Использование glycyrrhiza glabra l., achillea micrantha willd. и helichrysum arenarium l. для разработки биопрепаратов с антибактериальными свойствами
На правах рукописи
Астафьева Оксана Витальевна
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ GLYCYRRHIZA GLABRA L., ACHILLEA
MICRANTHA WILLD. И HELICHRYSUM ARENARIUM L. ДЛЯ РАЗРАБОТКИ
БИОПРЕПАРАТОВ С АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫМИ СВОЙСТВАМИ
03.01.06 – биотехнология
(в том числе бионанотехнологии)
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Ставрополь – 2013
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Астраханский государственный университет»
Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Егоров Михаил Алексеевич Таран Татьяна Викторовна,
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, Федеральное казённое учреждение здравоохранения «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, заведующая лабораторией питательных сред для культивирования микроорганизмов I-IV групп патогенности Брыкалов Анатолий Валерьевич, доктор химических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Кубанский государственный аграрный университет», профессор кафедры биотехнологии, биохимии и биофизики
Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Астраханская государственная медицинская академия»
Защита состоится «26» ноября 2013 года в 10-00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.109.01 при ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора по адресу: 355035, г. Ставрополь, ул. Советская, д. 13-15.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора
Автореферат разослан «_» октября 2013 г.
Ученый секретарь диссертационного совета Жарникова Ирина Викторовна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования. Использование лекарственных растений человеком как самостоятельного средства, так и в качестве первичного сырья для получения препаратов различного направления имеет многовековую историю, но до настоящего времени изучены свойства сравнительно небольшого числа видов растений. Наличие в растении, а также в растительных экстрактах комплексов, состоящих из десятков и более отдельных химических соединений, объясняет способность натурального препарата вызывать положительный эффект там, где отдельные соединения, выделенные из того же растения, оказываются малоэффективными (Голышенков П.П. с соавт., 1990;
Васильев А.С. с соавт., 2006). Активность экстрактов во многом обусловлена наличием в них определенных химических веществ (Георгиевский В.П. с соавт., 1990;
Муравьева Д.А. с соавт., 2002;
Castleman M., 2001;
Schulz V. et al., 2001;
Cseke L.J. et al., 2006;
Hopkins W.G., 2008;
Burlando B. et al., 2010).
Перспективным направлением является выделение биологически активных соединений в виде экстрактов с антибактериальными и фитонцидными свойствами из растений Астраханской области. Особые природные экологические условия: высокие инсоляция и температура, низкая влажность — способствуют образованию биологически активных веществ в повышенных концентрациях (Сагалаев В.А., 2003;
Сухенко Л.Т., 2006, 2010). Растения, произрастающие здесь (Пилипенко В.Н. с соавт., 2002), накапливают большое количество различных по химическому составу биологически активных веществ. Научно-практический интерес представляет сравнение химического состава и свойств экстрактов растений одного вида, произрастающих на территории Астраханского региона и в регионах Италии, на примере солодки голой (Русская солодка — Glycyrrhiza glabra var gladulifera и Испанская или Итальянская солодка — Glycyrrhiza glabra var typical) (Nomura T. et al., 2002;
Hayashi H. et al., 2009).
Наиболее перспективным для определения качественного и количественного состава экстрактов является метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (Стыскин Е.Л. с соавт., 1986;
Высокоэффективная…, 1988;
Сычев С.Н. с соавт., 2002;
Capodaglio G. et al., 2008;
Ceyhun S.A.E. et al., 2010).
Цель исследования. Целью настоящей работы является обоснование возможности использования некоторых растений — солодки голой Glycyrrhiza glabra, тысячелистника мелкоцветкового Achillea micrantha, цмина песчаного Helichrysum arenarium, произрастающих в аридной зоне для получения экстрактов с антибактериальными свойствами.
Задачи исследования Обосновать выбор использования растений (солодки голой Glycyrrhiza 1.
glabra, тысячелистника мелкоцветкового Achillea micrantha, цмина песчаного Helichrysum arenarium) для практического применения — получения экстрактов и отдельных биологически активных компонентов в качестве антибактериальных средств и компонентов биопрепаратов.
Выбрать оптимальные растворители для выделения биологически 2.
активных веществ из соцветий Achillea micrantha и Helichrysum arenarium и из корней Glycyrrhiza glabra.
Подобрать оптимальную систему элюентов для хроматографического 3.
