Гомо- и гетероолигомерные комплексы малых белков теплового шока человека

имени М.В. ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

Мымриков Евгений Викторович

ГОМО- И ГЕТЕРООЛИГОМЕРНЫЕ КОМПЛЕКСЫ МАЛЫХ БЕЛКОВ

ТЕПЛОВОГО ШОКА ЧЕЛОВЕКА

03.01.04 – биохимия

Автореферат диссертации

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва – 2012

Работа выполнена на кафедре биохимии биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Гусев Николай Борисович

Официальные оппоненты: Левицкий Дмитрий Иванович доктор биологических наук, профессор, Институт биохимии им.

А.Н. Баха РАН, зав. лабораторией Муронец Владимир Израилевич доктор биологических наук, профессор, Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ, зав. отделом

Ведущая организация: Институт экспериментальной кардиологии Федерального государственного учреждения «Российский кардиологический производственный комплекс»

Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита диссертации состоится 29 октября 2012 года в 15 часов 30 мин на заседании диссертационного совета Д 501.001.71 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу 119991, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12, биологический факультет Московского государственного университета имени М.В.

Ломоносова, аудитория 389.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан «» сентября 2012 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, Медведева Марина Валерьевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Представители семейства малых белков теплового шока (small heat shock proteins, sHsp) обнаружены практически у всех живых организмов. Все представители этого семейства содержат в своей структуре так называемый -кристаллиновый домен [1], состоящий из 6-8 антипараллельных -складок и играющий важную роль в формировании димеров. Характерными признаками малых белков теплового шока также являются небольшая молекулярная масса мономеров (от 12 до 43 кДа), склонность к формированию крупных олигомеров с молекулярной массой до 1 МДа [2, 3], динамичная четвертичная структура и шапероноподобная активность, проявляющаяся в способности sHsp предотвращать агрегацию частично денатурированных белков [3, 4]. Считается, что основной функцией sHsp является защита клеток от накопления агрегатов неправильно свернутых и денатурированных белков, образующихся под действием различных неблагоприятных факторов (тепловой шок, окислительный стресс, действие тяжелых металлов и других). Помимо этого, малые белки теплового шока принимают участие во многих других процессах, таких как апоптоз, пролиферация клеток, регуляция сократительной активности. Вероятно, именно из-за многофункциональности малых белков теплового шока точечные мутации этих белков зачастую сопровождаются развитием различных наследственных заболеваний [5].

В настоящее время в геноме человека обнаружено 10 генов, кодирующих малые белки теплового шока [5]. Некоторые sHsp человека экспрессируются повсеместно (HspB1, HspB5, HspB6 и HspB8), в то время как другие экспрессируются только в определенных тканях.

Малые белки теплового шока человека склонны к образованию олигомеров различного размера и состава. Из-за сходства первичных структур они могут образовывать как гомо- так и гетероолигомеры. При этом по данным из лаборатории Бенндорфа оказалось, что HspB является универсальным белком-партнером, способным взаимодействовать практически со всеми малыми белками теплового шока человека [6, 7]. До последнего времени при исследовании взаимодействия и процессов формирования гетероолигомеров малых белков теплового шока использовались такие подходы, как коиммунопреципитация, двойная гибридизация в клетках дрожжей, или флуоресцентно-резонансный перенос энергии (FRET).

Все эти методы предполагают использование модифицированных белков, содержащих дополнительные пептидные последовательности, или «химерных» белков, состоящих из соединенных между собой малых белков теплового шока и флуоресцентных белков.

Прикрепление подобных «меток» может значительно изменять свойства небольших по размеру и склонных к олигомеризации малых белков теплового шока, приводя к получению ложно положительных или ложно отрицательных результатов. В этой связи представлялось целесообразным исследовать взаимодействие различных sHsp с использованием белков дикого типа или точечных мутантов этих белков, структура которых минимально отличалась бы от структуры нативных белков. Помимо этого, представлялось важным исследовать механизм формирования гомо- и гетероолигомеров sHsp и картировать участки, вовлеченные во взаимодействие между мономерами внутри таких олигомеров.

Цель и задачи работы. Целью нашего исследования являлось изучение белок белковых взаимодействий различных малых белков теплового шока при образовании гомо- и гетероолигомеров. В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:

1. Получить малые белки теплового шока и их точечные «цистеиновые» мутанты в высокоочищенном виде.

2. Исследовать влияние точечных мутаций на структуру и шапероноподобную активность исследуемых sHsp.

3. С помощью различных методов исследовать образование гомо- и гетероолигомеров in vitro.

4. Исследовать взаимодействие малых белков теплового шока человека на клеточном уровне.

Основные положения, выносимые на защиту:

-кристаллинового 1. Седьмая -складка домена играет важную роль в формировании гомо- и гетеродимеров sHsp человека.

2. HspB1, HspB5 и HspB6 эффективно взаимодействуют между собой с образованием гетероолигомерных комплексов, но при этом очень слабо взаимодействуют с HspB8.

3. При образовании гетероолигомерных комплексов малых белков теплового шока человека необходима диссоциация крупных олигомеров до мономеров. Ключевой стадией в этом процессе является взаимодействие мономеров различных sHsp и образование гетеродимеров.

Научная новизна и практическая ценность работы. В ходе данной работы был разработан подход для анализа взаимодействия малых белков теплового шока человека, состоящий во введении остатка цистеина в участки, предположительно участвующие в образовании контактов, и были получены так называемые «цистеиновые» мутанты четырех sHsp. Установлено, что структура таких мутантных белков практически не отличается от структуры белков дикого типа. «Цистеиновые» мутанты sHsp эффективно образовывали дисульфидные связи в гомо- и гетеродимерах, что свидетельствует о том, что 7-складка, в которой расположен введенный остаток цистеина, принимает участие в образовании как гомо-, так и гетеродимеров различных малых белков теплового шока человека. Эти результаты были подтверждены экспериментами, выполненными зарубежными учеными на изолированных -кристаллиновых доменах HspB5 (B-кристаллина) и HspB6 (Hsp20) методами рентгеноструктурного анализа и ядерного магнитного резонанса (ЯМР) [8-10]. С использованием белков дикого типа и их «цистеиновых» мутантов различными методами было установлено, что HspB1, HspB5 и HspB6 эффективно взаимодействуют между собой, в то же время они лишь очень слабо взаимодействуют с HspB8.

На основе полученных результатов предложена схема, описывающая предполагаемый механизм образования гетероолигомерных комплексов sHsp человека. В отличие от общепринятой точки зрения, постулирующей димер в качестве минимальной стабильной субъединицы малых белков теплового шока, полученные нами результаты свидетельствуют о том, что для образования гетероолигомерных комплексов необходимо наличие свободных мономеров. Предположительно, такие мономеры могут образовываться как за счет диссоциации крупных олигомеров, так и за счет диссоциации гомодимеров. Взаимодействуя между собой, мономеры образуют гомо- или гетеродимеры, которые, ассоциируя, формируют различные по размеру и составу гомо- или гетероолигомеры.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на заседании кафедры биохимии Биологического факультета МГУ;

на 35-м Международном Конгрессе Европейских Биохимических Обществ (FEBS) в 2010 г. (Гетеборг, Швеция);

на Форуме молодых ученых и 12-й конференции Международного Союза Биохимиков и Молекулярных Биологов (IUBMB) в 2010 г. (Мельбурн, Австралия);

на международной конференции «Биология Молекулярных Шаперонов» в 2011 г. (Грундлси, Австрия);

на Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» в 2008- гг. (Москва).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, включая статей и 6 тезисов сообщений.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения полученных результатов, их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 118 страницах печатного текста, иллюстрирована 40 рисунками и 9 таблицами. Список цитированной литературы содержит 171 наименование.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Обзор литературы В обзоре литературы приведены данные о структуре, свойствах и некоторых функциях малых белков теплового шока. Особое внимание уделено структуре олигомеров этих белков и данным, касающимся образования гетероолигомеров малых белков теплового шока человека.

