Медицинский университет” удк 577.152:613.81 бутвиловский александр валерьевич динамика изменений нуклеотидных последовательностей матричных рнк и аминокислотных последовательностей алкогольдегидрогена

“БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ”

УДК 577.152:613.81

БУТВИЛОВСКИЙ Александр Валерьевич

ДИНАМИКА ИЗМЕНЕНИЙ НУКЛЕОТИДНЫХ

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ МАТРИЧНЫХ РНК И

АМИНОКИСЛОТНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

АЛКОГОЛЬДЕГИДРОГЕНАЗ В ПРОЦЕССЕ ЭВОЛЮЦИИ

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук по специальности 03.00.04 – биохимия Минск, 2007 1 Работа выполнена в УО «Белорусский государственный медицинский университет»

Научный руководитель: Барковский Евгений Викторович, доктор биологических наук, профессор, лауреат Государственной премии Республики Бе ларусь, заведующий кафедрой общей химии УО «Белорусский государственный медицинский университет»

Официальные оппоненты: Кухта Виктор Климентьевич, доктор медицинских наук, профессор, Заслуженный деятель науки Республики Беларусь, профессор кафедры биологической химии УО «Белорусский государственный медицинский университет»

Пронько Павел Сергеевич, доктор биологических наук, старший научный со трудник, исполняющий обязанности заместителя директора по науке и инновациям ГУ НПЦ «Институт фарма кологии и биохимии» НАН Беларуси Оппонирующая организация: УО «Гродненский государственный медицинский университет»

Защита состоится 18 мая 2007 г. в 15.00 часов на заседании совета по защите диссертации Д03.18.02 при УО “Белорусский государственный меди цинский университет”, г. Минск, пр. Дзержинского, 83, тел. 272-55-98.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке УО “Белорусский го сударственный медицинский университет”.

Автореферат разослан “_”_2007 г.

Ученый секретарь совета по защите диссертаций канд. мед. наук, доцент А.И. Герасимович ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Связь работы с крупными научными проектами Выполнение диссертационной работы начато в рамках НИР кафедры общей химии БГМУ «Структурно-функциональные свойства аденилатциклаз различного происхождения и теоретический анализ их аминокислотных после довательностей» (№ ГР 2001680, сроки выполнения 01.01.2001 г. – 31.12. г.), а затем продолжено в рамках НИР «Молекулярная эволюция генетических макромолекул» (№ ГР 2006234, сроки выполнения 01.01.2006 г. – 31.12.2010 г.), гранта Белорусского республиканского фонда фундаментальных исследований для молодых ученых по теме «Молекулярная эволюция генетических макромо лекул» (№ Б06М-060 от 01.04.06 г.).

Цель и задачи исследования Цель исследования: установить закономерности изменений последова тельностей матричных РНК и первичной структуры алкогольдегидрогеназ (АДГ) в процессе эволюции, характер эволюционных взаимоотношений между ними в широком филогенетическом ряду от низших хордовых до человека.

Поставленная цель предполагает решение следующих задач:

1. Определить родственные отношения между различными классами АДГ человека и на этой основе предложить их структурно-функциональную классифи кацию, а также установить последовательность возникновения отдельных классов АДГ человека в процессе эволюции.

2. Выявить особенности экзон-интронной структуры и нуклеотидного состава генов АДГ человека.

3. Установить направление и механизмы изменения мутационного дав ления в экзонах генов АДГ человека в процессе эволюции и оценить его влия ние на стратегию кодирования и аминокислотный состав кодируемых белков.

4. Оценить степень нейтральности замен нуклеотидов в последователь ностях мРНК, кодирующих моно- и полисубстратные изоферменты АДГ, и оп ределить связь между этим показателем и скоростями эволюции мРНК и соот ветствующих им белков.

Объектом настоящего исследования послужили взятые с сервера NCBI (National Center for Biotechnology information, www.ncbi.nlm.nih.gov) аминокис лотные последовательности АДГ, выделенных из различных источников жи вотного происхождения, и нуклеотидные последовательности соответствую щих им мРНК.

Предметом исследования было изучение закономерностей изменения нуклеотидных последовательностей мРНК и аминокислотных последователь ностей АДГ в процессе эволюции.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту 1. Семейство АДГ человека состоит из двух подсемейств: 1) АДГ, ме таболизирующие формальдегид и хиноны (2 и 3-й классы);

2) АДГ, метаболи зирующие спирты (1А, 1В, 1С, 4 и 5-й классы). Среди изученных АДГ живот ных эволюционным предшественником АДГ человека является АДГ 3 немато ды. Возникновение классов и подклассов АДГ происходило в последовательно сти: класс 3 класс 1 класс 2 класс 5 класс 4 подклассы А, В, С класса 1.

2. Особенностью экзон-интронной структуры и нуклеотидного состава генов АДГ человека является их ГЦ-мозаичное строение (чередование более ГЦ-насыщенных экзонов с менее ГЦ-насыщенными интронами), что обеспечи вается более низкими темпами эволюционных изменений экзонов изучаемых генов. В последовательностях мРНК, кодирующих АДГ 1С и 3 человека, суще ствуют два гипервариабельных участка (346-375 и 886-915). Эволюционные изменения первого гипервариабельного участка происходили в режиме поло жительного отбора, а второго – в режиме нейтральной эволюции.

3. Динамика стратегии кодирования АДГ3 в мРНК хордовых животных в процессе эволюции заключается в уменьшении значений RSCU для синони мичных ГЦ3-кодонов, увеличении частоты использования претерминальных кодонов, увеличении содержания аминокислот, кодируемых ГЦ-бедными кодо нами (FYMINK), и уменьшении содержания аминокислот, кодируемых ГЦ богатыми кодонами (GARP), что связано с изменением в процессе эволюции направленности мутационного давления (с ГЦ на АТ) в экзонах соответствую щих генов. Основным механизмом изменения направленности мутационного давления являются ЦГТГ мутации, осуществляемые посредством метилиро вания цитозина с последующим дезаминированием 5-метилцитозина.

4. Моносубстратные ферменты (АДГ3) хордовых и кодирующие их мРНК характеризуются меньшими темпами эволюционных изменений и ней тральности замен нуклеотидов в соответствующих им мРНК по сравнению с полисубстратными ферментами (АДГ1).

Личный вклад соискателя Приведенные в работе результаты были получены соискателем лично.

Проведена статистическая обработка полученных данных, их анализ, подготовка к публикации печатных работ по теме диссертации. Научный руководитель, по мимо постановки цели и задач исследования, оказывал консультативную помощь в обсуждении и трактовке полученных результатов.