разделения и выделения необходимых химических компонентов из исследуемых экстрактов.
Изучить качественный и количественный состав экстрактов корня 4.
Glycyrrhiza glabra, произрастающей в разных регионах, по содержанию основных веществ.
Изучить состав экстрактов соцветий тысячелистника мелкоцветкового и 5.
цмина песчаного.
Изучить антибактериальные свойства экстрактов и полученных фракций 6.
в отношении условно-патогенных микроорганизмов Staphylococcus aureus, Escherichia coli и Bacillus subtilis.
Разработать технологические схемы получения жидких экстрактов 7.
соцветий тысячелистника мелкоцветкового Achillea micrantha, соцветий цмина песчаного Helichrysum arenarium и корня солодки голой Glycyrrhiza glabra для возможности создания растительных биопрепаратов с антибактериальными свойствами.
Научная новизна работы. Выполнены исследования состава и антибактериальных свойств экстрактов трех видов растений — Gl. glabra (корень), A.
micrantha (соцветий), H. arenarium (соцветий), произрастающих на территории Астраханского региона.
Впервые проведены сравнительные исследования химического состава и антибактериальных свойств экстрактов корня двух разновидностей солодки голой, произрастающей в России (Астраханский регион) и в Италии (регион Калабрия).
Методом водноспиртовой экстракции из соцветий A. micrantha и H. arenarium выделена группа терпеновых соединений и их производных, ранее обнаруживаемых чаще всего в составе эфирных масел.
С помощью хроматографических методов получены фракции исследуемых экстрактов;
исследованы антибактериальные свойства (в отношении к наиболее часто используемым в качестве тест-микроорганизмов St. aureus, E. coli и B. subtilis) выделенных в виде фракций компонентов экстрактов корня солодки голой, произрастающей в Астраханском регионе (Россия) и регионе Калабария (Италия).
Представлены технологические схемы производства жидких экстрактов корня солодки голой Gl. glabra, соцветий цмина песчаного H. arenarium и соцветий тысячелистника мелкоцветкового A. micrantha с антибактериальными свойствами.
Практическая значимость работы. Результаты проведенных исследований являются основой для разработки новых методов стандартизации предложенных жидких экстрактов используемых растений. Выделенные биологически активные компоненты экстрактов, обладающие ценными свойствами, могут быть предложены для химического синтеза в лабораторных и в промышленных условиях. Результаты исследования используются для чтения курсов «Введение в биотехнологию», «Общая биотехнология» студентам биологических специальностей. Разработаны «Методические рекомендации по изучению и оценке антибактериальной активности растительных экстрактов методом определения общего микробного числа» (протокол №3 от 3.10.2013) и «Методические рекомендации для определения антиоксидантной активности в биологических жидкостях» (протокол №3 от 3.10.2013).
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
1. Используемые виды растений — солодка голая Gl. glabra, тысячелистник мелкоцветковый A. micrantha, цмин песчаный H. arenarium — являются перспективными для получения антибактериальных средств, а также других биологически активных компонентов с заданными свойствами.
2. Оптимальным экстрагентом для выделения антибактериальных компонентов, преимущественно терпеновых соединений, корня Gl. glabra, соцветий A. micrantha и H. arenarium является этиловый спирт (50%). Раствор диэтилкарбоната также является оптимальным растворителем для выделения антибактериальных компонентов корня Gl. glabra.
3. Разная степень антибактериальной активности относительно St. aureus, E. coli и B. subtilis экстрактов корня Gl. glabra из представленных мест произрастания (Астраханский регион, Россия и регион Калабрия, Италия) зависит в основном от количественного содержания действующих веществ при одинаковом качественном составе. Полученные экстракты и фракции могут использоваться в качестве антибактериальных компонентов биопрепаратов.
4. Разработанные технологические схемы получения жидких экстрактов корня солодки голой Gl. glabra, соцветий тысячелистника мелкоцветкового A.micrantha и соцветий цмина песчаного H. arenarium могут быть предложены для производства биопрепаратов с антибактериальными свойствами.
