Изучение разнообразия гена env штаммов вич-1, циркулирующих в группах риска в санкт- петербурге

На правах рукописи

ДУХОВЛИНОВА

Елена Николаевна

ИЗУЧЕНИЕ РАЗНООБРАЗИЯ ГЕНА env ШТАММОВ ВИЧ-1,

ЦИРКУЛИРУЮЩИХ В ГРУППАХ РИСКА В САНКТ-

ПЕТЕРБУРГЕ

03.01.04 – Биохимия

03.01.03 – Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2010

Работа выполнена в лаборатории негосударственного научно исследовательского учреждения «Биомедицинский центр», Санкт-Петербург.

Научный руководитель - доктор биологических наук профессор Козлов Андрей Петрович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Евтушенко Владимир Иванович кандидат биологических наук доцент Тищенко Людмила Ивановна Ведущее учреждение: Научно-исследовательский институт гриппа Северо Западного отделения Российской академии медицинских наук

Защита состоится « »_ 2010 г. в _часов на заседании Совета Д.212.232.09 по защите кандидатских и докторских диссертаций при Санкт Петербургском государственном университете (199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., д.7/9, ауд. 90)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. А. М. Горького Санкт-Петербургского государственного университета.

Автореферат разослан « »2010 г.

Ученый секретарь кандидат биологических наук Л.С. Курилова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В России и других странах бывшего СССР в настоящее время наблюдаются самые высокие в мире темпы роста числа новых случаев ВИЧ-инфекции. Подавляющее большинство случаев ВИЧ-инфекции происходит за счет инъекционного употребления наркотиков. В октябре года общее число случаев ВИЧ-инфекции, зарегистрированных в России с момента начала эпидемии, составило 516167 [Федеральный центр СПИД, 2009].

В такой ситуации для эффективной борьбы против эпидемии необходима разработка вакцины против ВИЧ/СПИД. Одной из проблем в создании эффективной вакцины против ВИЧ-1 является его высокий уровень генетического разнообразия. Высокие частоты мутационных и рекомбинационных процессов, высокая скорость размножения и большой размер вирусной популяции ведут к высокой изменчивости вируса в каждом инфицированном организме [Ho et al., 1995, Hu et al., 1990, Roberts et al., 1988].

Создание кандидатных вакцин против ВИЧ/СПИД считается целесообразным проводить на основе генов и белков субтипов и рекомбинантных форм ВИЧ-1, распространенных в регионе, для которого эти вакцины предназначены [Hanke et al., 2000]. ДНК-вакцина против ВИЧ, создающаяся исследовательской группой под руководством А.П. Козлова в Санкт-Петербурге, содержит ген белков оболочки ВИЧ-1 восточно-европейского варианта субтипа A, поскольку в момент разработки вакцины именно этот вариант доминировал в регионе [Мурашев и др., 2003]. Мониторинг генетического разнообразия ВИЧ-1 в популяции, а особенно в группах повышенного риска инфицирования ВИЧ, необходим для совершенствования профилактики, терапии и создания эффективной вакцины.

В момент инфицирования, за счет индивидуальных особенностей защитных реакций организма, происходит отбор новых вирусных вариантов, увеличивающий генетическое разнообразие ВИЧ-1 в человеческой популяции [Lawson et al., 2002]. В настоящее время существует теория о передаче половым путем (гетеро- и гомосексуально) преимущественно единичных геномов ВИЧ [Wolfs et al., 1992, Derdeyn et al., 2004, Long et al., 2000, Sagar et al., 2003].

Наличие подобной избирательности при парентеральной передаче ВИЧ-1 ранее установлено не было.

Детальная генетическая и иммунологическая характеристика переданных изолятов может помочь в разработке эффективной вакцины против ВИЧ.

[Derdeyn et al, 2004, Gottlieb et al, 2008, Keele et al, 2008]. Разработан новый подход лабораторной оценки эффективности кандидатной вакцины – определение иммунологических свойств белков оболочки ВИЧ и особенностей их взаимодействия с нейтрализующими антителами на стандартизованных панелях псевдовирусов, полученных на основе переданных изолятов ВИЧ [Mascola et al, 2005]. Изучение разнообразия гена env передаваемых изолятов ВИЧ и создание панели псевдовирусов на их основе является одним из наиболее перспективных подходов к созданию эффективной вакцины против ВИЧ [Li et al, 2005].

Цель и задачи исследования. Целью данного исследования являлось изучить разнообразие гена env штаммов ВИЧ-1, циркулирующих в группах риска в Санкт-Петербурге, для последующего использования полученной информации в целях разработки отечественной вакцины против ВИЧ/СПИД.