Материалы и методы Плазмиды, содержащие кодирующие последовательности белков дикого типа и их «цистеиновых» мутантов, для экспрессии в клетках E. coli были любезно предоставлены к.б.н. А.С. Сейт-Неби и к.б.н. О.В. Букач. «Цистеиновые» мутанты HspB5, HspB6 и HspB представляют собой белки, в которых все эндогенные остатки цистеина (если таковые имеются в белках дикого типа) заменены на остатки серина, а аминокислотные остатки, расположенные в положениях, гомологичных Cys137 HspB1, заменены на остаток цистеина.

Для экспрессии sHsp в клетках эукариот кодирующие последовательности (CDS) исследуемых белков были переклонированы в вектора pcDNA3.1 Hygro(+) и pcDNA6 myc His A (Invitrogen).

Рекомбинантные белки дикого типа (HspB1, HspB5, HspB6, HspB8), а также их «цистеиновые» мутанты экспрессировали в клетках E. coli штамма BL21(DE3). Очистку проводили путем фракционирования экстракта клеток сульфатом аммония и комбинирования двух стадий хроматографической очистки: для HspB5 и HspB1 – ионообменной хроматографии и гель-фильтрации, для HspB6 – ионообменной и гидрофобной хроматографий, а для HspB8 – гидрофобной хроматографии и гель фильтрации. Полученные препараты белков хранили при -20С в буфере В (20 мМ трис ацетат, pH 7,6, 10 мМ NaCl, 0,1 мМ ЭДТА, 2 мМ ДТТ, 0,1 мМ ФМСФ). Такая процедура очистки позволила получить значительные количества высокоочищенных препаратов малых белков теплового шока дикого типа и их «цистеиновых» мутантов.

Восстановление и окисление исследуемых sHsp проводили следующим образом. Для восстановления белки инкубировали 30 мин в буфере B, содержащем 15 мМ ДТТ.

Окисление, ведущее к образованию дисульфидных связей, проводили путем диализа образцов против буфера А (50 мМ трис-HCl, pH 7,4, 50 мМ KCl, 1 мМ MgCl2, 0,1 мМ ФМСФ) в течение ночи при 15С, 25С или 37С [11]. Получаемые белковые образцы анализировали методом электрофореза в системе Леммли [12] в градиентном (10-20%) или гомогенном (15%) полиакриламидном геле (ПААГ) в отсутствие -меркаптоэтанола (-МЭ).

Сравнение структуры белков дикого типа и их «цистеиновых» мутантов проводили методами спектроскопии кругового дихроизма (КД), флуоресцентной спектроскопии и гель фильтрации.

Восстановленные образцы белков диализовали против буфера PBS (50 мМ калий фосфатный буфер, рН 7,5, 150 мМ NaCl, 2 мМ ДТТ), и регистрировали спектры КД на приборе Chirascan Circular Dichroism Spectrometer (Applied Photophysics) в диапазоне длин волн 195-260 нм с последующим определением соотношения элементов вторичной структуры по методу Срирама и Вуди [13]. Автор глубоко благодарен к.б.н. А.В.

Пивоваровой за помощь в проведении экспериментов по спектроскопии кругового дихроизма.

Собственную триптофановую флуоресценцию белков (0,06-0,08 мг/мл) в буфере В возбуждали светом с длиной волны (ex) 295 нм и регистрировали в диапазоне 300-400 нм.

Для измерения параметров связывания гидрофобного зонда bis-ANS к образцу, содержащему 0,67-1,00 мкМ малого белка теплового шока (в расчете на мономер) в фосфатном буфере, добавляли до конечной концентрации 8-9 мкМ, регистрируя уровень bis-ANS флуоресценции при различном соотношении bis-ANS/белок. Флуоресценцию возбуждали светом с длиной волны 385 нм и регистрировали при 495 нм. Все измерения проводили на спектрофлуориметре Varian™ CaryEclipse при 25°C.

Для анализа четвертичной структуры белков проводили гель-фильтрацию на колонках Superdex 75 HR 10/30 и Superdex 200 HR 10/30, уравновешенных буфером В, содержащем 150 мМ NaCl. При анализе олигомерного состояния на колонку наносили от 10 до 170 мкг белка в 150 мкл буфера В. Метод гель-фильтрации также использовали при исследовании образования гетероолигомеров, при этом на колонку наносили 180 мкг белка в 200 мкл буфера В. Скорость элюции составляла 0,5 мл/мин. В ходе элюции собирали фракции объемом 0,4 мл и анализировали их белковый состав методом SDS-электрофореза в полиакриламидном геле [12]. В качестве белков-стандартов использовали тиреоглобулин (669 кДа), ферритин (440 кДа), каталазу (240 кДа), глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу из мышц кролика (144 кДа), бычий сывороточный альбумин (68 кДа), овальбумин (43 кДа), химотрипсиноген (25 кДа) и рибонуклеазу (13,7 кДа).

Сравнение шапероноподобной активности белков дикого типа и их «цистеиновых»

мутантов проводили, используя в качестве модельных субстратов инсулин или роданазу. В кювете спектрофотометра смешивали белок-субстрат (конечная концентрация 0,2 мг/мл) с исследуемым малым белком теплового шока в весовом соотношении sHsp/субстрат равном 0, 1/4, 1/2 или 1. В случае инсулина образцы преинкубировали 2 мин в термостатируемой кювете спектрофотометра и инициировали агрегацию добавлением 0,3М ДТТ до конечной концентрации 24 мМ. В случае роданазы образцы преинкубировали 10 мин при 25С и помещали в термостатируемую кювету спектрофотометра при 44С. Агрегацию субстрата регистрировали в течение 40-60 мин по увеличению кажущейся оптической плотности при 360 нм на спектрофотометре Ultrospec 3100.

Формирование гетероолигомерных комплексов sHsp человека проводили по ранее описанной методике [14]. Для этого предварительно восстановленные белки смешивали попарно в концентрации 0,5 или 1,0 мг/мл и инкубировали 1 час при 42С в буфере В. В качестве контроля использовали образцы, инкубированные при 4С. Было проведено три разных серии экспериментов. В первом случае образцы, содержащие белки дикого типа или «цистеиновые» мутанты, подвергались анализу сразу после инкубации при 42С. Во втором случае образцы, содержащие HspB1 дикого типа и/или «цистеиновые» мутанты, предварительно инкубированные при 42С для формирования гетероолигомеров, подвергали мягкому окислению и анализировали методами электрофореза и гель-фильтрации. Наконец, в третьем случае сначала проводили мягкое окисление HspB1 дикого типа или «цистеиновых» мутантов для образования ковалентно-«сшитых» гомодимеров, а затем окисленные гомоолигомеры смешивали и инкубировали при 42С для обмена субъединиц.

Белковый состав полученных проб анализировали методами гель-фильтрации и аналитического ультрацентрифугирования.

Аналитическое ультрацентрифугирование образцов изолированных sHsp и их смесей проводили на центрифуге Beckman, модель E (ротор AnJ-Ti) при 4С. После достижения ротором скорости 48000 об/мин регистрировали распределение белка по ячейке каждые 1, мин. На основании полученных данных строили диаграммы распределения в координатах от с использованием программы Автор выражает C(S20,W) S20,W SEDFIT [15].

признательность сотруднику НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского П.В. Калмыкову за проведение экспериментов по аналитическому ультрацентрифугированию.