Апробация работы. Полученные результаты исследовательской работы представлены на Международной конференции с элементами научной школы для молодежи (Астрахань, 2010);
на научно-практическом семинаре с международным участием «Настоящее и будущее биотехнологии в решении проблем экологии, медицины, сельского, лесного хозяйства и промышленности» (Ульяновск, 2011);
на VI Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2011);
на Международной научно-практической конференции (Тамбов, 2011);
на Международной Интернет-конференции «Биотехнология. Взгляд в будущее» (Казань, 2012);
на Международной конференции «Биология – наука XXI века» (Москва, 2012);
на ХI Молодежной международной научно-практической конференции (Новосибирск, 2012);
на Всероссийской молодежной конференции «Инновации и технологии Прикаспия» (Астрахань, 2012);
на VII Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития»
(Москва, 2013).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 18 работ, из них 3 — в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав экспериментальных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка сокращений и условных обозначений, списка литературы и приложений. Общий объем работы составляет 156 страниц, содержит 21 таблицу, рисунка и 7 приложений. Список литературы включает 293 источника, из них 214 — на иностранных языках.
Работа выполнена в совместной аспирантуре согласно действующему договору между Астраханским государственным университетом (Астрахань, Россия) и университетом Ка’Фоскари (Венеция, Италия).
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Во введении дано обоснование актуальности диссертационной работы и сформулирована цель проведения исследований.
Материалы и методы исследований Работа выполнена на кафедре биотехнологии и биоэкологии и в научно производственной лаборатории биотехнологий Астраханского государственного университета (Астрахань, Россия), а также в химических лабораториях факультета естественных наук, информатики и статистики и факультета молекулярных наук и наносистем университета Ка’Фоскари (Венеция, Италия).
Объектами исследования являлись соцветия тысячелистника мелкоцветкового Achillea micrantha, соцветия цмина песчаного Helicrysum arenarium, корни солодки голой Glycyrrhiza glabra. Растения собирали на территории Астраханской области:
корни Gl. glabra в Приволжском районе Астраханской области, соцветия A. micrantha и H. arenarium — на территории Наримановского района Астраханской области. Для сравнительных исследований брали корни Gl. glabra, произрастающей в регионе Калабрия, Италия.
В качестве тест-объектов для исследования антибактериальной активности экстрактов и фракций были выбраны St. aureus ВКПМ В-1899, E. coli СК ВКПМ В 1911 и B. subtilis ВКПМ В-1919, полученные из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ФГУП ГосНИИ Генетики.
Экстрагирование биологически активных веществ из исследуемых растений проводили методом настаивания с использованием в качестве растворителя 50% раствор этилового спирта, а также растворы 96% этилового спирта, этилацетата и диэтилкарбоната.
Предварительный анализ химического состава исследуемых экстрактов выполняли методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) с использованием хроматографических пластин «Macherey-Nage» и элюирующей системы: этанол: вода:
аммиак 90:10:1.
Спектрофотометрический анализ (Пешкова В.М. с соавт., 1965) проводили на спектрофотометре UV/Vis Beckman DU 640, оборудованном термостабильной кюветой (Hellma, QS1000) с оптическим путем 1 см.
Все экстракты разделены на фракции методом колоночной жидкостной хроматографии с использованием в качестве неподвижной фазы силикагеля (Merck Silica gel Grade 10184, pore size 100, 70-230 mesh SigmaAldrich) или полимерного сорбента XAD1600 (Amberlite XAD 1600), на колонке h =25 см, d =2,5 см. Для разделения компонентов использовали в качестве элюентов этиловый спирт 90%, содержащий 1% аммиака.
Идентификацию веществ проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии ВЭЖХ/УФ (Стыскин Е.Л. с соавт., 1986;
Столяров Б.В. с соавт., 2002) на жидкостном хроматографе Agilent 1200 (Agilent Technologies, Waldbroon, Germany) с УФ детектором. Детекция выполнялась при длинах волн: 254 нм, 275 нм, 280 нм, нм и 350 нм. Использовали хроматографическую колонку Phenomenex Synergi 4 µm Hydro-RP 80, 504,6 мм, в качестве подвижной фазы — ацетонитрил. В процессе хроматографирования состав смеси изменялся от 0 до 100 % по содержанию ацетонитрила в течение 34 и 74 мин. Скорость потока составляла 0,5 мл/мин. Объем вводимого исследуемого раствора — 10 мкл. В качестве стандартных растворов использовали водные растворы глицирризиновой кислоты, 18-глицирретовой кислоты, глабридина (Sigma-Aldrich).