Задачи исследования:

Определить нуклеотидные последовательности фрагмента 1) гена env штаммов ВИЧ-1, циркулирующих в группах риска в Санкт Петербурге.

Сравнить генетическое разнообразие ВИЧ-1 в различных 2) группах риска.

Определить нуклеотидные последовательности 3) полноразмерного гена env штаммов ВИЧ-1, циркулирующих в крови ПИН с острой и ранней стадиями ВИЧ-инфекции.

Оценить количество вариантов ВИЧ-1, передаваемых 4) парентерально.

Изучить свойства гликопротеина оболочки gp120 переданных 5) штаммов ВИЧ-1.

Получить панель псевдовирусных конструкций, содержащих 6) белки оболочки переданных изолятов ВИЧ-1 варианта А-ЕЕ для последующего изучения иммунологических свойств кандидатных вакцин против ВИЧ.

Научная новизна работы. Впервые показано особое положение штаммов субтипа В из стран бывшего СССР на филогенетическом дереве ВИЧ-1.

Обнаружен первый случай инфицирования штаммом ВИЧ-1, относящимся к циркулирующей рекомбинантной форме СRF06_cpx, в Санкт-Петербурге, и показана его вторичная рекомбинация с восточно-европейским вариантом субтипа А.

Впервые секвенированием единичных копий полноразмерного гена env штаммов ВИЧ-1, циркулирующих в организме ПИН, установлено наличие т.н.

«бутылочного горлышка», т.е. избирательности при передаче штаммов ВИЧ парентеральным путем.

Впервые создана панель псевдовирусных конструкций на основе переданных штаммов восточно-европейского варианта субтипа А для проведения испытаний кандидатных вакцин против ВИЧ-1.

Научно-практическая значимость работы. Показано наличие двух независимых эпидемий ВИЧ-1 в Санкт-Петербурге в группах риска ПИН и МСМ. Среди ПИН было выявлено присутствие преимущественно штаммов восточно-европейского варианта субтипа А (А-ЕЕ), тогда как среди МСМ циркулировали штаммы субтипа В. Показано, что новые случаи ВИЧ-инфекции вызываются штаммами А-ЕЕ, и таким образом установлена целесообразность испытания кандидатных вакцин против ВИЧ-1, содержащих гены варианта А ЕЕ среди ПИН. В рамках данной работы получены фрагменты и полноразмерные копии гена env штаммов ВИЧ-1, циркулирующих среди групп риска в Санкт-Петербурге. Определены и проанализированы их нуклеотидные последовательности, которые депонированы в международную базу данных GenBank. Выявлено наличие «бутылочного горлышка» при парентеральной передаче ВИЧ-1. Получена панель псевдовирусных конструкций на основе штаммов субтипа А, которая будет использована для проведения испытаний кандидатных вакцин против ВИЧ.

Полученные результаты представляют большой интерес для молекулярной эпидемиологии ВИЧ-инфекции в России и являются важным достижением в области создания реагентной базы для разработки, производства и испытания отечественной вакцины против ВИЧ/СПИД.

Форма выполнения диссертационной работы. Работа выполнялась в рамках финансирования ННИУ «Биомедицинский центр» по федеральному проекту, выполняемому в соответствии с распоряжением Правительства РФ №1905-р «Разработка ДНК-вакцины против ВИЧ и молекулярно эпидемиологический мониторинг разнообразия ВИЧ в Санкт-Петербурге», а также по грантам Международного центра Фогарти (Fogarty International Center) «Подготовка специалистов и исследования по превенции ВИЧ инфекции в России» (№ 5D43TW01028) и Американского фонда гражданских исследований и развития (CRDF) «Исследования в области ВИЧ и туберкулеза»

(№ RUB1-7000-ST-08).

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 16-й, 17-й и 18-й Международных конференциях «СПИД, рак и общественное здоровье», Санкт-Петербург, Россия, в 2007, 2008 и 2009 годах;

14й, 15-й и 17-й конференциях по ретровирусам и оппортунистическим инфекциям, США, в 2007, 2008 и 2010 годах;

4-й конференции по патогенезу и лечению СПИДа Международного Общества по СПИДу, Сидней, Австралия, 2007;

Конференции по вопросам ВИЧ/СПИДа в Восточной Европе и Центральной Азии, Москва, Россия, 2009. По теме диссертации опубликовано 2 статьи и тезисов докладов.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 173 страницах машинописного текста, иллюстрирована рисунками, 10 таблицами и 2 приложениями. Список литературы содержит литературных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Сыворотки крови. В данной работе использовались образцы сыворотки крови, полученные от участников различных исследований, проводившихся в Биомедицинском центре с 2002 по 2009 год. Образцы сывороток хранились при температуре -80°С и использовались для данного исследования с письменного согласия участников. Все образцы крови были протестированы на антитела к ВИЧ-1 и маркеры гепатита С и ИППП (сифилис, гонорея, ВПГ-2).

