Государственное научное учреждение институт микробиологии удк 579.841.11:579.2+577.18:579.222.7 феклистова ирина николаевна синтез антибиотиков ароматической природы у бактерий pseudomonas aurantiaca

ГОСУДАРСТВЕННОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

«ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ»

УДК 579.841.11:579.2+577.18:579.222.7

ФЕКЛИСТОВА ИРИНА НИКОЛАЕВНА

СИНТЕЗ АНТИБИОТИКОВ АРОМАТИЧЕСКОЙ ПРИРОДЫ

У БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS AURANTIACA B-162

03.00.07 – микробиология

Автореферат диссертации

на соискание ученой степени кандидата биологических наук Минск – 2006 Работа выполнена в Белорусском государственном университете Научный руководитель доктор биологических наук, доцент Максимова Н.П., заведующая кафедрой генетики биологического факультета Белорусского государственного университета Официальные оппоненты: доктор биологических наук, ведущий науч ный сотрудник Алещенкова З.М., заведующая лабораторией взаимоотношений микроорганизмов почвы и высших растений ГНУ «Институт микробиологии НАН Беларуси»

кандидат химических наук, доцент Бурдь В.Н., заведующий кафедрой химии и химической технологии УО «Гродненский государственный университет имени Янки Купалы»

Оппонирующая организация: УО «Белорусский государственный технологический университет»

Защита состоится «15» декабря 2006 г. в 14.00 часов на заседании совета по защите диссертаций Д 01.34.01 в ГНУ «Институт микробиологии НАН Беларуси» по адресу: 220141, г. Минск, ул. акад. В.Ф. Купревича, 2.

Тел.: (017)263-50-51, факс: (017)264-47-66, e-mail: [email protected] C диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ «Институт микробиологии НАН Беларуси»

Автореферат разослан « » ноября 2006 года Ученый секретарь совета по защите диссертаций кандидат биологических наук Т.С. Гвоздкова ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы диссертации. Одной из актуальных биотехнологических задач в настоящее время является создание эффективных и безопасных биологиче ских средств защиты растений для борьбы с заболеваниями сельскохозяйственных культур в процессе их возделывания. Необходимость максимальной замены в Рес публике Беларусь химических препаратов биологическими не вызывает сегодня со мнений и диктуется рядом экологических и экономических причин.

Наиболее интересными в этом плане являются биопестицидные препараты на основе живых культур микроорганизмов, способных заселять ризосферу и филосфе ру растений, размножаться в ходе их вегетации и обеспечивать пролонгированную защиту от заражения фитопатогенами. Кроме того, бактерии-антагонисты могут вы делять в окружающую среду вещества, стимулирующие рост растений, а также ин дуцировать у них системную устойчивость к возбудителям заболеваний, что в сово купности способствует повышению урожайности сельскохозяйственных культур.

Особенно перспективными в качестве основы для создания биопестицидных препаратов являются бактерии рода Pseudomonas, синтезирующие, как известно, свыше 300 наименований различных антимикробных соединений, часть из которых – антибиотики ароматической природы, получившие известность благодаря способно сти подавлять развитие возбудителей таких опасных заболеваний сельскохозяйст венных растений, как гнили корневой шейки зерновых и плодовых культур, сосуди стое и паренхиматозное поражение картофеля и капусты, ожоги листьев, пятнистость плодов, бактериальный рак, некрозы коры и т.д. (Cook e.a., 1996;

Fenton e.a., 1992;

Whipps, 2001 и др.). Кроме того, ризосферные бактерии этого рода выделяют в окру жающую среду ряд соединений (индолил-3-уксусную кислоту, этилен, аммиак, рам нолипиды и др.), оказывающих позитивное действие на растения (Боронин, 1998;

Beyeler e.a., 1999;

Whitelaw, 2000 и др.).

Новым направлением работ, связанных с созданием высокоэффективных био пестицидных препаратов на основе ризосферных бактерий Pseudomonas, является использование штаммов, антимикробная активность которых искусственно повыше на путем внесения генетических изменений в регуляторные механизмы клеток.

В свою очередь, необходимым условием целенаправленного конструирования штам мов-продуцентов антибиотиков является детальный анализ синтезируемых бакте риями антимикробных соединений и исследование механизмов регуляции их синтеза.

Связь работы с крупными научными программами, темами. Диссертаци онная работа выполнялась в рамках ГПОФИ «Биотехнология» по теме «Разработка микробных препаратов для защиты растений на основе природных высокоактивных штаммов», 2001–2005 г.г. (№ ГР 20012712), а также Государственной программы «Разработка и использование генно-инженерных биотехнологий в интересах сельско го хозяйства и медицины» по теме «Разработать подходы и осуществить конструиро вание новых штаммов-продуцентов антибиотиков широкого спектра действия на ос нове бактерий и создать новые эффективные средства защиты растений от заболева ний различной этиологии», 2003–2006 г.г. (№ ГР 20031377).

Цель и задачи исследования. Целью диссертационной работы являлась иден тификация антибиотиков ароматической природы и исследование механизмов их синтеза у ризосферных бактерий P. aurantiaca В-162, получение штаммов продуцентов, способных к сверхсинтезу указанных соединений, а также разработка приемов их использования для защиты сельскохозяйственных растений от болезней.

В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:

1. Осуществить скрининг штаммов ризосферных бактерий Pseudomonas по критерию высокой активности ключевого фермента ароматического пути – ДАГФ синтазы, способности к синтезу ряда антибиотиков ароматической природы, а также проявлению антимикробной активности в отношении различных фитопатогенов.

Отобрать штамм, пригодный для создания на его основе нового биопестицидного препарата для защиты растений.

2. Идентифицировать антибиотики ароматической природы, образуемые бакте риями отобранного штамма (P. aurantiaca В-162), и оптимизировать условия их син теза.

3. Изучить у бактерий P. aurantiaca В-162 механизмы регуляции синтеза анти биотиков феназинового ряда и пирролнитрина на уровне основных этапов аромати ческого пути.

4. Выявить у бактерий P. aurantiaca В-162 quorum-sensing (QS) систему регу ляции синтеза вторичных метаболитов и установить ее роль в синтезе антибиотиков феназинового ряда и пирролнитрина.

5. Получить мутанты бактерий P. aurantiaca В-162, способные к сверхпродук ции антибиотиков феназинового ряда, и установить природу этого явления.

6. Разработать подходы к использованию бактерий P. aurantiaca В-162 для за щиты растений от фитопатогенных микроорганизмов.

Объект и предмет исследования. Объектом исследования служил штамм бак терий P. aurantiaca B-162, полученный из коллекции Института биохимии и физио логии микроорганизмов РАН (г. Пущино, Российская Федерация), и его регулятор ные мутанты;

предмет исследования – синтез антибиотиков ароматической природы у данных бактерий.

Методология и методы проведенного исследования. Изложенные в диссер тационной работе результаты получены с использованием современных микробиоло гических, генетических, биохимических и физико-химических методов исследования (способы культивирования микроорганизмов, определение антимикробной активно сти, химический мутагенез, ферментативный анализ, количественный и качествен ный анализ микробных метаболитов, тонкослойная и высокоэффективная жидкост ная хроматография, спектрофотометрия, электрофорез, ПЦР), а также статистическая обработка данных.

Научная новизна и значимость полученных результатов. Отобран штамм P. aurantiaca B-162, клетки которого обладают более высокой, чем у других извест ных бактерий рода Pseudomonas, активностью ДАГФ-синтазы и синтезируют ряд ан тибиотиков ароматического ряда: феназиновые антибиотики, пирролнитрин, пиолю теорин и 2,4-диацетилфлороглюцинол.

Установлено, что феназиновый комплекс у бактерий P. aurantiaca B-162 пред ставлен феназином (C12H8N2), 1-оксифеназином (C12H7N2OH) и их общим предшест венником феназин-1,6-дикарбоксилатом (C14H8N2О4). Наиболее активным компонен том феназинового комплекса является 1-оксифеназин.

