Генетики и цитологии национальной академии наук беларуси удк 575.13: 577.21 мямин владислав евгеньевич генетическая регуляция патогенности и вирулентности возбудителя черной ножки картофеля erwinia ca

«ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И ЦИТОЛОГИИ

НАЦИОНАЛЬНОЙ АКАДЕМИИ НАУК БЕЛАРУСИ»

УДК 575.13: 577.21

МЯМИН Владислав Евгеньевич

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ПАТОГЕННОСТИ И

ВИРУЛЕНТНОСТИ ВОЗБУДИТЕЛЯ «ЧЕРНОЙ НОЖКИ» КАРТОФЕЛЯ

ERWINIA CAROTOVORA SUBSP. ATROSEPTICA

03.00.26 – молекулярная генетика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Минск – 2004 Работа выполнена в НИЛ молекулярной генетики бактерий при кафедре микробиологии Белорусского государственного университета Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Прокулевич В.А., Белорусский государственный университет, кафедра микробиологии Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор, академик НАН Беларуси Картель Н.А., ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси», лаборатория молекулярной генетики кандидат биологических наук, доцент Белясова Н.А., Учреждение образования «Белорусский государственный технологический университет», кафедра биотехнологии и биоэкологии Оппонирующая организация:

Федеральное государственное унитарное предприятие «Государственный научно исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» (г. Москва) Защита состоится «_» _ 2004 г. в часов на заседании совета по защите диссертаций Д 01.31.01 при ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси» по адресу: 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27. Тел. (017) 284-19-11, факс (017) 284-19-17, e-mail: [email protected] С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси».

Автореферат разослан «_» _ 2004 г.

Ученый секретарь совета по защите диссертаций, кандидат биологических наук Л.А.Тарутина ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы диссертации. Жизнедеятельность пектолитических бактерий рода Erwinia приводит к существенным потерями сельскохозяйственной продукции. Традиционно используемые меры борьбы с фитопатогенами не обеспечивают желаемого уровня защиты культивируемых растений, в частности, картофеля, потери урожая которого из-за поражений пектолитическими Erwinia в Беларуси в отдельные годы достигают 30-40%. Накопленный в мировом сельскохозяйственном производстве опыт указывает на то, что даже максимально возможное применение агротехнических приемов и защитных мероприятий не решает проблемы бактериозов, поэтому основным направлением в решении этой проблемы становится конструирование трансгенных растений, устойчивых к наиболее вредоносным заболеваниям. Обязательным условием реализации данного направления является получение более полных сведений об особенностях взаимодействия патогенов с растениями и конкретно о механизмах генетической регуляции факторов патогенности и вирулентности, поскольку только на основе этих знаний можно планировать и осуществлять введение в геном растений обеспечивающих резистентность генов.

Связь работы с крупными научными программами, темами. Начатые в 70-ые годы XX века профессором Ю. К. Фомичевым и его сотрудниками исследования фитопатогенных бактерий рода Erwinia создали необходимую основу для проведения в последующее время ряда научных программ и тем, в рамках которых осуществлялась диссертационная работа. Таковыми являлись:

1. “Изучение генетической организации и особенности регуляции детерминант вирулентности бактерий Erwinia carotovora”, 1996-1998 г.г., (№ ГР 19962092).

2. “Молекулярные механизмы взаимодействия фитопатогенных бактерий Erwinia carotovora subsp. atroseptica с растениями-хозяевами”, 1999-2001 г.г., (№ ГР 19992827).

3. “Изучение экспрессии факторов вирулентности бактерий Erwinia carotovora subsp. atroseptica, индуцируемых в процессе взаимодействия с растением хозяином”, 1999-2001 г.г., программа финансировалась Фондом фундаментальных исследований Беларуси (договор № Б98М-108, № ГР 19993637).

Цель и задачи исследования. Целью диссертационной работы являлась идентификация генов пектолитических бактерий Erwinia, контролирующих взаимодействие фитопатогена с растением-хозяином и определение факторов, обуславливающих особенности протекания патологического процесса, вызываемого различными видами Erwinia. Для достижения этой цели были поставлены и решались следующие задачи:

- проанализировать фенотипические проявления мутаций в бактериальных генах, индуцируемых при контакте клеток с растением-хозяином и влияющих на патогенные свойства Erwinia carotovora subsp. atroseptica и Erwinia chrysanthemi;

- определить роль конкретных генов, воздействующих на продукцию факторов вирулентности и патогенности у бактерий Erwinia carotovora subsp. atroseptica и Erwinia chrysanthemi;

- изучить видовые особенности регуляции продукции факторов вирулентности и патогенности у пектолитических эрвиний;

- изучить особенности протекания процесса патогенеза, вызываемого бактериями Erwinia carotovora subsp. atroseptica и бактериями Erwinia chrysanthemi.

Объект и предмет исследования. Объектом исследования служили бактерии Erwinia carotovora subsp. atroseptica, возбудители заболевания “черная ножка” картофеля, и бактерии Erwinia chrysanthemi, вызывающие мягкие гнили у различных видов растений. Предмет исследования – особенности генетической регуляции факторов патогенности и вирулентности у бактерий Erwinia carotovora subsp. atroseptica в сравнении с таковыми у Erwinia chrysanthemi.

Гипотеза. Известно, что экспрессия факторов патогенности и вирулентности у фитопатогенных бактерий имеет индуцибельный характер. Индуцирующими агентами являются вещества растительной природы, воздействующие на клетку патогена при контакте с растением-хозяином путем изменения функционирования соответствующих регуляторных систем. Предположительно, у пектолитических эрвиний, вызывающих специфические заболевания растений, могут наблюдаться различия в экспрессии одних и тех же факторов патогенности и вирулентности в результате участия в этом процессе как общих для разных видов Erwinia, так и специфических регуляторных систем.

Методология и методы проведенного исследования. Использование транспозона mini-Tn5xylE, в силу наличия в его составе лишенного собственного промотора гена катехол-2,3-диоксигеназы, позволяет отбирать клоны бактерий, в клетках которых транспозон встроился в какой-либо из генов, изменяющих свою экспрессию при контакте клеток с растением-хозяином. Свидетельством такого изменения будет увеличение (снижение) катехол-2,3-диоксигеназной активности, поскольку транскрипция репортерного гена xylE в этом случае осуществляется с промотора мутированного инсерцией гена. Клонирование мутантного гена и определение его нуклеотидной последовательности позволяет идентифицировать данный ген, а анализ фенотипа мутанта и изменений в характере взаимодействия мутантных бактерий с растением-хозяином дает возможность оценить участие продукта этого гена в формировании фитопатогенных свойств бактерий.

Для реализации такого методического подхода использованы методы определения ферментативных активностей;

конъюгационных скрещиваний и хромосомного картирования;

клонирования и секвенирования фрагментов хромосомной ДНК;

полимеразной цепной реакции и направленного мутагенеза путем замены интактного гена на мутированный;

очистки и хроматографического разделения продуктов деградации пектиновых веществ;

определения вирулентности бактерий на покоящихся и вегетирующих растениях картофеля.