Химический состав экстрактов исследовали также методом газовой хроматографии-масс-спектрофотометрии (ГХ/МС) (Herbert C.G. et al., 2003) на хроматографе-масс-спектрометре Shimadzu GC/MS (модели QP-5050А, Shimadzu, Япония). Использовали колонку типа DBI, 30 м;
0,53мм (идентификатор) и 1,5 мкм толщина пленки (J&W;,США). В качестве подвижной фазы использовали газ-носитель — гелий. Использовали следующий режим программирования температуры:
температура колонки составляла 50С (удерживается 1 мин), затем градиентный подъем температуры 10С/мин до 100С (удерживается 1 мин), градиентный подъем температуры со скоростью 5С/мин до 250С, (удерживается 5 мин), затем градиентный подъем со скоростью 5С/мин до 270С (удерживается 2 мин) и градиентный подъем со скоростью 3,5С/мин до 280С (удерживается 1 мин).
Температура детектора и инжектора — 250С и 280С соответственно. Вводимый объем пробы — 2 мкл с расходом 20 мл/мин.
Чувствительность микроорганизмов к исследуемым экстрактам определяли диско-диффузионным методом, методом прямой диффузии в агар с использованием лунок (Сухенко Л.Т., 1999;
Дзержинская И.С., 2004) и методом разведений препарата в жидкой питательной среде (Алешукина А.В., 2003;
Нетрусов А.И. с соавт., 2005).
Изучали развитие колоний тест-микроорганизмов на питательной среде с внесенными в нее экстрактами растений методом определения общего микробного числа (ОМЧ).
Исследования проводились в трех повторностях.
Результаты экспериментов обрабатывали общепринятыми методами математической статистики (Лакин Г.Ф., 1990;
Козак М.Ф., 1995) в виде графиков и таблиц с помощью программ Microsoft Excel, Статистика;
использовали текстовый редактор Microsoft Word.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Полученные в результате спектрального анализа УФ-спектры показывают возможное наличие в экстрактах некоторых органических соединений, содержащих группы хромофоров, таких как карбоксильные, карбонильные, фенольные, а также наличие таких активных химических компонентов, как флавоноиды и сапонины.
Значения абсорбции для водных экстрактов схожи со значениями абсорбции этанольных 50% экстрактов корня Gl. glabra. Для экстрактов A. micrantha значение абсорбции выше для водного экстракта с максимумом при 261 нм, а для экстрактов солодки голой выше для 50% этанольного экстракта с двумя максимумами при 270 и 317 нм. Таким образом, в исследуемых экстрактах содержатся примерно одинаковые группы химических соединений (флавоноиды, сапонины и др.), но в разных соотношениях.
В качестве предварительного химического анализа исследуемых экстрактов растений была проведена тонкослойная хроматография (ТСХ). Была подобрана подходящая система для элюирования (этанол: вода: аммиак 90:10:1). Целью проведения ТСХ было выявление количества выделенных компонентов в экстрактах исследуемых растений.
Все экстракты на основе результатов ТСХ разделены на фракции методом колоночной хроматографии, а затем проанализированы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
В результате исследования полученных фракций 50% этанольного экстракта корня Gl. glabra (Е1-Е5) методом ВЭЖХ с использованием стандартных растворов глицирризиновой кислоты и 18-глицирретовой кислоты получены следующие данные, представленные на рисунке 1.
Рисунок 1 — Сравнительная диаграмма содержания глицирризиновой кислоты и 18-глицирретовой кислоты во фракциях 50% этанольного экстракта корня Glycyrrhiza glabra (Астраханский регион) Наибольшая концентрация глицирризиновой кислоты обнаружена во фракции Е5, но в целом по содержанию данного вещества между фракциями не выявлено достоверных различий. 18-глицирретовая кислота присутствовала на уровне предела обнаружения во всех исследуемых фракциях, но большее ее количество обнаружено в Е5 фракции.
Наиболее высокая концентрация глицирризиновой кислоты обнаружена в 50% этанольном экстракте корня Gl. glabra (Астраханский регион). Этот результат, с одной стороны, указывает на большую эффективность извлечения этого соединения с помощью данной смеси растворителей по сравнению с только этанольным (96%) экстрактом (по литературным данным), с другой стороны, может свидетельствовать о повышенном содержании глицирризиновой кислоты в исследуемом растении.