Для анализа разнообразия гена env в группах риска использовали образцы сыворотки крови, полученные в Санкт-Петербурге в 2005-2008 годах от : (1) Потребителей иньекционных наркотиков (ПИН) - активные наркопотребители и те, кто имел опыт использования иньекционных наркотиков в течение жизни.

(2) Половые партнеры ПИН, никогда не употребявшие наркотиков. (3) Мужчины, имеющие секс с мужчинами (МСМ). Среди 127 ВИЧ положительных участников мы выявили 26 случаев недавней (до полугода) ВИЧ-инфекции и 16 случаев хронической инфекции ВИЧ.

Для анализа популяции ВИЧ-1 в крови ПИН в начальной фазе инфекции использовали образцы сыворотки крови, полученные с 2002 по 2008 год от участников с т.н. острой и ранней ВИЧ-инфекцией в соответствии с классификацией по Фибигу [Fiebig et al, 2003] (см. табл. 2) Таблица 1.

Демографические, клинические и и поведенческие характеристики участников с острой и ранней ВИЧ-инфекцией.

употребления употребления или половой) презерватива наркотиков (копии/мл) заражения участника по Фибигу инфекции (паренте маркеров Наличие log10ВН ральный Исполь Возраст зование Способ Стадия Номер (годы) (годы) ИППП ВИЧ Стаж Путь Пол 2- Ж Иногда Оба H386 27 n/a 5.8 IV 2 HSV Нет Оба H408 M 21 n/a 5.4 III 2 HSV Нет Нет Оба H410 M 24 n/a 5.8 III Нет Не было Парент-й K08 M 30 16 6.2 VI секса 3 мес Нет Да Парент-й K84 M 18 4 5.4 IV Ж Сифилис Иногда Оба R053 35 10 5.6 IV ВПГ- Ж Сифилис Да Парент-й R163 32 16 5.5 I-II ВПГ- Нет Нет Оба R392 M 41 25 5.7 IV Нет Да Парент-й R497 M 22 8 5.6 IV Нет Иногда Оба R526 M 30 7 5.7 I-II Нет Не было Парент-й R575 M 22 3 5.8 IV секса 3 мес Ж ВПГ-2 Оба R589 29 9 4.8 VI 2 n/a Сифилис Оба SC1283 M 29 2 4.7 VI 3 n/a ВН-вирусная нагрузка;

2 Рискованное использование наркотиков за счет использования нестерильного оборудования или чужих шприцев;

3 Безопасное использование наркотиков в течение последних 30 дней.

Нуклеотидные последовательности фрагмента гена env были получены матрице неразведенной кДНК и представляли собой консенсусные последовательности.

Для полноразмерного гена env были получены единичные ампликоны по методу АЕГ [Salazar-Gonsalez et al., 2008] РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Разнообразие субтипов ВИЧ-1 в Санкт-Петербурге. В нашем исследовании мы обнаружили присутствие штаммов ВИЧ-1 восточно европейского варианта субтипа А (А-ЕЕ) в 126 образцах крови, полученных от ПИН и их половых партнеров в Санкт-Петербурге в 2005-08 годах. Наличие данного варианта было показано с помощью секвенирования и филогенетического анализа коротких фрагментов гена env (109 из образцов) и полноразмерного гена env (16 из 17 образцов) штаммов ВИЧ-1, циркулирующих в группе ПИН. Полученные результаты соответствуют предыдущим наблюдениям нашей группы и других авторов о том, что в Санкт Петербурге среди ПИН циркулирует и передается половым путем восточно европейский вариант субтипа А, или А-ЕЕ.

Среди ПИН с ранней ВИЧ-инфекцией мы обнаружили одного участника, в крови которого циркулировали штаммы CRF06_cpx. Наличие ЦРФ CRF06_cpx в крови данного участника было подтверждено секвенированием и филогенетическим анализом полноразмерного гена env штаммов ВИЧ-1 этого пациента. Это первый случай выявления данной ЦРФ в Санкт-Петербурге.

