Молекулярное типирование штаммов yersinia pestis основного и неосновных подвидов
На правах рукописи
ПАВЛОВА Алла Ивановна
Молекулярное типирование штаммов Yersinia pestis
основного и неосновных подвидов
03.02.03 – микробиология
Автореферат
диссертации на соискание учёной степени
кандидата медицинских наук
Саратов – 2012
2
Работа выполнена в ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
Научный руководитель:
доктор биологических наук, старший научный сотрудник Ерошенко Галина Александровна
Официальные оппоненты:
Швиденко Инна Григорьевна – доктор медицинских наук, профессор ГБОУ ВПО «Саратовский государственный медицинский университет им. В.И. Разумовского» Минздравсоцразвития Российской Федерации, профессор кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии Микшис Наталья Ивановна – доктор медицинских наук ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора, ведущий научный сотрудник лаборатории прикладной генетики
Ведущая организация:
ФГБУ «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития Российской Федерации
Защита состоится «_» 2012 г. в _ часов на заседании диссертационного совета Д 208.078.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» (410005, г. Саратов, ул. Университетская, д. 46).
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб».
Автореферат разослан «_»2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, старший научный сотрудник Слудский А.А.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Чума – особо опасная инфекционная болезнь, ко торая и в настоящее время требует к себе пристального внимания и координирован ного контроля со стороны всего мирового сообщества. Природные очаги чумы рас положены на территории Азии, Африки, Европы, Северной и Южной Америк. В Российской Федерации и ближнем зарубежье существует 45 природных очагов чу мы, 11 из которых находятся непосредственно на территории России [Онищенко Г.Г.с соавт., 2004;
Попов Н.В.с соавт., 2011]. Широкое распространение возбудителя чумы, его высокие поражающие свойства делают чуму важной социально-значимой проблемой международного масштаба. Решение этой проблемы требует разработки новых высокоэффективных методов и средств диагностики и профилактики чумы.
Применение современных молекулярных технологий в изучении возбудителя чумы и секвенирование последовательностей полных геномов ряда штаммов показа ло, что возбудитель чумы является ветвью эволюции псевдотуберкулезного микроба, от которого он отделился относительно недавно [Achtman М. et al., 1999;
Parkhill J. et al., 2001;
Deng W. et al., 2002;
Chain P. et al., 2004;
Garcia E. et al., 2008;
Eppinger M. et al., 2010;
Morelli G. et al., 2010]. Несмотря на свою эволюционную молодость, возбу дитель чумы отличается значительным внутривидовым разнообразием и вариабель ностью его фенотипических свойств, что связано с существованием штаммов Yer sinia pestis в различных ландшафтно-географических условиях. Развитие методов со временной фундаментальной генетики и молекулярной микробиологии позволяют перевести существующие классификации Y.pestis на качественно новый уровень, ос нованный на генетических свойствах возбудителя. Создание генетической класси фикации повысит надежность систематизации и позволит избежать недостатков, присущих фенотипическим схемам. Особую актуальность приобретает разработка системы молекулярного типирования штаммов Y.pestis, которая необходима для оп ределения принадлежности выделяемых штаммов возбудителя чумы к подвиду, био вару и природному очагу, а также для получения молекулярных характеристик штаммов, циркулирующих в различных природных очагах чумы.
Для молекулярного типирования возбудителя чумы применяются различные генетические методы, такие как анализ полиморфизма длин рестрикционных фраг ментов (RFLP) и его варианты – IS - и риботипирование;
мультилокусное или полно геномное секвенирование;
мультилокусный анализ вариабельного числа тандемных повторов (MLVA);
анализ отличающихся участков (DFR) и кластерных регулярно разделенных коротких палиндромных повторов (CRISPRs) [Бобров А.Г., Филиппов A.A. 1997;
Горшков О.В. с соавт., 2000;
Guiyoule А. et al., 1994;
1997;
Achtman М. et al., 1999;
2004;
Keim Р. et al., 2000;
Kotetishwili М. et al., 2005;
Kingston J. et al., 2008;
Li Y. et al., 2008;
2009;
Morelli G. et al., 2010]. Также используются варианты ПЦР типирования: с праймерами на случайно амплифицируемую полиморфную ДНК (RAPD), повторяющуюся экстрагенную палиндромную ДНК (REP), на повторяю щиеся межгенные консенсусные последовательности энтеробактерий (ERIC) и дру гие [Kim W. et al., 2003;
De Gregorio E. et al., 2005;
Kingston J. et al., 2008].
Каждый из перечисленных методов был апробирован на возбудителе чумы и имеет свои преимущества и недостатки. С помощью метода IS типирования прове ден анализ родственных связей штаммов Y.pestis, циркулирующих на различных гео графических территориях, и осуществлена реконструкция внутривидовой эволюции возбудителя чумы [Бобров A.Г., Филиппов А.А. 1997;
Горшков О.В. с соавт., 2000;
Achtman М. et al., 1999, 2004]. Другой вариант RFLP – риботипирование был исполь зован для изучения мировой коллекции штаммов Y.pestis [Guiyoule А. et al., 1994, 1997], однако, этот метод практически не применялся для исследования штаммов Y.pestis из природных очагов Российской Федерации и ближнего зарубежья.
В изучении эволюционного родства чумного и псевдотуберкулезного микроба широкое распространение получил метод мультилокусного секвенирования [Achtman М. et al., 1999;
2004;
Kotetishwili М. et al., 2005]. В то же время число ис пользуемых ДНК мишеней ограничено, и необходимо значительно расширить их ко личество для повышения эффективности внутривидовой дифференциации Y.pestis.
Все более очевидным становится преимущество полногеномного секвенирования, однако, необходимость применения дорогостоящего оборудования значительно ог раничивает его использование [Parkhill J. et al., 2001;
Deng W. et al., 2002;
Garcia E. et al., 2008;
Eppinger M. et al., 2007;
Morelli G. et al., 2010].
Высокой разрешающей способностью обладают методы генотипирования, ос нованные на использовании высоко вариабельных участков ДНК –VNTR, DFR и CRISPRs [Сучков И.Ю. с соавт., 2004;
Keim Р. et al., 2000;
Le Fle`che Р. et al., 2001, 2002;
Zhou D. et al., 2004;
Pourcel C. еt al., 2004;
Cui Y. et al., 2008;
Li Y. et al., 2008, 2009]. Эти методы позволяют выявлять близкородственные штаммы Y.pestis, однако, ввиду высокой вариабельности используемых ДНК-мишеней необходимо совмест ное применение этих методов в комплексе с другими, дающими более стабильные результаты.