Научная новизна и значимость полученных результатов. В ходе проведения исследований впервые:

- охарактеризован ген 2,5-дикето-3-дезоксиглюконатдегидрогеназы (kduD) бактерий Erwinia carotovora subsp. atroseptica;

- определена локализация гена kduD на генетической карте хромосомы бактерий этого вида и показана его тесная сцепленность с геном kduI;

- выявлен репрессирующий эффект избыточных количеств 2,5-дикето-3 дезоксиглюконата (ДК2) на продукцию факторов патогенности и вирулентности возбудителем “черной ножки” картофеля и установлена внеклеточная локализация ДК2 у мутантных по гену kduD бактерий Erwinia carotovora subsp. atroseptica и Erwinia chrysanthemi;

- показано наличие у фитопатогенных бактерий Erwinia carotovora subsp.

atroseptica, помимо KdgR-системы, еще одной, отсутствующей у Erwinia chrysanthemi, дополнительной системы генетической регуляции синтеза основных факторов патогенности и вирулентности, реагирующей на продукты деградации пектиновых веществ.

Практическая (экономическая, социальная) значимость полученных результатов вытекает из выявления ранее не описанных отличий между двумя видами фитопатогенных бактерий – Erwinia carotovora subsp. atroseptica и Erwinia chrysanthemi. Наличие у возбудителя “черной ножки” своеобразной системы регуляции продукции факторов патогенности и вирулентности может послужить основой для лучшего понимания специфичности взаимодействия этого патогена с растениями картофеля, планирования дальнейших исследований с целью разработки мер борьбы с этими бактериями и отработки стратегий создания устойчивых к данному заболеванию трансгенных растений. Разработанный дешевый и эффективный метод получения 2,5-дикето-3-дезоксиглюконата (ДК2) и 2-кето-3-дезоксиглюконата (КДГ) с использованием мутантных бактерий Erwinia carotovora subsp. atroseptica P177 дает возможность синтезировать в необходимом количестве эти, не выпускаемые химической промышленностью, соединения и использовать их для изучения продукции факторов патогенности и вирулентности у пектолитических фитопатогенных бактерий и грибов.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

- у бактерий Erwinia carotovora subsp. atroseptica, в отличие от бактерий Erwinia chrysanthemi, продукты деградации пектиновых веществ клеточных стенок растений влияют не только на синтез ферментов пекто и целлюлолитических комплексов, но и на синтез внеклеточных протеаз;

- продукты деградации ненасыщенной дигалактуроновой кислоты способны оказывать как индуцирующий так и репрессирующий эффект на продукцию факторов вирулентности и патогенности у бактерий Erwinia carotovora subsp. atroseptica;

- влияние продуктов деградации пектиновых веществ на синтез основных факторов патогенности и вирулентности у Erwinia carotovora subsp.

atroseptica осуществляется как посредством KdgR-системы, функционирующей и у бактерий Erwinia chrysanthemi, так и посредством иной, отсутствующей у Erwinia chrysanthemi, дополнительной регуляторной системы;

- механизм действия дополнительной системы регуляции по своему проявлению отличен от механизма действия, осуществляемого KdgR-системой – продукты деградации пектиновых веществ не активируют, а репрессируют экспрессию генов факторов патогенности и вирулентности. Противоположный друг другу механизм действия двух регуляторных систем проявляется и на уровне взаимодействия патогена с растением-хозяином.

Личный вклад соискателя. Материалы, положенные в основу диссертационной работы, получены лично автором в НИЛ молекулярной генетики бактерий при кафедре микробиологии БГУ.

Автор выражает признательность доценту кафедры микробиологии БГУ, к.б.н.

Песнякевичу А. Г. за неоценимый вклад в планирование экспериментов, интерпретацию полученных данных и оформление диссертационной работы.

Существенная методическая помощь в выполнении молекулярно-биологической части работы оказана автору доцентом кафедры молекулярной биологии БГУ, PhD, к.б.н. Николайчиком Е. А.

Апробация результатов диссертации. Результаты диссертации апробированы на 53-й научной конференции студентов Белгосуниверситета (Минск, 1996);

Научной конференции “Достижения современной биологии и биологическое образование” (Минск, 1997);

Научной конференции “Актуальные проблемы фитовирусологии и защиты растений” (Прилуки, 1997);

VII съезде белорусского общества генетиков и селекционеров (Горки, 1997);

Международной конференции “Проблемы микробиологии и биотехнологии” (Минск, 1998);

9th International Congress on Molecular Plant-Microbe Interactions (Amsterdam, 1999);

Conference on Genetics and Molecular Biology (Lviv, 2000);

Международной конференции “Микробиология и биотехнология на рубеже XXI столетия” (Минск, 2000);

Международном симпозиуме “Молекулярные механизмы генетических процессов и биотехнология” (Москва-Минск, 2001);

Международной конференции “Микробиология и биотехнология XXI столетия” (Минск, 2002);

VIII съезде генетиков и селекционеров Республики Беларусь (Минск, 2002);

Международной научно-технической конференции “Новые технологии в химической промышленности” (Минск, 2002);

2-й Международной научно-практической конференции “Достижения современной биологии и биологическое образование” (Минск, 2002).

Опубликованность результатов. По теме диссертации имеется публикаций, из них 5 статей в научных журналах, статей в сборниках научных докладов – 2, тезисов докладов и выступлений на конференциях – 11. Общее количество страниц опубликованных материалов составляет 65.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, общей характеристики работы, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов исследований и их обсуждения, заключения и списка использованных источников. Полный объем диссертации составляет 132 страницы, таблиц – 7, рисунков – 36. Список цитируемой литературы включает 254 библиографических источника, в том числе 223 иностранных.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследований В работе использованы штаммы-производные бактерий E. atroseptica 3- (прототроф, Rifr): E. atroseptica JN42 (как 3-2, но инсерция Tn9 в хромосому, Cmr), E. atroseptica P177 (как JN42, но kduD::mini-Tn5xylE, Kmr), полиауксотрофные штаммы E. atroseptica 3-2 из коллекции НИЛ молекулярной генетики бактерий при кафедре микробиологии БГУ, сконструированные штаммы E. atroseptica MV204 (как JN42, но kdgR::”omega”Sm/Sp, Smr), E. atroseptica MV265 (как P177, но kdgR::”omega”Sm/Sp, Smr). Штаммы E. chrysanthemi A350 (lmrTc lacZ), E. chrysanthemi A691 (как A350, но kduD::Mu d(Ap lac)) и E. chrysanthemi A (как A350, но kdgR::MudII PR13) любезно предоставлены доктором Шевчиком В. Е. (лаборатория молекулярной генетики микроорганизмов, Лион, Франция). В работе также использовали бактерий E. coli K-12 J62, E. coli S17- pir, E. coli BW19851, E. coli XL1-Blue. Бактерий выращивали в жидкой и на агаризованной среде LB, на минимальных средах А и М9 (Миллер Дж., 1976).

Выделение плазмидной и хромосомной ДНК, операции с ДНК, трансформацию бактерий плазмидной ДНК, электрофорез в агарозном геле проводили согласно стандартным методикам (Маниатис Т. и соавт., 1984).

Праймеры OGL (5'-CGGAGCTCGTTCTAAGGATTTACGGATGG-3'), KDG (5'-CGGAGCTCTTATTAAGTCTCTGACGCGG-3') и KDG (5'-CGCTGCAGGCTCAGGCATTGATAGGG-3') использовали для амплификации методом ПЦР фрагментов ДНК, содержащих ген kdgR (праймеры KDG1 и KDG2) и кластер генов ogl-kdgR (праймеры OGL и KDG2).

Для проведения секвенирующей реакции использовали набор Auto Read Sequencing Kit (Amersham Pharmacia Biotech) и праймеры SO (5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3'), SO101 (5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3'), SM (5'-CAGGAAACAGCTATGACGGCCGCACTTGTGTATAAGAGT-3'). Анализ данных проводили с использованием программного обеспечения ALFwin (Amersham Pharmacia Biotech) и с использованием программы BLAST 2.