Помимо изолятов CRF06_cpx, которые доминировали в образце крови пациента SC1283, мы обнаружили уникальные рекомбинанты между CRF06_cpx и A-ЕЕ.

Явление рекомбинации было подтверждено CRF06_cpx/A-EE филогенетическим анализом (Рис.1) и сканирующим анализом генетического расстояния между нуклеотидными последовательностями (данные не представлены) участков единичных ампликонов. Отдельно штаммов A-EE в данном образце выявлено не было.

Секвенирование и филогенетический анализ коротких фрагментов гена env штаммов ВИЧ-1, циркулирующих в группе риска МСМ, показали, что из проанализированных образцов 17 содержали штаммы ВИЧ-1 субтипа В (Рис.2).

Филогенетический анализ выявил, что большинство штаммов ВИЧ-1, обнаруженных в Санкт-Петербурге, оказались родcтвенными штаммам ВИЧ- из других регионов России и стран бывшего СССР. Это наблюдение свидетельствует о том, что эпидемия ВИЧ-1 субтипа В развивается в Санкт Петербурге главным образом за счет распространения из других регионов России, а не только благодаря заносам из Западной Европы и США, как было раньше.

Один образец крови был получен от участника, который указал повышенный риск не только полового гомосексуального, но и парентерального заражения ВИЧ, и содержал штамм ВИЧ-1 варианта А-EE. Мы предполагаем, что данный индивид, несмотря на принадлежность к группе риска МСМ, заразился ВИЧ-1 парентеральным путем.

Результаты, полученные в данной части нашего исследования, ЦРФ CRF06_cpx 06 cpx.RU.2005.04RU001.DQ 06 cpx.EE.2001.EE0359.AY 32 06A1.EE.2001.EE0369.AY Ампликоны с 2 точками рекомбинации Вариант EF EF А-ЕЕ DQ AF DQ AY 0. Рис. 1. Результаты филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей 3'-концевого фрагмента ампликонов SC1283 с координатами 8330- п.н. в геноме HXB2. Исследуемые последовательности отмечены кружками, референсные – названиями в формате GenBank.

свидетельствуют о том, что в Санкт-Петербурге среди ПИН циркулируют штаммы ВИЧ-1 варианта А-EE. Учитывая эти данные, а также высокий уровень заражаемости ВИЧ в данной группе риска [Kozlov et al., 2006, Verevochkin et al., 2008], среди ПИН обосновано применение ДНК-вакцины против ВИЧ, несущей гены варианта А-ЕЕ. В группе риска МСМ обосновано применение ДНК вакцины против ВИЧ, несущей гены субтипа B.

Генетическое разнообразие ВИЧ-1 внутри субтипов. Значения генетического расстояния, полученные для штаммов субтипа А, были достоверно ниже значений, полученных для штаммов субтипа В. Это наблюдение согласуется с историей развития эпидемии ВИЧ в России и в мире.

Эпидемия ВИЧ-1 субтипа В в России началась на десятилетие раньше, чем эпидемия ВИЧ-1 субтипа А, и пути распространения этих субтипов различались. Давняя история эпидемии ВИЧ-1 субтипа В, половой путь передачи и множество заносов штаммов данного субтипа в страну из-за границы создали предпосылки для более высокой гетерогенности вируса.

Эпидемия ВИЧ-1 субтипа А среди ПИН имела «эффект основателя», т.е.

началась с единичного случая, и за счет высокой заражаемости парентеральным путем за короткий промежуток времени охватила большое число людей. При этом вирус не успевал значительно дивергировать внутри отдельного B.UA.2001.01UAKV B.RU.-.SP кластер B.GE.2003.03GEMZ B.UA.-.UA B-EE (1) 100 B.UA.-.UA B.UA.2001.01UAKV B.UA.2001.01UAKV B.RU.2004.04RU 67 B.UA.-.UA B.RU.2004.04RU B.NL.00.671 00T36.AY Субтип В B.RU.2004.04RU B.GE.2003.03GEMZ 50 B.US.98.15384 1.DQ B.RU.1996.RU1152 56 B.UA.1997.UA1216 B.UA.-.UKR B.UA.1998.NIK 89 B.RU.-.patient B.UA.1998.NIK 68 B.RU.-.patient B.RU.2004.04RU B.US.98.1058 11.AY B.TH.90.BK132.AY B.RU.-.patient B.RU.-.patient 50 B.FR.1983.HXB2-LAI-IIIB-BRU B.UA.-.UA кластер B.UA.-.UA B-EE (2) Субтип А A1.KE.94.Q23 17.AF 0. Рис. 2. Результаты филогенетического анализа 17 нуклеотидных последовательностей фрагмента гена env, полученных из группы риска полового инфицирования ВИЧ (МСМ). Кружками обозначены изучаемые последовательности.