Данные по разрешающей способности еще одной группы методов – ПЦР (RAPD, ERIC, REP) носят противоречивый характер, и их место в общей схеме мо лекулярного типирования штаммов Y.pestis остается неясным [Kim W. et al., 2003;
De Gregorio E. et al., 2005;
Kingston J. et al., 2008].
Таким образом, в настоящее время не разработан единый методический под ход к молекулярному типированию штаммов Y.pestis, и не определено оптимальное сочетание методов для проведения внутривидового генотипирования штаммов Y.pestis. Не создана система молекулярного типирования возбудителя чумы, которая может решать задачи по многоуровневой дифференциации штаммов Y.pestis, в том числе, отделять штаммы основного высоковирулентного подвида от штаммов неос новных подвидов и от возбудителя псевдотуберкулеза;
дифференцировать неоснов ные: кавказский, алтайский, гиссарский и улегейский подвиды;
делить штаммы Y.pestis основного подвида по их биоварной принадлежности, а также устанавливать принадлежность штаммов Y.pestis к определенным природным очагам.
Создание системы молекулярного типирования необходимо и для выяснения современной структуры вида Y.pestis и оценки правильности используемых феноти пических классификаций возбудителя чумы. Стандартизация используемых методи ческих подходов и создание эффективной системы молекулярного типирования штаммов Y.pestis позволит внести необходимые изменения в существующую клас сификацию возбудителя чумы.
Цель работы. Сравнительный анализ эффективности методов молекулярного типирования возбудителя чумы и выбор их оптимального сочетания для определе ния подвидовой, биоварной и очаговой принадлежности штаммов Y. pestis.
Задачи исследования:
1. Провести сравнительный анализ микробиологических, биохимических и генетиче ских особенностей штаммов Y. pestis из природных очагов Российской Федерации и ближнего зарубежья и установить приуроченность штаммов античного и средневе кового биоваров к очагам определенного (сурочьего, сусликового и песчаночьего) типов.
2. На основе метода ПЦР разработать способ дифференциации штаммов Y. pestis ос новного и неосновных подвидов и Yersinia pseudotuberculosis. Провести анализ эф фективности методов ПЦР типирования для внутривидового генотипирования воз будителя чумы.
3. Модифицировать метод анализа полиформизма длин рестрикционных фрагментов генов биосинтеза рРНК (риботипирования) для повышения его эффективности для молекулярного типирования возбудителя чумы. Создать классификацию риботипов штаммов Y. pestis, циркулирующих в Российской Федерации и в зарубежных стра нах.
4. Провести поиск высокоразрешающих ДНК мишеней и разработать схему диффе ренциации штаммов Y. pestis по подвидовой и биоварной принадлежности на основе метода мультилокусного секвенирования.
5. Изучить эффективность совместного использования трех участков вариабельных тандемных повторов – ms01, ms04 и ms46 для установления очаговой принадлежно сти штаммов Y. pestis.
6. Провести выбор оптимального сочетания методов молекулярного типирования для определения подвидовой, биоварной и очаговой принадлежности штаммов Y. pestis.
Научная новизна работы. На основе комплексного исследования генетиче ских и микробиологических свойств штаммов возбудителя чумы из природных оча гов России и ближнего зарубежья установлена приуроченность штаммов средневе кового биовара к очагам сусликового и песчаночьего типов (за исключением Заба кайльского степного очага), а штаммов античного биовара к очагам сурочьего типа.
Впервые выявлены генетические локусы – гены жизнеобеспечения terС, ilvN и inv, вариабельность которых позволяет быстро и эффективно проводить разделение штаммов основного и неосновных подвидов методом ПЦР. Штаммы основного под вида содержат в генах terС и ilvN, соответственно, делеции размером 89 п.н. и п.н., что отличает их от неосновных подвидов, у которых эти гены находятся в ин тактном виде. Наличие инсерции последовательности IS1541 размером 708 п.н в гене inv отличает штаммы Y. pestis основного и неосновных подвидов от штаммов Y. pseudotuberculosis. Получено решение о выдаче патента по заявке № (приоритет от 17.05.2010 г.) на изобретение «Способ дифференциации штаммов воз будителя чумы основного и неосновных подвидов методом полимеразной цепной реакции». Установлено, что ERIC ПЦР обладает большей эффективностью для гено типирования штаммов Y. pestis по сравнению с другим методом ПЦР типирования – RAPD ПЦР.
На основе изучения вариабельности участков хромосомы, содержащих гены 16S-rRNA, разработана схема классификации риботипов, по которой штаммы основ ного подвида из очагов России и сопредельных государств отнесены к I и III риботи пам, а неосновных подвидов – к VI риботипу.
Выявлены ДНК мишени – гены жизнеобеспечения rhaS, aspA, metB, napA и tcaB, применение которых на основе метода мультилокусного секвенирования обес печивает определение принадлежности штаммов Y. pestis к определенному подвиду и биовару.
Показано, что совместное применение трех участков вариабельных тандемных повторов – локусов ms01, ms04 и ms46 позволяет проводить кластеризацию штаммов возбудителя чумы по очаговой принадлежности, а комплексное использование мето дов мультилокусного секвенирования и мультилокусного анализа числа вариабель ных тандемных повторов обеспечивает дифференциацию штаммов возбудителя чу мы по их принадлежности к подвидам, биоварам и природным очагам.
Практическая значимость работы. По результатам работы разработаны ме тодические рекомендации «Выделение и очистка геномной ДНК Yersinia pestis, при годной для тонких молекулярно-биологических экспериментов» (утверждены дирек тором РосНИПЧИ «Микроб» 17 апреля 2007 г.) и «Дифференциация штаммов воз будителя чумы основного и неосновных подвидов и возбудителя псевдотуберкулеза методом полимеразной цепной реакции» (утверждены директором РосНИПЧИ «Микроб» 14 октября 2010 г.).
В Государственной коллекции патогенных бактерий депонированы два штам ма: Y. pestis КМ 229 и КМ 956. в качестве референс-штаммов античного и средневе кового биоваров для внутривидовой дифференциации Y. pestis методом мультило кусного секвенирования, циркулирующих в Российской Федерации и в ближнем за рубежье.
Полученные в ходе выполнения данные по генетической организации штам мов Y. pestis используются при чтении лекций по предмету «Генетика возбудителя чумы» на курсах специализации по особо опасным инфекциям при РосНИПЧИ «Микроб» и курсах повышения квалификации по программе усовершенствования врачей по специальности «бактериология» при РосНИПЧИ «Микроб».