В экстракте Gl. glabra (Калабрия), в сравнении с экстрактом солодки из Астраханского региона, обнаружена более низкая концентрация глицирризиновой кислоты. Содержание глабридина в 50% этанольных экстрактах корня Gl. glabra из Астраханского региона и региона Калабрия было примерно одинаково — 33 и нг/мкл соответственно.
Методом газовой хроматографии-масс-спектрофотометрии (ГХ/МС) в 50% этанольном экстракте соцветий A. micrantha было определено 19 соединений, из которых 17 относится к терпенам и их производным. Наибольшее процентное содержание от общего объема экстракта приходится на пиперитон (34,15%) и карвон (24,93%). В экстракте соцветий H. arenarium этим же методом (ГХ/МС) было определено 17 соединений, 13 из которых относится к терпенам и их производным.
Наибольшее количество приходится на эфир монотерпенового спирта — нерил ацетат (54,3%). Большинство обнаруженных терпеновых соединений, по литературным данным, обладает антибактериальной активностью (Kotan R. et al, 2007;
Gallucci N. et al, 2010).
В результате исследования антибактериальной активности экстрактов диско диффузионным методом перспективными оказались водные и этанольные (50%) экстракты корня Gl. glabra и соцветий H. arenarium. Экстракты соцветий A. micrantha в отношении всех трех штаммов микроорганизмов (E. coli, St. aureus, B. subtilis) проявили невысокую ингибирующую активность в сравнении с другими экстрактами и антибиотиками. Среди экстрактов соцветий H. arenarium высокое антибактериальное действие показали этанольные экстракты в отношении B. subtilis. В сравнении с водными экстрактами этанольные экстракты соцветий H. arenarium были более активны в отношении E.coli и B. subtilis (в 1,3 и 2,3 раза соответственно). Скорее всего, это связано с действием на бактерии спирторастворимых веществ (средней полярности), выделяемых экстракцией 50% этиловым спиртом;
в то время как в водном экстракте содержатся в основном полярные соединения. В отношении E. coli и St. aureus в сравнении с другими исследуемыми экстрактами более эффективны 50% этанольные и водные экстракты корня Gl. glabra;
причем, 50% этанольные экстракты проявили большую активность, чем водные экстракты (примерно в 1,5 раза). Это можно объяснить тем, что водной экстракцией выделяются такие соединения, как сапонины, в частности глицирризиновая кислота и ее соли, которые обладают противомикробным действием. В результате экстракции 50% этиловым спиртом из корня Gl. glabra извлекаются, кроме водорастворимых веществ, преимущественно флавоноиды, обладающие более сильным антибактериальным действием, чем сапонины. Хотя антибиотики и оказывают высокое ингибирующее действие в отношении условно-патогенных тест-микроорганизмов в сравнении с исследуемыми экстрактами, последние оказывают пролонгирующее антибактериальное действие (Сухенко Л.Т., 2011).
Антибактериальную активность водных и 50% этанольных экстрактов соцветий H. arenarium, A. micrantha и корней Gl. glabra исследовали также методом диффузии в среду с помощью лунок. Полученные результаты схожи с результатами исследования антибактериальной активности этих же экстрактов диско-диффузионным методом.
Однако показатели ДЗЗР, полученные методом лунок, превосходят по значению показатели, полученные методом дисков. Это объясняется тем, что в методе лунок экстракт непосредственно диффундирует из лунки в питательную среду с культурой, а в методе дисков, экстракт диффундирует из бумажного диска, в котором и могла остаться часть действующих веществ растений.
Все три штамма тест-микроорганизмов (E.coli, St. aureus, B. subtilis) были более чувствительны к этанольному экстракту корня Gl. glabra. Более высокое ингибирующее действие этанольный экстракт корня Gl. glabra проявил в отношении E.coli. К St. aureus водные и этанольные экстракты корня Gl. glabra проявили примерно одинаково высокое подавляющее рост и развитие действие. Водной экстракцией выделяются в основном сапонины, в том числе гликозиды, в частности, глицирризиновая кислота, обладающая противомикробными свойствами, а 50% этанолом выделяются также спирторастворимые соединения, в частности, флавоноиды.
Антибактериальную активность водных экстрактов исследовали путем высева тест-микроорганизмов на питательные среды с внесенными в них экстрактами растений методом определения общего микробного числа (ОМЧ) (таблица 1).