Апробация результатов диссертации Полученные в ходе исследования результаты представлены и обсуждены на 56-й итоговой научной конференции студентов и молодых ученых ВГМУ “Актуальные вопросы современной медицины” (Витебск, 2004), Международной научной конференции студентов и молодых ученых “Актуальные проблемы со временной медицины 2004” (Минск, 2004), 52-й итоговой студенческой меди цинской научной конференции с международным участием (Москва, 2004), Ме ждународной научной конференции студентов и молодых ученых “Актуальные проблемы современной медицины 2005”, посвященной 60-летию Великой Побе ды в Великой Отечественной войне (Минск, 2005), Научной сессии БГМУ (Минск, 2005), Международной научной конференции молодых ученых, посвя щенной Всемирному дню науки во имя мира и развития “Молодежь в науке 2005” (Минск, 2005), Международном симпозиуме “Молекулярные механизмы регуляции функции клетки” (Тюмень, 2005 г.), Юбилейной межвузовской науч ной конференции студентов и молодых ученых, посвященной 70-летию КГМУ “Молодежная наука и современность” (Курск, 2005), Международной научной конференции “Молекулярные, мембранные и клеточные основы функциониро вания биосистем” (Минск, 2006), Международной научной конференции моло дых ученых “Молодежь в науке-2006” (Минск, 2006), Научной сессии, посвя щенной 85-летию БГМУ (Минск, 2006), III-м Международном симпозиуме “Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии”, посвященном 100-летию со дня рождения акад. Н.М. Сисакяна (Москва, Дубна, 2007).

Опубликованность результатов По теме диссертации опубликовано 24 печатные работы, в том числе статей в рецензируемых журналах – 10, статей в сборниках – 4, учебно методических пособий – 1, тезисов докладов – 9. Общий объем опубликован ных материалов – 7 авторских листов.

Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 139-ти страницах печатного текста и состоит из введения, общей характеристики работы, обзора литературы, описания мате риалов и методов исследования, трех глав результатов собственных исследова ний, заключения и библиографического указателя, включающего список ис пользованных источников и список публикаций соискателя. Диссертационная работа содержит 29 таблиц и 48 рисунков.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследования Изучены аминокислотные последовательности АДГ класса 1 человека (Homo sapiens – H.s, А, В и С изоферменты), шимпанзе (Pan troglodytes – P.t., В изофермент), бабуина (Papio hamadryas – P.h., В-изофермент), лошади (Equus caballus – E. c.), кролика (Oryctolagus cuniculus – O.c.), мыши (Mus musculus – M.m.), петуха (Gallus gallus – G.g.), киви (Apteryx australis – A.a.), шпорцевой лягушки (Xenopus laevis – X.l.) нематоды (Caenorhabditis elegans – C.e.);

класса 2 человека, мыши и нематоды;

класса 3 человека, мыши, кролика, петуха, ля гушки, костных рыб (Danio rerio – D.r., Sparus aurata – S.a., Oryzias latipes – O.l.), ланцетника (Branchiostoma fluoridae – B.f.), оболочника (Ciona intestinalis – С.i.), дрозофилы (Drosophila melanogaster – D.m.), нематоды;

класса 4 человека и мыши;

класса 5 человека и мыши. Также изучены нуклеотидные последова тельности мРНК, кодирующие вышеназванные белки, и гены АДГ человека классов 1 (A, B, C), 2, 3, 4, 5 и мыши класса 3.

Показатели сходства аминокислотных последовательностей (S`) и их достоверность (E) определены методом BLAST-анализа 2.2.9 [Altschul et al., 1997]. Выравнивания аминокислотных и нуклеотидных последовательностей проведены с помощью программ ClustalW [Tompson et al., 1994]. Определение картины замещений выполнено с использованием ID-теста [Kumar, Gadagkar, 2001].

Эволюционные дистанции между аминокислотными последовательно стями рассчитаны методами EIM [Nei, Kumar, 2000] и JTT (Джонса-Тейлора Торнтона) [Jones, Taylor, Thornton, 1992]. Вычисление скорости молекулярной эволюции проведено по методу М. Кимуры [Кимура, 1985].

Эволюционные дистанции между нуклеотидными последовательностя ми в случае гомогенной картины замещений рассчитаны по методам Джукса Кантора [Jukes, Cantor, 1969], Кимуры [Kimura, 1980], Тадзимы-Нея [Tajima, Nei, 1984], Тамуры [Tamura, 1992], Тамуры-Нея [Tamura, Nei, 1993], а в случае гетерогенной – по методам Тадзимы-Нея, Тамуры и Тамуры-Нея. Синонимич ная (pS) и несиноничная (pN) p-дистанции вычислены по модифицированному методу Нея-Годжобори [Nei, Gojobori, 1986, Ina, 1995, Zhang et al., 1998].

Для анализа эволюционных взаимоотношений между аминокислотными (нуклеотидными) последовательностями использованы методы связывания ближайших соседей (NJ) попарного невзвешенного кластирования с арифмети ческим усреднением (UPGMA) [Saitou, Nei, 1987].

Характер аминокислотных замен определен физико-химической дис танции Грэнтсема (Grantham distance, GD) [Grantham, 1974]. Для определения конформационной подвижности основной цепи вычисляли среднюю величину энтропии, приходящейся на аминокислотный остаток, по методу В.В. Поройко ва и соавт. [Поройков и соавт., 1980]. Содержание нуклеотидов, расчетное со отношение транзиций и трансверсий (R), содержание претерминальных и ГЦ3 кодонов, а также показатели относительного использования синонимичных ко донов (RSCU) вычислены с помощью пакета программ MEGA3 [Kumar et al., 2004]. Мутационное давление (D) вычислено по методу Н. Суеоки [Sueoka, 1988].

Полученные результаты обработаны статистически с помощью про грамм Microsoft Excel 2000. Статистическое подтверждение корректности ден дрограмм осуществляли методом бутстрэп при 1000 повторов путем вычисле ния индекса BCL (bootstrap confidence level) [Kumar et al., 2004].

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Результаты BLAST-анализа (таблица 1) и полученные дендрограммы (рисунок 1) для последовательностей мРНК, кодирующих АДГ человека, сви детельствуют о том, что эволюционным предшественником АДГ человека яв ляется АДГ3 нематоды. Эволюционный предшественник АДГ человека и соот ветствующего ортолога дрозофилы существовал уже на ранних этапах форми рования биохимических систем беспозвоночных, т. е. около 1 млрд. лет назад.

Таблица 1 - Значения показателей сходства (выделены жирным шрифтом) и их достоверность для аминокислотных последовательностей АДГ человека Контроль/класс 1А 1В 1С 2 3 4 АДГ человека 75 73 82 88 77 79 АДГ1С.е.