Впервые у бактерий P. aurantiaca B-162 изучена регуляция активности и синте за ключевых ферментов общего участка ароматического пути – ДАГФ-синтазы, ФЕП-синтазы и трансальдолазы, а также антранилат-синтазы – основного фермента пути синтеза триптофана – предшественника пирролнитрина. Установлено, что ДАГФ-синтаза изучаемых бактерий представлена двумя изоферментами (ДАГФ синтазой [phe] и ДАГФ-синтазой [tyr]), регуляция активности которых осуществляет ся путем аллостерического ингибирования фенилаланином и тирозином. Активность фермента повышается в присутствии ионов двухвалентных металлов (Со2+, Сu2+ и Fe2+). Впервые установлено, что феназин вызывает бесконкурентное ингибирование ДАГФ-синтазы. Синтез ДАГФ-синтазы у бактерий P. aurantiaca B-162 осуществляет ся конститутивно.

Показано, что в регуляции активности ФЕП-синтазы и антранилат-синтазы у бактерий P. aurantiaca В-162 принимают участие ионы металлов (Mg2+, Co2+, Fe2+ и Fe2+, Mg2+, Co2+, Cu2+, Zn2+ соответственно).

Установлено, что у бактерий P. aurantiaca В-162 регуляция синтеза антибиоти ков феназинового ряда осуществляется с помощью N-гексаноил-гомосерин лактона – регуляторной молекулы QS-системы.

Впервые показано, что токсические аналоги метаболитов ароматического пути (азасерин, m-фтор-DL-фенилаланин и 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин) могут быть ис пользованы для отбора штаммов-продуцентов антибиотиков феназинового ряда. Ус тановлено, что в основе сверхсинтеза феназиновых антибиотиков у полученных му тантных штаммов лежит дерегуляция ДАГФ-синтазы (снижение чувствительности фермента к ингибирующему действию фенилаланина, тирозина или феназина) либо повышенный уровень синтеза N-гексаноил-гомосерин лактона.

Практическая значимость полученных результатов. Штамм P. aurantiaca В-162 является природным продуцентом антибиотиков феназинового ряда с уровнем синтеза, превышающим таковой у известных штаммов рода Pseudomonas в 4 раза.

Определены бактерицидные и фунгицидные дозы 1-оксифеназина (25–35 и 25–50 мкг/мл), феназина (50–75 и 25–75 мкг/мл), а также пирролнитрина (7,5–12,5 и 2,5–3,5 мкг/мл).

Оптимизированы условия (температурный оптимум, pH среды, источник угле рода, наличие ионов металлов) культивирования бактерий P. aurantiaca В-162, что позволило повысить их продуктивность в 1,3 раза в отношении антибиотиков фена зинового ряда и 1,2 раза в отношении пирролнитрина.

С помощью химического мутагенеза и последующего отбора на устойчивость бактерий P. aurantiaca В-162 к токсическим аналогам метаболитов ароматического пути получены штаммы-продуценты антибиотиков феназинового ряда. Наиболее вы сокий уровень продукции феназиновых антибиотиков зарегистрирован у бактерий штамма P. aurantiaca В-162/498 – 205,32 мг/л, что в три раза выше, чем продуктив ность исходного штамма, и в 10 раз выше, чем у известных в этом отношении штам мов P. chlororaphis и P. aeruginosa.

Показано, что штамм P. aurantiaca В-162, а также полученные на его основе аналогорезистентные регуляторные мутанты, способные к сверхсинтезу антибиоти ков феназинового ряда, обладают высокой антибактериальной и антифунгальной ак тивностями в отношении фитопатогенных микроорганизмов в условиях как лабора торных, так и производственных экспериментов, при этом антимикробная активность мутантных бактерий повышена в среднем в 1,3 раза.

Установлено, что бактерии P. aurantiaca В-162 и их мутанты способны стиму лировать рост побегов и корневой системы сельскохозяйственных растений.

На основе мутантного штамма бактерий P. aurantiaca В-162/498 создан новый полифункциональный биопестицидный препарат «Аурин», предназначенный для за щиты сельскохозяйственных культур от заболеваний грибной и бактериальной этио логии и стимуляции их роста. Разработан лабораторный регламент на получение препарата «Аурин».

Результаты диссертационной работы внедрены в учебный процесс на кафедре генетики Белорусского государственного университета и используются при проведе нии спецпрактикума (раздел «Регуляция метаболизма») со студентами специальности 1–31 01 01 (Биология).

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Штамм P. aurantiaca В-162 является природным продуцентом антибиотиков феназинового ряда (продуктивность 71,40 мг/л) и пирролнитрина (5,64 мг/л). Ком плекс феназиновых антибиотиков представлен 1-оксифеназином, феназином и фена зин-1,6-дикарбоксилатом.

2. Синтез антибиотиков феназинового ряда у бактерий P. aurantiaca В-162 регу лируется на уровне ключевых ферментов ароматического пути ДАГФ-синтазы и ФЕП-синтазы, а пирролнитрина, кроме того, антранилат-синтазы. Активность ДАГФ синтазы подвержена ингибированию фенилаланином, тирозином и феназином, а ан транилат-синтазы – триптофаном. В регуляции активности указанных ферментов участвуют ионы металлов.

3. Бактерии P. aurantiaca B-162 синтезируют N-гексаноил-гомосерин лактон, яв ляющийся компонентом QS-системы, участвующей в регуляции синтеза антибиоти ков феназинового ряда.

4. Мутанты бактерий P. aurantiaca В-162, устойчивые к токсическим аналогам метаболитов ароматического пути (азасерину, m-фтор-DL-фенилаланину и 6-диазо-5 оксо-L-норлейцину), способны к сверхсинтезу антибиотиков феназинового ряда, что связано с дерегуляцией ДАГФ-синтазы (снятие ингибирования фенилаланином, ти розином и феназином) либо со сверхпродукцией N-гексаноил-гомосерин лактона.

5. Бактерии штамма P. aurantiaca В-162 и его регуляторные мутанты обладают широким спектром антимикробной активности в отношении ряда фитопатогенных микроорганизмов и способны стимулировать рост сельскохозяйственных растений.

Штамм P. aurantiaca В-162/498, являющийся сверхпродуцентом антибиотиков фена зинового ряда, может быть использован для создания биопестицидного препарата для защиты растений.

Личный вклад соискателя. Материалы, положенные в основу диссертацион ной работы, получены лично автором в НИЛ молекулярной генетики бактерий при кафедре микробиологии БГУ. Автор благодарит заведующего кафедрой биохимии БГУ, доцента, к.б.н. Семака И.В. и научного сотрудника кафедры биохимии Корик Е.О. за проведение HPLC–анализа, а также к.х.н. Бурдя В.Н. (Гродненский государ ственный университет) за предоставление препарата пирролнитрина.

Апробация результатов диссертации. Основные положения диссертационной работы были представлены и докладывались на Международной конференции «Со временное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии»

(Минск, 2004);

3-м съезде генетиков и селекционеров России «Генетика в XXI веке:

современное состояние и перспективы развития» (Москва, 2004);

Международной научной конференции «Молекулярная генетика, геномика и биотехнология» (Минск, 2004);

конференции «Молодежь в науке–2004» (Минск, 2004);

Международной на учно-практической конференции «Актуальные проблемы изучения фито- и микобио ты» (Минск, 2004);

2-й Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Биоразнообразие. Экология. Эволюция. Адаптация.» (Одесса, 2005);

Международной научно-практической конференции «Перспективы и пробле мы развития биотехнологии в рамках единого экономического пространства стран содружества» (Минск–Нарочь, 2005);

Международной научной конференции «Со временные проблемы генетики» (Минск, 2005);

Втором Всероссийском съезде по за щите растений «Фитосанитарное оздоровление экосистем» (Санкт-Петербург, 2005);

Международной научной конференции «Физиология микроорганизмов в природных и экспериментальных системах» (Москва, 2006).