В экспериментах по коиммунопреципитации использовали моноклональные антитела к HspB1, HspB6 и HspB8, полученные ранее в лаборатории иммунохимии и любезно предоставленные д.б.н. А.Г. Катруха. Моноклональные антитела к HspB5 были получены при выполнении данной работы. Образцы изолированных sHsp или их смесей инкубировали 30 мин при 4С с сефарозой с иммобилизованными моноклональными антителами к одному из исследуемых малых белков теплового шока человека. Сефарозу промывали четыре раза фосфатно-солевым буфером, содержащим 0,1% Tween-20 (после каждой промывки сефарозу осаждали центрифугированием). Элюцию связанных с сефарозой белков проводили 0,1М глициновым буфером (рН 2,0) в течение 15-20 мин при 20С и постоянном перемешивании.

По окончании элюции осадок сефарозы удаляли центрифугированием, супернатант нейтрализовали 2М раствором трис и анализировали белковый состав методом SDS электрофореза с последующим вестерн-блоттингом. Для анализа образования «сшитых»

дисульфидными связями гетеродимеров, перед стадией элюции сефарозу, содержащую связанные белки, промывали буфером А и инкубировали ее 2 часа в этом же буфере при 37С для окисления и образования дисульфидных связей. Полученные образцы анализировали методом электрофореза в градиентном (10-20%) ПААГ в отсутствие -меркаптоэтанола или вестерн-блоттингом.

Для исследования взаимодействия sHsp на клеточном уровне клетки линии HEK293F трансфицировали по стандартной методике с использование липосомного агента LipofectamineTM 2000 (Invitrogen). Через ~72 ч после трансфекции клетки отмывали от среды инкубации, осаждали в буфере PBS и лизировали 10 мин при 37С в буфере CLB (50 мМ трис-HCl, рН 7,8, 150 мМ NaCl, 1% Nonidet P-40), содержащем 1 мМ ФМСФ, 1,75 мкМ лейпептина и 6,25 мкМ пепстатина. Для удаления ядер полученный лизат центрифугировали 10 мин при 10000g. Общую концентрацию белка в полученных образцах измеряли методом Бредфорд [16], используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин (БСА).

Экспрессию исследуемых белков анализировали методом вестерн-блоттинга, нанося по мкг тотального белка на дорожку, при этом окрашивание проводили антителами, специфичными к sHsp человека, и антителами 6С5, специфичными к глицеральдегид-3 фосфатдегидрогеназе. Детекцию гетероолигомеров малых белков теплового шока человека в клеточных лизатах проводили методом коиммунопреципитации. Автор выражает глубокую признательность к.б.н. Ф.Н. Розову за всестороннюю помощь в проведение экспериментов на клеточных культурах.

Основные результаты и их обсуждение Получение и сравнение структуры и свойств рекомбинантных малых белков теплового шока человека и их «цистеиновых» мутантов В работе Завьялова и соавторов [11] было установлено, что единственный остаток цистеина (Cys141) Hsp25 мыши может участвовать в образовании дисульфидных связей между соседними мономерами. При этом подобная модификация не сопровождалась существенными изменениями в структуре и шапероноподобной активности исследуемого белка. Данное наблюдение свидетельствует о том, что указанный остаток находится в области контакта между соседними мономерами малых белков теплового шока. Мы предположили, что введение единственного остатка цистеина в структуру различных малых белков теплового шока человека в положение, гомологичное Cys141 Hsp25 мыши, позволит получить так называемые «цистеиновые» мутанты, которые могут быть успешно использованы для исследования структуры гомо- и гетероолигомерных комплексов. Для реализации этого проекта в трех исследуемых белках человека (HspB5, HspB6, HspB8) все эндогенные остатки цистеина были заменены на серин, а остаток, гомологичный Cys141 Hsp25 мыши (а также Рис. 1. Схема строения «цистеиновых»

мутантов sHsp человека. Звездочками отмечены Cys137 HspB1 человека), был заменен на эндогенные остатки цистеина, замененные на серин, стрелкой – точечная мутация, цистеин (рис. 1). Очевидно, что сопровождающаяся введением единственного использование «цистеиновых» мутантов для остатка цистеина.

исследования гомо- или гетероолигомерных комплексов возможно лишь в том случае, если введенные мутации не влияют на структуру и свойства исследуемых белков. В связи с этим белки дикого типа и их «цистеиновые» мутанты были получены в высокоочищенном состоянии [17, 18], и было проведено подробное сравнение их свойств.

Метод спектроскопии кругового дихроизма (КД) был использован для анализа вторичной структуры белков. Спектры КД HspB5 и HspB6 имеют широкий отрицательный максимум между 208 и 215 нм, соответственно (рис.

2, А и Б), что характерно для белков, в структуре которых преобладают -складчатые участки.

- Отрицательный максимум спектра КД HspB8 смещен - A - в более коротковолновую область и приходится на [], град*см /дмоль 203-205 нм (рис. 2, В), что свидетельствует о наличии повышенного (относительно других sHsp) - количества неупорядоченных участков в структуре Б - белка. Спектры КД «цистеиновых» мутантов практически идентичны спектрам белков дикого типа, из чего следует, что введенные точечные - мутации не влияют на вторичную структуру - исследуемых белков (рис. 2).

В - Для сравнения третичной структуры 200 210 220 230 240 250 Длина волны, нм исследуемых мы использовали метод sHsp Рис. 2. Спектры кругового дихроизма дикого типа собственной триптофановой флуоресценции. Этот sHsp (сплошные линии) и их метод позволяет оценить микроокружение остатков «цистеиновых» мутантов (пунктирные линии). А – HspB5, Б – HspB6, B – триптофана в белковой глобуле и получить HspB8.

определенную информацию о третичной структуре белка, по крайней мере, в области, непосредственно примыкающей к остаткам триптофана. Оказалось, что спектры собственной триптофановой флуоресценции всех исследуемых белков имеют максимум при 345-346 нм, при этом форма и амплитуда спектров белков дикого типа и соответствующих «цистеиновых» мутантов практически не различаются (данные не представлены). Анализ полученных спектров показал, что большая часть остатков триптофана располагается на поверхности белковой глобулы, но не контактирует с молекулами воды [19]. Таким образом, метод флуоресцентной спектроскопии также не выявил значительных изменений структуры исследуемых sHsp при внесении точечных мутаций. Для сравнения гидрофобных свойств исследуемых белков мы анализировали связывание гидрофобного зонда bis-ANS с белками дикого типа и их «цистеиновыми» мутантами. Было установлено, что характер связывания bis-ANS в значительной степени зависит от природы белка [20]. Так, HspB5 (B-кристаллин) (в концентрации 0,67 мкМ) эффективно и с высоким сродством связывает гидрофобный зонд, при этом насыщение центров связывания происходило при концентрации bis-ANS около 5,0 мкМ. Это свидетельствует о том, что HspB5 имеет небольшое количество центров прочного связывания bis-ANS. Кривая титрования «цистеинового» мутанта HspB незначительно отличается от кривой титрования белка дикого типа, что свидетельствует о том, что введенная мутация не изменяет гидрофобных свойств этого белка. Титрование HspB6 и HspB8 bis-ANS сопровождалось медленным увеличением флуоресценции, которое не достигает насыщения даже при очень высоких концентрациях флуоресцентного зонда.

Так, например, добавление даже 8-9-кратного избытка bis-ANS к HspB6 (или HspB8) не приводило к насыщению, а сопровождалось лишь линейным увеличением флуоресценции.

Такая форма кривой характерна для белков, имеющих большое количество центров связывания с низким сродством к bis-ANS. По этим причинам сравнение гидрофобных свойств HspB6 и HspB8 и их «цистеиновых» мутантов оказалось довольно затруднительным.

Тем не менее, анализ связывания bis-ANS не выявил существенных изменений гидрофобных свойств HspB6 и его «цистеинового» мутанта. «Цистеиновый» мутант HspB8 связывал bis ANS лучше, чем белок дикого типа, однако это различие было довольно незначительным.