4е–13 2е–12 3е–15 4е–17 1е–13 2е–14 1е– 69 65 83 80 70 АДГ2 С.е.

3е–11 4е–10 2е–13 2е–15 9е–15 9е–12 2е– 342 346 339 348 486 322 АДГ3 С.е.

2е–93 1е–94 1е–92 2е–95 е–137 2е–87 1е– 391 397 385 407 535 378 АДГ3 D.m.

е–10 е–11 е–10 е–11 е–15 е–10 6е– ADH1B Hs ADH1C Hs ADH1A Hs ADH4 Hs ADH5 Hs ADH2 Hs ADH3 Hs ADH3 Ce Рисунок 1 - Дендрограмма, обработанная методом бутстрэп, для последовательностей мРНК, кодирующих АДГ человека (над точками ветвления указаны значения ВСL) На рисунке 1 видно, что возникновение отдельных классов АДГ челове ка достоверно происходило в последовательности (класс 3 класс 1 класс класс 5 класс 4), а затем в пределах первого класса выделились три под класса (1А, 1В и 1С). По предложенной нами методике, учитывающей различия скоростей эволюции, установлено время существования общих предшествен ников АДГ 1 и 3-го классов (422,8 млн. лет).

Полученные данные по содержанию гуанина и цитозина в зависимости от положения кодона позволяют сформулировать следующую закономерность:

Г1+Ц1Г3+Ц3Г2+Ц2, которая характерна для всех мРНК, кодирующих АДГ человека, за исключением АДГ 2 и 3-го классов, в которых содержание гуанина и цитозина во втором положении больше, чем в третьем (Г1+Ц1 Г2+Ц Г3+Ц3).

На основании этого параметра, полученных дендрограмм для последова тельностей мРНК, кодирующих АДГ человека и выполняемых функций все среднецепочечные АДГ человека разделены нами на два подсемейства. К перво му подсемейству (АДГ, метаболизирующие формальдегид и хиноны) отнесены АДГ третьего и второго классов, а ко второму семейству (АДГ, метаболизирую щие спирты) – АДГ 1 (А, В, С), 4 и 5-го классов.

Особенности нуклеотидного состава экзонов и интронов генов АДГ за ключаются в том, что экзоны имеют достоверно бльшую ГЦ-насыщенность по сравнению с интронами (таблица 2).

Таблица 2 - Среднее ГЦ-содержание в экзонах и интронах генов АДГ классов 1 5 человека (в %) Класс 1А 1В 1С 2 3 4 АДГ Экзоны 45,4±2,37 47,7±2,31 46,5±2,33 45,7±1,98 45,8±3,35 46,1±1,49 45,3±1, Интроны 35,9±2,02 35,0±2,07 36,3±1,91 35,1±2,02 38,1±1,43 34,4±1,89 34,1±2, p 0,01 0,001 0,001 0,001 0,05 0,001 0, Чередование экзонов и интронов, то есть участков соответственно с большим и меньшим содержанием гуанина и цитозина, служит основой ГЦ мозаичного строения генов АДГ человека. Такое строение за счет различия в содержании водородных связей будет обеспечивать чередование более термо динамически стабильных участков молекулы ДНК (соответствующих экзонам) и менее стабильных (соответствующих интронам).

Данное строение, по-видимому, обеспечивается более низкими (по сравнению с интронами) темпами эволюционных изменений экзонов изучае мых генов (рисунок 2).

5, скорость эволюции, x 10-9 замен на сайт в год 4, 4, 4, 4, 4,0 3, 3, 3, 3, 3, 2, 2, 2, 2, 1, 1, 0, 0, 0,64 0, 0, 0,5 0, 0,40 0, 0, 0, - - - - - - - - on on on on on on on on on n n n n n n n n ex ex ex ex ex ex ex ex ex t ro t ro t ro t ro t ro tro tro tro in in in in in in in in экзон-интронная структура Рисунок 2 - Скорости эволюции экзонов и интронов гена АДГ человека и мыши При сравнении последовательностей мРНК, кодирующих АДГ 1С и человека, обнаружены два участка с высокой частотой мутаций (рисунок 3).

Первый вариабельный участок (346–375) соответствует части пятого экзона, а второй (886–915) – седьмого экзона.

число нуклеотидных различий 10 19 25 31 43 49 55 61 67 73 79 85 91 97 37 10 13 - - 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 - - 6 участки мРНК Рисунок 3 – Число мутаций в соответствующих декапептидам участках мРНК, кодирующих АДГ классов 1С и 3 человека Построенные профили ГЦ-содержания (рисунок 4) и ГЦ3-содержания (рисунок 5) в экзонах генов АДГ классов 1С и 3 человека отличаются, но дос товерные отличия по ГЦ-насыщенности обнаруживаются лишь при сравнении их пятых экзонов (р0,01).

58, 60 56,8 55, 52, Насыщенность гуанином и цитозином, % 52, 49, 48, 51, 48, 40,2 46, 44, 44, 40 36, 42, 39, 35, 29, АДГ АДГ 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Экзоны Рисунок 4 - Общая ГЦ-насыщенность экзонов генов АДГ классов 1С и 3 человека 100, АДГ АДГ1С ГЦ3-насыщенность, % 66, 55, 49, 50, 45, 41, 40,0 39, 44, 33,4 41,2 40,4 40, 37, 30, 32, 22, 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Экзоны Рисунок 5 - Насыщенность гуанином и цитозином третьего положения кодонов в экзонах генов АДГ классов 1С и 3 человека Вторичная структура участков аминокислотных последовательностей АДГ, соответствующих пятым экзонам, различается: в области N-конца участка АДГ класса 3 имеется -спиральный фрагмент, который отсутствует в АДГ класса 1С.

Наблюдаемые различия вторичной структуры, безусловно, сопряжены с изменениями третичной структуры и функции изучаемых ферментов. Дейст вительно, рентгеноструктурным анализом было показано, что аминокислот ные остатки, соответствующие пятому экзону, участвуют в связывании суб стратов [Hurley, et al., 1991, Engeland, et al., 1993]. Остатки, занимающие 116, 117, 140, 141-е положения, входят в состав субстрат-связывающего пакета, а остаток Арг-115 АДГ класса 3 связывает глутатион и омега-гидроксижирные кислоты.

Таким образом, нами предложен оригинальный способ определения по профилям содержания ГЦ и ГЦ3 функционально отличающихся участков эво люционно родственных белков.

В пользу предположения о существовании положительного отбора свидетельствует и то, что в десяти выровненных N-концевых кодонах участ ков мРНК, соответствующих пятому экзону генов АДГ классов 1С и 3 челове ка, достоверно преобладают многошаговые мутации (80,0 ± 13,33%, р 0,01).