Таблица 1 — Сравнительная антибактериальная активность водных экстрактов растений в питательной среде (ОМЧ) Экстракты E. coli St. aureus B. subtilis КОЕ 4,7±0,3* 7,5±0,3* 1,7±0,2* H. arenarium (соцветия) 10,3±0,2* 5,1±1,6* 4,7±1,03* A. micrantha (cоцветий) 3,0±0,1* Отсутствие роста Отсутствие роста Gl. glabra (корня) Контроль 244,9±5,6 139,6±1,9 200,2±2, Примечание: * — различия с контролем достоверны при р0, Как видно, грамположительные микроорганизмы (St. aureus и B. subtilis) оказались более восприимчивы к действию водных экстрактов исследуемых растений (A. micrantha, H. arenarium, Gl. glabra), чем используемые в качестве тест микроорганизмов грамотрицательные штаммы E. coli.
В результате сравнительного исследования 50% этанольных экстрактов корня Gl.
glabra из России и Италии (рисунок 2) наибольшей антибактериальной активностью в отношении E.coli обладали этанольные экстракты корня Gl. glabra из региона Калабрия.
Рисунок 2 — Сравнительная антибактериальная активность этанольных экстрактов (50%) корня солодки голой Gl. glabra В отношении остальных штаммов тест-микроорганизмов (St. aureus и B. subtilis) сильное ингибирующее действие показали 50% этанольные экстракты корня Gl.
glabra из Астраханского региона в сравнении с такими же экстрактами солодки из региона Калабрия (в 2,5 и в 1,4 раза). Определено, что при уменьшении концентрации действующих веществ вдвое, экстракт Gl. glabra из региона Калабрия имел сниженную антибактериальную активность, тогда как экстракт корня Gl. glabra, взятой из Астраханского региона, наоборот, при меньшей концентрации веществ сохранял или обладал более высоким антибактериальным действием. Это свидетельствует о необходимости исследования экстрактов методом серийных разведений для выявления минимально ингибирующей концентрации (МИК).
Следующим этапом были проведены исследования антибактериальной активности выделенных химических компонентов корней Gl. glabra, собранной в различных регионах, экстрагируемых разными растворителями (метод ДЗЗР). В качестве экстрагентов использовали этиловый спирт, этилацетат и диэтилкарбонат.
Более выраженный антибактериальный эффект в отношении всех трех штаммов микроорганизмов выявлен для диэтилкарбонатных экстрактов корня Gl. glabra из Астраханского региона, хотя наибольшая концентрация глицирризиновой кислоты (516 мг/г) обнаружена в 50% этанольных экстрактах. Однако в диэтилкарбонатном экстракте корня солодки, собранной в Астраханском регионе, содержится в 5-10 раз больше 18-глицирретовой кислоты (10,81 мг/г).
В результате фракционирования 50% этанольных экстрактов корня Gl. glabra из Астраханского региона (Россия) было получено 5 фракций;
из региона Калабрия (Италия) — 9 фракций и проведены исследования этих фракций в отношении тест микроорганизмов в методе прямой диффузии в агар и методом серийных разведений (МИК).
Обнаружено антибактериальное действие в отношении St. aureus у фракций Е4 и Е5, концентрации глицирризиновой и 18-глицирретовой кислот, в которых наибольшие, в сравнении с другими исследуемыми фракциями (рисунок 3). Причем, фракция Е4 ингибировала рост всех трех тест-микроорганизмов (St. aureus, E. coli, B.
subtilis), фракции Е3 и Е2 - E. coli и B. subtilis.
Рисунок 3 — Сравнительные исследования антибактериальной активности выделенных фракций 50% спиртового экстракта корня солодки голой Gl. glabra (Астраханский регион) (метод диффузии в агар) Минимальная ингибирующая концентрация (МИК) фракций Е2 и Е4 выше в отношении E. coli (62,5 мкг/мл), а у Е3 — в отношении B. subtilis (62,5 мкг/мл), в отношении St. aureus — у фракций Е4 (62,5 мкг/мл) и Е5 (250,0 мкг/мл) (таблица 2).
Концентрация глицирризиновой кислоты и 18-глицирретовой кислоты во фракции Е5 наибольшая (рисунок 1).