Одним из отличительных свойств малых белков теплового шока является их способность образовывать крупные и динамичные олигомерные комплексы, поэтому важной характеристикой этих белков является их четвертичная структура. Метод гель-фильтрации был использован для сравнения олигомерного состояния HspB5, HspB6 и HspB8 и их «цистеиновых» мутантов. В связи с тем, что олигомерное состояние может зависеть от концентрации белка, мы наносили на гель-фильтрационную колонку различные количества исследуемых sHsp и анализировали зависимость объема элюции от количества наносимого белка (рис. 3). формирует крупные 11,0 HspB А олигомеры с кажущейся молекулярной массой 10, около 660 кДа (максимум пика элюции с колонки 10, Superdex 200 приходится на 10,6 мл), при этом 10, положение максимума не зависит от количества 10, наносимого белка (рис. 3, А). Кажущаяся 10, Объем элюции, мл 20 40 60 80 100 120 140 Б 10, молекулярная масса олигомеров «цистеинового»

10, мутанта HspB5 близка к таковой белка дикого типа 10, (различие в положении максимума не превышает 10, 0,2 мл). HspB6 при гель-фильтрации на колонке 10, Superdex 75 элюируется в виде симметричного пика 10 20 30 40 50 В 11, с объемом элюции ~10,6 мл, что соответствует 11, белку с кажущейся молекулярной массой около 11, кДа. Положение максимума пика на профиле 11, элюции не зависит от количества наносимого белка, 11, и при этом при всех исследованных концентрациях 0 10 20 30 40 50 60 Количество белка, мкг хроматографическое поведение «цистеинового»

Рис. 3. Зависимость объема элюции мутанта HspB6 не отличается от поведения белка sHsp дикого типа (сплошные линии) и их «цистеиновых» мутантов дикого типа (рис. 3, Б). В отличие от первых двух (штриховые линии) от количества белков HspB8, по всей видимости, не образует наносимого на колонку белка. А – HspB5 (гель-фильтрация на Superdex стабильных олигомеров, а существует в виде 200), Б – HspB6 и В – HspB8 (гель фильтрация на Superdex-75). равновесной смеси мономеров и димеров.

Следствием этого является уменьшение объема элюции при увеличении количества наносимого на колонку белка (рис. 3, В). «Цистеиновый» мутант HspB8 при гель-фильтрации ведет себя подобным образом, однако его объемы элюции незначительно (менее 0,1 мл) меньше объема элюции белка дикого типа. Таким образом, приведенные выше данные свидетельствуют о том, что точечные мутации, введенные в «цистеиновых» мутантах HspB и HspB8, лишь незначительно влияют на размер или форму этих белков, а олигомерное состояние HspB6 не изменяется вовсе.

Предотвращение агрегации частично денатурированных белков (шапероноподобная активность) является одним из наиболее важных свойств малых белков теплового шока. В этой связи представлялось важным сравнить шапероноподобную активность белков дикого типа и их «цистеиновых» мутантов. В качестве субстратов были выбраны инсулин и роданаза, являющиеся классическими модельными субстратами для измерения шапероноподобной активности в условиях in vitro. Агрегацию инсулина индуцировали добавлением избытка ДТТ, а агрегацию роданазы – 0, А повышением температуры. За процессом агрегации 0, следили по увеличению кажущейся оптической 0, плотности при 360 нм при различном весовом 0, 0, соотношении sHsp/субстрат (0, 1/1, 1/2 и 1/4).

0, Оказалось, что и полностью HspB5 HspB Б 0, предотвращают агрегацию роданазы при А360, a.u.

0, соотношении 1/2 (рис. 4, А и В). Шаперонная 0, активность HspB6 при использовании роданазы 0, оказалась ниже, чем у двух других белков, и в 0, выбранных условиях он лишь частично В 0, предотвращал агрегацию данного субстрата (рис. 4, 0, Б). При этом шапероноподобная активность 0, «цистеиновых» мутантов HspB5, HspB6 и HspB 0, оказалась сравнимой с активностью 0, соответствующих белков дикого типа (рис. 4, 0 10 20 30 40 50 Время, мин штриховые линии). При использовании инсулина в Рис. 4. Кинетика агрегации качестве субстрата было выявлено значительное роданазы в отсутствие sHsp (штрих пунктирные линии) и в присутствии различие в шапероноподобной активности HspB белка дикого типа (сплошные) или «цистеиновых» мутантов дикого типа и его «цистеинового» мутанта. В (пунктирные). Весовое отношение выбранных условиях и фиксированном роданаза/sHsp 2/1. А – HspB5, Б – HspB6, В – HspB8. соотношении HspB6/инсулин белок дикого типа полностью предотвращал агрегацию данного субстрата, в то время как «цистеиновый»

мутант лишь замедлял ее на начальном этапе. Мы связываем такое поведение «цистеинового» мутанта HspB6 с наличием в нем точечной мутации в N-концевой части (C46S). По данным литературы [21] остатки 11-18 и 33-40 в HspB5 (B-кристаллине), гомологичные остаткам 13-23 и 38-46 в HspB6, напрямую вовлечены в связывание инсулина.

Возможно, точечная замена во втором участке связывания приводит к определенному изменению шапероноподобной активности «цистеинового» мутанта при использовании инсулина в качестве модельного субстрата. В случае двух других малых белков теплового шока (HspB5 и HspB8) шапероноподобная активность белков дикого типа была практически не отличимой от шапероноподобной активности соответствующих «цистеиновых» мутантов.

При этом следует заметить, что при использовании инсулина в качестве субстрата HspB5 (и его «цистеиновый» мутант) обладали наибольшей, а HspB8 (и его «цистеиновый» мутант) – наименьшей шапероноподобной активностью.

Суммируя представленные результаты, можно заключить, что введение точечных мутаций не приводит к существенным изменениям во вторичной, третичной или четвертичной структуре исследуемых белков. Шапероноподобная активность «цистеиновых» мутантов исследуемых sHsp (за исключением «цистеинового» мутанта HspB6 при использовании инсулина в качестве модельного субстрата) существенно не отличается от шапероноподобной активности белков дикого типа. Таким образом, полученные нами «цистеиновые» мутанты малых белков теплового шока человека могут быть использованы в качестве инструмента для анализа образования гомо- и гетероолигомерных комплексов sHsp.

Образование гомо- и гетеродимеров различными малыми белками теплового шока человека В исследованиях последних трех лет, было установлено, что 7-складка кристаллинового домена непосредственно вовлечена в образование межмолекулярных связей в димерах малых белков теплового шока [8-10, 22]. При этом остаток цистеина, расположенный в 7-складке Hsp25 и его ортологов, может участвовать в образовании дисульфидных мостиков между соседними мономерами [11]. Получив «цистеиновые»

мутанты HspB5, HspB6 и HspB8 и имея в руках HspB1 дикого типа с единственным остатком цистеина, расположенным в середине 7-складки, мы могли проанализировать эффективность образования дисульфидных связей и формирование гомодимеров различными малыми белками теплового шока. Учитывая тот факт, что многие малые белки теплового шока способны образовывать гетероолигомерные комплексы, мы могли исследовать образование таких гетероолигомеров, используя «цистеиновые» мутанты. Для того чтобы исключить неспецифическое окисление SH-групп при хранении белка, перед каждым экспериментом исследуемые белки подвергались восстановлению. Для анализа образования гомодимеров сразу после восстановления sHsp диализовали против буфера А (50 мМ трис-HCl, pH 7,4, 50 мМ KCl, 1 мМ MgCl2, 0,1 мМ ФМСФ) при 25С в течение ночи.

Такая обработка обеспечивала мягкое окисление и формирование дисульфидных мостиков между остатками цистеина. Для анализа образования гетероолигомерных комплексов предварительно восстановленные белки смешивали попарно и инкубировали 1 час при 42С.