По средней физико-химической дистанции между 10-ю данными ами нокислотными сайтами (75,8±5,04) достаточно сложно оценить характер замен (степень их консервативности и радикальности). Однако такие радикальные за мены в данном функционально важном участке, как аргинина на аспарагино вую кислоту (в 116-положении;

нумерация по АДГ1С), треонина на лейцин (в 123-м положении) и пролина на глутамин (в 125-м положении), безусловно, могли закрепиться только в результате положительного отбора.

Установлено, что замены аминокислот в положениях 116-118 последо вательности АДГ1С привели к увеличению гибкости остова основной цепи (ри сунок 6).

Появление остатка лейцина в 116-м положении (в результате замены ВалЛей) позволило дифференцировать доступ и ретенцию различных по раз меру субстратов в активный центр АДГ. Вместе с тем для компенсации увели чения объема бокового радикала 116-го остатка произошли замены на амино кислоты с меньшим объемом боковых радикалов в 115-м (АргАсп) и 117-м положениях (ТреГли). Общей целью фиксации замен в участке АДГ1С 116 125, вероятно, была подстройка субстрат-связывающего пакета для улучшения взаимодействия и более эффективного окисления спиртов и стероидов.

Высокое соотношение несинонимичной и синонимичной р-дистанций (0,88), достоверное преобладание многошаговых аминокислотных замен, нали чие трех высокорадикальных замен аминокислот, увеличение гибкости остова основной цепи, сопряженное с изменением объемов боковых радикалов цепи, на N-конце соответствующего пятому экзону участка АДГ 1С и 3 человека сви детельствуют о наличии положительного отбора мутаций.

8, АДГ1С 7, АДГ 7, средняя энтропия на остаток 6, 6,89 6, 6, 6,81 6, 6,81 6, 6, 6,45 6, 5,75 5, 5, 5, 5,40 5,40 5, 5, 5, 4, 4, 116 117 118 119 120 121 122 123 124 аминокислотные остатки Рисунок 6 – Средняя энтропия в расчете на аминокислотный остаток для 116-125 участков последовательностей АДГ 1С и 3 человека Аминокислоты, соответствующие второму вариабельному участку (886 915), не выполняют какой-либо важной функции [Niederhut, et al., 2001]. Следо вательно, большинство возможных аминокислотных замен являются приемле мыми и селективно нейтральными. Поэтому замены нуклеотидов (и, соответст венно, аминокислот) в данном участке, по-видимому, происходили в режиме нейтральной эволюции.

С определенной степенью осторожности мы полагаем, что положитель ный отбор мутаций в первом гипервариабельном участке мРНК, кодирующих АДГ 1С и 3, может быть связан с возникновением уникальной свойственной АДГ1С каталитической активности – способности окислять не только этанол, но и ацетальдегид. Известно, что при алкоголизме наблюдается дисбаланс меж ду активностью ферментов наработки и окисления ацетальдегида, что приводит к повышению содержания в крови токсичного ацетальдегида. В связи с этим для диагностики алкоголизма было предложено определение активности альде гиддегидрогеназы и алкогольдегидрогеназы [Пронько, 2004].

Необходимо отметить, что в доступной нам литературе отсутствует ин формация об активности АДГ1С при алкоголизме. Способность АДГ1С в отли чие от остальных изоферментов алкогольдегидрогеназ катализировать два эта па окисления этанола, а также полученные данные о высокой вероятности по ложительного отбора мутаций в этом изоферменте позволяют предположить, что определение активности АДГ1С может выступать в качестве более чувст вительного и специфичного маркера для лабораторной диагностики алкоголиз ма. На основании вышеизложенных фактов предполагается разработка метода определения активности АДГ1С для диагностики, определения степени тяже сти и оценки эффективности проводимого лечения алкоголизма.

Скорости аминокислотных замен в последовательностях АДГ классов и 3 хордовых равны 0,55 По и 0,25 По, соответственно. Темпы эволюции по следовательностей мРНК, кодирующих АДГ 1 и 3-го классов, являются разны ми, но приблизительно постоянными и составляют 0,6010–9 и 0,4010–9 замен на сайт в год, соответственно.

Различия темпов эволюционных изменений аминокислотных последо вательностей двух классов изучаемых ферментов, а также кодирующих их мРНК связаны с разным количеством субстратов (чем больше число лигандов, тем выше скорость эволюции). Данная закономерность подтверждена и на при мере доменов АДГ 1. Так, скорость эволюционных изменений аминокислотных последовательностей каталитического домена (множество лигандов – спирты, альдегиды, стероиды, жирные кислоты и др.) АДГ класса 1 составляет 0,60 По, а кофермент-связывающего (один лиганд – НАД+) – 0,50 По. Равные скорости эволюции двух доменов АДГ 3 (0,25 По) легко объяснить приблизительно оди наковым количеством лигандов для НАД+-связывающего и каталитического доменов (формальдегид, глутатион, S-нитрозоглутатион).

При анализе последовательностей мРНК, кодирующих АДГ класса хордовых, установлено, что значения показателей D (таблица 3) связаны дос товерной обратной сильной корреляционной связью с содержанием претерми нальных кодонов (r = –0,81±0,207, р 0,001).

Таблица 3 – Мутационное давление и содержание претерминальных кодонов в мРНК, соответствующих АДГ класса 3 хордовых Показатель / H. s. O. c. M. m. G. g. X. l. D. r. O. l. S. a. B. f.

организм D 0,37 0,40 0,45 0,45 0,39 0,50 0,54 0,54 0, Содержание 33,3 32,3 30,1 29,6 30,5 27,3 29,2 30,5 26, ПТК, % Из данных, приведенных в таблице 3, следует, что нуклеотидные после довательности мРНК, кодирующих АДГ3 B.f., S.a., O.l. находятся под влиянием направленного ГЦ-давления (D 0,5), а ГЦ-состав мРНК D.r. находится в рав новесии с мутационным давлением (D = 0,5). Наоборот, нуклеотидные после довательности мРНК, соответствующие АДГ3 земноводных, птиц и млекопи тающих, находятся под влиянием АУ-давления (D 0,5). Иными словами, в процессе эволюции мРНК, кодирующих АДГ класса 3 хордовых, наблюдается изменение направленности мутационного давления.

С целью установления возможного биохимического механизма этого явления нами проведено исследование, связанное с изучением характера мута ционных превращений гипермутабильных ЦГ-динуклеотидов в экзонах генов АДГ 3 мыши и человека.