Генетическое картирование генов проводили с использованием методов коньюгационного анализа (Николайчик Е. А., Песнякевич А. Г., 1995).

Для качественного анализа продуктов деградации пектинов использовали метод нисходящей хроматографии, проводимой в течение 9 часов на бумаге Filtrac FN11 (PN;

ГДР) в системе растворителей этилацетат: уксусная кислота:

муравьиная кислота: вода (90:15:5:20). Результаты визуализировали опрыскиванием хроматограмм периодатом и затем тиобарбитуровой кислотой.

Количественное определение продуктов деградации пектинов проводили с помощью периодат-тиобарбитурат (ТБК) метода (Preiss J., Achwell G., 1963).

В качестве источника получения ДК2 использовали культуральную жидкость штамма E. atroseptica P177, выращенного в среде А с полипектатом натрия (0,5%).

Для получения КДГ в качестве субстрата использовали ДК2 из культуральной жидкости штамма E. atroseptica P177, выращенного в среде А с полипектатом натрия (0,5%), а в качестве фермента KduD – экстракт клеток штамма E. atroseptica JN42, выращенного в таких же условиях. Для очистки ДК2 и КДГ использовали метод ионообменной хроматографии на анионообменной смоле Dowex 1 8 в HCOO–-форме с проведением элюции градиентом концентраций муравьиной кислоты (0,05 М и 0,5 М) и последующим качественным и количественным анализом содержимого фракций.

Пектолитическую активность определяли согласно методу, предложенному Евтушенковым А. Н., Фомичевым Ю. К. (1978). Активность целлюлаз определяли по методу Pirhonen M. et al. (1991). Активность протеаз определяли по модифицированному методу Anson M. L. (1988). Для определения олигогалактуронатлиазы (Ogl) использовали метод из работы Moran F. et al.

(1968). Для определения активностей 5-кето-4-дезоксиуронатизомеразы (KduI) и 2,5-дикето-3-дезоксиглюконатдегидрогеназы (KduD) использовали методы из работы Preiss I., Ashwell G. (1963). Активность 2-кето-3-дезоксиглюконаткиназы (KdgK) определяли по методу Hugouvieux-Cotte-Pattat N., Robert-Baudouy J. (1985).

Активность катехол-2,3-диоксигеназы определяли по методу Sala-Trepat J. M., Evans W. C. (1971). -галактозидазную активность определяли согласно методу, предложенному Миллером Дж. (1976).

Мацерирующую способность определяли посредством введения 40 мкл суспензии бактерий (5109 кл/мл) с помощью шприца в клубни картофеля сорта «Темп», последующей инкубации клубней при температуре 28С в течение 48 часов и взвешивания мацерированной ткани. Определение способности вызывать симптомы «черной ножки» осуществляли путем введения с помощью шприца 20 мкл бактериальной суспензии (5109 кл/мл) в междоузлия выращенных в грунте в лабораторных условиях растений.

Результаты и их обсуждение Идентификация инсерционного мутанта E. atroseptica P На первом этапе исследований проводился отбор mini-Tn5xylE– индуцированных инсерционных мутантов E. atroseptica, способных реагировать повышенной экспрессией гена xylE на присутствие в среде культивирования гомогената тканей растений картофеля. Из 1200 проверенных в чашечных тестах мутантов был отобран штамм E. atroseptica P177, в клетках которого экспрессия репортерного гена возрастает при добавлении гомогената тканей картофеля (в частности, фракции клеточных стенок) в среду культивирования, что свидетельствует об инсерции транспозона в ген или оперон, активирующийся при контакте с растением-хозяином. Поэтому было проанализировано влияние аналогов полисахаридов растительных клеточных стенок и продуктов их деградации на экспрессию мутированного гена. Оказалось, что индукторами в равной степени являются свекловичный пектин и полипектат натрия, наибольший эффект достигается при воздействии на клетки анализируемых бактерий ненасыщенной дигалактуроновой кислоты, а карбоксиметилцеллюлоза не является индуктором (рис. 1А). Культивирование бактерий на средах с углеводами растительного происхождения показало, что мутантные бактерии E. atroseptica P177 утратили характерную для исходных бактерий E. atroseptica JN способность использовать полипектат натрия и ненасыщенную дигалактуроновую кислоту в качестве источников углерода и энергии, но сохранили способность утилизировать галактуроновую кислоту. Исходя из известной схемы утилизации продуктов деградации пектиновых веществ бактериями E. chrysanthemi (рис. 1В), и учитывая тот факт, что галактуроновая кислота, утилизация которой не затронута мутацией, транспортируется в бактериальные клетки по независимому пути, можно предположить, что инсерция транспозона произошла либо в один из генов системы транспорта дигалактуронатов, либо в один из трех генов внутриклеточной деградации дигалактуронатов – олигогалактуронатлиазы (ogl), 5-кето-4-дезоксиуронатизомеразы (kduI) или 2,5-дикето-3 дезоксиглюконатдегидрогеназы (kduD).

Для идентификации мутантного гена осуществляли клонирование фрагмента хромосомы бактерий штамма E. atroseptica Р177, включившего транспозон mini-Tn5xylE, в вектор pUC18 по сайтам рестрикции для фермента PstI.

Полученную плазмиду (pKDUD1), несущую фрагмент хромосомы протяженностью 15,8 т. п. н., использовали для секвенирования прилегающих к транспозону фрагментов ДНК. Сравнение полученной нуклеотидной последовательности фрагмента хромосомы E. atroseptica P177 длиной 1165 п. н.

(EMBL Nucleotide Sequence Database, код доступа № AJ507294) с имеющимися в этой базе данных показало, что этот фрагмент со 193 по 979 нуклеотид имеет 82% гомологии с kduD-геном бактерий E. chrysanthemi EC3937 (код доступа № X62073.1). Инсерция mini-Tn5xylE локализована между 505 и 506 нуклеотидом секвенированного фрагмента, то есть в гене kduD бактерий E. atroseptica 3-2.

Открытая рамка считывания с 218 по 979 нуклеотид кодирует представленный аминокислотами полипептид, который на 90% идентичен и на 96% гомологичен по аминокислотной последовательности KduD-белку бактерий E. chrysanthemi EC3937 (код доступа № Q05528). Изученный фрагмент хромосомы E. atroseptica P177 с 2 по 134 нуклеотид имеет 87% гомологии с фрагментом 3'-концевой последовательности kduI-гена бактерий E. chrysanthemi EC3937 (код доступа № X62073.1). Таким образом, гены kduI и kduD у бактерий E. atroseptica P расположены рядом и имеют одинаковое направление считывания, так же как и у бактерий E. chrysanthemi EC3937 (Reverchon S. et al., 1991).