Черным цветом обозначены референсные последовательности ВИЧ-1, взятые из GenBank.

Референсная последовательность субтипа А использована в качестве внешней группы.

индивида, поэтому долгое время генетическое разнообразие ВИЧ-1 в популяции остается на относительно низком уровне.

При сравнении генетического расстояния в подгруппах ПИН с недавней (менее полугода) и хронической (более года) ВИЧ-инфекцией мы обнаружили статистически достоверные различия: в подгруппе ПИН с недавней инфекцией генетическое разнообразие было ниже, чем в подгруппе с хронической инфекцией (Рис. 3). Это может быть связано с тем, что большая часть заражения происходит от пациентов, находящихся в ранней стадии инфекции.

0, 0, 0, 0, 0, Генетическое расстояние 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, медиана 0, 25%-75% мин - макс 0, Субтип A Субтип B 0, 0, 0, 0, 0, Генетическое расстояние 0, Медиана 25%-75% мин - макс 0, ПИН (1) ПИН (2) Рис. 3. (A) Сравнительный анализ генетического разнообразия фрагмента гена env для штаммов ВИЧ-1 субтипа А (ПИН) и субтипа В (МСМ). (Б) Сравнительный анализ генетического разнообразия фрагмента гена env для штаммов ВИЧ-1 субтипа А из разных подгрупп ПИН. На оси абсцисс отмечены изучаемые подгруппы, на оси ординат - значения генетического расстояния, полученные при попарном сравнении нуклеотидных последовательностей.

Генетическое разнообразие вирусной популяции в организме ВИЧ инфицированных ПИН. С помощью секвенирования, анализа нуклеотидных различий и филогенетического анализа единичных копий полноразмерного гена env мы обнаружили множественную передачу вирусных вариантов (два и более) в 4 случаях из 13, что составило 30.7% (См. Табл.2). Это несколько больше, чем было обнаружено при передаче ВИЧ половым путем [Keele et al, 2008, Abrahams et al, 2009], хотя данное превышение не является статистически достоверным.

Таблица Данные генетического разнообразия полноразмерного гена env изолятов ВИЧ-1, полученных от ПИН с острой и хронической инфекцией Порядк. Номер Стадия Кол-во ед. Макс. число Кол-во номер образца ВИЧ по ампли-конов нукл. вариантов уч-ка Фибигу различий Пациенты с острой и ранней ВИЧ-инфекцией 1 H386 -1 IV 26 5 H386 -2 V 23 6 2 H408 -1 III 24 3 H408 -2 IV 20 36 3 H410 -1 III 27 36 H410 -2 IV 24 24 4 K08 VI 23 7 5 K84 -1 IV 29 5 K84 -2 V 23 5 2, реком 6 R053 -1 IV 22 бинатны 2, реком R053 -2 V 20 бинанты 7 R163 I-II 21 2 8 R392 IV 29 4 9 R497 -1 IV 26 10 10 R526 -1 I-II 28 3 R526 -2 V 19 10 11 R575 IV 18 5 12 R589 VI 29 10 13 SC1283 VI 24 97 Пациенты с хронической ВИЧ-инфекцией Смесь R497-2 VI+ 25 Смесь 14 SC1233 VI+ 25 Смесь 15 SC1457 VI+ 21 Смесь 16 SC3208 VI+ 25 Смесь 17 SC3410 VI+ 23 Таким образом, почти в 70% случаев мы наблюдали А.

гомогенную вирусную популяцию ВИЧ в крови ПИН с острой и ранней инфекцией (по Фибигу). Поведенческие данные участников Вар. использования (отсутствие презервативов, большое число сексуальных партнеров или наличие ИППП) позволили нам полностью исключить половой путь передачи ВИЧ Вар. для пяти из тринадцати Вар. пациентов с острой/ранней ВИЧ-инфекцией (R163, R497, R575, K08 и K84, см. Табл 1).

Для этих 5 пациентов анализ Б.

нуклеотидных различий и филогенетический анализ единичных ампликонов показал наличие в крови единичных вариантов ВИЧ-1.