Опубликованность результатов. Основные результаты диссертационной ра боты изложены в 18 публикациях, из них в научных рецензируемых журналах – 5, в сборниках статей – 3, материалах конференций – 8, тезисах докладов – 2. Общий объем опубликованных по теме диссертации материалов составляет 48 страниц.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, общей характеристики работы, 3-х глав, заключения, списков использованных источников литературы и публикаций автора, 7-ми приложений на 10 стр.

Диссертационная работа изложена на 157 страницах машинописного текста, иллюстрирована 26 таблицами на 19 стр., 46 рисунками на 22 стр. Список использо ванных источников литературы включает 361 наименование на 28 стр.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Обзор литературы состоит из пяти подразделов, в которых обобщены данные о синтезируемых бактериями рода Pseudomonas антибиотиках ароматического ряда, путях и механизмах регуляции их синтеза, а также перспективах практического ис пользования продуцирующих антибиотики бактерий этого рода.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объектами исследований были бактерии P. aurantiaca B-162 дикого типа и ре гуляторные мутанты, полученные на их основе. Бактерии выращивали в жидкой ми неральной среде М9 (Маниатис и др, 1984) либо полноценном питательном бульоне в колбах Эрленмейера объемом 250 мл на круговой качалке (180–200 об/мин) при температуре 28°С в течение 24–48 ч. Для выделения феназино вых антибиотиков бактерии выращивали в среде, предложенной Levitch, Stadtman (1970), а для выделения пирролнитрина – в среде, предложенной van Pee (1983).

Штаммы фитопатогенных микроорганизмов культивировали в соответствии с мето дами, изложенными в “Методах общей бактериологии” (1984).

Выделение хромосомной ДНК и электрофорез в агарозном геле проводили со гласно стандартным методикам (Маниатис и др, 1984). Подбор праймеров для поли меразной цепной реакции осуществляли с использованием данных Basic Local Alignment Search Tool. Мутанты получали путем обработки бактерий N-метил-N нитро-N-нитрозогуанидином в концентрации 200 мкг/мл в цитратном буфере (рН 5,5) в течение 40 мин.

Для определения активности ДАГФ-синтазы, ФЕП-синтазы, трансальдолазы и антранилат-синтазы использовали методы, предложенные Jensen, Nester (1966), Cooper, Kornberg (1065), Novello, McLean (1968) и Ito, Crawford (1965), соответственно.

Выделение антибиотиков феназинового ряда осуществляли по схеме, предло женной Levitch и Stadtman (1970), а выделение пирролнитрина – Burkhead e.a. (1994).

Идентификацию антибиотиков феназинового ряда и пирролнитрина осуществляли с помощью жидкостного хроматографа с масс-спектрометрическим детектором LCMS QP8000 (“Shimadzu” Japan). Определение биологической активности антибиотиков проводили методом серийных разведений (Егоров, 1965).

Выделение N-ацил-гомосерин лактона осуществляли по известной методике (McClean e.a., 1997), а его идентификацию – по Shaw e.a. (1997). Количественный анализ N-ацил-гомосерин лактона проводили согласно методике, предложенной Blosser, Gray (2000).

Антимикробную активность бактерий P. aurantiaca B-162 изучали стандартны ми методами (Егоров, 1965;

Bankhead e.a., 2004;

Rodriguez, Pfender, 1997;

Sugimoto e.a., 1990). Определение способности бактерий стимулировать рост растений осуществляли по методике, предложенной Viebahn e.a. (2003). Во всех экспериментах использовали бактериальную культуру в концентрации 105 КОЕ/мл. Учет ризосферной микрофлоры осуществляли согласно методу, предложенному Теппер (Аникиев, Лукомская, 1984).

Статистическая обработка данных проводилась с использованием Microsoft Ex cel для Microsoft Office 2000.

ОТБОР ШТАММОВ PSEUDOMONAS – ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ ПРОДУЦЕНТОВ АНТИБИОТИКОВ Анализ 20-ти штаммов ризосферных бактерий рода Pseudomonas по критерию высокой активности ключевого фермента ароматического пути – ДАГФ-синтазы, на личию широкого спектра антимикробной активности в отношении фитопатогенных грибов и бактерий, а также генов, контролирующих синтез антибиотиков ароматиче ского ряда, позволил отобрать штамм P. aurantiaca B-162, перспективный для созда ния нового биопестицидного препарата для защиты растений. Штамм P. aurantiaca B-162 характеризуется повышенной в 4–6 раза по сравнению с известными штамма ми Pseudomonas удельной активностью ДАГФ-синтазы, которая составила 14,72±0,45 нмоль/мин мг белка, широким спектром антимикробной активности – эффективен в отношении всех исследуемых культур фитопатогенных бактерий и грибов различных видов (20 штаммов), а также способностью синтезировать анти биотики ароматического ряда: пирролнитрин, феназиновые антибиотики, 2,4-диацетилфлороглюцинол и пиолютеорин.

ХАРАКТЕРИСТИКА АНТИБИОТИКОВ ФЕНАЗИНОВОГО РЯДА БАКТЕРИЙ P. AURANTIACA B- Для идентификации синтезируемых P. aurantiaca B-162 феназиновых соедине ний был проведен масс-спектрометрический анализ очищенного препарата антибио тиков, который показал наличие ионов с массой 181 (М+), 197 (М+) и 257 (М+) (рис. и 2), что соответствует феназину – C12H8N2 (молекулярная масса 180 Да, максимумы поглощения соответствуют 240 и 369 нм), 1-оксифеназину – C12H7N2OH (молекуляр ная масса 196 Да, максимумы поглощения соответствуют 260 и 387 нм), а также их общему предшественнику – феназин-1,6-дикарбоксилату.

Рис. 1 Спектр поглощения (А) и масс-спектр (Б) феназина и феназин-1,6-дикарбоксилата. 1 – феназин, 2 – феназин-1,6-дикарбосилат Установлено, что исследуемые бактерии являются природными продуцентами феназиновых антибиотиков, уровень продукции которых на среде стандартного со става соответствовал 56,6 мг/л. Разработаны подходы повышения продуктивности бактерий P. aurantiaca B-162 путем оптимизации состава питательной среды (ис пользование глюкозы или арабинозы (1%) в качестве источника углерода и энергии), а также внесения в среду для культивирования микроэлементов – кобальта и цинка (1 мкмоль/л), что позволило увеличить выход антибиотиков в 1,3 раза. Максимальная продукция антибиотиков феназинового ряда, наблюдаемая при культивировании бактерий в течение 4 сут без аэрации при 30°С и значении рН среды, равном 7,2, со ставляет 71–76 мг/л, что превышает таковую у известных бактерий P. chlororaphis и P. aeruginosa примерно в 4 раза.

Рис. 2 Спектр поглощения (А) и масс-спектр (Б) 1-оксифеназина Определены бактерицидные и фунгицидные дозы 1-оксифеназина (25–35 и 25–50 мкг/мл), феназина (50–75 и 25–75 мкг/мл), а также пирролнитрина (7,5–12,5 и 2,5–3,5 мкг/мл). Наиболее активным компонентом феназинового комплекса является 1-оксифеназин.

СИНТЕЗ ПИРРОЛНИТРИНА БАКТЕРИЯМИ P. AURANTIACA B- Масс-спектрометрический анализ синтезируемого бактериями P. aurantiaca B-162 антибиотика, идентифицированного по результатам ТСХ, как пирролнитрин, показал наличие иона с массой 258 (М+) (таким образом, истинная молекулярная масса вещества – 257), максимумом поглощения 249 нм и временем удерживания 31,7 мин (рис. 3), что полностью соответствует характеристикам данного антибиоти ка (формула C10H6Cl2N2O2), описанным ранее.