Положения, выносимые на защиту:
1. На территории Российской Федерации и ближнего зарубежья в природных очагах чумы сусликового и песчаночьего типов (за исключением Забайкальского степного очага) циркулируют штаммы Y. pestis, содержащие мутацию (G на Т) в позиции 613 гена периплазматической нитратредуктазы napA (средневековый биовар), а в очагах сурочьего типа – штаммы, у которых эта мутация отсутствует (античный биовар).
2. Мультилокусная ПЦР с использованием эффективных ДНК мишеней, таких как гены terC (устойчивость к теллуру), ilvN (ацетолактатсинтаза) и inv (инвазин-адге зин) обеспечивает надежную дифференциацию штаммов Y.pestis основного и неос новных подвидов, а также штаммов Y.pseudotuberculosis. Метод ПЦР типирования с праймерами на повторяющиеся межгенные консенсусные последовательности энте робактерий – ERIC ПЦР может быть использован для установления генетического родства штаммов возбудителя чумы.
3. Вариабельность хромосомных участков ДНК, содержащих гены биосинтеза рРНК, позволяет проводить дифференциацию штаммов Y.pestis по их происхождению.
Штаммы основного подвида из природных очагов России и ближнего зарубежья от носятся к I и III риботипам, а штаммы неосновных подвидов к VI риботипу.
4. Метод мультилокусного секвенирования с применением вариабельных последова тельностей генов жизнедеятельности (rhaS, aspA, metB, napA, tcaB) обеспечивает ус тановление принадлежности штаммов Y. pestis к подвиду и биовару;
а метод мульти локусного анализа трех областей вариабельных тандемных повторов ms01, ms04 и ms46 проводит кластеризацию штаммов по их очаговой принадлежности. Комплекс ное использование методов мультилокусного секвенирования и мультилокусного анализа числа вариабельных тандемных повторов позволяет проводить определение подвидовой, биоварной и очаговой принадлежности штаммов Y. pestis.
Апробация работы. Материалы диссертации представлены и обсуждены на:
2-ой Всероссийской научно-практической конференции «Инфекции, обусловленные иерсиниями», г. Санкт-Петербург, 12-13 октября 2006 г.;
Российском медицинском форуме «Фундаментальная наука и практика», Москва, 2006 г.;
научной конферен ции «Новые технологии в профилактике, диагностике, эпиднадзоре и лечении ин фекционных заболеваний», Нижний Новгород, 31 мая 2006 г.;
7-ой Межгосударст венной научно-практической конференции государств-участников СНГ, Оболенск, 2006 г.;
Х Межгосударственной научно-практической конференции государств участников СНГ «Актуальные проблемы предупреждения и ликвидации последст вий чрезвычайных ситуаций в области санитарно-эпидемиологического благополу чия населения государств – участников СНГ», 2010 г.;
а также на ежегодных итого вых конференциях РосНИПЧИ «Микроб», Саратов, 2006- 2011 гг.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, из них в периодических изданиях, входящих в перечень ведущих рецензируемых научных журналов, рекомендованных ВАК России.
Структура и объём диссертации. Диссертация представлена на 166 страни цах, состоит из введения, главы обзора литературы, пяти глав собственных исследо ваний (в том числе, одной главы с описанием материалов и методов), заключения и выводов. Работа иллюстрирована 9 таблицами и 27 рисунками. Библиографический указатель содержит 218 отечественных и зарубежных источников.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы В работе использовано более 130 штаммов Y. pestis, выделенных в природных очагах на территории Российской Федерации и за рубежом, а также 10 штаммов Y. pseudotuberculosis различного происхождения. Культуры Y. pestis и Y. pseudotuber culosis выращивали на агаре и бульоне LB при 28 °С в течение 24 – 48 часов. Для оп ределения денитрифицирующей активности, ферментации глицерина, арабинозы, рамнозы, мелибиозы применяли общепринятые методы исследования биохимиче ской активности штаммов возбудителей чумы и псевдотуберкулеза [Руководство по лабораторной диагностики чумы, 2009 г.]. Питательные потребности штаммов Y. pestis определяли на минимальной синтетической среде, предложенной R. Bru baker (1970) с небольшими модификациями.
Выделение ДНК штаммов Y. pestis осуществляли стандартным методом с по мощью лизирующего раствора на основе 6М гуанидинтиоизоцианата [МУ 1.3.1794 03]. Полимеразную цепную реакцию проводили на программируемом термоциклере БИС-Н (ООО «БИС-Н», Россия), а продукты ПЦР анализировали методом электро фореза в 0,8 – 2 % агарозном геле, согласно рекомендациям, изложенным в руково дствах Л.А. Остермана (1981) и Т. Маниатиса с соавт. (1984).
Рестрикцию ДНК бактериальных штаммов с помощью эндонуклеаз рестрик ции и ДНК-ДНК гибридизацию по Саузерну осуществляли, как это описано в руко водстве по молекулярному клонированию [Маниатис T. с соавт., 1984]. В качестве ДНК зонда использовали фрагменты генов 16S-rRNA, которые получали в ПЦР и ме тили дигоксигенином («Roche Diagnostics», Германия).
Определение нуклеотидной последовательности продуктов амплификации осуществляли на генетическом анализаторе модели “CEQ 8000” (Beckman Coulter).
Сравнительный анализ геномов бактерий проводили с помощью алгоритма BLAST базы данных NCBI GenBank. Построение дендрограмм выполняли с помощью ком пьютерных программ Mega 5.0 и SplitsTree 4.0 с использованием дистанционно матричного метода UPGMA.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 1. Изучение микробиологических и биохимических свойств штаммов Y. pestis основного и неосновных подвидов из природных очагов чумы различного типа Для оценки эффективности различных молекулярно-генетических методов, применяемых при генотипировании возбудителя чумы, была изучена коллекция из 130 природных штаммов Y. pestis, отражающих внутривидовое разнообразие возбу дителя и относящихся к различным подвидам, биоварам и природным очагам, рас положенным в Российской Федерации и за рубежом.
Таблица 1. Характеристика биохимических свойств штаммов Y. pestis, выделенных в Российской Федерации и ближнем зарубежье биозы, рам рина/ мута ция глице Фермента Фермента Фермента арабинозы ция в glpD нитратов/ мутация в ция мели Редукция Штаммы Yersinia pestis нозы napA ция subsp. pestis (основной подвид):
очаги сурочьего типа (античный биовар):
20 штаммов +/– – +/– + очаги сусликового и песчаночьего типов (средневековый биовар):25 штаммов –/+ – +/– + subsp. caucasica (кавказский подвид):
15 штаммов +/– +/– + + subsp. altaica (алтайский подвид):
13 штаммов – /– – +/– + subsp. hissarica (гиссарский подвид):
11 штаммов –/– – +/– + subsp. ulegeica (улегейский подвид):
6 штаммов –/– +/– + + Все использованные в работе штаммы возбудителя чумы имели типичные культурально-морфологические свойства, характерные для бактерий Y. pestis. Обоб щенные биохимические характеристики использованных в работе штаммов Y. pestis, представлены в таблице 1.