Вар. Образец крови SC содержал два типа изолятов, один из которых соответствовал CRF06_cpx, а другой – рекомбинанту по 3' участку между ЦРФ CRF06_cpx и вариантом A-ЕЕ (Рис 1). Участок 5', общий для ампликонов CRF06_cpx и Вар. обладал CRF06_cpx/A-ЕЕ, Вар. высокой гомогенностью, и отдельно вариантов A-ЕЕ в образце обнаружено не было.

Рис. 3.2.3. Генетическое разнообразие вирусной Эти два наблюдения позволяют популяции в образцах H410. (А) Диаграмма предположить, что нуклеотидных различий, где ампликоны рекомбинация произошла в сортированы по наличию мутаций. (Б) Результат организме донора, и пациент филогенетического анализа полученных двумя ампликонов. Вирусные варианты отмечены заразился SC указанными рекомбинантами скобками и стрелкой справа.

ВИЧ от одного донора в один момент времени. Однако, мы не можем исключать версию того, что индивид SC1283 заразился двумя вирусными вариантами – варианта А-ЕЕ и CRF06_cpx, после чего на самых ранних стадиях инфекции произошла рекомбинация этих двух вариантов. Штаммы рекомбинантной формы CRF06_cpx могли оказаться более приспособлеными и размножились в организме, а штаммы субтипа А могли элиминироваться из организма за счет гипермутирования и нарушений репликации. Косвенно в пользу этого предположения свидетельствует тот факт, что среди ПИН в Эстонии штаммы CRF06_cpx доминируют, практически вытеснив штаммы A-EE. Мы не можем полностью исключать и суперинфекцию, т.е. заражение уже инфицированного организма штаммами другого субтипа.

Хотя теоретически в когорте ПИН должна наблюдаться большая частота передачи нескольких вирусных вариантов при заражении ВИЧ по сравнению с когортами, где доминирует половой путь передачи, большинство инфекций в нашем случае было инициировано одним вирусным вариантом.

Особенности использования наркотиков, частота половых контактов и распространенность ИППП влияют на число передаваемых при заражении ВИЧ вирусных вариантов в любой когорте. Кроме того, в популяции со столь высокой заражаемостью ВИЧ-1, какая наблюдается в Санкт-Петербурге [Kozlov et al., 2006], большинство доноров ВИЧ-инфекции могут находиться в стадии острой или ранней инфекции с низким уровнем генетического разнообразия вируса, и поэтому даже в случае передачи нескольких вариантов они будут не отличимы друг от друга. Мало что известно о вирусных популяциях в течение первых нескольких дней после передачи ВИЧ-1. Согласно одной из гипотез, единственная вирусная частица заражает одну клетку, после чего вирус успешно размножается и данное событие дает начало продуктивной инфекции. По другой гипотезе, в организм проникают многочисленные вирусы, но в результате отбора при размножении в клетках реципиента вирусная популяция становится гомогенной. [Learn et al, 2002] Мы обнаружили примера, подтверждающих вторую гипотезу. В образцах крови H410 мы наблюдали на стадии III – 3 вирусных варианта, а на стадии IV – только два, что было подтверждено анализом нуклеотидных различий и филогенетическим анализом единичных ампликонов env этих образцов (См. Рис 4). Для образцов R053 мы выяснили, что вирусный вариант, который в популяции на стадии V был минорным, на стадии IV стал доминировать (данные не представлены) Мы изучили генетическую сложность вирусной популяции в крови ПИН с острой и ранней ВИЧ-инфекцией. Множественные вирусные варианты были представлены лишь в 30% (4 из 13 пациентов) случаев.

Филогенетический анализ показал, что штаммы ВИЧ-1, обнаруженные у разных ПИН, не образуют эпидемиологический кластер, и генетическое разнообразие ВИЧ-1 внутри организма ПИН с хронической ВИЧ-инфекцией значительно выше, чем в случаях недавней ВИЧ-инфекции. Эти факты свидетельствуют о том, что низкая сложность вирусной популяции у недавно инфицированных ПИН может обьясняться передачей низких инфекционных доз при заражении среди ПИН. Однако более низкая общая сложность местной эпидемии вследствие начальной стадии ВИЧ-инфекции у доноров и высокой заражаемости в популяции также может быть причиной наблюдаемого эффекта «бутылочного горлышка».

Фенотипическое разнообразие вирусной популяции в организме ВИЧ-инфицированных ПИН. При анализе аминокислотных последовательностей единичных ампликонов env, полученных от ПИН с острой/ранней и хронической стадией ВИЧ-инфекции, мы обнаружили, что по правилу 11/25 и суммарному заряду V3-петли (Табл. 3) большинство вирусов имеют R5-фенотип.

Таблица 3.