Рис. 3 Спектр поглощения (А) и масс-спектр (Б) пирролнитрина Установлено, что максимальная продукция пирролнитрина бактериями P. aurantiaca B-162 (5,64 мг/л) наблюдается при их культивировании в течение 3–4-х сут и внесении в ростовую среду глицерина, триптофана или фруктозы (1%), а также ио 2+ нов Fe (1 мкмоль/л). Наибольшая антимикробная активность пирролнитрина прояв ляется в отношении фитопатогенных грибов A. alternatа и F. culmorum (фунгицидная доза составляет 2,5–3,5 мкг/мл), тогда как бактерицидная доза в отношении фитопа тогенных бактерий Pseudomonas и Erwinia в 3,5 раза выше (7,5–12,5 мкг/мл).

РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ И СИНТЕЗА КЛЮЧЕВЫХ ФЕРМЕНТОВ АРОМАТИЧЕСКОГО ПУТИ У БАКТЕРИЙ P. AURANTIACA B- ДАГФ-синтаза. Определение удельной активности ДАГФ-синтазы бактерий P. aurantiaca B-162 показало, что оптимальным для этого фермента является рН 7,1 и температура 36°С, время реакции 10 мин, наличие ионов Co2+ (1,0 ммоль/л). Удель ная активность ДАГФ-синтазы изучаемых бактерий в указанных условиях была мак симальной – 14,72±0,45 нмоль/мин мг белка. Изучение регуляции активности ДАГФ-синтазы in vitro, проведенное с использованием частично очищенного экс тракта клеток, позволило установить, что этот фермент подвержен ингибированию тирозином и фенилаланином.

тирозин;

При этом 50%-ное ингибиро Ингибированиие, % вание активности фермента ти фенилаланин;

60 розином наблюдалось при кон 5,510- центрации моль/л, триптофан а фенилаланином – при 1,310-5 моль/л (рис. 4). Дейст смесь аминокислот вие триптофана, который зна 0 чительного влияния на актив -8 -6 - 10 10 10 ность ДАГФ-синтазы не оказы Концентрация ингибитора, моль/л вал, является неспецифиче ским. Хроматографический Рис. 4 Ингибирование активности ДАГФ-синтазы анализ очищенного препарата P. aurantiaca В-162 ароматическими аминокислотами ДАГФ-синтазы показал, что элюционный профиль фермента характеризуется двумя пиками (рис. 5), что свиде тельствует о наличии в его составе двух изоферментов, идентифицированных, как ДАГФ-синтаза [tyr] и ДАГФ-синтаза [phe].

Изучение влияния феназина на активность ДАГФ-синтазы изучаемых бактерий при варьирующей концентрации субстратов и отображение полученных результатов в координатах Лайнуивера-Берка позволило установить, что феназин вызывает бес конкурентное ингибирование данного фермента, когда эффектор присоединяется только после образования фермент-субстратного комплекса.

Регуляцию синтеза ДАГФ-синтазы P. aurantiaca В-162 изучали с использова нием полученного в данной работе мутантного штамма Aro– фенотипа (блок общего участка ароматического пути), клетки которого для своего роста нуждались в трех ароматических аминокислотах, а также n-оксибензоате и n-аминобензоате. Было по казано, что уровень удельной активности ДАГФ-синтазы у изучаемых бактерий не зависит от концентрации аминокислот 1,2 в ростовой среде, что свидетельствует о (при длине волны 549 нм) (при длине волны 280 нм) конститутивном характере синтеза изу 1 1 1, чаемого фермента.

Поглощение, о.е.

Поглощение, о.е.

0, Исследование влияния ионов ме 0,6 таллов (Со2+, Zn2+, Mn2+, Cu2+ и Fe2+) на 0,4 активность ДАГФ-синтазы при внесе 0, нии их в реакционную смесь (в услови 0, ях in vitro, концентрация 10 ммоль/л) и 0 ростовую среду (в условиях in vivo, 0 30 60 концентрация 10 мкмоль/л) показало, номер фракции что повышение активности фермента наблюдается в присутствии ионов Со2+, Рис. 5 Хроматография на DEAE-целлюлозе изо Cu2+ и Fe2+ в условиях in vitro и только ферментов ДАГФ-синтазы P. aurantiaca B-162.

Со2+ в условиях in vivo. Ионы осталь 1 – ДАГФ-синтаза [tyr], 2 – ДАГФ-синтаза [phe].

Пунктирная линия обозначает профиль элюции ных металлов вызывают лишь незначи белка тельное изменение активности ДАГФ 2+ синтазы, тогда как ионы Zn в условиях in vivo снижают этот показатель на 50%.

ФЕП-синтаза. Изучение активности ФЕП-синтазы, проведенное в стандартной реакционной смеси, показало, что оптимальными для проявления активности фер мента являются температура 27°С и рН 6,5, время реакции 5 мин. Удельная актив ность ФЕП-синтазы P. aurantiaca В-162, измеренная при оптимальных условиях, со ставила 2,13 нмоль/мин мг белка.

Установлено, что в условиях in vitro для проявления максимальной активности фермента необходимо присутствие ионов Mg2+, которые увеличивают активность ФЕП-синтазы в два раза. С меньшей эффективностью действуют ионы Fe2+, а ионы Zn2+, Co2+, Mn2+ и Cu2+ влияния на фермент практически не оказывают. В условиях in vivo ионы Co2+ и Cu2+ способны повышать, а ионы Fe2+ и Zn2+ – понижать актив ность ФЕП-синтазы.

Трансальдолаза. В ходе оптимизации условий протекания трансальдолазной реакции, приводящей к образованию эритрозо-4-фосфата, было установлено, что максимальная активность трансальдолазы бактерий P. aurantiaca В-162 проявляется в диапазоне температур 35–40°С (оптимум наблюдается при 37°С) и значении рН 7,3, время реакции 15 мин. Удельная активность трансальдолазы, измеренная при опти мальных условиях, составила 31,45±2,3 мкмоль/мин мг белка. Выявлено, что изу чаемый фермент для проявления максимальной активности не нуждается в присутст вии ионов металлов.

Антранилат-синтаза. Определение удельной активности антранилат-синтазы P. aurantiaca B-162, проведенное в стандартной реакционной смеси, показало, что оптимальным для данной реакции является температура 30°С и рН 7,4, время реак ции 20 мин. В ходе экспериментов установлено, что максимальная степень ингиби рования фермента P. aurantiaca B-162 триптофаном наблюдается при его концентра ции 10 моль/л, а 50%-ное ингибирование – при 810-6 моль/л. Удельная активность - антранилат-синтазы составляет 16,05 мкмоль/мин мг белка. Стимулирующее дейст вие на активность антранилат-синтазы оказывают ионы Fe2+, Mg2+, а ионы Co2+, Cu2+ и Zn2+, наоборот, снижают ее активность.

ИДЕНТИФИКАЦИЯ N-АЦИЛ-ГОМОСЕРИН ЛАКТОНА – КОМПОНЕНТА QS–СИСТЕМЫ, УЧАСТВУЮЩЕЙ В РЕГУЛЯЦИИ СИНТЕЗА АНТИБИОТИКОВ ФЕНАЗИНОВОГО РЯДА С помощью тонкослойной хроматогра линия фронта фии освобожденной от клеток культуральной жидкости P. aurantiaca B-162 и последующе го выявления N-ацил-гомосерин лактона с использованием индикаторного штамма C. violaceum CV026, было установлено нали старт чие компонента, значение Rf которого со ставляет 0,68 (рис. 6), что соответствует Рис. 6 Тонкослойная хроматография N-гексаноил-гомосерин лактону – компонен молекул N-ацил-гомосерин лактона, ту QS-системы, участвующей в регуляции выделенных из культуры бактерий P. aurantiaca B-162 синтеза антибиотиков феназинового ряда.