ПЕКТИН пектиназы смесь ОГ, НДК и ДК внешняя среда цитоплазма ОГ НДК ДК Ogl Ogl PelW Катехол-2,3-диоксигеназная 5-кето-4-дезоксиуронат (ДК1) галактуронат активность (Е/мг белка) 60 UxaC KduI тагатуронат 2,5-дикето-3-дезоксиглюконат (ДК2) UxaB альтронат KduD UxaA 2 2-кето-3-дезоксиглюконат (КДГ) KdgK 6-фосфо-2-кето-3-дезоксиглюконат (КДГФ) KdgA А B 1 2 3 4 5 6 пируват + 3-фосфоглицеральдегид Рис. 1. (А) Влияние индукторов на экспрессию анализируемого гена. Бактерии выращивали в среде М9, не содержащей индуктора (1) или содержащей по отдельности карбоксиметилцеллюлозу (2), полипектат натрия (3), свекловичный пектин (4), ненасыщенную дигалактуроновую кислоту (5), галактуроновую кислоту (6). (В) Деградация и катаболизм пектина у бактерий E. chrysanthemi (Hugouvieux-Cotte-Pattat N., Reverchon S., 2001). Показано образование смеси олигогалактуронатов (ОГ), ненасыщенной дигалактуроновой кислоты (НДК) и насыщенной дигалактуроновой кислоты (ДК) в результате действия внеклеточных пектиназ. Широкая стрелка указывает направление их поступления в клетку через соответствующие транспортные системы, тонкие указывают путь катаболизма углеводов в цитоплазме, осуществляемый ферментами, обозначенными жирным шрифтом.

Функциональный анализ гена kduD E. atroseptica Согласно схеме путей утилизации пектиновых веществ бактериями Erwinia (рис. 1В), мутация в гене kduD должна приводить к накоплению 2,5-дикето-3 дезоксиглюконата (ДК2) внутри бактериальных клеток. Однако анализ с использованием периодат-ТБК метода не выявил сколько-нибудь заметного присутствия промежуточных продуктов, возникающих в процессе утилизации пектинов, ни в клетках дикого типа E. atroseptica JN42, ни в клетках мутантных бактерий E. atroseptica Р177, что могло свидетельствовать о существовании неизвестного дополнительного пути превращения ДК2 либо об экскреции этого соединения из клеток мутантных бактерий. Установлено, что, в отличие от штамма E. atroseptica JN42, культивирование E. atroseptica P177 приводит к накоплению продуктов деградации полипектата вне клеток. Хроматографическое разделения присутствующих в культуральной жидкости мутанта углеводов выявило наличие двух зон, не относящихся к зоне ненасыщенной дигалактуроновой кислоты (НДК), а являющихся продуктами ее деградации – 5-кето-4-дезоксиуронатом (ДК1) и ДК2 (рис. 2А). Исходя из этого было сделано предположение о возможности удаления из клеток E. atroseptica P177 ДК1 и ДК при накоплении их в избытке. Для проверки этого предположения изучалась динамика образования ДК1 и ДК2 из НДК и локализация образуемых метаболитов при культивировании бактерий в течение 180 минут (рис. 2B).

4 1 Концентрация в супернатантеa Концентрация в клеткахб 3 НДК ДК1 2 1 ДК2 0 30 60 90 120 150 А B Время (мин) Рис. 2. (А) Хроматографическая подвижность НДК (1) и углеводов (2) культуральной жидкости штамма E. atroseptica Р177. (B) Изменение концентраций ДК1 и ДК2 в супернатанте (1) и в клетках (2) в зависимости от времени инкубирования E. atroseptica P177 с НДК (а – концентрация выражена в мкМоль / мг клеточного белка из 1 мл культуры;

б – концентрация выражена в нМоль / мг клеточного белка из 1 мл культуры).

Из представленных на рисунке 2B данных видно, что в течение первого часа происходит накопление ДК1 и ДК2 как в культуральной жидкости, так и внутри клеток, но затем клетки начинают достаточно быстро освобождаться от них. По всей вероятности, при достижении концентраций неутилизируемых продуктов деградации НДК в клетках в пределах 35-40 нМ активируется пока еще не исследованный механизм экспорта этих веществ в окружающую среду.

Отсутствие активности 2,5-дикето-3-дезоксиглюконатдегидрогеназы (KduD) и наличие в клетках E. atroseptica P177 активности 5-кето-4 дезоксиуронатизомеразы (KduI) подтверждает сделанное на основании молекулярно-генетического анализа заключение об инсерции транспозона mini-Tn5xylE в хромосому E. atroseptica P177 в область гена kduD и отсутствии полярного эффекта в отношении сцепленного с ним гена kduI.

Генетическое картирование генов E. atroseptica, участвующих во внутриклеточной утилизации пектиновых веществ Для локализации мутированного гена на генетической карте использовали созданную ранее систему конъюгационного анализа бактерий E. atroseptica 3- (Николайчик Е. А., Песнякевич А. Г., 1995). Эта система позволяет превратить в доноров хромосомных генов бактерий, несущих транспозон Tn9 в определенном локусе хромосомы, после введения в клетки плазмиды pR471a с таким же транспозоном. Следует отметить, что мутант E. atroseptica P177 является производным штамма E. atroseptica JN42, в хромосоме которого транспозон Tn расположен между локусами proA и tyr-1, в силу чего клетки E. atroseptica P легко трансформировались в Hfr-подобных доноров с противоположными направлениями переноса хромосомы с одной и той же точки origin. Наличие в составе транспозона mini-Tn5xylE гена канамицинрезистентности позволяет картировать место инсерции транспозона по фенотипическому проявлению этого маркера. Для трансформации E. atroseptica P177 в донорский штамм в его клетки была введена плазмида pR471a::Tn9L, и далее проведены скрещивания с полиауксотрофными реципиентными бактериями E. atroseptica. Анализ частот переноса, сцепления маркеров и результатов трехточечных скрещиваний позволил определить, что маркер Kmr располагается между маркерами aro-7 и gly-2.

Опираясь на эти данные и, зная расстояние между маркерами his-1 и gly-2, определили, что расстояние между маркерами Kmr и gly-2 составляет 5,9 минуты.

Учитывая, что gly-2 расположен на 132,7 минуте генетической карты хромосомы E. atroseptica 3-2 (Николайчик Е. А., Песнякевич А. Г., 1995), маркер Kmr и, следовательно, гены kduD и kduI расположены на 126,8 минуте карты, на расстоянии 8,8 минут от маркера trp. Эти данные соотносятся с данными о локализации кластера генов ogl, kduI и kduD на хромосоме E. chrysanthemi 3937, который располагается на расстоянии 10 минут генетической карты от маркера trp (Hugouvieux-Cotte-Pattat N. et al., 1996).

Фенотипическая характеристика KduD-мутанта E. atroseptica Р Эволюционная близость бактерий E. atroseptica и E. chrysanthemi послужили основанием для проведения сравнительного исследования продукции факторов патогенности и вирулентности у мутантных по гену kduD бактерий этих видов (табл. 1). У бактерий E. atroseptica JN42 при культивировании в присутствии полипектата натрия происходит индукция продукции факторов патогенности и вирулентности, тогда как у штамма E. atroseptica P177 индуцирующий эффект полипектата натрия выражен в гораздо меньшей степени. В тоже время у бактерий E. chrysanthemi протеазная активность практически не изменяется в присутствии пектиновых веществ, целлюлазная активность у мутанта и у бактерий дикого типа возрастает приблизительно в 2 раза, но индукция пектатлиазной активности у мутантных по гену kduD бактерий (штамм А691) выражена в наибольшей степени.

Таблица Продукция факторов патогенности и вирулентности бактериями E. atroseptica и E. chrysanthemi Активностьв (Е/мг белка) Среда куль Штамм тивирования пектатлиазы целлюлазы протеазы а E. atroseptica Среда А 0,08±0,01 24,3±2,7 0,32±0, + б JN42 (kduD ) Среда А + ПН 1,14±0,1 261,7±27,3 1,48±0, Среда А 0,08±0,01 21,2±2,2 0,29±0, E. atroseptica – Р177 (kduD ) Среда + ПН 0,17±0,02 102,4±11,6 0,62±0, Среда А 0,29±0,03 221,7±21,8 0,42±0, E. chrysanthemi + A350 (kduD ) Среда А + ПН 7,3±0,8 489,2±50,6 0,48±0, E. chrysanthemi Среда А 0,29±0,03 223,2±23,7 0,43±0, – A691 (kduD ) Среда А + ПН 88,4±9,2 516±53,8 0,47±0, а Примечания: – использована среда А с дрожжевым экстрактом и казеином;

б – в среду добавлен полипектат натрия в концентрации 0,3%;

в – активности определяли в культуральной жидкости.