Ранее при анализе фенотипических и генетических свойств штаммов Y. pestis было показано, что на территории Российской Федерации и ближнего зарубежья распространены штаммы античного и средневекового биоваров, в то время как оча гов с постоянной циркуляцией штаммов восточного биовара здесь не выявлено [Султанов Г.В, Козлов М.П., 1995;
Одиноков Г.Н., 2010]. Нами проведены дальней шие исследования по изучению особенностей распространения штаммов Y. pestis ан тичного и средневекового биоваров на территории России и сопредельных стран и исследована приуроченность этих биоваров к очагам сусликового, песчаночьего и сурочьего типов. Изучение денитрифицирующей активности показало, что неспо собные к денитрификации штаммы циркулируют в очагах сусликового и песчаночь его типа, в то время как денитрифицирующие штаммы распространены в очагах су рочьего типа.
С помощью специфических праймеров на ген napA и амплификации вариа бельного участка гена в ПЦР нами проведено сравнительное секвенирование napA у штаммов чумного микроба из очагов сурочьего, сусликового и песчаночьего типов.
Полученные результаты показали, что штаммы из очагов сурочьего типа не содер жат характерной для штамма средневекового биовара мутации – замены единичного нуклеотида (G Т) в позиции 613 от начала гена [Deng W. et al., 2002;
Motin V. et al., 2002], что наряду с наличием денитрифицирующей активности доказывает их принадлежность к античному биовару. В противоположность им штаммы Y. pestis из очагов сусликового и песчаночьего типов содержат характерную мутацию в гене napA и не денитрифицируют нитраты, что определяет их принадлежность к средне вековому биовару. Единственным исключением из этого правила является Забай кальский степной очаг сусликового типа, в котором циркулируют штаммы антично го биовара. По-видимому, это исключение связано со сменой носителя (сурка на суслика), которое произошло ранее в этом природном очаге чумы.
2. Использование метода ПЦР для проведения внутривидовой дифференциации штаммов Y. pestis Нами были изучены возможности метода ПЦР для проведения внутривидовой дифференциации штаммов возбудителя чумы. Для разработки простого способа дифференциации штаммов Y. pestis основного и неосновных подвидов и возбудителя псевдотуберкулеза в ПЦР нами был проведен поиск перспективных ДНК мишеней и отобраны хромосомные гены terС, ilvN и inv, кодирующие, соответственно, белок ре зистентности к теллуру, ацетолактатсинтазу и инвазин-адгезин. На основе проведен ного компьютерного анализа впервые установлено, что все штаммы Y. pestis основ ного подвида из NCBI GenBank содержат в гене terС делецию размером 89 п.н., а в гене ilvN – делецию размером 45 п.н. В гене inv у всех штаммов Y. pestis выявлено присутствие вставки инсерционной последовательности IS1541 размером 708 п.н., отсутствующей у штаммов Y. pseudotuberculosis. На вариабельные области генов terС, ilvN и inv нами рассчитаны праймеры, с помощью которых изучены природные штаммы Y. pestis и Y. pseudotuberculosis (рис. 1).
Как оказалось, у штаммов основного подвида образовывались амплификаты размером 300 п.н. (terC), 515 п.н. (ilvN) и 877 п.н. (inv);
у неосновных подвидов – 389 п.н. (terC), 560 п.н. (ilvN) и 877 п.н. (inv);
у Y.pseudotuberculoisis – 389 п.н. (terC), 560 п.н. (ilvN) и 169 п.н. (inv). Всего с помощью разработанной мультилокусной ПЦР было исследовано 130 природных штаммов Y. pestis и 10 штаммов Y. pseudotubercu losis, и показана эффективность выбранных ДНК мишеней для проведения внутри видовой дифференциации возбудителя чумы.
Таким образом, впервые сконструирована мультилокусная ПЦР, которая по зволяет просто и эффективно разделять штаммы Y. pestis основного и неосновных подвидов и Y. pseudotuberculosis. При этом дифференциация штаммов возбудителя чумы основного и неосновных подвидов проводится по двум ДНК локусам – terС и ilvN, расположенным в разных участках хромосомы, что повышает надежность идентификации штаммов Y. pestis основного высоковирулентного подвида.
Рисунок 1. ПЦР анализ штаммов Y. pestis и Y. pseudotuberculosis с праймерами на ге ны terС, ilvN и inv. Штаммы Y. pestis основного: 1- 8;
9: маркер молекулярных масс O,Range Ruler™ 100 bp DNA Ladders (Fermentas);
штаммы кавказского: 10 - 11;
ал тайского: 12;
гиссарского: 13;
улегейского: 14 подвидов;
Y. pseudotuberculosis: 15-17.
Нами также исследована эффективность методов ПЦР типирования с приме нением случайных праймеров (RAPD ПЦР) и праймеров на повторяющиеся межген ные консенсусные последовательности энтеробактерий (ERIC ПЦР) для генотипиро вания штаммов Y. pestis, циркулирующих в очагах России и за рубежом. Полученные результаты свидетельствуют о том, что RAPD ПЦР [Булат С.А. с соавт., 1992;
Ako pyantz N. et al., 1992] имеет ограниченные типирующие возможности в отношении штаммов возбудителя чумы. Профили RAPD амплификации штаммов основного и неосновных подвидов мало отличались друг от друга, как и у штаммов внутри груп пы неосновных подвидов. Наибольшую разрешающую способность этот метод имел в отношении штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов.
Большую по сравнению с RAPD ПЦР эффективность имеет метод ERIC ПЦР.
Профили амплификации в ERIC ПЦР, полученные с помощью специфических прай меров [Versalovic J. et al., 1991], у штаммов Y. pestis основного и неосновных подви дов отличаются между собой (за исключением штаммов улегейского подвида).
В тоже время ERIC ПЦР не позволяет дифференцировать штаммы античного и сред невекового биоваров, а также не разделяет штаммы неосновных подвидов. Штаммы Y. pseudotuberculosis имеют принципиально отличающиеся профили ERIC амплифи кации.
С помощью метода ERIC ПЦР нами проведено изучение штаммов, выделенных на Американском континенте. Из всех изученных американских штаммов идентич ные ПЦР профили имели штаммы, выделенные в Бразилии – Exu 21 и Exu 33, кото рые были очень близки штамму 65/23 восточного биовара из Вьетнама. ПЦР – про фили штаммов М-23 и 193 Hawai из США были идентичны между собой и близки штаммам Exu 21, Exu 33 и 65/23, но, все же, отличались от них. Уникальные ПЦР фингерпринты имели штаммы 14 Аргентина, A-1122 и Sonche, которые отличались от других американских штаммов, а также от изолятов античного и средневекового биоваров (рис. 2).