ХАРАКТЕРИСТИКА РЕГУЛЯТОРНЫХ МУТАНТОВ P. AURANTIACA B-162, СПОСОБНЫХ К СВЕРХСИНТЕЗУ АНТИБИОТИКОВ ФЕНАЗИНОВОГО РЯДА С помощью токсических аналогов метаболитов ароматического пути (азасери на, m-фтор-DL-фенилалаинина и 6-диазо-5-оксо-L-норлейцина) отобраны мутанты, способные к сверхсинтезу антибиотиков феназинового ряда (табл. 1).

Наиболее высокая продукция феназиновых антибиотиков зарегистрирована у мутантных штаммов P. aurantiaca B-162/497 (193,71 мг/л) и P. aurantiaca B-162/ (205,32 мг/л), что в 2,8–3 раза выше, чем продуктивность исходного штамма, и в 10 раз выше, чем у известных продуцентов феназиновых антибиотиков P. chlororaphis и P. aeruginosa. Установлено, что в основе сверхсинтеза феназиновых антибиотиков у полученных мутантных штаммов лежит дерегуляция ДАГФ-синтазы (у большинства из них зарегистрировано снижение чувствительности фермента к ингибирующему действию фенилаланина, тирозина либо феназина), а у одного из них (штамма P. aurantiaca В-162/57) – повышенный в 2 раза уровень синтеза N-гексаноил гомосерин лактона. Полученные штаммы-продуценты феназиновых антибиотиков обладали стабильно высокой продуктивностью, которая сохранялась в течение 19 мес. Использованный в работе прием получения продуцентов антибиотиков фена зинового ряда с помощью токсических аналогов метаболитов ароматического пути предложен впервые.

Таблица Синтез феназиновых антибиотиков регуляторными мутантами P. aurantiaca В- Штамм Токсические аналоги, использован- Продукция феназинов, ные для получения мутантов мг/л P. aurantiaca B- – 71,11±2, (контроль) B-162/494 азасерин 136,31±1, B-162/115 азасерин 141,40±2, B-162/495 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин 143,80±2, B-162/492 азасерин 147,23±1, B-162/499 азасерин 158,53±1, B-162/351 азасерин 159,14±1, B-162/352 азасерин 160,35±2, B-162/57 m-фтор-DL-фенилаланин 167,73±1, B-162/272 азасерин 180,02±2, B-162/490 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин 181,30±2, B-162/274 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин 183,61±2, B-162/497 азасерин 193,71±2, B-162/498 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин 205,32±1, РАЗРАБОТКА ПОДХОДОВ К ИСПОЛЬЗОВАНИЮ БАКТЕРИЙ P. AURANTIACA B-162 ДЛЯ ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ ОТ ФИТОПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ Проведенные в лабораторных условиях исследования антагонистической ак тивности P. aurantiaca B-162 показали, что изучаемые бактерии подавляют как веге тативную (рис. 7), так и генеративную функции фитопатогенных грибов, относящих ся к родам Fusarium, Alternaria, Ascochyta, Sclerotinia, Botrytis, Phytophthora, а также проявляют антибактериальную активность в отношении всех использованных в ра боте индикаторных культур (рис. 8).

И нгибирование роста, % 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Фитопатогенные грибы Рис. 7 Антифунгальная активность бактерий P. aurantiaca B-162. Примечание. Цифрами обозначе ны: 1 – A. alternata;

2 – Ascochyta sp.;

3 – B. cinerea;

4 – F. avenaceum 6(9);

5 – F. avenaceum 04-7;

6 – F. culmorum 1(8);

7 – F. culmorum 005;

8 – F. culmorum 1(17);

9 – F. oxysporum 6(14);

10 – F. oxysporum 6(12);

11 – F. sambucinum;

12 – F. semitectum;

13 – S. sclerotiorum;

14 – P. infestans 3/2;

15 – P. infestans 3/032;

16 – P. infestans 3/ задержки роста, мм Диаметр зоны 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Фитопатогенные бактерии Рис. 8 Антибактериальная активность бактерий P. aurantiaca B-162. Примечание. Цифрами обозна чены: 1 – E. aroideae 291-1;

2 – E. aroideae 348-1;

3 – E. carotovora 75-V;

4 – E. carotovora 330;

5 – E. carotovora 8526;

6 – E. carotovora 549;

7 – E. carotovora С366;

8 – E. carotovora g217;

9 –P. atrofaciens 7967;

10 – P. glycinea 8541;

11 – P. lachrymans П-3;

12 – P. lachrymans 7595;

13 – P. lupini 8532;

14 – P. pisi 7152;

15 – P. syringae 345;

16 – P. syringae S-10;

17 – P. vignae 1025;

18 – P. xanthochlora Производственные испытания показали, что обработка растений томата бакте риальной культурой P. aurantiaca В-162 приводит к подавлению развития грибов рода Botrytis, являющихся возбудителем серой гнили. Эффективность защитного действия изучаемых бактерий составила 92,3% (в качестве контроля применялась ис пользуемая в сельском хозяйстве бордосская жидкость).

В серии экспериментов было изучено влияние бактерий P. aurantiaca В-162 на рост наиболее распространенных овощных культур. Установлено, что при обработке семян бактериями P. aurantiaca В-162 наблюдается стимуляция роста побегов (в 1,4–2,2 раза) и корневой системы (в 1,7–3,3 раза) изучаемых сельскохозяйственных растений (рис. 9), что свидетельствует о достаточно высокой фитостимулирующей активности изучаемых бактерий.

Относительная масса, % побеги корни 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Овощные культуры Рис. 9 Стимуляция роста побегов и корней овощных культур бактериями P. aurantiaca B-162. При мечание. Цифрами обозначены: 1 – огурцы ‘Верасень’, 2 – огурцы ‘Родничок’, 3 – свекла ‘Красный шар’, 4 – свекла ‘Бордо’, 5 – томаты ‘Пралеска’, 6 – томаты ‘Ляна’, 7 – капуста ‘Белорусская 85’, 8 – капуста ‘Русиновка’, 9 – морковь ‘Нантская’, 10 – морковь ‘Карлена’, 11 – редис ‘Красный ве ликан’ Подобные результаты получены и в условиях производственных эксперимен тов. Установлено, что 4-х разовая обработка растений в ходе вегетации бактериаль ной культурой P. aurantiaca В-162 приводит к увеличению их высоты на 50% (на 60-е сут выращивания) по сравнению с контрольной группой (без обработки бакте риальной культурой) и появлению дополнительных корней.

Исследование антагонистической активности аналогорезистентных регулятор ных мутантов P. aurantiaca В-162 с различным уровнем образования феназиновых антибиотиков показало, что их действие зависит от продуктивности бактерий: на пример, у штамма В-162/492 (уровень синтеза феназинов 147,23 мг/л) антибактери альная активность увеличивается в 1,21 раза по сравнению с контролем (P. aurantiaca В-162), а у штамма В-162/498 (уровень синтеза феназинов 205,32 мг/л) – в 1,35 раза.

Наиболее эффективный штамм (P. aurantiaca В-162/498) был отобран для изу чения антимикробной активности бактерий в системе in planta. Растения высаживали в инфицированную фитопатогенными грибами (F. avenaceum, Ascochyta sp. и B. cinerea) почву и обрабатывали бактериальной культурой P. aurantiaca В-162 и P. aurantiaca В-162/498. Признаки заболевания растений появлялись только в кон трольных вариантах опыта на 20-е сут, и к окончанию эксперимента (на 60-е сут) на блюдались пятна и налет на листьях, а также признаки пожелтения и увядания расте ний, в то время как растения, в почву под которыми вносили бактерии-антагонисты, оставались здоровыми и отличались более развитой корневой системой и надземной частью (рис. 10). При этом защитное действие мутантных бактерий было более вы раженным. Подобный эффект зарегистрирован также по отношению к растениям пшеницы (табл. 2).