При анализе точечных мутаций обнаружено, что из 19-ти мутировавших ЦГ-динуклеотидов 13 (68,4 ± 10,96%) превратились в ТГ-, ТА- и ЦА динуклеотиды. Среди последних в 11-ти динуклеотидах (84,6 ± 10,42%) про изошли замены цитозина на тимин, что привело к возникновению ТГ динуклеотидов. С нашей точки зрения, появление АГ-, ТЦ-, ЦТ- и ГГ динуклеотидов на месте ЦГ-динуклеотидов связано не только с трансверсиями в самих ЦГ-динуклеотидах, но и в возникших на их основе ТГ-, ТА- и ЦА динуклеотидах.

Таким образом, основным молекулярным механизмом изменения на правления мутационного давления в изучаемых нуклеотидных последователь ностях экзонов генов, являются ЦГТГ мутации, осуществляемые посредст вом метилирования цитозина с последующим дезаминированием 5 метилцитозина. Нами показано, что часть мутаций в ЦГ-динуклеотидах может происходить по другим механизмам (ЦГЦА и ЦГТГТА), что связано с высокой вероятностью транзиций.

Оценим влияние изменения направленности мутационного давления в процессе эволюции мРНК, кодирующих АДГ класса 3 хордовых, на использо вание синонимичных ГЦ3-кодонов (таблица 4).

Таблица 4 – Показатели корреляции между значениями мутационного давления и RSCU для ГЦ3-кодонов в последовательностях мРНК, кодирующих АДГ класса 3 хордовых ЦГЦ УУГ УЦЦ ГУЦ ЦЦЦ АЦЦ ГЦЦ ГГЦ ГЦ3-кодоны УУЦ ЦГГ ЦУЦ УЦГ ГУГ ЦЦГ АЦГ ГЦГ ГГГ (аминокислота) (Фен) АГГ ЦУГ АГЦ (Вал) (Про) (Тре) (Ала) (Гли) (Арг) (Лей) (Сер) 0,86± 0,82± 0,64± 0,65± 0,71± 0,86± 0,84± 0,59± 0,91± r±m для D и RSCU 0,180* 0,202* 0,272* 0,268* 0,250* 0,181* 0,190* 0,285* 0,144* ГЦ3-кодоны ААГ ААЦ ЦАГ ГАЦ ЦАЦ ГАГ АУЦ УГЦ УАЦ (аминокислота) (Лиз) (Асн) (Глн) (Асп) (Гис) (Глу) (Иле) (Цис) (Тир) 0,87± 0,72± 0,54± 0,87± 0,76± 0,85± 0,86± 0,83± 0,85± r±m для D и RSCU 0,176* 0,244* 0,298 0,172* 0,228* 0,189* 0,182* 0,199* 0,184* Примечание - Достоверные корреляционные связи (р0,05) обозначены знаком * Установлено, что между значениями мутационного давления в изучае мых последовательностей мРНК и значениями RSCU для синонимичных ГЦ3 кодонов существуют достоверные прямые сильные корреляционные связи (за исключением кодонов, соответствующих глутамину). По причине существова ния таких связей значения RSCU для синонимичных ГЦ3-кодонов будут уменьшаться вместе с уменьшением значений D, которое наблюдается в ряду от ланцетника до человека (таблица 3).

Перейдем к определению влияния на аминокислотный состав АДГ хордовых (ционы, ланцетника, данио, лягушки, мыши, кролика и человека) ГЦ насыщенности кодирующих их мРНК. Сопоставим суммарное содержание аминокислот, кодируемых ГЦ-богатыми кодонами (GARP - глицин, аланин, ар гинин и пролин) и ГЦ-бедными кодонами (FYMINK - фенилаланин, тирозин, метионин, изолейцин, аспарагин и лизин) в последовательностях АДГ3 с со держанием гуанина и цитозина в соответствующих мРНК (рисунок 7).

y = 0,12x + 21, R2 = 0, Содержание аминокислот, % 27 GARP FYMINK Линейный (FYMINK) Линейный (GARP) y = -0,21x + 35, R2 = 0, 30 35 40 45 50 55 60 65 ГЦ-насыщенность, % Рисунок 7 – Зависимость содержания GARP и FYMINK в АДГ класса хордовых от ГЦ-насыщенности кодирующих их мРНК Установлено, что с ростом ГЦ-насыщенности изучаемых мРНК наблю дается линейный рост содержания аминокислот группы GARP (r = 0,72 ± 0,310, р 0,05) и линейное падение содержания аминокислот FYMINK (r = –0,88 ± 0,211, р 0,001). Таким образом, можно сделать вывод о том, что АУ-богатые мРНК кодируют белки с высоким содержанием FYMINK, а ГЦ-богатые мРНК – белки с высоким содержанием GARP.

На основании зависимости между (ГЦ1 + ГЦ2)/2-содержанием и ГЦ3 насыщенностью мРНК, кодирующих АДГ классов 1 и 3 хордовых (рисунок 8), установлены степени нейтральности замен нуклеотидов в них.

(ГЦ1+ГЦ2)/2-содержание, % y = 0,063x + 46, 60 R = 0, 1– 0 20 40 60 80 ГЦ3-насыщенность, % Рисунок 8 – Графическое представление степени нейтральности () и степени селективных ограничений (1–), налагаемых на молекулу мРНК АДГ3 хордовых Для мРНК, кодирующих полисубстратные ферменты (АДГ1) хордовых, характерна бльшая степень нейтральности замен в первом и втором положе ниях кодона ( = 9,7%) по сравнению с мРНК, кодирующими моносубстратные ферменты (АДГ3, = 6,3%).

Мы полагаем, что определенная степень нейтральности замен А или Т на Г или Ц в первом и втором положениях кодонов под влиянием направленно го ГЦ-давления, является отражением степени нейтральности замен в молекуле в целом. Таким образом, между темпами эволюционных изменений аминокис лотных последовательностей АДГ классов 1 и 3, а также кодирующих их мРНК и степенью нейтральности замен нуклеотидов данных мРНК существует пря мая связь.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Основные научные результаты диссертации 1. На основании наличия двух закономерностей последовательного ко личественного распределения гуанина и цитозина в мРНК, кодирующих АДГ человека, расположения изоферментов АДГ по отношению к корню построен ных дендрограмм и выполняемых функций можно утверждать, что семейство АДГ человека состоит из двух подсемейств: 1) АДГ, метаболизирующие фор мальдегид и хиноны (2 и 3-й классы);

2) АДГ, метаболизирующие спирты (1А, 1В, 1С, 4 и 5-й классы). Результаты проведенного BLAST-анализа свидетельст вуют, что эволюционным предшественником АДГ человека и соответствующе го ортолога дрозофилы является АДГ класса 3 нематоды. Согласно полученным дендрограммам, возникновение изоферментов АДГ происходило в последова тельности: класс 3 класс 1 класс 2 класс 5 класс 4 выделение подклассов класса 1 (А, В, С) [5, 6, 12, 13].