Рисунок 2. ERIC ПЦР типирование штаммов Y. pestis. Американские штаммы: 1) Exu 21, 2) Exu 33, 3) 14 Аргентина, 4) М-23, 5) A-1122, 6) Sonche, 7) 193 Hawai;
8) Kenya 102 – античный, 9) А-161 – средневековый, 10) 65/23 – восточный, 11) С-621 – сред невековый, 12) 1 kb Ladders (Gibco – BRL).
Таким образом, по данным ERIC ПЦР типирования большая часть изученных нами американских штаммов близка штамму восточного биовара 65/23, выделенно му в Юго-Восточной Азии. В то же время наличие среди них штаммов с отличаю щимися ПЦР – фингерпринтами позволяют высказать предположение о том, что эти штаммы представляют различные филогенетические линии Y. pestis восточного био вара.
Как следует из полученных результатов, методы ПЦР являются полезным инст рументом внутривидовой дифференциации штаммов возбудителя чумы. В целом они позволяют разделять виды Y. pseudotuberculosis и Y. pestis, основной и неосновные подвиды чумного микроба, изоляты различного географического происхождения.
Ввиду простоты выполнения методы ПЦР могут быть использованы для быстрого генотипирования штаммов Y.pestis и определения их филогенетической близости.
3. Риботипирование штаммов возбудителя чумы основного и неосновных под видов Нами была разработана модификация метода риботипирования с применением в качестве ДНК зонда на гены биосинтеза рРНК фрагмента гена 16S-rRNA, который получали в ПЦР с помощью рассчитанных праймеров. Проведенное секвенирование гена 16S-rRNA у ряда штаммов Y. pestis и Y. pseudotuberculosis выявило их полную идентичность у этих близкородственных бактерий, что обеспечивает гибридизацию используемого зонда со штаммами Y. pestis всех биоваров и подвидов, а также со штаммами Y. pseudotuberculosis.
Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов хромосомной ДНК, содержа щих гены биосинтеза рРНК, исследован нами у 127 штаммов чумного микроба ос новного и неосновных подвидов, выделенных в природных очагах чумы в Россий ской Федерации и в ближнем (всего 89 штаммов), а также дальнем (38 штаммов) за рубежье. На основании изучения EcoRI профилей рестрикции rrn генов у штаммов Y. pestis нами выделено 11 риботипов (рис. 3).
Рисунок 3. Схема риботипов штаммов Y. pestis их различных географических регио нов Установлено, что на территории РФ и ближнего зарубежья циркулируют штам мы, относящиеся к риботипам – I, III (основной подвид) и VI (неосновные подвиды).
Штаммы Y. pestis основного подвида, выделяемые из различных природных очагов Российской Федерации и ближнего зарубежья, относятся к риботипу I. На террито рии Монголии выделяют штаммы основного подвида III риботипа. Все штаммы не основных подвидов относятся к риботипу VI (рис.3).
Нами также изучен полиморфизм длин рестрикционных фрагментов генов био синтеза рРНК у штаммов, полученных в странах дальнего зарубежья, в том числе в Африке (Кения, Конго, Сенегал, Мадагаскар, Марокко), Америке (Бразилия, Арген тина, США), Азии (Монголия, Китай, Индия, Иран, Израиль, Вьетнам, Камбоджа) и Европе (Франция, Германия, Италия, Турция). Выявлено большое разнообразие ри ботипов в Африке, где выделяются штаммы всех трёх биоваров – antiqua, medievalis, orientalis. Штаммы, распространённые на этом континенте, относятся ко II, IV, VIII, IX, X, XI риботипам. В глубине материка (Конго, Кения и другие), где имеются древние эндемичные очаги чумы, выделяют штаммы биоваров antiqua, medievalis, относящиесяк риботипам VIII, X, XI, в то время как штамммы биовара orientalis, изолированные на побережье (Мадагаскар, Марокко, Сенегал), относятся ко II и IV риботипам и занесены сюда во время третьей пандемии чумы, вызванной этим био варом в начале XX века. Нами установлено, что штамм Y. pestis EV восточного био вара, выделенный в 1926 г. на о. Мадагаскар, имеет уникальный риботип, отличи тельной чертой которого является наличие низкомолекулярного фрагмента, не встречающегося у других штаммов. Риботипу штамма EV присвоен номер IX, кото рый позволяет отличать этот штамм от других штаммов Y.pestis.
К биовару orientalis относятся изученные нами штаммы, выделенные в странах Американского континента – Аргентине, Бразилии, в США и на Гавайских островах.
Эти штаммы представляют собой преимущественно II риботип.
На территории Азиатского континента (Монголия, Китай, Иран, Индия, и дру гие) циркулируют штаммы биовара medievalis, а также биовара antiqua. Изученные нами штаммы этих биоваров азиатского происхождения относятся, в основном, к I и III риботипам (хотя встречаются штаммы и других риботипов), совпадающим с ри ботипами штаммов основного подвида Y. pestis из природных очагов РФ и других стран СНГ, что свидетельствует о филогенетической близости штаммов, циркули рующих в Азиатском регионе. Риботипы штаммов antiqua и medievalis азиатского происхождения отличаются от риботипов африканских штаммов этих биоваров.
Штаммы Y. pestis, выделенные в Юго-Восточной Азии (Вьетнам, Камбоджа), относятся к биовару orientalis и как штаммы восточного биовара с других континен тов относятся к риботипам II и IV. Штаммы Y. pestis из Европы (Франция, Италия, Германия, Турция и другие), так же относятся к восточному биовару и имеют рибо типы II и IV.
Изучение штаммов Y. pseudotuberculosis, выделенных в Российской Федера ции (Дальний Восток, Астраханская область) и в Средней Азии (Туркмения), а также за рубежом, показало, что штаммы этого возбудителя имеют другие профили рест рикции генов рРНК, которые значительно отличаются от штаммов Y. pestis.
Таким образом, разработанная нами классификация риботипов штаммов чум ного микроба позволяет проводить дифференциацию штаммов чумного и псевдоту беркулёзного микробов, штаммов возбудителя чумы основного подвида от неоснов ных подвидов;
штаммов биовара orientalis от биоваров antiqua и medievalis. С помо щью полученных результатов определена приуроченность различных риботипов к конкретным географическим территориям.