фитопатогенный гриб фитопатогенный гриб + растений огурца, см Длина проростков P. aurantiaca В- 15 фитопатогенный гриб + 10 P. aurantiaca В-162/ P. aurantiaca В- контроль А Б В Рис. 10 Влияние бактерий P. aurantiaca В-162 и P. aurantiaca В-162/498 на длину проростков расте ний огурца, культивируемых на почве, инфицированной F. avenaceum (А), Ascochyta sp. (Б) и B. cinerea (В) Таблица Влияние бактерий P. aurantiaca В-162 и P. aurantiaca В-162/498 на длину корней растений пшеницы, культивируемых на почве, инфицированной F. semitectum Длина корней растений пшеницы в различных вариантах опыта, см контроль 1 контроль 2 F. semitectum + F. semitectum + P. aurantiaca (без микроор- (F. semitectum) B- P. aurantiaca P. aurantiaca ганизмов) B-162 B-162/ 12,92±0,28 8,52±0,11 16,42±0,75 18,90±0,60 18,09±0, В условиях производственных экспериментов установлено, что 4-х разовая об работка растений огурца культурой клеток P. aurantiaca В-162/498 привела к увели чению их высоты на 50% по сравнению с контрольной группой (без обработки бак териальной культурой).

Совокупность полезных свойств мутантного штамма P. aurantiaca В-162/ явилась основой для создания полифункционального биопестицидного препарата «Аурин», предназначенного для защиты растений от заболеваний бактериальной и грибной этиологии, а также стимуляции их роста. На получение препарата «Аурин»

разработан лабораторный регламент.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 1. Анализ коллекции штаммов ризосферных бактерий по критерию высокой активности ключевого фермента ароматического пути – ДАГФ-синтазы, наличию широкого спектра антимикробной активности в отношении фитопатагенных микро организмов, а также генетических детерминант (генов phzF, prnD, phlD и pltF), опре деляющих синтез антибиотиков ароматической природы (феназинов и пирролнитри на) и поликетидного происхождения (2,4-диацетилфлороглюцинола и пиолютеори на), позволил отобрать перспективный штамм P. aurantiaca B-162, пригодный для разработки на его основе нового биопестицидного препарата для защиты растений [3, 14].

2. Осуществлена идентификация синтезируемых бактериями P. aurantiaca B-162 антибиотиков феназинового ряда и пирролнитрина. Установлено, что фенази новый комплекс изучаемых бактерий представлен феназином (C12H8N2), 1-оксифеназином (C12H7N2OH) и их общим предшественником феназин-1,6 дикарбоксилатом (C14H8N2О4). Наиболее активным компонентом феназинового ком плекса является 1-оксифеназин. Бактерицидные и фунгицидные дозы 1-оксифеназина и феназина находятся в пределах 25–50 мкг/мл и 50–75 мкг/мл соответственно.

Максимальная продукция антибиотиков феназинового ряда наблюдается при культивировании бактерий P. aurantiaca B-162 в течение 4 сут без аэрации при 30°С и значении рН среды равном 7,2. Внесение в ростовую среду в качестве источника углерода и энергии глюкозы или арабинозы (1%), а также ионов Co2+ и Zn2+ (1 ммоль/л) позволяет повысить уровень их синтеза в 1,3 раза (с 56,6 до 76,0 мкг/мл).

Бактерицидные и фунгицидные дозы пирролнитрина в 6–10 раз ниже, чем у феназиновых антибиотиков и находятся в пределах 7,5–12,5 мкг/мл и 2,5–3,5 мкг/мл соответственно. Максимальная продукция пирролнитрина (5,6 мкг/мл) наблюдается при культивировании бактерий P. aurantiaca B-162 в течение 3–4 сут и внесении в ростовую среду глицерина, триптофана или фруктозы (1%), а также ионов Fe2+ (1 ммоль/л) [4, 11, 12].

3. Впервые у бактерий P. aurantiaca B-162 изучена регуляция активности и синтеза ключевых ферментов общего участка ароматического пути – ДАГФ-синтазы, ФЕП-синтазы и трансальдолазы, а также антранилат-синтазы – основного фермента пути синтеза триптофана – предшественника пирролнитрина. Установлено, что ДАГФ-синтаза изучаемых бактерий представлена двумя изоферментами (ДАГФ синтазой [phe] и ДАГФ-синтазой [tyr]), подверженными ретроингибированию фени лаланином и тирозином. Кроме того, активность ДАГФ-синтазы ингибируется фена зином, действие которого носит бесконкурентный характер, и стимулируется ионами металлов, наиболее активными среди которых являются ионы Со2+, Сu2+ и Fe2+. Син тез ДАГФ-синтазы у бактерий P. aurantiaca B-162 осуществляется конститутивно.

На активность ФЕП-синтазы оказывают стимулирующее действие ионы Mg2+, Fe2+ и Со2+, а трансальдолаза с помощью ионов металлов не регулируется.

Антранилат-синтаза подвержена ретроингибированию триптофаном. Стимули рующее действие на активность фермента оказывают ионы Fe2+, Mg2+, а ионы Co2+, Cu2+ и Zn2+, наоборот, снижают его активность [1, 2, 6, 9, 10, 13, 17].

4. Установлено, что регуляция синтеза антибиотиков феназинового ряда у бак терий P. aurantiaca B-162 осуществляется QS-системой с участием N-гексаноил гомосерин лактона [15].

5. Впервые с помощью химического мутагенеза с последующим отбором на ус тойчивость к токсическим аналогам метаболитов ароматического пути (азасерину, m-фтор-DL-фенилаланину и 6-диазо-5-оксо-L-норлейцину) получены штаммы продуценты антибиотиков феназинового ряда, уровень синтеза которых достигает 205,32 мг/л, что в три раза выше, чем продуктивность исходного штамма. Установле но, что в основе сверхсинтеза феназиновых антибиотиков у полученных мутантов лежит дерегуляция ДАГФ-синтазы (снятие ингибирования фенилаланином, тирози ном и феназином) либо сверхсинтез N-гексаноил-гомосерин лактона [14, 15, 16, 18].

6. Установлено, что бактерии P. aurantiaca В-162 обладают антимикробной ак тивностью в отношении широкого спектра фитопатогенных микроорганизмов. Наи более выраженный эффект наблюдается в отношении бактерий E. сarotovora, P. pisi и P. syringae, а также грибов A. alternata, B. cinerea, F. culmorum, P. infestans и S. sclerotiorum.

Высокий уровень синтеза феназиновых антибиотиков у мутантных штаммов коррелирует с возрастанием их антибактериальной (в 1,21–1,35 раза) и антифунгаль ной (в 1,3–1,5 раза) активностей. На примере бактерий P. aurantiaca В-162/498 (уро вень синтеза феназиновых антибиотиков 205,32 мг/л) продемонстрирована антифун гальная активность в системе in planta, что проявлялось в подавлении развития ин фекций, вызванных B. cinerea, Ascochyta sp., F. avenaceum и F. semitectum, а также снятие неспецифического фитотоксического действия этих микроорганизмов в от ношении исследуемых культур растений (огурцы и пшеница).

В условиях лабораторных и производственных экспериментов зарегистрирова на высокая стимулирующая рост растений активность (в 1,4–3,3 и 1,5 раза соответст венно) штамма P. aurantiaca В-162 и его мутанта P. aurantiaca В-162/498.

На основе бактерий P. aurantiaca В-162/498 создан новый полифункциональ ный биопестицидный препарат «Аурин», предназначенный для защиты сельскохо зяйственных культур от заболеваний грибной и бактериальной этиологии и стимуля ции их роста [5, 7, 8, 14, 16, 18].

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в журналах:

1. Феклистова И.Н., Максимова Н.П. Влияние ионов металлов на активность ключевых ферментов ароматического пути у бактерий Pseudomonas aurantiaca B- // Вест. Белорус. ун-та.– Сер. 2: Химия. Биология. География.– 2004.– № 3.– С. 48–53.

2. Феклистова И.Н., Максимова Н.П. ДАГФ-синтаза Pseudomonas aurantiaca B-162: регуляция активности и синтеза // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология.– 2005.– № 4.– С. 34–36.