Подобно бактериям E. atroseptica Р177, клетки штамма E. chrysanthemi А характеризуются наличием KduI-активности, более высокими уровнями активностей Ogl и KdgK по сравнению с клетками бактерий дикого типа и отсутствием KduD-активности. Кроме того, при выращивании штамма E. chrysanthemi А691 в присутствии полипектата натрия в его культуральной жидкости происходит накопление ДК1 и ДК2 в тех же соотношениях, что и у штамма E. atroseptica P177.

Гиперпродукция ферментов пектолитичеcкого комплекса у KduD-мутантов E. chrysanthemi согласуется с полученными ранее Nasser W. и соавт. (1992, 1994) данными, согласно которым промежуточные метаболиты утилизации НДК посредством связывания с белком-репрессором KdgR активируют транскрипцию генов пектатлиаз. В то же время, у KduD-мутанта E. atroseptica при накоплении таких же количеств этих метаболитов не только не наблюдается сверхэкспрессии, но даже происходит снижение внеклеточных ферментативных активностей по сравнению с бактериями дикого типа. С целью выяснения механизмов этих различий далее оценивали влияние метаболитов ДК2 и КДГ на продукцию факторов патогенности и вирулентности у исследуемых бактерий.

Изучение влияния ДК2 и КДГ на продукцию факторов вирулентности и патогенности бактериями рода Erwinia В ходе проведенных исследований был разработан оригинальный способ получения ДК2 и КДГ с использованием в качестве источника ДК2 культуральной жидкости штамма E. atroseptica P177, выращенного в среде А с полипектатом натрия (0,5%).

Влияние ДК2 изучали на продукцию ферментов пекто-, целлюло- и протеолитического комплексов (рис. 3A, 3B, 3C), а также ферментов внутриклеточной утилизации пектиновых веществ (рис. 3D) у анализируемых видов бактерий.

3,5 100 Пектолитическая активность Пектолитическая активность E. chrysanthemi (E/мг белка) Активность (E/мг белка) E. atroseptica (E/мг белка) 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 0 0 50 100 150 200 250 0 50 100 150 200 А B Концентрация ДК2 (мкг/мл) Концентрация ДК2 (мкг/мл) 2, Активность (E/мг белка) Активность (E/мг белка) 1, 1, 0, 0, 0 50 100 150 200 0 50 100 150 200 C D Концентрация ДК2 (мкг/мл) Концентрация ДК2 (мкг/мл) Рис. 3. Влияние концентраций ДК2 на продукцию пектатлиаз (A) целлюлаз (B), протеаз (C) и Ogl (D) у kduD-штаммов E. atroseptica Р177 ( ), E. chrysanthemi + А691 ( ) и kduD -штаммов E. atroseptica JN42 ( ) и E. chrysanthemi А ( ).

У штамма E. atroseptica JN42 при повышении концентрации ДК2 в среде культивирования имеет место постоянное возрастание активностей пектатлиаз, целлюлаз и протеаз, тогда как у KduD-мутанта E. atroseptica P177 низкие концентрации (до 10 мкг/мл) метаболита вызывают гипериндукцию синтеза этих ферментов, но по мере увеличения концентраций ДК2 наблюдается снижение их продукции. У штаммов мутантного и дикого типов E. chrysanthemi присутствие ДК2 в среде культивирования не влияет на продукцию протеаз и одинаково изменяет продукцию целлюлаз. Однако продукция пектатлиаз у штамма E. chrysanthemi А691 гипериндуцирована по сравнению с бактериями E. chrysanthemi А350 при всех использованных в экспериментах концентрациях ДК2. Измерение активностей Ogl, KdgK и KduD (активностей продуктов репортерных генов для штаммов P177 и А691) в присутствии ДК2 показало, что между E. atroseptica и E. chrysanthemi не имеется существенных различий.

KduD-мутанты обоих видов характеризуются резким усилением по сравнению с бактериями дикого типа продукции ферментов внутриклеточной утилизации пектиновых веществ. Репрессирующего действия высоких концентраций ДК2 не проявляется ни у одного вида бактерий.

КДГ, в отличие от ДК2 являющийся метаболизируемым субстратом для KduD-мутантов, оказывает сходное влияние на мутантные и немутантные бактерии двух видов. Как и ДК2, КДГ стимулирует проявление всех трех экзоферментных активностей у бактерий E. atroseptica, не оказывает влияния на продукцию внеклеточных протеаз у E. chrysanthemi и индуцирует активности генов ogl, kduD и kdgK у бактерий обоих видов.

Таким образом, у бактерий E. atroseptica и E. chrysanthemi выявлены различия в регуляции экспрессии генов вирулентности и патогенности метаболитами ДК2 и КДГ. Известно, что регуляторный эффект этих метаболитов у E. chrysanthemi реализуется через белок-репрессор KdgR (Nasser W. и соавт., 1992, 1994). Поэтому для выяснения возможного участия аналогичного белка в регуляции биосинтеза факторов вирулентности и патогенности у E. atroseptica, у бактерий этого вида были направлено получены мутации в гене kdgR.

Получение мутантных по гену kdgR бактерий E. atroseptica С помощью сконструированных праймеров методом ПЦР были амплифицированы два фрагмента хромосомы E. atroseptica, размером 0,95 т. п. н.

и 2,2 т. п. н., клонирование которых в вектор pBluescriptIISK(-) позволило получить плазмиды pKDGR1 и pKDGR2. Секвенирование фрагмента размером 0,95 т. п. н. и сравнение полученной последовательности с имеющимися в базах данных выявляет 99% гомологии нуклеотидной последовательности с kdgR-геном E. carotovora F148, 96% – с kdgR-геном E. atroseptica SCRI27 и 82% – с kdgR-геном E. chrysanthemi EC3937. Соответствующий этому гену белок входит в IclR семейство транскрипционных регуляторов и гомологичен KdgR-белку E. carotovora F148 на 99%, KdgR-белку E. atroseptica SCRI27 – на 99%, KdgR-белку E. chrysanthemi EC3937 – на 95%. В плазмиде pKDGR2 был клонирован более протяженный фрагмент хромосомы E. atroseptica, содержащий кластер генов ogl-kdgR, что дает возможность проведения эффективной рекомбинационной замены интактного гена kdgR на инактивированный. Для этого в область гена kdgR плазмиды pKDGR2 производили инсерцию кассеты антибиотикорезистентности “омега” из плазмиды pUT::mini-Tn5Sm/Sp. Фрагмент полученной плазмиды pKDGR3, содержащий инактивированный ген kdgR, был клонирован в векторе pJQ200SK с образованием плазмиды pKDGR4, которую затем вводили в штаммы E. atroseptica JN42 и E. atroseptica P177. Селекцию рекомбинантов, утративших плазмидную ДНК, проводили на средах с сахарозой по признакам стрептомицинрезистентности и гентамицинчувствительности. У полученных таким образом kdgR-мутантов E. atroseptica MV204 (производный от E. atroseptica JN42) и E. atroseptica MV265 (производный от E. atroseptica P177) подтверждали наличие вставки в составе хромосомного гена kdgR методом ПЦР.

