на фоне снижения абсолютного количества лейкоцитов и лимфоцитов ПК отмечается увеличение доли лимфоцитов с БКЦ и спонтанно проли ферирующих ЛПК. Для лиц с еще более глубоким угнетением гемопоэза (снижено несколько типов лейкоцитов), исследуемые показатели имели максимальные значе ния. Полученные эффекты могут указывать на взаимосвязь между абсолютным коли чеством лейкоцитов, лимфоцитов ПК и показателями клеточного цикла. Мы отметили слабую линейную положительную зависимость только между абсолютным количест вом лимфоцитов ПК у облученных людей и абсолютным количеством лимфоцитов с БКЦ в исходном уровне (r=0,21;
p=0,02). Не отмечено таковой зависимости для груп пы необлученных людей (r=0,30;
p=0,14). Не выявлено зависимости между количест вом лейкоцитов ПК и лимфоцитов с блоком клеточного цикла у облученных (r=-0,01;
p=0,90) и необлученных людей (r=0,17;
p=0,40).
Абсолютное количество ЛПК у облученных и у необлученных людей, также не зависит от количества лимфоцитов с БКЦ после инкубации (r=0,15;
p=0,1 и r=0,27;
p=0,17, соответственно) и инкубации с облучением (r=0,08;
p=0,4 и r=0,30;
p=0,13 со ответственно). Аналогичные результаты получены и при анализе зависимости между частотой лимфоцитов с БКЦ после инкубации с дополнительным -облучением и аб солютным количеством лейкоцитов ПК.
Абсолютное количество ЛПК не имеет линейной зависимости от количества лимфоцитов, пролиферирующих в ПК у облученных (r=0,02, p=0,85) и необлученных людей (r=0,33;
p=0,16). Также не отмечено зависимости между спонтанной пролифе рацией лимфоцитов и уровнем лейкоцитов в ПК у облученных (r=0,02;
p=0,85) и не облученных людей (r=0,35;
p=0,12). Напротив, выявлена слабая линейная зависимость между содержанием лимфоцитов (рис.7.) и лейкоцитов (r=0,24;
p=0,02) в ПК и коли чеством пролиферирующих лимфоцитов после инкубации с ФГА в группе облучен ных лиц.
Абсолютное количество лимфоцитов в r=0,35, p=0,0008;
y=1,67+1,23*x периферической крови, 109\л Абсолютное количество митогенстимулированных лимфоцитов, 109/л Рис.7. Корреляция между абсолютным количеством ПК у облученных людей и абсо лютным количеством пролиферирующих лимфоцитов после митогенной стимуляции.
Аналогично отмечена слабая линейная корреляция между абсолютным количе ством лейкоцитов(r=0,25, p=0,02), лимфоцитов (r=0,51, p=0,05) и количеством про лиферирующих лимфоцитов после инкубации с ФГА у необлученных людей.
Таким образом, у облученных лиц и необлученных лиц отмечается слабая кор реляция между абсолютным количеством лимфоцитов\лейкоцитов ПК и их пролифе ративной активностью.
ВЫВОДЫ 1. У жителей прибрежных сел р. Теча, в отдаленный период (59-61 год), после начала хронического радиационного воздействия (дозы облучения красного костного мозга составили 0,06-4,46 Гр;
среднее значение 1,11±0,06 Гр) выявлено статистически значимое увеличение в периферической крови числа пролиферирующих лимфоцитов, лимфоцитов с блоком клеточного цикла и CD3–CD4+ лимфоцитов по сравнению с показателями у необлученных людей.
2. Не установлено зависимости пролиферативной активности лимфоцитов, до ли лимфоцитов с блоком клеточного цикла и количества CD3–CD4+ лимфоцитов от дозы облучения красного костного мозга у людей в отдаленный период после начала хронического радиационного воздействия. Выявлена слабая положительная зависи мость частоты лимфоцитов периферической крови с блоком клеточного цикла после дополнительного острого -облучения в дозе 1 Гр от дозы облучения ККМ, а также исходной частоты лимфоцитов с блоком клеточного цикла и спонтанной пролифера тивной активности лимфоцитов от мощности дозы облучения ККМ в период макси мального радиационного воздействия (0,03-1,25 Гр;
среднее значение 0,28±0,02Гр).
3. У людей, проживающих в прибрежных селах р. Теча и перенесших хрони ческую лучевую болезнь (дозы облучения красного костного мозга 0,23-2,70 Гр;
среднее значение 0,87±0,10Гр), в отдаленные сроки от начала облучения не отмечено изменений пролиферативной активности и числа лимфоцитов с блоком клеточного цикла, а также количества CD3-CD4+ лимфоцитов по сравнению с показателями не облученных людей.
4. У облученных людей, имеющих в отдаленные сроки лейкопению (дозы об лучения красного костного мозга 0,06–4,46 Гр;
среднее значение 1,07±0,19 Гр), на блюдается увеличение пролиферативной активности лимфоцитов периферической крови и доли лимфоцитов с блоком клеточного цикла по сравнению с контролем и с группой облученных людей, не имеющих лейкопению.