Как было установлено ранее, такая обработка обеспечивала полный обмен субъединиц и формирование гетероолигомерных комплексов. Полученные смеси малых белков теплового шока подвергали мягкому окислению при 25С в течение ночи. Образование димеров, «сшитых» дисульфидными связями, детектировали методом электрофореза в градиентном 10-20% ПААГ в отсутствие -МЭ. К сожалению, оказалось, что этот метод не позволяет разделить гомо- и гетеродимеры HspB1 и HspB8, поэтому разделение димеров этих белков проводили методом SDS-электрофореза в 10% ПААГ в присутствии 6 М мочевины.

Данные, представленные на рис. 5, свидетельствуют о том, что дикого типа и все HspB «цистеиновые» мутанты в выбранных условиях с высокой эффективностью образуют гомодимеры, «сшитые»

дисульфидными связями.

Подробное изучение этого процесса Рис. 5. Химическое «сшивание» «цистеиновых» показало, что эффективность мутантов и HspB1 дикого типа в ходе мягкого окисления SH-групп. Дорожки 1 и 3 – изолированные образования дисульфидных связей окисленные белки, дорожка 2 – смесь двух белков, увеличивается при повышении инкубировавшаяся при 42С перед окислением.

Электрофорез в градиентном ПААГ (10-20%) в температуры, и при проведении отсутствие -МЭ. Маленькой стрелкой обозначено диализа при 37С более 80% белков положение гетеродимеров.

оказывается вовлеченными в формирование «сшитых» гомодимеров.

Окисление смесей двух «цистеиновых» мутантов sHsp или «цистеинового» мутанта с HspB1 дикого типа во всех случаях приводило к появлению на электрофореграмме дополнительной полосы, отмеченной стрелкой на дорожках 2 рис. 5. Эта полоса, имеющая кажущуюся молекулярную массу промежуточную между молекулярными массами гомодимеров sHsp, входящих в состав образца, соответствует гетеродимерам исследуемых белков. Наиболее эффективно образование гетеродимеров происходило в образцах, содержащих HspB1, HspB5 и HspB6 (рис. 5, верхний ряд). В парах указанных белков доля гетеродимеров составляла более 35% от всех образующихся димеров, «сшитых»

дисульфидными связями. Наибольшая доля гетеродимеров была обнаружена в случае HspB и HspB6 (рис. 5, вверху слева).

Напротив, если одним из двух малых белков теплового шока был HspB8, доля образующихся гетеродимеров была значительно меньше. В этом случае HspB8 и любой из его партнеров эффективно образовывали гомодимеры, но доля гетеродимеров не превышала 15-20% от всех «сшитых» дисульфидными связями димеров (рис. 5, нижний ряд). Таким образом, HspB1, HspB5 и HspB6 эффективно обмениваются субъединицами (мономерами). В то же время эффективность образования гетеродимеров всех перечисленных малых белков теплового шока с «цистеиновым» мутантом HspB8 значительно ниже. Представленные результаты в некоторой степени противоречат данным, полученным в лаборатории Бенндорфа, согласно которым HspB8 является универсальным малым белком теплового шока, способным взаимодействовать практически со всеми другими sHsp человека [6, 7].

Нам кажется, что это противоречие может быть связано с тем, что использованные в работах Бенндорфа и соавт. методы не позволяют достаточно точно оценить прочность взаимодействия различных малых белков теплового шока. К тому же в работах Бенндорфа и соавт. использовались малые белки теплового шока «слитые» с флуоресцентными белками или пептидами-метками. Это могло приводить к значительному изменению свойств исследуемых белков и к получению ложноположительных результатов.

Представленные данные свидетельствуют о том, что 7-складка -кристаллинового домена играет важную роль во взаимодействии соседних субъединиц различных малых белков теплового шока человека. Cys137 HspB1 или остатки цистеина, введенные в гомологичные позиции других sHsp, располагаются в непосредственной близости (на расстоянии не более 8 [23]) в структуре как гомо-, так и гетеродимеров и могут легко подвергаться окислению с образованием дисульфидных связей. Межсубъединичное взаимодействие, по всей видимости, осуществляется не только посредством контактов, образуемых двумя антипараллельно направленными 7-складками, но и за счет других участков в структуре малых белков теплового шока. Возможно, взаимодействие по этим участкам влияет на стабильность димеров тех или иных sHsp и может либо увеличивать (как в случае пары HspB1/HspB6), либо уменьшать (как в случае пары любого из изученных sHsp и HspB8) эффективность образования «сшитых» дисульфидными связями гетеродимеров малых белков теплового шока.

Формирование гетероолигомеров малых белков теплового шока человека в условиях in vitro и in vivo В начале 90-х годов было обнаружено, что HspB6 (Hsp20, p20) и HspB1 (Hsp27) соочищаются с B-кристаллином (HspB5) при выделении из скелетных мышц [24, 25].

Позднее эти исследования были расширены. При этом, как правило, использовались методы дигибридного скрещивания, коиммунопреципитации модифицированных малых белков теплового шока или метод флуоресцентного переноса энергии (FRET) с использованием sHsp, «слитых» с флуоресцентными белками [6, 7, 26], Все перечисленные методы не лишены недостатков. Кроме того, до последнего времени не проводилось систематических исследований механизма формирования гетероолигомерных комплексов, и не были изучены свойства образующихся гетероолигомеров. В А HspB HspB этой связи мы предприняли попытку исследовать процесс формирования гетероолигомеров малых белков теплового шока, используя методы химического A280, mAu «сшивания» «цистеиновых» мутантов, а также методов гель-фильтрации, аналитического Б ультрацентрифугирования и коиммунопреципитации sHsp дикого типа в 3 условиях in vitro и in vivo.

Вследствие того, что ранее в нашей лаборатории были подробно исследованы свойства гетероолигомеров, формируемых 8 10 12 14 16 HspB1 и HspB6 [14], мы сконцентрировали Объем элюции, мл Рис. 6. Гель-фильтрация изолированных свое внимание на гетероолигомерных HspB5, HspB6 и их гетероолигомерных комплексах, образуемых HspB5 и HspB6. В комплексов. А – белки дикого типа, Б – «цистеиновые» мутанты HspB5/HspB6, кристаллин (HspB5) дикого типа образует после окисления, проведенного после обмена субъединиц. Штрих-пунктирными крупные гомоолигомеры с молекулярной линиями (1 и 2) представлены профили массой около 600-700 кДа, а HspB6, по всей элюции изолированных белков, штриховыми линиями (3) – смеси, видимости, представлен в виде димеров. При инкубированные при 4С, сплошными линиями (4) – смеси двух белков, гель-фильтрации изолированные и HspB инкубированные при 42. На врезках HspB6 элюировались в виде симметричных представлены электрофореграммы соответствующих фракций. SDS- пиков с кажущимися молекулярными массами электрофорез проводили в присутствии (A) около 660 кДа (HspB5) и 52 кДа (HspB6) (рис.

или в отсутствие (Б) -МЭ. Стрелкой на Б обозначено положение гетеродимеров.

6, А). Однако, если перед нанесением на колонку смесь HspB5/HspB6 преинкубировали 1 час при 42С, то на профиле элюции появлялся новый пик с промежуточной молекулярной массой около 350 кДа, в котором обнаруживались оба белка (рис. 6, А). Как было описано выше, «цистеиновые» мутанты HspB5 и HspB6 не отличаются по олигомерному состоянию от белков дикого типа, и поэтому мы могли использовать их для изучения состава гетероолигомерных комплексов.