Влияние мутации в гене kdgR на продукцию факторов вирулентности и патогенности у бактерий E. atroseptica и E. chrysanthemi У kdgR-мутанта E. chrysanthemi A1077 активности пектатлиаз (рис. 4А) и целлюлаз значительно выше, чем у немутантных по гену kdgR бактерий, но уровень продукции протеаз не изменяется по сравнению с соответствующими уровнями штаммов А350 и A691, что указывает на отсутствие у бактерий этого вида влияния белка KdgR на продукцию этого фактора патогенности и вирулентности. В то же время мутантные по гену kdgR штаммы E. atroseptica MV204 и E. atroseptica MV265 характеризуются высокими базальными уровнями продукции пектатлиаз, целлюлаз и протеаз, значительно превышающими базальные уровни этих активностей у бактерий E. atroseptica JN42 и E. atroseptica Р177. Кроме того, если у бактерий E. atroseptica, не имеющих мутации в гене kdgR, пектиновые вещества индуцируют продукцию этих ферментов, у бактерий E. atroseptica MV265, не утилизирующих ДК2, присутствие полипектата в среде культивирования приводит к снижению уровня продукции факторов вирулентности и патогенности.

100 6 0 мкг/мл с индуктором 80 5 мкг/мл без индуктора 60 25 мкг/мл 40 125 мкг/мл Активность (E/мг белка) Активность (E/мг белка) 8 6 4 2 0 A JN42 P177 MV204 MV B P JN A A V V A M M Рис. 4. (A) Влияние мутации в гене kdgR на внеклеточную пектолитическую активность. (B) Влияние концентраций ДК2 в среде культивирования на продукцию внеклеточных пектатлиаз бактериями E. atroseptica.

Изучение влияния ДК2 на синтез пектатлиаз (рис. 4B), целлюлаз и протеаз у исследуемых бактерий показывает, что низкие концентрации ДК2 (5 мкг/мл) не влияют на продукцию этих ферментов kdgR-мутантом E. atroseptica MV265, но при концентрациях выше 25 мкг/мл проявляется эффект репрессии их синтеза и секреции. Таким образом, у бактерий E. atroseptica существует зависимость продукции факторов патогенности и вирулентности как от действующей через белок KdgR регуляторной системы, так и от дополнительной системы регуляции, реагирующей на промежуточные продукты утилизации пектиновых веществ.

Влияние мутаций в генах kduD и kdgR на взаимодействие бактерий Erwinia с растением-хозяином Для выяснения влияния мутаций в генах kduD и kdgR на продукцию факторов патогенности и вирулентности в условиях in planta бактерии вводили в ткани клубней и активно вегетирующих стеблей картофеля. Результаты экспериментов (рис. 5) показывают, что kduD-мутант E. atroseptica Р177 обладает существенно сниженной вирулентностью, тогда как kdgR-мутант E. atroseptica MV204 вызывает симптомы “черной ножки” быстрее, чем исходные бактерии E. atroseptica JN42.

Тем не менее, совмещение этих мутаций в одном геноме (штамм MV265) существенно снижает вирулентные свойства. В то же время у бактерий E. chrysanthemi мутации в генах kduD (штамм А691) и kdgR (штамм А1077) практически не сказываются на способности мацерировать ткань живого растения.

3, Масса мацерированной ткани 2, 2, 1, 1, 0, 0, JN42 P177 MV204 MV A A M M A B P JN A V V Рис. 5. (A) Поражение вегетирующих растений картофеля штаммами E. atroseptica (B) Количество мацерированной ткани (в граммах), образуемое бактериями E. atroseptica и E. chrysanthemi при заражении клубней картофеля.

Это позволяет сделать вывод о том, что выявленные в ходе исследований in vitro различия в механизмах регуляции факторов патогенности и вирулентности у бактерий изучаемых видов проявляются и в ходе взаимодействия бактерий с растением, а картина проявления процесса патогенеза определяется регуляторными системами, которые различаются у разных видов Erwinia.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 1. Ген kduD в хромосоме бактерий E. atroseptica 3-2 тесно сцеплен с геном kduI и локализован на 127 минуте генетической карты. Его нуклеотидная последовательность имеет 82% гомологии с kduD-геном бактерий E. chrysanthemi EC3937. Кодируемый kduD-геном E. atroseptica 3- полипептид представлен 253 аминокислотами, на 90% идентичным и на 96% гомологичным по аминокислотной последовательности KduD-белку бактерий E. chrysanthemi EC3937 [4, 6-8, 11, 12, 15, 16].

2. Промежуточный метаболит внутриклеточного пути утилизации пектиновых веществ 2,5-дикето-3-дезоксиглюконат (ДК2) оказывает у бактерий E. atroseptica как индуцирующий (при низких концентрациях), так и репрессирующий эффект (при высоких концентрациях) на продукцию факторов патогенности и вирулентности. У мутантных по гену kduD бактерий E. atroseptica и E. chrysanthemi установлена внеклеточная локализация ДК2 [1, 2, 5, 6, 9-15].

3. Ген kdgR бактерий E. atroseptica 3-2 на 99% гомологичен по нуклеотидной последовательности kdgR-гену E. carotovora F148, на 96% – kdgR-гену E. atroseptica SCRI27 и на 82% – kdgR-гену E. chrysanthemi EC3937.

Соответствующий этому гену белок входит в IclR семейство транскрипционных регуляторов и гомологичен KdgR-белку E. carotovora F148 на 99%, KdgR-белку E. atroseptica SCRI27 – на 99%, KdgR-белку E. chrysanthemi EC3937 – на 95% [15-17].

4. У бактерий E. atroseptica и E. chrysanthemi белок-репрессор KdgR контролирует экспрессию генов внутриклеточного пути утилизации пектиновых веществ и продукцию ферментов пекто- и целюлолитического комплексов. Однако у бактерий E. atroseptica через KdgR-систему регулируется также продукция протеаз, что не наблюдается у бактерий E. chrysanthemi [3, 5, 16-18].

5. У бактерий E. atroseptica, в отличие от бактерий E. chrysanthemi, существует дополнительная система регуляции продукции основных факторов патогенности и вирулентности, реагирующая на продукты деградации пектиновых веществ [1, 3, 5, 6, 12-14, 16, 17].

6. Влияние дополнительной системы регуляции по своему проявлению отлично от регуляторного влияния, осуществляемого KdgR-системой, и проявляется как in vitro при продукции факторов патогенности и вирулентности, так и in planta на уровне взаимодействия патогена с растением-хозяином [5, 16, 17].

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в научных журналах:

1. Nikolaichik E.A., Myamin V.E., Limorova I.M., Ignatenko E.I., Pesnyakevich A.G., Evtushenkov A.N. Detection and characterization of Erwinia carotovora subsp.

atroseptica genes participating in the interaction with potato host // Beitrage zur Zuchtungforschung. – 2002. – 8. Jahrgang, Heft 3. – P. 20–23.

2. Мямин В.Е., Песнякевич А.Г., Прокулевич В.А. Получение очищенных метаболитов пути утилизации пектиновых веществ // Вестн. Белорус. ун-та. Cер. 2.

– 2003. – №1. – C. 47–51.

3. Скобляков С.А., Мямин В.Е., Лагоненко А.Л., Песнякевич А.Г., Николайчик Е.А. Влияние мутаций в генах pelW и kdgR на продукцию пектатлиаз у Erwinia carotovora subsp. atroseptica // Вестн. Белорус. ун-та. Cер. 2. – 2004. – №2. – C. 40– 44.