Таблица 2 — Антибактериальное действие фракций 50% этанольного экстракта корня солодки голой (Астраханский регион) (метод МИК) Фракции E.coli St. aureus B. subtilis МИК, мкг/мл E1 1000,0±0,0 1000,0±0,0 1000,0±0, 62,5±9,5* E2 1000,0±0,0 1000,0±0, 125,0±19,4* 62,5±13,9* E3 1000,0±0, 62,5±11,3* 62,5±8,9* E4 1000,0±0, E5 1000,0±0,0 250,0±21,3 1000,0±0, Примечание: * — различия с контролем достоверны при р0, Фракции корня Gl. glabra региона Калабрия G1, G5 и G6 проявили интенсивное действие против E. coli и St. aureus, фракции G2, G3 и G4 — только E. coli, а фракция G7 – только St. aureus. Среди исследуемых фракций, фракции G5 и G6 показали сильную ингибирующую активностью особенно в отношении St. aureus. B. subtilis оказался устойчивым ко всем фракциям G1-G7.
St. aureus оказался более чувствительными к фракциям 50% этанольного экстракта солодки из региона Калабрия, чем к фракциям экстракта солодки из Астраханского региона. Экстракт же солодки из Астраханского региона в отношении St. aureus в 2,5 раза активнее, чем экстракт солодки из региона Калабрия.
Величины минимальной концентрации фракций этанольного экстракта (50%) корня Gl. glabra из Астраханского региона, ингибирующих рост и развитие штаммов тест-микроорганизмов St. aureus, E. coli и B. subtilis, были меньше, чем у фракций экстрактов корня Gl. glabra из региона Калабрия (Италия). Это определяет необходимость более подробного исследования качественного и количественного состава также фракций экстракта корня калабрийской солодки. Возможно, именно невысокое содержание антибактериальных компонентов и объясняет почти полное отсутствие антибактериального действия фракций.
В результате проведенных исследований определено, что все экстракты используемых растений (Gl. glabra, A. micrantha и H. arenarium) обладали антибактериальной активностью, выраженной в разной степени. E. coli оказалась более восприимчива к исследуемым экстрактам. На используемые в качестве тест объектов штаммы грамположительных микроорганизмов (St. aureus и B. subtilis) исследуемые экстракты оказали менее выраженное действие. Экстракты соцветий A.
micrantha и H. arenarium показали также ингибирующий эффект, как и экстракты корня Gl. glabra. Проанализированные результаты дают возможность в дальнейшем применять экстракты и фракции использованных в исследовании растений в качестве антибактериальных компонентов биопрепаратов в различных биотехнологических производствах.
Одним из основных этапов производства экстрактов с антибактериальными свойствами является разработка технологии их получения и способов применения.
Технология получения жидких экстрактов из исследуемых растений, обладающих антибактериальной активностью, для создания растительных биопрепаратов состояла в следующем (рисунок 4):
1. Выбор мест произрастания и сбора растительного сырья для последующего выделения антибактериальных компонентов.
2. Сбор, обработка и сушка растительного сырья (соцветий A. micrantha, соцветий H. arenarium, корня Gl. glabra). Собранное растительное сырье тщательно промывали и высушивали в прохладном помещении, разложив тонким слоем (2—3 см) на бумаге.
3. Подготовка растительного сырья — измельчение и взвешивание необходимого количества растительного материала.
4. Приготовление экстрагента. В качестве экстрагента был выбран 50% этиловый спирт, он обеспечивает выделение основных групп биологически активных веществ.
5. Получение первичной вытяжки — жидкого экстракта. Измельченное растительное сырье помещали в стеклянные емкости из темного стекла, заливали водно-спиртовой смесью (в соотношение 1:10) и оставляли на 7 суток при постоянном перемешивании на перемешивающем устройстве (ПЭ-6300 М) при средней скорости (105 об/мин) при комнатной температуре 20—25С.
6. Очистка экстракта от балластных веществ путем фильтрации через бумажный фильтр.
7. Розлив по 30 мл по флаконам из темного стекла ФВ-30-20 по ОСТ 64-2-71-80.
8. Стерилизация экстракта и выпаривание спирта в сухо-воздушном стерилизаторе (стерилизатор воздушный ГП-40 МО) при температуре 85С три раза по 15 минут.
9. Стандартизация полученного жидкого экстракта. Стандартизацию проводят по содержанию действующих веществ или биологической активности. Содержание действующих веществ определяется химическими методами. Количественное определение суммы терпеновых и фенольных соединений проводят спектрофотометрически (более точный, но более дорогостоящий – метод ВЭЖХ).