Смесь «цистеиновых» мутантов HspB5 и HspB6 инкубировали 1 час при 42С, тем самым обеспечивая возможность обмена субъединиц. Полученный образец диализовали против буфера А при 15С. В этих условиях обмен субъединиц незначителен, но происходит мягкое окисление сульфгидрильных групп и образование дисульфидных связей в димерах. При гель-фильтрации полученного таким образом образца оказалось, что окисление практически не влияло на форму и положение пика, соответствующего гетероолигомерам HspB5/HspB (ср. рис. 6, А и Б). В пике, соответствующем «сшитым» гетероолигомерам мы обнаруживали гомодимеры HspB5 и гетеродимеры HspB5/HspB6, однако в нем не было обнаружено «сшитых» гомодимеров HspB6, которые элюировались в отдельном пике (рис. 6, Б). Таким образом, мономеры HspB6 могут встраиваться в крупные олигомеры HspB5 только через образование гетеродимеров с HspB5.

В хорошем соответствии с данными, ранее полученными в нашей лаборатории [14], мы наблюдали образование гетероолигомеров двух типов между HspB1 и HspB6. Анализ состава этих олигомеров с использованием «цистеинового» мутанта HspB6 показал, что комплексы с кажущимися молекулярными массами 120-150 и 300 кДа содержат в своем составе преимущественно гетеродимеры. Это наблюдение впоследствии было подтверждено с использованием метода коиммунопреципитации (данные не представлены). Анализ взаимодействия между HspB1 дикого типа и HspB5 методом гель-фильтрации оказался затруднен вследствие того, что оба этих белка образуют крупные олигомерные комплексы.

По этой причине мы исследовали взаимодействие HspB5 с точечным мутантом HspB1, имитирующим фосфорилирование по трем остаткам серина (S18D/S78D/S82D). Этот мутантный белок, обозначаемый как HspB1_3D образует небольшие олигомеры (димеры или тетрамеры), что облегчает исследование его взаимодействия с HspB5. Оказалось, что HspB дикого типа и HspB1_3D способны образовывать гетероолигомерные комплексы с кажущейся молекулярной массой, близкой к массе гомоолигомеров HspB5.

Результаты, полученные при гель-фильтрации, были подтверждены с использованием метода аналитического ультрацентрифугирования. В выбранных условиях HspB седиментировался в виде острого пика с коэффициентом седиментации 2,6S (рис. 7, линии 1). В то же время образующие крупные гетерогенные олигомерные комплексы HspB1 и HspB5 седиментировались в виде широких пиков с коэффициентами седиментации 10-15S и 13-17S, соответственно (рис. 7, линии 2). Если аналитическому ультрацентрифугированию подвергали смеси HspB1/HspB6 или HspB5/HspB6, преинкубированные при 4С, то на седиментограммах выявлялись пики, соответствующие изолированным белкам (рис. 7, линии 3). Напротив, если перед ультрацентрифугированием смеси HspB1/HspB6 или HsPB5/HspB6 преинкубировали при 42С, то пики, соответствующие изолированным белкам, исчезали и вместо них на седиментограммах выявлялись комплексы с промежуточными коэффициентами седиментации (рис. 7, линии 4). В случае пары HspB1/HspB6 были обнаружены пики с коэффициентами седиментации 3,9S и 7,0S, а в случае пары HspB5/HspB6 – пики с коэффициентами 7,9S и 10,4S.

Б A 0, 0, 0, 1 C (S) 0, C(S) 0, 0, 0, 4 6 8 10 12 14 16 18 20 2 3 4 0, 0, 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 S20,W S20,W Рис. 7. Исследование взаимодействия в парах HspB1/HspB6 (А) и HspB5/HspB6 (Б) методом аналитического ультрацентрифугирования. Представлены седиментограммы изолированных белков (штрих-пунктирные линии 1 и 2) и их смесей, преинкубированных при 4С (штриховые линии 3) или 42С (сплошные линии 4). Врезка на Б представляет собой увеличенную часть седиментограммы в области 6-22S.

В связи с тем, что при использовании «цистеиновых» мутантов нам не удалось выявить взаимодействие HspB8 с другими малыми белками теплового шока человека, мы попытались исследовать взаимодействие HspB8 дикого типа с HspB1 и HspB5 методом гель фильтрации. В отличие от ранее исследованных малых белков теплового шока HspB оказался не способным образовывать гетероолигомеры ни с HspB1, ни с HspB5. Таким образом, в полном согласии с данными, полученными методами химического «сшивания», HspB1, HspB5 и HspB6 эффективно взаимодействуют между собой и образуют устойчивые гетероолигомерные комплексы, в то время как HspB8 не способен образовывать прочных комплексов ни с одним из перечисленных sHsp. Все приведенные выше данные были получены в условиях in vitro. Поэтому возникает вопрос, способны ли анализируемые белки образовывать гетероолигомерные комплекcы in vivo. Для ответа на этот вопрос необходимо было использовать метод, который позволил бы выявить гетероолигомерные комплексы малых белков теплового шока в сложной белковой смеси клеточных лизатов. В качестве такого метода мы выбрали метод коиммунопреципитации. Прежде чем приступить к работе с клеточными лизатами, было необходимо получить моноклональные антитела к каждому из исследуемых малых белков теплового шока, иммобилизовать эти антитела на BrCN активированной сефарозе и провести предварительные эксперименты на изолированных белках in vitro. Полученный аффинный носитель инкубировали с четырьмя пробами, отличающимися по белковому составу. Первая проба содержала изолированный малый белок теплового шока, являющийся антигеном для иммобилизованных антител. Вторая проба содержала второй малый белок теплового шока, взаимодействие с которым предполагалось исследовать. Третья проба содержала смесь двух анализируемых sHsp, преинкубированную при 4С. Наконец, четвертая проба содержала смесь двух указанных белков, преинкубированную при 42С. После инкубации сефарозу с иммобилизованными антителами отмывали от несвязавшихся белков буфером PBS, содержащим 0,1% Tween-20, а связавшиеся белки элюировали глициновым буфером с рН 2,0. Белковый состав проб, сорбированных на аффинном носителе, анализировали методом SDS-электрофореза с последующим вестерн-блоттингом.

Если с носителем были связаны 1 2 3 антитела на то на сефарозе HspB6, А HspB сорбировался только изолированный HspB HspB (дорожка 1 на рис. 8, А) и не сорбировался Б HspB5 HspB5 (дорожка 2 на рис. 8, А). Если смесь HspB инкубировалась при низкой HspB5/HspB Рис. Коиммунопреципитация 8. температуре (когда обмен субъединиц не изолированных HspB6 (1) и HspB5 (2), возможен), то на носителе сорбировался только смеси этих белков, инкубировавшейся при 4С (3) или при 42С (4). A – сефароза с HspB6 (дорожка 3 на рис. 8, А). В то же время иммобилизованными антителами к HspB6, Б – сефароза с иммобилизованными после инкубации смеси HspB5/HspB6 при 42С, антителами к HspB5.

т.е. после образования гетероолигомеров, с аффинным сорбентом связывались оба белка (дорожка 4 на рис. 8, А). Аналогичные данные были получены при использовании сефарозы с иммобилизованными антителами на HspB (рис. 8, Б).

Используя метод коиммунопреципитации, мы также смогли выявить взаимодействие в парах HspB1/HspB6 и HspB1/HspB5. Следует заметить, что эффективность связывания HspB1 с носителем была, как правило, ниже эффективности связывания других малых белков теплового шока. Используя «цистеиновые» мутанты и немного модифицировав методику иммунопреципитации (введя дополнительную стадию окисления перед элюцией с аффинного сорбента), мы смогли детектировать образование «сшитых» дисульфидными связями гетероолигомерных комплексов HspB1/HspB6 и HspB5/HspB6. Мы попытались использовать метод коиммунопреципитации и для выявления образования гететроолигомеров между HspB6 и HspB8. Однако, также как во всех предыдущих экспериментах, нам не удалось выявить взаимодействие между этими белками. В этом случае на аффинном сорбенте на HspB8 мы могли обнаружить только следовые количества HspB6.

После проведения экспериментов с изолированными белками in vitro, мы могли приступить к анализу взаимодействия малых белков теплового шока на клеточной модели.