2. Сравнительный анализ нуклеотидного состава экзонов и интронов генов АДГ человека и определение темпов эволюционных изменений экзонов и интронов генов, кодирующих АДГ класса 3 мыши и человека, позволили уста новить особенность экзон-интронной структуры и нуклеотидного состава генов АДГ человека. Данная особенность заключается в их ГЦ-мозаичном строении (чередовании достоверно более ГЦ-насыщенных экзонов с менее ГЦ насыщенными интронами), что обеспечивается более низкими темпами эволю ционных изменений экзонов изучаемых генов. В последовательностях мРНК, кодирующих АДГ 1С и 3 человека, существуют два гипервариабельных участка (346-375 и 886-915). Для первого гипервариабельного участка характерно высо кое соотношение несинонимичной и синонимичной дистанций (0,88), досто верное преобладание многошаговых аминокислотных замен, наличие трех вы сокорадикальных замен аминокислот, увеличение гибкости остова основной цепи, сопряженное с изменением объема боковых радикалов. Учитывая, что со ответствующие ему аминокислоты (115, 116 и 117) входят в состав активного центра фермента, можно утверждать, что его эволюционные изменения проис ходили в режиме положительного отбора. Аминокислотные остатки, соответст вующие второму гипервариабельному участку не выполняют значимой функ ции, а следовательно, его изменения происходили в режиме нейтральной эво люции [8, 9, 22, 23].

3. Динамика стратегии кодирования АДГ класса 3 в мРНК хордовых в процессе эволюции заключается в уменьшении значений RSCU для синонимич ных ГЦ3-кодонов, увеличении частоты использования претерминальных кодо нов, увеличении содержания аминокислот, кодируемых ГЦ-бедными кодонами (FYMINK), и уменьшении содержания аминокислот, кодируемых ГЦ-богатыми кодонами (GARP), что связано с изменением в процессе эволюции направленно сти мутационного давления в экзонах соответствующих генов (с ГЦ на АТ). Ос новным механизмом изменения направленности мутационного давления явля ются ЦГТГ мутации, осуществляемые посредством метилирования цитозина с последующим дезаминированием 5-метилцитозина. Часть мутаций в ЦГ динуклеотидах может происходить по другим механизмам (ЦГЦА и ТГТА), что связано с высокой вероятностью транзиций [10, 19].

4. Сопоставление данных о степени нейтральности мутационных изме нений нуклеотидного состава мРНК (в терминах ГЦ-содержания) полисубстрат ных (АДГ1) и моносубстратных (АДГ3) ферментов в процессе эволюции ( = 9,7% для АДГ1, = 6,3% для АДГ3) с темпами эволюционных изменений мРНК (0,60 10–9 и 0,40 10–9 замен на сайт в год для АДГ 1 и 3 соответственно) и аминокислотных последовательностей (0,55 По и 0,25 По для АДГ 1 и 3 соответ ственно) показало существование между ними прямой связи, что находится в полном соответствии с теорией нейтральной эволюции [2, 3, 7, 14, 20].

Рекомендации по практическому использованию результатов 1. Предложенный подход для анализа генов, основанный на построении профилей ГЦ- и ГЦ3-содержания в экзонах гомологичных генов, может быть использован для выявления в них участков, потенциально эволюционирующих в режиме положительного отбора.

2. Обнаруженная взаимосвязь между скоростью молекулярной эволю ции и степенью селективных ограничений, налагаемых на различные АДГ, от крывает путь к разработке независимого метода определения времен диверген ции различных групп организмов, что имеет огромное медико-биологическое значение для таксономии вирусов и бактерий.

3. Полученные данные о высокой вероятности положительного отбора мутаций в АДГ1С и функциональные особенности данного изофермента позво ляют разработать метод определения активности АДГ1С для оценки степени тяжести алкоголизма и эффективности проводимого лечения.

4. Полученные данные и подготовленные с их использованием учебно методические пособия используются при преподавании биологии в медицин ских ВУЗах Республики Беларусь.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в журналах 1. Барковский, Е.В. Сравнительный анализ нуклеотидных последова тельностей мРНК алкогольдегидрогеназы класса IV мыши и человека / Е.В.

Барковский, А.В. Бутвиловский // Белорусский медицинский журнал. – Минск, 2005. – №1. – C. 19–22.

2. Бутвиловский, А.В. Молекулярная эволюция алкогольдегидрогеназ класса I хордовых животных / А.В. Бутвиловский, Е.В. Барковский, В.Э. Бут виловский // Медицинский журнал. – Минск, 2005. – №4. – С. 30–33.

3. Бутвиловский, А.В. Молекулярная эволюция алкогольдегидрогена зы класса III хордовых животных / А.В. Бутвиловский, Е.В. Барковский // Здравоохранение. – Минск, 2005. – №9. – С. 11–15.

4. Бутвиловский, А.В. Стратегия кодирования алкогольдегидрогеназ человека / А.В. Бутвиловский, Е.В. Барковский, В.Э. Бутвиловский // Вестник ВГМУ. – Витебск, 2006. – №3. – С. 24–29.

5. Бутвиловский, А.В. Эволюционные взаимоотношения и структур но-функциональная классификация алкогольдегидрогеназ человека / А.В. Бут виловский, Е.В. Барковский, В.Э. Бутвиловский. // Вестник ВГМУ. – Витебск, 2006. – №2. – С. 22–27.

6. Бутвиловский, А.В. Эволюционные дистанции и расчетные соотно шения транзиций и трансверсий в нуклеотидных последовательностях мРНК ал когольдегидрогеназы человека. / А.В. Бутвиловский, Е.В. Барковский // Здраво охранение. – Минск, 2005. – №2. – С. 49–50.

7. Методы изучения эволюционных изменений аминокислотных после довательностей. Сообщение 2. Методы, основанные на моделях замещения аминокислот / А.В. Бутвиловский, Е.В. Барковский, В.Э. Бутвиловский, В.В.

Давыдов // Здравоохранение. – Минск, 2006. – №1. – С. 45–49.

8. Бутвиловский, А.В. Сравнительный анализ генов алкогольдегидро геназ человека / А.В. Бутвиловский, Н.С. Климович // Вести Национальной Академии Наук Беларуси. Серия медицинских наук. – 2006, №5. – С. 40–42.

9. Гипервариабельные участки алкогольдегидрогеназ классов 1С и человека / А.В. Бутвиловский, Е.В. Барковский, О.В. Ачинович, В.Э. Бутви ловский // Медицина. – 2007, №1. – С. 38-41.