5. Пролиферативная активность и доля лимфоцитов с блоком клеточного цик ла, а также частота CD3-CD4+ лимфоцитов не имеют зависимости от накопленной дозы и мощности дозы облучения ККМ в период максимального радиационного воз действия (0,04–1,25 Гр\год;
0,27±0,06 Гр\год) у облученных людей, имеющих в отда ленный период лейкопению.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи 1. Почухайлова Т.Н., Веремева Г.А, Аклеев А.В. Пролиферация и состояние клеточного цикла лимфоцитов периферической крови человека в отдаленные сроки после хронического радиационного воздействия // Медицинская наука и образование Урала. – 2009. – Т. 10. – № 3. – С. 52–54.
2. Veremeyeva G., Akushevich I., Pochukhailova T., Blinova E., Varfolomeyeva T., Ploshchanskaya O., Khudyakova O., Vozilova A., Kozionova O., Akleyev A. Long-term cellular effects in humans chronically exposed to ionizing radiation // Health Physics. – 2010. – Vol. 97. – P. 204- 3. Маркина Т.Н., Веремеева Г.А., Блинова Е.А., Аклеев А.В. Блок клеточного цикла и активность апоптоза лимфоцитов периферической крови (ЛПК), частота му таций в генах TCR в отдаленные сроки у людей, подвергшихся хроническому радиа ционному воздействию // Вопросы радиационной безопасности. – 2011. – №1. – С.
41- 4. Маркина Т.Н., Аклеев А.В., Веремеева Г.А. Пролиферативная активность и клеточный цикл лимфоцитов периферической крови (ЛПК) человека в отдаленные сроки после хронического радиационного воздействия \\ Радиация и риск. – 2011. – Т. 20. – Вып. 1. – С. 50- Тезисы 1. Веремеева Г.А., Акушевич И.В., Маркина Т.Н., Блинова Е.А., Площанская О.Г., Варфоломеева Т.А., Худякова О.И., Аклеев А.В. Особености внутриклеточных процессов при хроническом облучении человека // Тезисы докладов IV международ ной конференции «Хроническое радиационное воздействие: эффекты малых доз». 9 11 ноября 2010г. – Челябинск, 2010. – С. 2. Веремеева Г.А., Е.А. Блинова, Т.Н. Почухайлова, А.В. Аклеев. Влияние хронического облучения на апоптоз лимфоцитов периферической крови человека/ Чернобыльские чтения-2008 // Материалы международной научно-практической кон ференции. – 24 – 25 апреля 2008 г. – Гомель, 2008. – С. 52-57.
3. G. Veremeyeva, I. Akushevich, E. Blinova, T. Pochukhailova and A. Akleyev.
The Role of Apoptosis in the Development of Radiation-Induced Genome Instability under Chronic Radiation Exposure // Radioprotection. – 2008. – Vol. 43. – No.5., – P. 4. G.Veremeyeva, T.Varfolomeyeva, A.Vozilova, E.Blinova, T.Pochukhailova, S.Pushkaryov, A.Akleyev. Genomic instability at late time after chronic radiation exposure // Poster presentation at the 12th International Congress of the International Radiation Pro tection Association. –19-24 October 2008. – Buenos Aires, Argentina, 2008. – P. 92-93.
5. Veremeyeva G., Akushevich I., Pochukhailova T., Blinova E., Varfolomeyeva T., Ploshchanskaya O., Khudyakova O., Vozilova A., Kozionova O, Akleyev A. Frequency of genomic abnormalities and peculiarities of physiological processes in blood cells under chronic radiation exposure in man: Bridging the Experimental and Epidemiologic Divide // Georgetown University Hotel & Conference Center. – 4-6 May 2009. – Washington, USA, 2009. – P. 37.
6. Veremeyeva G., Akushevich I., Pochukhailova T., Blinova E., Varfolomeyeva T., Ploshchanskaya O., Khudyakova O., Vozilova A., Kozionova O, Akleyev A. Long-term Cellular Effects in Humans Chronically Exposed to Ionizing Radiation // Presentation at 10th International Conferences on Health Effects of Incorporated Radionuclides. – 10-14 May 2009. – Santa Fe, USA, 2009. – P.101.
7. Akleyev A.V., Pochukhailova T., Blinova E. Proliferation. Cell cycle and Apop tosis in Blood Lymphocytes at Late Time after Chronic Radiation Exposure in Man // 54th Annual Meeting of the Health Physics Society. – 12–16 July 2009. – Minneapolis, USA, 2009. – P. 8. Почухайлова Т.Н., Веремеева Г.А., Аклеев А.В. Пролиферация и состояние клеточного цикла лимфоцитов периферической крови человека в отдаленные сроки после хронического радиационного воздействия // Материалы 5 международной на учно-практической конференции, посвященной 10-летию создания Северского био физического центра ФМБА России. – 13-14 апреля 2010. – Томск, 2010. – С. 105- 9. Димов Г.П., Маркина Т.Н., Блинова Е.А., Веремеева Г.А., Аклеев А.В.
Оценка показателей клеточного цикла лимфоцитов периферической крови как метод прогнозирования ответа системы гемопоэза на регенеративную терапию // Материалы 1 международной научно-практической конференции постгеноные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине. – 17-19 ноября 2010. – Москва, 2010. – С. 10. Маркина Т.Н., Веремеева Г.А., Аклеев А.В. Пролиферация и задержка клеточного цикла лимфоцитов периферической крови человека в отдаленные сроки после хронического радиационного воздействия // Тезисы докладов IV международ ной конференции «Хроническое радиационное воздействие: эффекты малых доз». – 9-11 ноября 2010г. – Челябинск, 2010. – С.37.