4. Анализ эффективности методов мультилокусного секвенирования и мульти локусного анализа числа вариабельных тандемных повторов для типирования штаммов Y.pestis Метод мультилокусного секвенирования является одним из самых эффектив ных методов генотипирования, однако, достаточно сложную задачу представляет собой поиск эффективных ДНК мишеней для проведения внутривидовой дифферен циации штаммов Y. pestis. Нами в качестве таких ДНК мишеней выбраны гены: rhaS (активатор транскрипции L-рамнозного оперона), aspA (аспартатаммониум-лиаза), metB (цистатионин--синтаза), napA (периплазматическая нитратредуктаза) и tcaB (белок TcaB комплекса инсектицидных токсинов).
Ранее Л.М. Куклевой с соавт. (2009) при секвенировании полной нуклеотид ной последовательности гена rhaS у штаммов Y. pestis выявлены три вариабельных локуса в позициях 482, 494 и 671. Нами в рамках этой работы при анализе 46 штам мов возбудителя чумы подтверждено, что наличие замены нуклеотида AG в пози ции 671 от начала регуляторного гена rhaS рамнозного оперона, является характер ным только для штаммов основного подвида (табл. 2). В позиции 482 у штаммов Y. pestis основного, кавказского, алтайского и улегейского подвидов и у штаммов Y. pseudotuberculosis выявлено присутствие нуклеотида G, а у штаммов гиссарского подвида – нуклеотида А, что отличает его от штаммов других подвидов и может рас сматриваться как характерная генетическая метка штаммов гиссарского подвида.
В локусе 494 гена rhaS у штаммов кавказского подвида и возбудителя псевдотубер кулеза содержится нуклеотид С, а у всех остальных подвидов – T. Таким образом, вариабельность нуклеотидной последовательности гена rhaS по трем ранее выявлен ным локусам единичных нуклеотидных замен делает его высокоэффективной ДНК мишенью для проведения внутривидовой дифференциации возбудителя чумы.
Выявлена также значительная вариабельность нуклеотидной последовательно сти другого гена – aspA, кодирующего белок AspA (табл. 2). При секвенировании природных штаммов Y. pestis установлено, что в последовательности гена aspA со держится вариабельный локус в позиции 1087 – 1089 от начала гена, в котором у штаммов основного подвида присутствует триплет TTG, кодирующий аминокислоту лейцин в положении 363 белка AspA. Штаммы кавказского и улегейского подвидов содержат в позиции 1087–1089 триплет TCG, который кодирует аминокислоту се рин. У штаммов алтайского и гиссарского подвида в этой позиции присутствует триплет GTG, детерминирующий в белке AspA аминокислоту валин. Часть штаммов из высокогорного очага чумы в Киргизии, как и штаммы кавказского и улегейского подвидов, имеют в этом локусе триплет TCG и аминокислоту серин в AspA. Еще один штамм основного подвида из высокогорного очага чумы на Кавказе – КМ содержит в этой позиции триплет TTT, который кодирует аминокислоту фенилала нин. Такую же мутацию имеют и два штамма – Nepal516 и Angola, представленные в базе данных NCBI GenBank. Таким образом, использование вариабельности нуклео тидной последовательности гена aspA позволяет выделять дополнительные группы штаммов внутри основного подвида Y. pestis.
Таблица 2. Вариабельность генов rhaS, aspA, metB, napA и tcaB у штаммов Y. pestis и Y. pseudotuberculosis. *Указаны размеры (в п.н.) секвенированного фрагмента гена Штаммы rhaS (822)* 1087 – (-A, 1037) 988 – napA (436)* (719)* (483)* (270)* metB aspA tcaB 482 494 Yersinia pestis GenBank:
T(-G) А CO92 (orientalis) TTG G T A G T KIM10 TTG G T A T T(-G)А A (medievalis) Antiqua TTG G T A G T(-G)А A Nepal516 TTT G T A G T(-G)А A (antiqua) Angola TTT G T G G GT A 91001 (microtus) GTG G T G G GT A Pestoides F (кавказский п/в) TCG G C G G GT A Y.pseudotubercu losis: 5 шт. GTG G C G G GT A Yersinia pestis Основной п/в 4 шт. (восточный TTG G T A G T(-G)А T б/в) 8 шт. (античный TTG G T A G T(-G)А A б/в) 9 шт. (средневе- TTG G T A T T(-G)А A ковый б/в) 2 шт. (античный TCG G T A G T(-G)А T б/в) 1 шт. (средневе- TTT G T A T T(-G)А A ковый б/в) Кавказский п/в TCG G C G G GT A 4 шт.
Алтайский п/в GTG G T G G GT A 4 шт.
А Гиссарский п/в GTG T G G G (+G) A 4 шт.
Улегейский п/в TCG G T G G GT A 4 шт.
Еще одной эффективной ДНК мишенью для проведения внутривидового гено типирования является ген metB, продукт которого цистатионин--синтаза участвует в биосинтезе серосодержащей аминокислоты – метионина. При секвенировании этого гена нами впервые показано, что в гене metB у штаммов основного подвида в пози ции 988 от начала гена присутствует делеция единичного нуклеотида – гуанина, ко торая приводит к сдвигу рамки считывания и преждевременной остановке трансля ции полипептидной цепи молекулы фермента после 329 аминокислотного остатка за счет образования стоп-кодона TAG в позициях 988-990. У всех штаммов кавказско го, алтайского и улегейского подвидов, а также Y. pseudotuberculosis делеция G в ге не metB отсутствует. В отличие от других неосновных подвидов у штаммов Y. pestis гиссарского подвида выявлена инсерция единичного нуклеотида (+ G) в позиции гена metB, которая может рассматриваться как характерная генетическая метка этого подвида. Применение вариабельных локусов всех трех генов - rhaS, aspA и metB по зволяет разделять штаммы Y. pestis, относящиеся к основному, кавказскому, алтай скому, гиссарскому и улегейскому подвидам.
С помощью проведенного нами компьютерного анализа, а также данных лите ратуры были определены еще две ДНК-мишени, применение которых обеспечивает проведение дифференциации штаммов Y. pestis основного подвида по их принад лежности к трем биоварам – античному, средневековому и восточному. Для выделе ния штаммов средневекового биовара была использована мутация в гене периплаз матической нитратредуктазы napA – замена единичного нуклеотида G T в позиции 613, которая присутствует только у штаммов этого биовара [Deng W. et al., 2002;
Motin V. et al., 2002]. Для дифференциации штаммов восточного биовара нами ис пользована обнаруженная ранее мутация в одном из генов комплекса инсектицид ных токсинов – tcaB [Одиноков Г.Н. с соавт., 2010]. Штаммы Y. pestis восточного биовара содержат делецию единичного нуклеотида (-А) в позиции 1037 от начала гена tcaB, которая нарушает его функциональность. Проведенное нами секвенирова ние полученных в ПЦР фрагментов гена tcaB у различных штаммов Y. pestis показа ло, что у всех изученных штаммов восточного биовара присутствовала мутация – делеция единичного нуклеотида (-А) в позиции 1370 от начала гена). В то же время подобная мутация отсутствовала у штаммов других биоваров и подвидов, из чего следует, что делеция единичного нуклеотида в позиции 1370 гена tcaB является спе цифическим генетическим маркером штаммов восточного биовара.