4. Мямин В.Е., Песнякевич А.Г., Николайчик Е.А., Прокулевич В.А.

Генетическая регуляция факторов патогенности и вирулентности у бактерий Erwinia carotovora subsp. atroseptica. Идентификация гена kduD // Генетика. – 2004. – Т.40, №9. – C. 1187–1193.

5. Мямин В.Е., Песнякевич А.Г., Прокулевич В.А. Генетическая регуляция факторов патогенности и вирулентности у бактерий Erwinia carotovora subsp.

atroseptica. Фенотипическая характеристика мутантных по гену kduD бактерий // Генетика. – 2004. – Т.40, №9. – C. 1194–1199.

Статьи в сборниках материалов конференций:

6. Песнякевич А.Г., Анкудо Т.М., Доронина В.А., Мямин В.Е., Приступук Л.М.

Применение транспозонов для изучения фитопатогенных бактерий Erwinia // Достижения современной биологии и биологическое образование: Тр. науч. конф.

/ Бел. гос. ун-т. –Минск: БГУ, 1997. – С. 130–137.

7. Мямин В.Е., Песнякевич А.Г., Прокулевич В.А. Локализация гена kduD на генетической карте хромосомы бактерий Erwinia carotovora subsp. atroseptica 3-2 // Достижения современной биологии и биологическое образование: Тр. 2-й Междунар. научно-практической конф., Минск, 29-30 нояб. 2002 г. / Бел. гос. ун-т.

– Минск: Издательский центр БГУ, 2002. – С. 177–182.

Тезисы докладов и выступлений на конференциях:

8. Мямин В.Е., Приступук Л.М. Изучение некоторых свойств мутантов Erwinia carotovora subsp. atroseptica 3-2, связанных с взаимодействием с растением хозяином // 53 науч. конф. студентов Белгосуниверситета: Сб. науч. cт. / М-во образования и науки Респ. Беларусь. Бел. гос. ун-т. – Минск: БГУ, 1996. – С. 30– 33.

9. Мямин В.Е., Приступук Л.М. Использование транспозонов серии mini-Tn для изучения фитопатогенных свойств возбудителя черной ножки картофеля // Актуальные проблемы фитовирусологии и защиты растений: Материалы науч.

конф., Прилуки, 16 июня 1997 г. / М-во сельского хозяйства и продовольствия Респ. Беларусь. Акад. аграр. наук Респ. Беларусь. Белорус. науч.-исслед. ин-т защиты растений. Белорус. фитопатологическое общество. – Минск: ПКФ Экаунт, 1997. – С. 94–95.

10. Мямин В.Е. Характеристика мутантных бактерий Erwinia carotovora subsp.

atroseptica 3-2 P177 // VII съезд белорусского общества генетиков и селекционеров: Тез. докл., Горки, 16-19 июля 1997 г. / Отд. Биол. Наук. НАН Беларуси. Общественное Объединение «Белорусское общество генетиков и селекционеров». Ин-т генетики и цитологии НАН Беларуси. Белорус. с.-х. акад.

Компания «Соя-Север». – Минск: ИООО Право и экономика, 1997. – С. 86–87.

11. Мямин В.Е., Песнякевич А.Г. Влияние промежуточных продуктов деградации пектина на регуляцию факторов патогенности бактерий Erwinia // Проблемы микробиологии и биотехнологии: Материалы междунар. конф., Минск, 25-27 нояб. 1998 г. / НАН Беларуси. Концерн «Белбиофарм». Отд. биол. наук НАН Беларуси. Науч. совет по проблемам биотехнологии. Белорус.

микробиологическое общество. Ин-т микробиологии. – Минск, 1998. – С. 67-68.

12. Myamin V.E., Pesnyakevich A.G. Characterization of the kduD mutant of Erwinia carotovora subsp. atroseptica // 9th International congress on molecular plant microbe interactions:

Abstract

book., Netherlands, Amsterdam, July 25-30, 1999 / Society for general microbiology. Federation of european microbiological societies. – Amsterdam, 1999. – P. 55.

13. Myamin V.E., Pesnyakevich A.G. Regulation of the production of major virulence factors in bacterium Erwinia spp. by pectate catabolic products // Conference on genetics and molecular biology: Abstract book., Ukraine, Lviv, April 20-22, 2000 / Ivan Franco national university. Chair of genetic and biotechnology. Chair of biochemistry. Student scientific society «Genetic club». – Lviv, 2000. – P. 63.

14. Мямин В.Е., Песнякевич А.Г. Различный эффект мутаций в гене kduD на экспрессию факторов патогенности у бактерий Erwinia carotovora subsp.

atroseptica и Erwinia chrysanthemi // Микробиология и биотехнология на рубеже XXI столетия: Материалы междунар. конф., Минск, 1-2 июня 2000 г. / НАН Беларуси. Отд. биол. наук НАН Беларуси. Науч. совет по проблемам биотехнологии. Белорус. микробиологическое общество. Ин-т микробиологии.

Концерн «Белбиофарм». Бел. гос. ун-т. – Минск: ЗАО Пропилеи, 2000. – С. 64–65.

15. Мямин В.Е., Песнякевич А.Г. Различия в регуляции факторов вирулентности у бактерий Erwinia chrysanthemi и Erwinia carotovora subsp.

atroseptica // Молекулярные механизмы генетических процессов и биотехнология:

Сб. тр. междунар. симпозиума., Москва, 18-21 нояб. 2001 г., Минск, 22-24 нояб.

2001 г. / Акад. наук. России. Ин-т общей генетики им. Н.И. Вавилова. М-во промышленности, науки и технологий Российской Федерации. Отд. биол. наук НАН Беларуси. Ин-т генетики и цитологии НАН Беларуси. Общественное Объединение «Белорусское общество генетиков и селекционеров». – М.:

Полиграф-ресурсы, 2001. – С. 117–118.

16. Мямин В.Е., Песнякевич А.Г. Выяснение механизма регуляции факторов патогенности Erwinia carotovora subsp. atroseptica продуктами деградации пектиновых веществ // Микробиология и биотехнология XXI столетия Материалы междунар. конф., Минск, 22-24 мая 2002 г. / НАН Беларуси. Отд. биол.

наук НАН Беларуси. Науч. совет по проблемам биотехнологии. Ин-т микробиологии. Концерн «Белбиофарм». – Минск, 2002. – С. 141–142.

17. Мямин В.Е., Песнякевич А.Г. Роль репрессора KdgR в регуляции продукции факторов вирулентности у бактерий Erwinia carotovora subsp. atroseptica и Erwinia chrysanthemi // Генетика и селекция в XXI веке: Материалы VIII съезда генетиков и селекционеров Республики Беларусь., Минск, 23-25 июля 2002 г. / НАН Беларуси. Отд. биол. наук НАН Беларуси. Ин-т генетики и цитологии НАН Беларуси. Общественное Объединение «Белорусское общество генетиков и селекционеров». Бел. гос. ун-т. – Минск, ИгиЦ НАНБ, 2002. – С. 249–251.

18. Орлова О.М., Мямин В.Е. Особенности проявления регуляторного гена kdgREca в клетках бактерий рода Erwinia // Новые технологии в химической промышленности: Материалы междунар. науч.-технич. конф., Минск, 20-22 нояб.

2002 г. / М-во образования Респ. Беларусь. Бел. гос. технологич. ун-т. – Минск, 2002. – С. 164–166.