Мы транфицировали клетки линии HEK293 плазмидами, содержащими CDS двух разных малых белков теплового шока и попытались методом коиммунопреципитации детектировать взаимодействие между этими белками. При выполнении этой задачи мы столкнулись с рядом трудностей. Во-первых, уровень экспрессии HspB5 оказался ниже, чем уровень экспрессии других исследуемых sHsp, вследствие чего при котрансфекции не удавалось добиться одинакового уровня экспрессии двух sHsp. Во-вторых, HspB1 при экспрессии в эукариотических клетках слабо связывался с антителами, специфичными к этому белку.

Вследствие этого мы не могли использовать сефарозу с иммобилизованными антителами на HspB1 для выявления гетероолигомерных комплексов. Тем не менее, нам удалось детектировать взаимодействие в парах 1 2 HspB1/HspB6 и HspB5/HspB6. На рис. А HspB представлены результаты HspB коиммунопреципитации лизатов клеток, Б HspB5 трансфицированных плазмидой, содержащей HspB кодирующую последовательность одного из Рис. 9. Коиммунопреципитация лизатов анализируемых белков (HspB5 или HspB6), клеток трасфицированных HEK293, плазмидами HspB5 (1), HspB6 (2) или либо котрансфицированных обеими обеими плазмидами (3). A – сефароза с плазмидами. Как и следовало ожидать, если иммобилизованными антителами к HspB6, Б – сефароза с иммобилизованными клетки были трансфицированы одной антителами к HspB5.

плазмидой, на аффинном носителе сорбировался только один из малых белков теплового шока, т.е. тот белок, антитела к которому были иммобилизованы на носителе (дорожки 1 и 2 на рис. 9). При котрансфекции двумя плазмидами с носителем оказываются связанными оба исследуемых белка, способных образовывать гетероолигомерные комплексы (дорожка 3 на рис. 9). В связи с тем, что нам не удалось получить одинакового уровня экспрессии обоих белков, а также в связи с тем, что аффинные сорбенты обладают разным сродством, метод коиммунопреципитации не позволяет определить эффективность образования гетероолигомерных комплексов и их стехиометрию.

Таким образом, изучив взаимодействие четырех sHsp человека с применением широкого набора методов, мы можем заключить, что малые белки теплового шока склонны к образованию не только крупных гомоолигомеров, но и различного типа гетероолигомеров.

Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что HspB1, HspB5 и HspB способны образовывать гетероолигомерные комплексы, в то время как HspB8 лишь очень слабо взаимодействует с другими малыми белками теплового шока и не способен образовывать с ними гетероолигомеров. Такое поведение HspB8 может быть следствием нескольких причин. Во-первых, в отличие от других малых белков теплового шока в структуре HspB8 отсутствуют 2-складка в -кристаллиновом домене и консервативный I-X мотив в С-концевой области. Оба этих участка играют важную роль в I/V межсубъединичных контактах в олигомерах sHsp. Во-вторых, HspB8 относится к группе внутренне разупорядоченных белков и в отличие от всех других sHsp человека не образует крупных олигомеров, а существует в виде равновесной смеси мономеров и димеров.

Наконец, в-третьих, данные последних лет свидетельствуют о том, что о том, что в клетке у HspB8 есть иные белковые партнеры, чем малые белки теплового шока. Так, например, установлено, что HspB8 взаимодействует с белком Bag3, принимая участие в деградации белков путем автофагии [27, 28].

Возможный механизм образования гетероолигомеров малых белков теплового шока человека Механизм образования гетероолигомерных комплексов ранее подробно не изучался.

В то же время, данные, полученные методом химического «сшивания», свидетельствуют о том, что мономеры могут участвовать в формировании гетероолигомеров. Вопрос о том, участвуют ли гомодимеры, считающиеся стабильными структурными единицами sHsp, в обмене субъединиц и формировании гетероолигомеров оставался открытым. Для ответа на этот вопрос мы исследовали взаимодействие между окисленными HspB1 дикого типа и «цистеиновыми» мутантами HspB5 и HspB6. Как было показано ранее, указанные белки эффективно образовывали гомодимеры, «сшитые» дисульфидной связью, причем если диализ проводился при 37С, то доля таких димеров составляла более 80%. Мы смешивали полученные таким образом гомодимеры Б 60 HspB попарно и инкубировали в условиях, HspB оптимальных для образования A280, mAu гетероолигомеров (1 час при 42С), а затем анализировали полученные образцы методом гель-фильтрации (рис. 10). На профиле элюции смеси, 8 10 12 14 16 преинкубированной при 42С, Объем элюции, мл отсутствовал пик с кажущейся Рис. 10. Гель-фильтрация окисленных «цистеиновых» мутантов HspB5 и HspB6. молекулярной массой 350 кДа, Штрих-пунктирными линиями (1 и 2) показаны профили элюции изолированных белков, соответствующий гетероолигомерам штриховой линией (3) – сумма этих двух HspB5/HspB6 (рис. 10, сплошная линия), и профилей, сплошной линией (4) – профиль элюции смеси предварительно окисленных мы наблюдали лишь небольшое белков, инкубированные при 42С. На врезке уменьшение размера гомоолигомеров представлена электрофореграмма соответствующих фракций. SDS-электрофорез Представленные данные HspB5.

проводили в отсутствие -МЭ.

свидетельствуют о том, что окисленные гомодимеры «цистеиновых» мутантов HspB5 и HspB6 слабо взаимодействуют между собой, но не способны формировать стабильные гетероолигомеры. Аналогичные результаты были получены при исследовании взаимодействия между окисленными гомодимерами HspB1 дикого типа и «цистеинового»

мутанта HspB6. В этом случае положение обоих пиков в образце, преинкубированном при 42С, точно соответствовало положению пиков изолированных белков. Представленные результаты были подтверждены в независимых экспериментах, проведенных с использованием метода аналитического ультрацентрифугирования.

На основе полученных в ходе нашей работы результатов мы предложили схему, описывающую механизм формирования гетероолигомеров малых белков теплового шока человека (рис. 11).

Мы предполагаем, что для формирования гетероолигомерных комплексов обязательно наличие Рис. 11. Предполагаемый механизм образования свободно обменивающихся гетероолигомеров различных малых белков теплового шока человека. мономеров. Свободные мономеры могут образовываться либо путем прямой диссоциации из крупных олигомеров, либо в ходе двухстадийного процесса, когда сначала из олигомеров освобождаются димеры, которые позднее диссоциируют до мономеров. По всей видимости, время жизни свободных мономеров в растворе очень незначительно, и они быстро реассоциируют с образованием гомо- или гетеродимеров. Как уже отмечалось, долгое время считалось, что олигомеры малых белков теплового шока диссоциируют только до димеров, которые являются наименьшей структурной единицей олигомеров. Однако в последнее время появились данные, подтверждающие нашу точку зрения и свидетельствующие о том, что в ходе диссоциации могут образовываться как димеры, так и мономеры малых белков теплового шока [29, 30]. Образующиеся при ассоциации двух различных мономеров гетеродимеры необходимы для формирования более крупных гетероолигомерных комплексов. Если мы предотвращаем образование свободных мономеров путем химического «сшивания»

гомодимеров, то формирование гетероолигомеров становится невозможным (см. рис. 10). В то же время «сшитые» гомодимеры могут участвовать в формировании крупных гомоолигомеров. С этим предположением хорошо согласуются данные, полученные при анализе пар HspB1/HspB6 и HspB5/HspB6. В первом случае гетероолигомеры состоят исключительно из гетеродимеров, а во втором случае в составе героолигомеров выявляются гомодимеры HspB5 и «сшитые» гетеродимеры HspB5/HspB6. Однако в этом комплексе не удается выявить гомодимеров HspB6 (см. рис. 6, Б).