Таким образом, использование двух локусов napA и tcaB обеспечивает эффек тивное разделение штаммов всех трех биоваров Y. pestis, а их применение в сочета нии с тремя вышеуказанными мишенями – rhaS, aspA, metB позволяет определять как подвидовую так и биоварную принадлежности штаммов Y. pestis, что подтвер ждено при построении дендрограмм штаммов Y. pestis различных подвидов с помо щью дистанционно-матричного метода UPGMA (рис.4).
EV EV I- I- I- A- I- A- Sonche Hamburg 65/ Antiqua CO EV EV EVNIIEG KM EV KIM A- KM C- A- A- A- C- C- A- Angola C- C- Pestoides F I- I- I- I- A- A- A- A- I- I- I- I- IP YPIII IP PB1/+ Рисунок 4. UPGMA дендрограмма штаммов Y. pestis и Y. pseudotuberculosis, постро енная на основе вариабельных локусов генов rhaS, aspA, metB, napA и tcaB.
Однако значительный консерватизм генов жизнеобеспечения у возбудителя чу мы не позволяет на их основе в полной мере провести определение очаговой при надлежности штаммов Y.pestis. В связи с этим требуется совместное использование метода мультилокусного секвенирования в комплексе с другим высокоразрешаю щим методом, основанном на применении более вариабельных ДНК локусов, таких как VNTR. Мы изучили типирующие возможности трех VNTR локусов: ms01, ms и ms046 [Le Fle`che Р. et al., 2002;
Pourcel С. et al., 2004] для определения очаговой принадлежности штаммов Y. pestis, циркулирующих в природных очагах Российской Федерации, ближнего и дальнего зарубежья. Всего было исследовано 83 природных штамма Y. pestis.
При использовании VNTR локуса – ms01 изученные штаммы разделились на 10 генотипов. Применение локуса ms01 обеспечивало выделение в отдельную груп пу штаммов алтайского и гиссарского подвидов, а также штаммов основного подви да средневекового биовара, но не позволяло разделять их по очаговой принадлежно сти, как и не разделяло штаммы античного, восточного биоваров и улегейского под вида, объединяя их в один кластер. Наибольшая разрешающая способность локуса ms01 отмечалась по отношению к штаммам кавказского подвида, которые делились на несколько VNTR-типов. С помощью локуса ms04 было выделено 8 генотипов, в которые входили штаммы восточного биовара, а также штаммы улегейского и гис сарского подвидов. Однако применение ms04 не позволяло дифференцировать штаммы алтайского и кавказского подвидов, а также не разделяло между собой штаммы средневекового биовара. Наиболее вариабельным оказался локус ms46, ис пользование которого позволило выделить 15 генотипов среди изученных штаммов.
Использование этого локуса не обеспечивало четкой дифференциации штаммов ан тичного и восточного биоваров, но позволяло разделять штаммы средневекового биовара по очаговой принадлежности.
В то же время нами установлено, что использование трех локусов - ms01, ms04, ms46 позволяет дифференцировать штаммы античного, средневекового, вос точного биоваров, а также гиссарского, улегейского, кавказского и алтайского под видов. Совместное использование трех VNTR локусов создает основу для диффе ренциации штаммов Y. pestis и по очаговой принадлежности. Однако в целом пра вильно выделяя в отдельные кластеры штаммы Y. pestis по подвидовой, биоварной и очаговой принадлежности, метод MLVA не обеспечивает эффективного анализа фи логенетического родства штаммов и реконструкции внутривидовой эволюции воз будителя чумы. На одной ветви дендрограммы одновременно присутствуют класте ры штаммов разных подвидов и биоваров возбудителя чумы, что свидетельствует об ограниченных возможностях применения этого метода для проведения классифика ции штаммов Y. pestis.
Для повышения надежности генотипирования штаммов Y. pestis по их принад лежности к подвидам, биоварам и очаговой приуроченности нами была изучена воз можность комплексного использования вариабельных локусов генов жизнеобеспе чения rhaS, aspA, metB, napA и tcaB (определение подвидов и биоваров) в сочетании с анализом трех вариабельных VNTR локусов – ms01, ms04, ms46 (определение оча говой принадлежности) (рис. 5).
Совместное использование вариабельных участков генов жизнеобеспечения и VNTR локусов повышает надежность дифференциации штаммов Y. pestis по подви довой, биоварной и очаговой принадлежности, и в целом правильно отражает внут ривидовые филогенетические связи вида. В дальнейшем для создания более надеж ной и высокоразрешающей системы молекулярного типирования возбудителя чумы следует расширить данные по штаммам Y. pestis из различных природных очагов Российской Федерации, ближнего и дальнего зарубежья.
Таким образом, нами проведено сравнительное изучение эффективности ряда современных молекулярно-генетических методов для молекулярного типирования штаммов возбудителя чумы и выявлено очевидное преимущество использования для этих целей двух методов – мультилокусного секвенирования и мультилокусного анализа числа вариабельных тандемных повторов. Их совместное использование по зволяет проводить определение видовой, подвидовой, биоварной и очаговой принад лежности штаммов Y. pestis. При этом метод мультилокусного секвенирования обес печивает определение подвидовой, биоварной и, частично, природно-очаговой при надлежности, а метод мультилокусного анализа числа вариабельных тандемных по второв – кластеризацию штаммов по очаговой приуроченности.
Рисунок 5. UPGMA дендрограмма штаммов Y. pestis на основе вариабельности генов жизнеобеспечения: rhaS, aspA, metB, napA, tcaB и трех VNTR локусов: ms01, ms04 и ms46.
Полученные в ходе этого диссертационного исследования данные создают ос нову для разработки системы молекулярного типирования штаммов возбудителя чу мы;
составления молекулярных портретов штаммов из природных очагов Россий ской Федерации и ближнего зарубежья, а также для определения современной структуры вида Y. pestis.
ВЫВОДЫ 1. На основе комплексного изучения генетических и фенотипических свойств штам мов Y. pestis различного происхождения установлено, что в природных очагах сус ликового и песчаночьего типа (за исключением Забайкальского степного очага), рас положенных в Российской Федерации и странах ближнего зарубежья, циркулируют штаммы средневекового биовара, а в очагах сурочьего типа – штаммы античного биовара.