Результаты анализа аминокислотной последовательности V3-петли исследуемых изолятов.

Правило Номер Аминокислотная последовательность Правило заряда 11\ образца Заряд Фенотип Пациенты с острой и ранней ВИЧ-инфекцией R5 R H386 CIRPGNNTRTSIRIGPGQTFYATGDVIGDIRRAYC R5 R H408 CSRPGNNTRTSVRIGPGQTFYATGDVIGDIRRAHC R5 R H410 CIRPGNNTRTSIRIGPGQTFYATGDVIGDIRRAHC R5 R K08 CIRPGNNTRTSIRIGPGQTFFGTGDVIGDTRKAHC R5 R K84 CIRPSNNTRTGIRIGPGQTFYATGNVIGDIRKAYC R5 R R053 CIRPGNNTRTSIRIGPGQAFYATGDVIGDIRKAHC R5 R R163 CIRPGNNTRTSIRIGPGQTFYATGDVIGDIRRAYC R5 R R392 CIRPGNNTRTSIRIGPGQTFYATGDVIGDPRKAHC R5 R R497 CIRPGNNTRTSVRIGPGQTWYATGGVTGDIRRAYC R5 R R526 CIRPGNNTRTSIRIGPGQTFYATGDVIGDIRRAYC CIRPGNNTRTSMRIGPGQTFYATGDVTGDIRKAYC R5 R R575 R5 R R589-2B10 CIRPSNNTRTSIRIGPGQTFYATGEVVGNIRKAYC X4 X R589-A12 CIRPSNNTRTSIRIGPGQTFYATGKVVGNIRKAYC R5 R SC1283 CTRPYNNTRKSIHIGPGQSFYATGAIIGDIRQAHC Пациенты с хронической ВИЧ-инфекцией R5 R SC1233 CIRPGNNTRTGIHIGPGQTFFATGAVIGDIRKAHC R5 X SC1457-B12 CIRPSSKTRASIRIGPGRTFYAMDGVGGNPRKAYC R5 R SC1457-C3 CTRPGNNTRKSTRIGPGQTFYTTGEIIGDIRKAHC R5 R SC3208 CIRPGNNTRTSVRIGPGQTFYATGDVIGDIRRAHC CIRPGNNTRTSIRIGPGQAFYATGEVTGDIRKAHC R5 R SC3410 В двух случаях в популяции ВИЧ внутри пациента мы обнаружили и R5-, и X4-варианты, причем в случае пациента SC1457 результаты предсказания фенотипа двумя различными методам различались: фенотип Х4 в случае одного из изолятов определялся лишь по правилу заряда, которых был равен шести.

Наличие вариантов, различных по фенотипу, в вирусной популяции одного пациента свидетельствует об эволюции вируса внутри хозяина.

Мы сравнивали число потенциальных сайтов гликозилирования между хронически инфицированными пациентами и пациентами с острой и ранней ВИЧ-инфекцией и выяснили, что достоверных различий в количестве сайтов между этими группами не наблюдается. При анализе количества потенциальных сайтов отдельных образцов мы заметили уменьшение числа сайтов на один при прогрессии инфекции в образцах R497. Сайт отсутствовал в участке между V2 и V3 петлями. Литературных данных, которые бы свидетельствовали о влиянии наличия сайта гликозилирования в данном положении на фенотип, на данный момент нет. В образце SC1475-B12 помимо увеличения суммарного заряда наблюдалось отсутствие консервативного сайта гликозилирования в начале V3 петли. Наличие этого сайта гликозилирования ассоциировано с R5-фенотипом, а его отсутствие является дополнительным признаком фенотипа X4 исследуемого варианта SC1457 [Ogert et al, 2001, Pollakis et al, 2001]. Мы обнаружили два изолята, соответствующие ампликонам SC1457-В12 и R526, которые обладали двойным тропизмом и могли использовать как CCR5-, так и CXCR4-корецепторы. Остальные изоляты имели фенотип R5. (Рис.5).

Активность люциферазы в клетках, RLU Рис. 5. Анализ тропизма вирусных изолятов в культуре клеток TZM-bl в Ингибитор X присутствии Ингибитор R ингибиторов корецепторов CCR5 (R5) и CXCR4 (X4).

FL K JR R R R R R R NL SC Названия псевдовирусных конструкций Таким образом, теоретические методы предсказания использования корецептора, построенные на модели субтипа В, в нашем случае с изолятами субтипа А оказались неточными (см. табл. 3.2.3). Присутствие в образцах в основном вирусов фенотипа R5 согласуется с тем фактом, что большинство образцов были получены на острой и ранней стадиях ВИЧ-инфекции.