РЕЗЮМЕ Мямин Владислав Евгеньевич Генетическая регуляция патогенности и вирулентности возбудителя “черной ножки” картофеля Erwinia carotovora subsp. atroseptica Ключевые слова: фитопатогенность, транспозоновый мутагенез, Erwinia, катаболизм пектинов, факторы патогенности и вирулентности, регуляторные мутанты, индукция, репрессия.

Объект исследования: бактерии Erwinia carotovora subsp. atroseptica и Erwinia chrysanthemi.

Предмет исследования: особенности генетической регуляции факторов патогенности и вирулентности у бактерий Erwinia carotovora subsp. atroseptica Цель работы: идентификация генетических детерминант бактерий Erwinia carotovora subsp. atroseptica, участвующих во взаимодействии фитопатогена с растением-хозяином, и выяснение их роли в таком взаимодействии.

Методы исследования: микробиологические, биохимические, генетические, молекулярно-биологические, фитопатологические.

Полученные результаты и их новизна. Впервые охарактеризован ген 2,5-дикето-3-дезоксиглюконатдегидрогеназы (kduD) бактерий E. atroseptica 3-2 и показано, что он тесно сцеплен с геном kduI и локализован на 127 минуте генетической карты. Его нуклеотидная последовательность имеет 82% гомологии с kduD-геном бактерий E. chrysanthemi EC3937. У бактерий E. atroseptica, в отличие от бактерий E. chrysanthemi, продукты деградации пектиновых веществ влияют не только на продукцию ферментов пекто- и целлюлолитических комплексов, но и на уровень внеклеточной протеолитической активности.

Выявлен репрессирующий эффект избыточных количеств 2,5-дикето-3 дезоксиглюконата (ДК2) на продукцию факторов патогенности и вирулентности возбудителем “черной ножки” и показана внеклеточная локализация ДК2 у мутантных по гену kduD бактерий E. atroseptica и E. chrysanthemi. Влияние продуктов деградации пектиновых веществ осуществляется не только через высокогомологичный для обоих видов белок-репрессор KdgR, но и через иную, отсутствующую у E. chrysanthemi, дополнительную регуляторную систему.

Степень использования: результаты могут использоваться при планировании исследований с целью разработки мер борьбы с бактериями E. atroseptica и для определения стратегии создания устойчивых к этому патогену трансгенных растений.

Область применения: фитопатология, генетика микроорганизмов, генетическая инженерия растений, защита растений.

РЭЗЮМЕ Мямін Уладзіслаў Яўгеньевіч Генетычная рэгуляцыя патагеннасці і вірулентнасці ўзбуджальніка “чорнай ножкі” бульбы Erwinia carotovora subsp. atroseptica Ключавыя словы: фітапатагеннасць, транспазонавы мутагенэз, Erwinia, катабалізм пектынаў, фактары патагеннасці і вірулентнасці, рэгуляторныя мутанты, індукцыя, рэпрэсія.

Аб’ект даследавання: бактэрыі Erwinia carotovora subsp. atroseptica і Erwinia chrysanthemi.

Прадмет даследавання: асаблівасці генетычнай рэгуляцыі фактараў патагеннасці і вірулентнасці ў бактэрый Erwinia carotovora subsp. atroseptica.

Мэта работы: идэнтыфікацыя генетычных дэтэрмінантаў бактэрый Erwinia carotovora subsp. atroseptica, прымаючых удзел ва ўзаемадзеянні фітапатагена з раслінай-гаспадаром, і высвятленне іх ролі ў такім узаемадзеянні.

Метады даследавання: мікрабіялагічныя, біяхімічныя, генетычныя, малекулярна-біялагічныя, фітапаталагічныя.

Атрыманыя вынікі і іх навізна. Упершыню ахарактарызаваны ген 2,5-дыкета-3-дэзоксіглюканатдэгідрагеназы (kduD) бактэрый E. atroseptica 3-2 і паказана, што ен цесна зчэплены з генам kduI і лакалізаваны на 127 хвіліне генетычнай карты. Ягоная нуклеатыдная паслядоўнасць мае 82% гамалогіі з kduD-генам бактэрый E. chrysanthemi EC3937. У бактэрый E. atroseptica, у адрозненне ад бактэрый E. chrysanthemi, прадукты дэградацыі пектынавых рэчываў уплываюць не толькі на прадукцыю ферментаў пекта- і цэллюлалітычных комплексаў, але і на ўзровень пазаклетачнай пратэалітычнай актыўнасці.

Высветлены рэпрэсуючы эфект павышаных канцэнтрацый 2,5-дыкета-3 дэзоксіглюканата (ДК2) на прадукцыю фактараў патагеннасці і вірулентнасці ўзбуджальнікам “чорнай ножкі” і паказана пазаклетачная лакалізацыя ДК2 у мутантных па гену kduD бактэрый E. atroseptica і E. chrysanthemi. Уплыў прадуктаў дэградацыі пектынавых рэчываў ажыццяўляецца не толькі праз высокагамалагічны для абодзьвух відаў бялок-рэпрэсар KdgR, але і праз іншую, дадатковую рэгуляторную сістэму, якая адсутнічае ў E. chrysanthemi.

Ступень выкарыстання: вынікі магчыма выкарыстоўваць пры планаванні даследаванняў з мэтай распрацоукі мераў барацьбы з бактэрыямі E. atroseptica і для вызначэння стратэгіі стварэння ўстойлівых к гэтаму патагену трансгенных раслін.

Галіна ўжывання: фітапаталогія, генетыка мікраарганізмаў, генетычная інжынерыя раслін, ахова раслін.

SUMMARY Myamin Vladislav Evgenievich Genetic regulation of pathogenicity and virulence of Erwinia carotovora subsp.

atroseptica, a aetiological agent of potato blackleg Key words: phytopathogenicity, transposon mutagenesis, Erwinia, pectin catabolism, factors of pathogenicity and virulence, regulatory mutants, induction, repression.

Object of research: Erwinia carotovora subsp. atroseptica and Erwinia chrysanthemi bacteria.

Subject of research: principles of genetic regulation of virulence and pathogenicity factors in Erwinia carotovora subsp. atroseptica.

Aim of work: identification of genetic determinants of Erwinia carotovora subsp.

atroseptica, participating in interaction of phytopathogen with host plant, elucidating the role of these determinants in such interaction.

Research methods: microbiological, biochemical, genetic, molecular, phytopathological.

Obtained results and their novelty. The kduD gene coding for 2,5-diketo-3 deoxygluconate oxidoreductase of E. atroseptica 3-2 was characterized for the first time. It was shown that this gene is closely linked with the kduI gene and is located at 127 min of genetic map. Its nucleotide sequence has 82% homology with the kduD gene of E. chrysanthemi EC3937. Contrary to the situation in E. chrysanthemi, in E. atroseptica products of pectin degradation influence not only the production of pectolytic and cellulolytic enzyme complexes, but also the level of extracellular proteolytic activity. The repressory effect of excessive quantities of 2,5-diketo-3 deoxygluconate (DKII) on the production of pathogenicity and virulence factors was observed for the aetiological agent of potato blackleg. Extracellular localization of DKII in kduD mutants of E. atroseptica and E. chrysanthemi was demonstrated. The effect of pectin degradation products occurs not only through the KdgR repressor protein common for both species, but also through another additional system, missing from E. chrysanthemi.

Degree of application: the results could be used in planning research aimed at the development of protective measures against E. atroseptica and also to develop a strategy of creation of resistant transgenic plants for this pathogen.

Area of application: phytopathology, bacterial genetics, plant genetic engineering, crop protection.