2. Сконструированная мультилокусная ПЦР на вариабельные участки генов жизне обеспечения terС, ilvN и inv позволяет проводить дифференциацию штаммов Y. pestis основного и неосновных подвидов и Y. pseudotuberculosis. Надежность разделения штаммов основного и неосновных подвидов возбудителя чумы обеспечивается при менением двух локусов terС и ilvN, которые отличаются у этих подвидов.
3. Сравнительное изучение методов ПЦР типирования с применением случайных праймеров (RAPD ПЦР) и праймеров на повторяющиеся межгенные консенсусные последовательности энтеробактерий (ERIC ПЦР) выявило более высокую эффектив ность ERIC ПЦР, которая может быть применена для установления генетического родства штаммов возбудителя чумы.
4. Разработанная модификация метода риботипирования с использованием в качест ве ДНК зонда фрагмента гена 16S-rRNA повышает его эффективность для внутриви довой дифференциации штаммов Y. pestis. В соответствии с созданной классифика цией риботипов штаммы основного подвида из природных очагов чумы в Россий ской Федерации и ближнего зарубежья отнесены к I и III риботипам, а неосновных подвидов – к VI риботипу.
5. Создана система мультилокусного секвенирования возбудителя чумы на основе вариабельности последовательностей генов жизнеобеспечения rhaS, aspA, metB, napA, tcaB, которая обеспечивает определение подвидовой и биоварной принадлеж ности штаммов Y. pestis.
6. Установлена эффективность кластеризации штаммов Y. pestis по их очаговой при надлежности на основе применения трех участков вариабельных тандемных повто ров – ms01, ms04 и ms46. Использование метода мультилокусного анализа числа ва риабельных тандемных повторов в комплексе с мультилокусным секвенированием позволяет проводить дифференциацию штаммов Y.pestis по подвидовой, биоварной и очаговой принадлежности.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ 1. Куклева Л.М., Ерошенко Г.А., Павлова А.И., Шавина Н.Ю., Солодовников Н.С Кутырев В.В. Характеристика штаммов возбудителя чумы разных подвидов по признакам нитратредукции, ферментации глицерина и арабинозы// Пробл. особо опасных инф. – 2007. – Вып. (94) – С.50–53. (Журнал из перечня ВАК) 2. Ерошенко Г.А., Павлова А.И., Куклева Л.М., Шавина Н.Ю., Кутырев В.В.
Генотипирование штаммов Yersinia pestis на основе вариабельности генов биосинте за рРНК// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунбиол. – 2007. – №3. – С.6–10.
(Журнал из перечня ВАК) 3. Куклева Л.М., Ерошенко Г.А., Шавина Н.Ю., Павлова А.И., Кутырев В.В.
Молекулярно-генетические особенности штаммов возбудителя чумы, выделенные на Американском континенте// Пробл. особо опасных инф. – 2007. – Вып. (93). – С.55– 57. (Журнал из перечня ВАК) 4. Ерошенко Г.А., Одиноков Г.Н., Куклева Л.М., Павлова А.И., Шавина Н.Ю., Краснов Я.М., Гусева Н.П., Кутырев В.В. Вариабельные локусы генов napA, aspA, rhaS, zwf и tcaB как эффективные ДНК-мишени для генотипирования штаммов Yer sinia pestis// Пробл. особо опасных инф. – 2010. – Вып. (104). – С. 57–59. (Журнал из перечня ВАК) 5. Одиноков Г.Н., Ерошенко Г.А., Краснов Я.М., Куклева Л.М., Шавина Н.Ю., Павлова А.И., Кутырев В.В. Генетические основы метионинзависимости штаммов Yersinia pestis основного и неосновных подвидов// Генетика. – 2011. –№ 2. – С. 15– 19. (Журнал из перечня ВАК) 6. Павлова А.И., Ерошенко Г.А., Куклева Л.М., Шавина Н.Ю., Кутырев В.В.
Использование вариабельности rrn-участков хромосомы для типирования штаммов Yersinia pestis// Инфекции, обусловленные иерсиниями: Матер. 2-й Всерос. науч. практ.конф. – СПб., 2006. – С.104–106.
7. Куклева Л.М., Ерошенко Г.А., Павлова А.И., Шавина Н.Ю., Солодовников Н.С Кутырев В.В. Изучение особенностей проявления признака нитратредукции штаммами основного и неосновных подвидов возбудителя чумы// Фундаментальная наука и практика: Тез. докл. – М., 2006. – С.81.
8. Павлова А.И., Ерошенко Г.А., Куклева Л.М., Шавина Н.Ю Кутырев В.В.
Риботипирование штаммов патогенных иерсиний// Фундаментальная наука и прак тика: Тез.докл. – М., 2006. – С.118.
9. Ерошенко Г.А., Павлова А.И., Куклева Л.М.. Шавина Н.Ю., Кутырев В.В.
Рибо- и ПЦР типирование штаммов чумного микроба// Новые технологии в профи лактике, диагностике, эпиднадзоре и лечении инфекционных заболеваний: Ма тер.научн.конф.– Н. Новгород, 2006. – С.76.
10. Павлова А.И., Ерошенко Г.А., Видяева Н.А., Куклева Л.М., Шавина Н.Ю., Кутырев В.В. Использование молекулярно-генетических методов для изучения ос новных и неосновных подвидов возбудителя чумы и штаммов с измененными свой ствами// Матер. 7-й Межгос.науч.-практ. конф.госуд.-участников СНГ. – Оболенск, 2006. – С.231–232.
11. Ерошенко Г.А., Кутырев В.В., Куклева Л.М., Павлова А.И. Комплексный подход к молекулярному типированию штаммов Yersinia pestis// Материалы IX съез да Всероссийс. науч.-практ. об-ва эпидемиол., микробиол. и паразитол. – 2007. – Т.3.
– С. 46–47.
12. Одиноков Г.Н., Ерошенко Г.А., Павлова А.И., Кутырев В.В. Генетические особенности экспрессии биохимических признаков у штаммов Yersinia pestis основ ного и неосновных подвидов// Актуальные проблемы предупреждения и ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения государств – участников СНГ: Матер. Х Межгос. научно практической конф. государств-участников СНГ. – 2010. – 216–217.
Подписано к печати 06.02. Формат 60 х 84 1/16 Печать лазерная Бумага офисная Объем 1,0 усл. п.л. Тираж 100 экз.
Отпечатано на полиграфическом оборудовании ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб»
410005, г. Саратов, ул. Университетская,