10. Изменения в процессе эволюции мутационного давления в после довательностях мРНК, кодирующих алкогольдегидрогеназы класса 3 хордовых животных / А.В. Бутвиловский, Е.В. Барковский, О.В. Ачинович, В.Э. Бутви ловский // Медицинский журнал. – Минск, 2007. – №1. – С. 22–25.

Статьи в сборниках 11. Бутвиловский, А.В. О виде селекции в нуклеотидных последова тельностях мРНК алкогольдегидрогеназы классов I-IV мыши и человека / А.В.

Бутвиловский // Науки о человеке: материалы VI съезда молодых ученых и специалистов;

под ред. Л.М. Огородовой, Л.В. Капилевича. – Томск: СибГМУ.

– 2005. – С. 70–71.

12. Бутвиловский, А.В. Об использовании претерминальных кодонов и кодонов, содержащих гуанин и цитозин в нуклеотидных последовательностях мРНК алкогольдегидрогеназ человека 1-7 типов. / А.В. Бутвиловский, Е.В.

Барковский // Материалы междунар. симпозиума “Молекулярные механизмы регуляции функции клетки”, Тюмень, 2005 г. / Тюмень, 2005. – С. 275–277.

13. Бутвиловский, А.В. Эволюционные дистанции и показатели BLAST-анализа для аминокислотных последовательностей алкогольдегидроге наз человека / А.В. Бутвиловский // Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем: Международная научная конференция;

Седьмой съезд Белорусского общественного Объединения фотобиологов и био физиков, Минск, 21-23 июня 2006 г.: Сборник статей в 2-х томах. Том I. / под ред. И.Д. Волотовского, С.Н. Черенкевича и др. – Мн.: Право и экономика, г. – С.51–53.

14. Бутвиловский, А.В. Эволюционные дистанции и скорости эволю ции аминокислотных последовательностей алкогольдегидрогеназ класса 1 хор довых животных / А.В. Бутвиловский // Труды молодых ученых 2006: сб. на уч. работ / под общ. ред. С.Л. Кабака – Минск: БГМУ, 2006. – С. 37–40.

Учебно-методические пособия 15. Таганович, А.Д. Классификация, номенклатура, структура, меха низм действия, регуляция и функции алкогольдегидрогеназ: учеб.-метод. посо бие / А.Д. Таганович, А.В. Бутвиловский. – Мн.: БГМУ, 2006. – 32 с.

Тезисы докладов 16. Бутвиловский, А.В. О транзициях и трансверсиях в нуклеотидных последовательностях мРНК алкогольдегидрогеназы класса IV мыши и человека / А.В. Бутвиловский // Студенческая медицинская наука 2004. 52-я итоговая сту денческая медицинская научная конференция (с международным участием): ма териалы конференции. – Москва, 2004. – С. 156.

17. Бутвиловский, А.В. О скорости молекулярной эволюции нуклео тидных и аминокислотных последовательностей мРНК алкогольдегидрогеназы класса IV мыши и человека / А.В. Бутвиловский // Молодежная наука и со временность. Материалы 69-й межвузовской научной конференции студентов и молодых ученых. В 2-х частях. Часть II. – Курск: КГМУ, 2004. – С. 110–111.

18. Бутвиловский, А.В. Транзиции и трансверсии в нуклеотидных по следовательностях мРНК алкогольдегидрогеназ классов I-IV мыши и человека / А.В. Бутвиловский, В.В.Хрусталев // Молодежная наука и современность. Юби лейная межвузовская научная конференция студентов и молодых ученых, посвя щенная 70-летию КГМУ. В 2-х частях. Часть I. – Курск: КГМУ, 2005. – С. 53–54.

19. Хрусталев, В.В. Влияние мутационного давления на использование претерминальных кодонов в мРНК алкогольдегидрогеназ III класса хордовых жи вотных / В.В. Хрусталев, А.В. Бутвиловский // Молодежная наука и современ ность: юбилейная межвузовская науч. конф. студентов и молодых ученых, по свящ. 70-летию КГМУ. В 2-х частях. Часть I. – Курск: КГМУ, 2005. – С. 81–82.

20. Бутвиловский, А.В. Эволюционные дистанции и скорости молеку лярной эволюции алкогольдегидрогеназ класса 1 хордовых животных / А.В.

Бутвиловский // V Всероссийская университетская научно-практическая кон ференция молодых ученых и студентов по медицине: сборник материалов / Под общ. Ред. проф. В.Г. Сапожникова. – Тула, 2006. – С. 42–44.

21. Бутвиловский, А.В. Эволюционные дистанции и скорости молеку лярной эволюции алкогольдегидрогеназ класса 1-4 мыши и человека / А.В. Бут виловский // V Всероссийская университетская научно-практическая конферен ция молодых ученых и студентов по медицине: сборник материалов. Под общ.

ред. проф. В.Г. Сапожникова. – Тула, 2006. – С. 44–45.

22. Бутвиловский, А.В. Темпы эволюционных изменений и насыщен ность гуанином и цитозином экзонов и интронов генов алкогольдегидрогеназ класса 3 мыши и человека / А.В. Бутвиловский, Е.В. Барковский, В.Э. Бутви ловский // Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии: III Международный симпозиум, посвященный 100-летию со дня рождения акаде мика Н.Р. Сисакяна (Москва, Дубна, 24-28 января 2007 г.): Анннот. докл. – Дубна: ОИЯИ, 2006. – С. 31–32.

23. Бутвиловский, А.В. Насыщенность гуанином и цитозином экзонов и интронов генов алкогольдегидрогеназ человека / А.В. Бутвиловский, О.В.

Ачинович // Материалы межрегиональной научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием “Молодежь и наука:

итоги и перспективы” – Саратов, 2006. – С. 61.

24. Бутвиловский, А.В. Зависимость содержания гуанина и цитозина в каждом из положений кодона от общей ГЦ-насыщенности экзонов ряда генов алкогольдегидрогеназ человека / А.В. Бутвиловский, О.В. Ачинович // Вест ник РГМУ. Периодический медицинский журнал. – М.: ГОУ ВПО РГМУ Росз драва. – 2007, №2 (55). – С. 254–255.

РЭЗЮМЭ Бутвілоўскі Аляксандр Валер’евіч Дынаміка змен нуклеатыдных паслядоўнасцей матрычных РНК і амінакіслотных паслядоўнасцей алкагольдэгідрагеназ у працэсе эвалюцыі Ключавыя словы: алкагольдэгідрагеназа, мутацыі, эвалюцыйныя змены, стра тэгія кадзіравання.

Аб’екты даследавання: нуклеатыдныя паслядоўнасці мРНК і амінакіслотныя паслядоўнасці алкагольдэгідрагеназ розных жывёл.