3. Феклистова И.Н., Максимова Н.П. Синтез феназиновых соединений бакте риями Pseudomonas aurantiaca B-162 // Вест. Белорус. ун-та.– Сер. 2: Химия. Биоло гия. География.– 2005.– № 2.– С. 66–69.

4. Феклистова И.Н., Максимова Н.П. Оптимизация условий синтеза феназина бактериями Pseudomonas aurantiaca B-162 // Вест. Белорус. ун-та.– Сер. 2: Химия.

Биология. География.– 2005.– № 3.– С. 29–31.

5. Феклистова И.Н., Максимова Н.П. Бактерии Pseudomonas aurantiaca B- как основа биопрепарата для защиты растений // Земляробства i ахова раслiн.– 2006.– № 2.– С. 42–44.

Статьи в сборниках:

6. Феклистова И.Н. Регуляция антранилат-синтазы II ризосферных бактерий Pseudomonas aurantiaca B-162 // Современная биотехнология: проблемы и перспек тивы развития: Сб. трудов молодых ученых НАН Беларуси / Под ред. И.Д. Волотов ского, Ф.А. Лахвич.– Минск: 2004.– С. 81–85.

7. Феклистова И.Н., Веремеенко Е.Г. Стимуляция роста растений бактериями Pseudomonas aurantiaca B-162 // Актуальные проблемы изучения фито- и микобиоты:

Сб. статей / Под ред. В.Д. Поликсеновой.– Минск: 2004.– С. 203–205.

8. Феклистова И.Н., Максимова Н.П. Антимикробная активность бактерий Pseudomonas aurantiaca B-162 // Актуальные проблемы изучения фито- и микобиоты:

Сб. статей / Под ред. В.Д. Поликсеновой.– Минск: 2004.– С. 201–203.

Материалы конференций:

9. Феклистова И.Н., Максимова Н.П. Роль ионов металлов в регуляции синтеза и активности ФЕП-синтазы бактерий P. aurantiaca B-162 // Молекулярная генетика, геномика и биотехнология: Материалы науч. конф., Минск, 24–26 нояб. 2004 г. / Нац.

акад. наук Беларуси. Ин-т генетики и цитологии НАН Беларуси. Бел. общ-во генети ков и селекционеров. Бел. Респ. фонд фунд. иссл.– Минск, 2004.– С. 123–124.

10. Феклистова И.Н., Максимова Н.П. Регуляция синтеза ДАГФ-синтазы иона ми металлов у бактерий P. aurantiaca B-162 // Молекулярная генетика, геномика и биотехнология: Материалы науч. конф., Минск, 24–26 нояб. 2004 г. / Нац. акад. наук Беларуси. Ин-т генетики и цитологии НАН Беларуси. Бел. общ-во генетиков и селек ционеров. Бел. Респ. фонд фунд. иссл.– Минск, 2004.– С. 124–125.

11. Феклистова И.Н. Влияние условий культивирования на продукцию феназина бактериями Pseudomonas aurantiaca B-162 // Биоразнообразие. Экология. Эволюция.

Адаптация: Материалы междунар. науч. конф., Одесса, 28 мар.–1 апр. 2005 г. / Мин.

образования и науки Украины. Одесский нац. ун-т. Совет молодых ученых биол. фак та.– Одесса, 2005.– С. 159.

12. Феклистова И.Н., Веремеенко Е.Г., Максимова Н.П. Продукция антибиотика феназина бактериями Pseudomonas aurantiaca B-162 при росте на различных источ никах углерода // Эффективное овощеводство в современных условиях: Материалы междунар. науч. конф., Минск, июль. 2005 г. / Нац. акад. наук Беларуси. Ин-т овоще водства.– Минск, 2005.– С. 295–298.

13. Феклистова И.Н., Максимова Н.П. Регуляция ДАГФ-синтазы бактерий P. aurantiaca B-162 ароматическими аминокислотами // Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии: Материалы науч.-практ.

конф., Минск, 26–28 мая 2005 г. / Нац. акад. наук Беларуси. Ин-т микробиологии НАН Беларуси. Гос. концерн «Белбиофарм». БРФФИ.– Минск, 2005.– С. 165–166.

14. Феклистова И.Н., Максимова Н.П. Бактерии Pseudomonas aurantiaca B-162 как объект агробиотехнологии // Перспективы и проблемы развития биотех нологии в рамках единого экономического пространства стран содружества: Мате риалы междунар. науч.-практ. конф., Минск, 25–28 мая 2005 г. / БГУ. Гос. Ком-т по науке и тех-ям Респ. Беларусь. Федеральное Агентство по науке и инновациям РФ.

Нац. акад. наук Беларуси. Гос. концерн «Белбиофарм». Комитет по разв. биол. и мед.

Промышленности торг.-промыш. палаты РФ.– Минск–Нарочь, 2005.– С. 244–245.

15. Феклистова И.Н., Максимова Н.П. Получение мутантов бактерий Pseudomonas aurantiaca B-162, способных к сверхсинтезу антибиотиков феназиново го ряда, и их характеристика // Фитосанитарное оздоровление агроэкосистем: Мате риалы II всероссийского съезда по защите растений., Санкт-Петербург, 5–10 дек.

2005 г. / Мин-во сельского хоз-ва РФ. Российская акад. сельскохозяйственных наук.

ВНИИЗР. Инновационный центр защиты растений.– Санкт-Петербург, 2005.– С. 221– 222.

16. Феклистова И.Н., Максимова Н.П., Скакун Т.Л. Антифунгальная активность Pseudomonas aurantiaca B-162/498 – продуцентов антибиотиков феназинового ряда в системе in planta // Физиология микроорганизмов в природных и экспериментальных системах: Материалы междунар. науч. конф., Москва, 16–19 мая 2006 г. / МГУ. Биол.

фак-т. МГУ. Рос. фонд фунд. иссл.– Москва, 2006.– С. 40.

Тезисы докладов 17. Феклистова И.Н., Максимова Н.П. ДАГФ-синтаза Pseudomonas aurantiaca B-162: регуляция активности и синтеза фермента ионами металлов // Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития: Тез. докл. науч. конф., Москва, 6–12 июня 2004 г. / Вавиловское общ-во генетиков и селекционеров. Ин-т общей ге нетики. МГУ.– Москва, 2004.– С. 415.

18. Феклистова И.Н, Максимова Н.П. Антимикробная активность мутантов бак терий Pseudomonas aurantiaca B-162, способных к сверхсинтезу феназина // Молеку лярная и прикладная генетика: Тез. докл. науч. конф., Минск, 17–18 нояб. 2005 г. / Ин-т генетики и цитологии.– Минск, 2005.– С. 251.

РЭЗЮМЕ ФЕКЛIСТАВА Iрына Мiкалаеўна СIНТЭЗ АНТЫБIЁТЫКАЎ АРАМАТЫЧНАЙ ПРЫРОДЫ У БАКТЭРЫЙ PSEUDOMONAS AURANTIACA B- Ключавыя словы: бактэрыi роду Pseudomonas, феназiн, 1-оксiфеназiн, пiролнiтрын, прадуцэнты, антымiкробная актыўнасць.

Аб'ект даследавання: штам Pseudomonas aurantiaca B-162 i яго мутанты.

Прадмет даследавання: сiнтэз антыбiётыкаў араматычнай прыроды бактэры ямi P. aurantiaca B-162.

Мэта даследавання: iдэнтыфiкацыя антыбiётыкаў араматычнай прыроды i даследванне механiзмаў iх сiнтэза ў рызасферных бактэрый P. aurantiaca В-162, атрыманне штамаў-прадуцэнтаў, здольных да звышсiнтэза ўказанных злучэнняў, а таксама распрацоўка прыёмаў iх выкарыстання для аховы сельскагаспадарчых раслiн ад захворванняў.

Метады даследавання: мiкрабiялагiчныя, бiяхiмiчныя, генетычныя i фiзiка хiмiчныя.