Отсутствие вирусов фенотипа X4 в образцах с хронической инфекцией может быть связано с небольшой выборкой (4 образца). В данной части исследования мы получили панель псевдовирусов восточно-европейского варианта субтипа А, состоящую из 8 образцов c различными фенотипическими свойствами, которые выражались в использовании корецптора ССR5 или CCR5/CXCR4.

Данная панель будет использована для будущего исследования эффективности кандидатных вакцин против ВИЧ-1.

ВЫВОДЫ 1) Секвенирование и филогенетический анализ фрагментов гена env штаммов ВИЧ-1, циркулирующих в группе риска парентерального заражения ВИЧ-1, показали, что в данной группе риска доминирует восточно-европейский вариант субтипа А с низким уровнем генетического разнообразия.

2) Секвенирование и филогенетический анализ фрагментов гена env штаммов ВИЧ-1, циркулирующих в группе риска гомосексуального полового заражения ВИЧ-1, показали, что в данной группе риска доминирует субтип В с высоким уровнем генетического разнообразия.

3) Сравнение попарных значений генетического расстояния фрагмента гена env в группе риска парентерального заражения ВИЧ показало, что генетическое разнообразие штаммов в подгруппе с недавней инфекцией было меньше, чем в подгруппе с хронической инфекцией.

4) Методом амплификации и секвенирования единичных копий полноразмерного гена env штаммов ВИЧ-1, циркулирующих среди ПИН с острой и ранней инфекцией ВИЧ, в 70% случаев была показана парентеральная передача генетически однородных вирусных вариантов, т.е. впервые продемонстрирован эффект генетического «бутылочного горлышка» при передаче ВИЧ-1 у наркозависимых.

5) Анализ гликопротеина gp120 оболочки штаммов ВИЧ-1 с использованием подходов биоинформатики и изучение тропизма псевдовирусных конструкций показал наличие в вирусной популяции ПИН, находящихся на стадиях острой и ранней ВИЧ инфекции, преимущественно CCR5-тропных вирусов.

6) В рамках данного исследования впервые получена панель псевдовирусных конструкций с охарактеризованным нуклеотидным и белковым составом гена env изолятов ВИЧ-1 восточно европейского варианта субтипа А, которая будет использована для для доклинической оценки эффективности кандидатных вакциновых препаратов.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Murashev B.V., Kazennova E.V., Kozlov A.A., Murasheva I.V., Dukhovlinova E.N., Galachyants Y.P., Dorofeeva E.C., Dukhovlinov I.V., Smirnova G.V., Masharsky A.E., Klimov N.A., Kozlov A.P. Immunogenicity of candidate DNA vaccine based on subtype A human immunodeficiency virus type 1 predominant in Russia.// Biotechnol. J. – 2007. – V.2. – P.871- 2. Beyrer C., Baral S., Shaboltas A., Dukhovlinova E., Masharsky A., Verevochkin S., Latkin C., Heimer R., Hoffman I., Kozlov A. The feasibility of HIV vaccine efficacy trials among Russian injection drug users. // Vaccine. 2007. - Vol. 25(41). –P.7014-7016.

3. Dukhovlinova E., Masharsky A., Solovjeva T., Verevochkin S., Toussova O., Klimov N., Alexander L., Heimer R., Kozlov AP. The Surveillance of HIV- Subtype Distribution in the Year 2005 to 2006 in Saint Petersburg, Russia.//

Abstract

#515 of the 15th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections, Boston, MA, USA. - 2008. - Р.515.

Духовлинова Е.Н., Машарский, А.Э., Мерингоф М., Веревочкин С.В., 4.

Тюсова О.В., Климов Н.А., Волкова Г.В., Андерсон Дж., Сванстрём Р., Хаймер Р., Козлов А.П. Молекулярная эпидемиология ВИЧ-1 в Санкт Петербурге в 20052008 гг.//Тезисы Конференции по вопросам ВИЧ/СПИДа в Восточной Европе и Центральной Азии, Москва. - 2009. Т.2. - С.245.

5. Dukhovlinova E., Masharsky A., Verevochkin S., Shevchenko A., Toussova O., Skochilov R., Anderson J, Cohen M., Swanstrom R., Kozlov A. A significant transmission bottleneck among newly and recently HIV-1 infected injection drug users in St. Petersburg, Russia.//Abstract #477 of the 17th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections, san Francisco, СA, USA. – 2010. - Р. 477.