Прадмет работы: вывучэнне заканамернасцей змянення нуклеатыдных пасля доўнасцей мРНК і амінакіслотных паслядоўнасцей алкагольдэгідрагеназ у працэсе эвалюцыі.

Мэта даследавання: вызначыць асноўныя заканамернасці змянення паслядоўнасцей мРНК і першаснай структуры алкагольдэгідрагеназ у працэсе эвалюцыі, характар эвалюцыйных узаемаадносін паміж імі ў шырокім філагенетычным радзе ад ніжэйшых хордавых да чалавека.

Метады даследавання: комплекс метадаў эвалюцыйнай біяхіміі, малекулярнай эвалюцыі, біяфізікі і статыстыкі.

Атрыманыя вынікі і іх навізна. Упершыню прапанавана структурна функцыянальная класіфікацыя алкагольдэгідрагеназ чалавека. Выяўлена ГЦ мазаічная будова генаў алкагольдэгідрагеназ чалавека, якая забяспечваецца больш нізкімі тэмпамі эвалюцыйных змен іх экзонаў. Выяўлена дынаміка стратэгіі кадзіравання алкагольдэгідрагеназ класа 3 у мРНК хордавых, якая заключаецца ў памяншэнні мутацыйнага ціску і зменах яго кірунку з ГЦ на АТ (асноўным механізмам дадзенага працэсу з’яўляюцца ЦГТГ мутацыі), што прыводзіць да змен у амінакіслотным саставе кадзіруемых бялкоў (павелічэння амінакіслот групы FYMINK і памяншэння амінакіслот групы GARP).

Упершыню выяўлена, што нейтральнасць замен па першым і другім палаженням кадона і тэмпы эвалюцыйных змен полісубстратных ферментаў (алкагольдэгідрагеназа клас 1) вышэйшыя за монасубстратныя (алкаголь дэгідрагеназа класа 3).

Рэкамендацыі па выкарыстанню: вызначаныя ў рабоце заканамернасці могуць быць выкарыстаны для аналізу генаў і выяўлення ў іх участкаў, якія патэнціальна эвалюцыяніруюць у рэжыме станоўчага адбору, для распрацоўкі незалежнага метаду вызначэння перыядаў дывергенцыі розных груп арганізмаў, а таксама маркераў вызначэння ступені цяжкасці алкагалізма і ацэнкі эфек тыўнасці праводнага лячэння.

Галіна прымянення: біяхімія, эвалюцыйная біяхімія, малекулярная біялогія, генная інжынерыя.

РЕЗЮМЕ Бутвиловский Александр Валерьевич Динамика изменений нуклеотидных последовательностей матричных РНК и аминокислотных последовательностей алкогольдегидрогеназ в процессе эволюции Ключевые слова: алкогольдегидрогеназа, мутации, эволюционные изменения, стратегия кодирования.

Объекты исследования: нуклеотидные последовательности мРНК и аминокис лотные последовательности алкогольдегидрогеназ различных животных.

Предмет работы: изучение закономерностей изменения нуклеотидных после довательностей мРНК и аминокислотных последовательностей алкогольдегид рогеназ в процессе эволюции.

Цель исследования: установить основные закономерности изменения последователь ностей мРНК и первичной структуры алкогольдегидрогеназ в процессе эволюции, характер эволюционных взаимоотношений между ними в широком филогенетиче ском ряду от низших хордовых до человека.

Методы исследования: комплекс методов эволюционной биохимии, молеку лярной эволюции, биофизики и статистики.

Полученные результаты и их новизна. Впервые предложена структурно функциональная классификация алкогольдегидрогеназ человека. Установлено ГЦ-мозаичное строение генов алкогольдегидрогеназ человека, обеспечиваю щееся более низкими темпами эволюционных изменений их экзонов. Установ лена динамика стратегии кодирования алкогольдегидрогеназ класса 3 в мРНК хордовых, заключающаяся в уменьшении мутационного давления и изменении его направления с ГЦ на АТ (основным механизмом данного процесса являют ся ЦГТГ мутации), что приводит к изменению аминокислотного состава ко дируемых белков (увеличению аминокислот группы FYMINK и уменьшению аминокислот группы GARP). Впервые показано, что нейтральность замен по первому и второму положениям кодона и темпы эволюционные изменений по лисубстратных ферментов (алкогольдегидрогеназа класс 1) выше, чем моно субстратных (алкогольдегидрогеназа класса 3).

Рекомендации по использованию: обнаруженные в работе закономерности мо гут быть использованы для анализа генов и выявления в них участков, потенци ально эволюционирующих в режиме положительного отбора, для разработки независимого метода определения времен дивергенции различных групп орга низмов, а также маркеров определения степени тяжести алкоголизма и оценке эффективности проводимого лечения.

Область применения: биохимия, эволюционная биохимия, молекулярная био логия, генная инженерия.

SUMMARY Alexander Butvilovsky Dynamics of changes of mRNA nucleotide sequences and amino acid sequences of alcoholdehydrogenases during evolution Keywords: alcoholdehydrogenase, mutations, evolutionary changes, coding strategy.

Research objects: mRNA nucleotide sequences and amino acid sequences of alco holdehydrogenases of various animals.

Research subject: study of changes of mRNA nucleotide sequences and amino acid sequences of alcoholdehydrogenases during evolution.

Objective: to determine the main pattern of changes of mRNA sequences and primary structure of alcoholdehydrogenases during evolution, the character of evolutionary mutual relation between them in a wide phylogenetic number from the lowest chord animals up to the man.

Research methods: complex of methods of evolutionary biochemistry, molecular evolution, biophysics and statistics.

Obtained results and their novelty. Structure-functional classification of human alco holdehydrogenases has been offered for the first time. We determined GC-mosaic structure of human alcoholdehydrogenases genes;

it is provided by lower rates of evolutionary changes of their exons. Dymanics of class 3 alcoholdehydrogenases coding strategy in mRNA of the chord animals has been detected. It involves the de crease of mutation pressure and change of its direction from GC to АТ (the main mechanism of the given process is GCTG mutation) that results in changing of the amino acid composition of encoded protein (increase of amino acids of FYMINK group and decrease of amino acids of GARP group). For the first time it has been shown that the neutrality of replacements in the first and second codon’s positions and rates of evolutionary changes of polysubstrate enzymes (alcoholdehydrogenase class 1) are higher than those of the monosubstrate enzyme (alcoholdehydrogenase class 3).

Suggested usage: the patterns discovered in the research can be applied for gene’s analysis and for detection the sites potentially evolving in the mode of positive selec tion, for the development of an independent method defining divergence times of various groups of organisms as well as the development of a marker defining degree of alcoholism and estimating efficiency of spent treatment.

Fields of application: biochemistry, evolutionary biochemistry, molecular biology, genetic engineering.