Атрыманыя вынiкi i iх навiзна: адабраны штам рызасферных бактэрый P. aurantiaca В-162, якi валодае шырокiм спектрам антымiкробный актыўнасцi ў ад носiнах да фiтапатагеных грыбоў i бактэрый, здольны да сiнтэза антыбiётыкаў арама тычнага рада (пiролнiтрына, феназiнавых антыбiётыкаў, 2,4-дыацэтылфлора глюцынола, пiалютэарына) i з'яўляецца прыродным прадуцэнтам феназiнаў (прадук тыўнасць 76,0 мг/л) i пiролнiтрына (5,64 мг/л). Комплекс феназiнавых антыбiётыкаў прадстаўлен 1-оксiфеназiнам, феназiнам i феназiн-1,6-дыкарбаксiлатам.

Упершыню прадэманстравана, што сiнтэз феназiнавых антыбiётыкаў рэгулю ецца на ўзроўнi ключавых ферментаў араматычнага шляху ДАГФ-сiнтазы и ФЭП сiнтазы, а пiролнiтрына, акрамя таго, антранiлат-сiнтазы шляхам iх iнгiбiравання;

у рэгуляцыi актыўнасцi ферментаў значную ролю адыгрываюць iоны металаў. Паказа на, што ў бактэрый P. aurantiaca В-162 асноўным кампанентам QS-сiстэмы, якая ўдзельнiчае ў регуляцыi сiнтэза антыбiётыкаў феназiнавага рада, з'яўляецца N-гексанаiл-гомасерын лактон.

Распрацаваны арыгiнальны падыход атрымання штамаў, здольных да павышана га сiнтэза феназiнавых антыбiётыкаў, заснаваны на выкарыстаннi ў якасцi селекты руючых фактараў таксiчных аналагаў метабалiтаў араматычнага шляху. Штам P. aurantiaca В-162/498 (прадуктыўнасць феназiнаў 205,32 мг/л) выкарыстаны для стварэння новага полiфункцыянальнага бiяпестыцыднага прэпарата «Аўрын», пры значанага для аховы сельскагаспадарчых раслiн ад захворванняў грыбной и бактэры яльнай этыалогii i стымуляцыi iх роста. Распрацаваны лабараторны рэгламент на атрыманне прэпарата «Аўрын».

РЕЗЮМЕ ФЕКЛИСТОВА Ирина Николаевна СИНТЕЗ АНТИБИОТИКОВ АРОМАТИЧЕСКОЙ ПРИРОДЫ У БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS AURANTIACA B- Ключевые слова: бактерии рода Pseudomonas, феназин, 1-оксифеназин, пир ролнитрин, продуценты, антимикробная активность.

Объект исследования: штамм Pseudomonas aurantiaca B-162 и его мутанты.

Предмет исследования: синтез антибиотиков ароматической природы бакте риями P. aurantiaca B-162.

Цель работы: идентификация антибиотиков ароматической природы и иссле дование механизмов их синтеза у ризосферных бактерий P. aurantiaca В-162, полу чение штаммов-продуцентов, способных к сверхсинтезу указанных соединений, а также разработка приемов их использования для защиты сельскохозяйственных рас тений от болезней Методы исследования: микробиологические, биохимические, генетические и физико-химические.

Полученные результаты и их новизна: отобран штамм ризосферных бактерий P. aurantiaca В-162, обладающий широким спектром антимикробной активности в отношении фитопатогенных грибов и бактерий, способный к синтезу антибиотиков ароматического ряда (пирролнитрина, феназиновых антибиотиков, 2,4-диацетил флороглюцинола, пиолютеорина) и являющийся природным продуцентом феназинов (продуктивность 76,0 мг/л) и пирролнитрина (5,64 мг/л). Комплекс феназиновых ан тибиотиков представлен 1-оксифеназином, феназином и феназин-1,6 дикарбоксилатом.

Впервые продемонстрировано, что синтез феназиновых антибиотиков регули руется на уровне ключевых ферментов ароматического пути ДАГФ-синтазы и ФЕП синтазы, а пирролнитрина, кроме того, антранилат-синтазы путем их ингибирования;

в регуляции активности ферментов значительную роль играют ионы металлов. Пока зано, что у бактерий P. aurantiaca В-162 основным компонентом QS-системы, участ вующей в регуляции синтеза антибиотиков феназинового ряда, является N-гексаноил-гомосерин лактон.

Разработан оригинальный подход получения штаммов, способных к сверхсин тезу феназиновых антибиотиков, основанный на использовании в качестве селекти рующих факторов токсических аналогов метаболитов ароматического пути. Штамм P. aurantiaca В-162/498 (продуктивность феназинов 205,32 мг/л) использован для создания нового полифункционального биопестицидного препарата «Аурин», пред назначенного для защиты сельскохозяйственных растений от заболеваний грибной и бактериальной этиологии и стимуляции их роста. Разработан лабораторный регла мент на получение препарата «Аурин».

SUMMARY FEKLISTOVA Iryna AROMATIC ANTIBIOTICS SYNTHESIS IN PSEUDOMONAS AURANTIACA B-162 BACTERIA Key words: bacteria Pseudomonas, phenazine, 1-hydroxyphenazine, pyrrolnitrin, producers, antimicrobial activity.

Object of investigation: strain Pseudomonas aurantiaca B-162 and its mutants.

Subject of investigation: aromatic antibiotics synthesis in P. aurantiaca B-162 bacte ria.

Aim of investigation: identification of aromatic antibiotics and research of mecha nisms of its synthesis in rhizobacteria P. aurantiaca В-162, obtaining of strains–producers capable to oversynthesis of indicated compounds, and development of ways of their usage for protection of agricultural plants against diseases.

Methods of investigation: microbiological, biochemical, genetic, physical and chemical methods were used.

Obtained results and their novelty: the strain of rhizobacteria P. aurantiaca B-162, possessing a wide spectrum of the antimicrobial activity against phytopathological fungi and bacteria, capable to synthesis of antibiotics of an aromatic series (pyrrolnitrin, phenazine antibiotics, 2,4-diacetylphloroglucinol, pyoluteorin) and being a natural producer of phenazine antibiotics (efficiency 76,0 mg/L) and pyrrolnitrin (5,64 mg/L) is selected.

Complex of phenazine antibiotics represented by 1-hydroxyphenazine, phenazine and phenazine-1,6-dicarboxylic acid.

For the first time it is shown, that synthesis of phenazine antibiotics is regulated at a level of aromatic pathway key enzymes DAHP-synthase and PEP-synthase, and pyrrolni trin, besides anthranilic–synthase by their inhibition;

ions of metals play the significant role in a regulation of activity of enzymes. It is shown, that N-hexanoyl-homoserine lactone is a main component of the QS-system participating in a regulation of phenazine antibiotics synthesis in P. aurantiaca В-162 bacteria.

The original approach of obtaining of the strains, capable to the oversynthesis of phenazine antibiotics, based on usage of toxic analogue of aromatic metabolites in quality of selective factors is developed. Strain P. aurantiaca В-162/498 (efficiency of phenazine antibiotics 205,32 mg/L) is used for creation of the new multifunctional biopesticidal preparation "Aurin" intended for protection of agricultural plants from diseases fungal both bacterial origin and stimulation of their growth. The laboratory rules of obtaining of prepa ration "Aurin" are developed.

Подписано в печать 31.10.2006. Формат 60х84 1/16 Бумага офсетная. Гарнитура Roman.

Печать цифровая. Усл.печ.л. 1,3. Уч.изд.л. 1,4. Тираж 60 экз. Заказ № ИООО «Право и экономика» Лицензия № 02330/0056831 от 01.04.2004.

220072 Минск Сурганова 1, корп. 2. Тел. 284 18 66, 8 029 684 18 66.

Отпечатано на настольно-издательской системе XEROX в ИООО «Право и экономика».