Предложенная схема объясняет механизм формирования гетероолигомерных комплексов малых белков теплового шока человека. Кроме того, с помощью этой схемы можно описать пути образования гетероолигомеров HspB2/HspB3, имеющих стехиометрию 3:1 [31], а также гетероолигомеров HspB4 (A-кристаллин) и HspB5 (B-кристаллин), стехиометрия которых варьирует в интервале от 3:1 до 1:1 [32]. Такие комплексы могут образовываться только в том случае, если в формировании гетероолигомеров принимают участие именно мономеры малых белков теплового шока.

ВЫВОДЫ 1. Получены так называемые «цистеиновые» мутанты трех малых белков теплового шока человека, в которых все эндогенные остатки цистеина заменены на остатки серина, а в положение, гомологичное Cys137 HspB1, введен остаток цистеина.

2. Установлено, что структура и шапероноподобная активность «цистеиновых»

мутантов HspB5, HspB6 и HspB8 существенно не отличаются от соответствующих свойств белков дикого типа.

3. Опыты, проведенные с использованием белков дикого типа и их «цистеиновых»

мутантов, свидетельствуют о том, что HspB1, HspB5 и HspB6 взаимодействуют между собой и способны образовывать прочные гетероолигомерные комплексы.

4. Ни HspB8 дикого типа, ни его «цистеиновый» мутант не способны образовывать прочных гетероолигомерых комплексов с HspB1, HspB5 или HspB6.

5. Предложена модель, согласно которой свободные мономеры малых белков теплового шока человека необходимы для формирования гетероолигомерных комплексов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в рецензируемых журналах 1. E.V. Mymrikov, O.V. Bukach, A.S. Seit-Nebi, N.B. Gusev (2010) The pivotal role of the strand in the intersubunit contacts of different human small heat shock proteins, Cell Stress and Chaperones, 15, pp. 365–377.

2. E.V. Mymrikov, A.S. Seit-Nebi, N.B. Gusev (2011) Large potentials of small heat shock proteins, Physiological Reviews, 91(4), pp. 1123-1159.

3. E.V. Mymrikov, A.S. Seit-Nebi, N.B. Gusev (2012) Heterooligomeric complexes of human small heat shock proteins, Cell Stress and Chaperones, 17(2), pp. 157-169.

4. M.V. Sudnitsyna, E.V. Mymrikov, A.S. Seit-Nebi, N.B. Gusev (2012) The Role Of Intrinsically Disordered Regions In The structure and functioning of small heat shock proteins, Curr. Protein Pept. Sci., 13, pp. 76-85.

Статья в коллективной монографии 1. A.A. Shemetov, E.V. Mymrikov, A.S. Seit-Nebi, N.B. Gusev (2010) Structure, properties and multiple functions of human small heat shock protein HspB8 (Hsp22, H11 protein kinase or E2IG1) in P. Durante and L. Colucci (eds), Handbook of Molecular Chaperones:

Roles, Structure and Mechanisms, Nova Science Publishers Inc., pp. 333-352.

Тезисы докладов 1. А.Е. Глухова, Е.В. Мымриков, О.В. Букач (2008) Свойства гетероолигомерных комплексов Hsp20 и Hsp27 человека, МАКС-Пресс, Тезисы докладов Международной конференции «Ломоносов-2008», стр. 33-34, Москва.

2. Е.В. Мымриков (2009) Белок-белковые взаимодействия в гомоолигомерах малых белков теплового шока человека, МАКС-Пресс, Тезисы докладов Международной конференции «Ломоносов-2009», стр. 57-58, Москва.

3. Е.В. Мымриков (2010) Мономеры участвуют в образовании гетероолигомеров малых белков теплового шока человека, МАКС-Пресс, Тезисы докладов Международной конференции «Ломоносов-2010», стр. 59-60, Москва.

4. E.V. Mymrikov, O.V. Bukach, A.S. Seit-Nebi, N.B. Gusev (2010) 7-Strand of -crystallin domain is important for monomer-monomer interaction in homo- and heterooligomers of human small heat shock protein, FEBS J., 277 (Suppl. 1), p. 171, Abstracts of «35th FEBS Congress - Molecules of Life», Gothenburg, Sweden.

5. E.V. Mymrikov, O.V. Bukach, A.S. Seit-Nebi, N.B. Gusev (2010) 7-strand is essential for monomer interaction in homo- and heterooligomers of human small heat shock proteins, Proceedings of the Australian Society for Biochemistry and Molecular Biology, 42, p. 245, Abstracts of «OzBio2010 Combined Conference - Molecules of life: from discovery to biotechnology», Melbourne, Australia.

6. E.V. Mymrikov, A.S. Seit-Nebi, N.B. Gusev (2011) Formation of heterooligomeric complexes of human small heat shock proteins, Abstracts of conference «The Biology of Molecular Chaperones: From Basic Mechanisms To Intervention Strategies in Disease and Aging», p. 131, Grundlsee, Austria.

Данное исследование проводилось при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проекты 07-04-00115а и 10-04-00026а).

СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 1. Kappe G, et al. (2010) Cell Stress Chaperones, 15: 457-61.

2. Horwitz J. (2009) Exp. Eye Res., 88: 190-4.

3. Narberhaus F. (2002) Microbiol. Mol. Biol. Rev., 66: 64-93.

4. Haslbeck M, et al. (2005) Nat.Struct. Mol. Biol., 12: 842-6.

5. Mymrikov EV, et al. (2011) Physiol. Rev., 91: 1123-59.

6. Fontaine JM, et al. (2005) Biochem. Biophys. Res. Commun., 337: 1006-11.

7. Sun X, et al. (2004) J. Biol. Chem., 279: 2394-402.

8. Bagneris C, et al. (2009) J. Mol. Biol., 392: 1242-52.

9. Baranova EV, et al. (2011) J. Mol. Biol., 411: 110-22.

10. Jehle S, et al. (2009) J. Mol. Biol., 385: 1481-97.

11. Zavialov A, et al. (1998) Int. J. Biol. Macromol., 22: 163-73.

12. Laemmli UK. (1970) Nature, 227: 680-5.

13. Sreerama N, Woody RW. (2000) Anal. Biochem., 287: 252-60.

14. Bukach OV, et al. (2009) Biochim. Biophys. Acta, 1794: 486-95.

15. Schuck P. (2000) Biophys. J., 78: 1606-19.

16. Kruger NJ. (2002). In The Protein Protocols Handbook: Second Edition, 15-21.

17. Kasakov AS, et al. (2007) FEBS J., 274: 5628-42.

18. Bukach OV, et al. (2004) Eur. J. Biochem., 271: 291-302.

Пермяков ЕА. 2003. Метод собственной люминесценции белка. М.: Наука 19.

20. Slavik J. (1982) Biochim. Biophys. Acta, 694: 1-25.

21. Ghosh JG, et al. (2007) Biochemistry, 46: 6308-17.

22. Laganowsky A, et al. (2010) Protein Sci., 19: 1031-43.

23. Berengian AR, et al. (1999) J. Biol. Chem., 274: 6305-14.

24. Kato K, et al. (1994) J. Biol. Chem., 269: 15302-9.

25. Kato K, et al. (1992) J. Biol. Chem., 267: 7718-25.

26. Sugiyama Y, et al. (2000) J. Biol. Chem., 275: 1095-104.

27. Vos MJ, et al. (2011) Autophagy, 7: 101-3.

28. Carra S, et al. (2008) Autophagy, 4: 237-9.

29. Baldwin AJ, et al. (2011) J. Mol. Biol., 413: 310-20.

30. Benesch JL, et al. (2008) J. Biol. Chem., 283: 28513-7.

31. den Engelsman J, et al. (2009) J. Mol. Biol., 393: 1022-32.

32. Horwitz J. (2003) Exp. Eye Res., 76: 145-53.