Биологическую активность полученного жидкого экстракта определяют биологическими методами. В данном случае, проводят скрининг экстракта на антибактериальную активность согласно биологическим методам контроля (ГФ XII, МУК 4.2.1890-04). Используют метод серийных разведений или метод диффузии в агар.
Содержание спирта, плотность, тяжелые металлы и сухой остаток определяют по методикам ГФ XI.
10. Укупоривание флаконов пробками из полиэтилена по ГОСТ 163-37-77 с навинчиваемыми пластмассовыми крышками по ОСТ 64-2-87-81.
Полученные фракции и жидкие экстракты корня Gl. glabra, соцветий A. micrantha и H. arenarium с антибактериальными свойствами можно использовать в качестве компонентов растительных биопрепаратов как фармацевтического, так и косметического направления, а также как самостоятельные антибактериальные средства.
ВР 1.1. Санитарная подготовка помещения отходы ВР 1. Санитарная ВР 1.2. Санитарная подготовка подготовка персонала производства Кт, Км в канализацию ВР 1.3. Санитарная подготовка оборудования ВР 2.1. Подготовка дистиллированной воды ВР 2. Подготовка сырья ВР 2.2. Приготовление Потери и экстрагента Кт, Кх, Км 50% этанола механические ВР 2.3. Измельчение и взвешивание растительного сырья ВР 3. Подготовка Стеклотара на УМО 5.1.
стеклотары, оборудования Кт, Кх ТП 4.1. Получение этанольного извлечения ТП.4. Получение ТП 4.2. Фильтрование жидкого экстракта Кт, Шрот в отброс Кх, Км ТП 4.3. Выпаривание ТП 4.4. Стерилизация УМО 5.1. Фасовка УМО 5. Фасовка, Потери маркировка, упаковка УМО 5.2. Маркировка и механические Кт, Кх, Км упаковка Готовую продукцию на склад ВР — вспомогательные работы, ТП — технологический процесс, УМО — упаковка, маркировка и отгрузка, Кх — химический контроль, Кт — технологический контроль, Км — микробиологический контроль Рисунок 4 — Технологическая схема получения жидкого экстракта ВЫВОДЫ Анализ информационных источников и материалов собственных 1.
исследований по свойствам и химическому составу исследуемых растений — тысячелистника мелкоцветкового A. micrantha и цмина песчаного H. arenarium, а также солодки голой Gl. glabra — обосновывает выбор данных растений с целью практического их использования в качестве сырья для получения жидких экстрактов и отдельных биологически активных компонентов в виде фракций с антибактериальным действием.
2. Среди изучаемых экстрагентов 50% раствор этилового спирта явился оптимальным растворителем для выделения антибактериальных компонентов (флавоноидов, терпеноидов) из соцветий A. micrantha и H. arenarium и из корней Gl.
glabra. Разработан метод и оптимизированы параметры получения с помощью данного растворителя экстракта, содержащего необходимое количество основных действующих веществ с антибактериальными свойствами. Так, экстракт корня Gl.
glabra содержит глицирризиновую кислоту в количестве 514 мг/г, 18 глицирретовую кислоту — 110-4-410-4 мг/г, глабридин — 33 нг/мкл. Также оптимальным экстрагентом для выделения антибактериальных компонентов из корней Gl. glabra явился раствор диэтилкарбоната.
3. Определены наиболее эффективные методы хроматографического разделения и подобран оптимальный элюент — спиртовой раствор (1%) аммиака (в 90% этаноле) для выделения необходимых химических компонентов из водных и 50% спиртовых экстрактов исследуемых растений.
4. Наиболее выраженный антибактериальный эффект выявлен для экстракта Gl. glabra из Астраханского региона, в котором также было обнаружено повышенное содержание глицирризиновой кислоты. Вероятно, это вызвано тем, что на качественный и количественный состав биологически активных веществ растений оказывают влияние климато-географические условия места произрастания, в частности, особенности аридной зоны Астраханского региона.
5. Определены наиболее оптимальные биотехнологические параметры для получения с использованием в качестве экстрагента 50% водного раствора этилового спирта для получения экстрактов из соцветий A. micrantha и H. arenarium, содержащих набор терпеновых соединений, обычно выделяемых в составе эфирных масел.
6. Разработаны наиболее эффективные методы получения экстрактов с антибактериальным действием всех исследуемых растений — A. micrantha, H.
arenarium и Gl. glabra. Среди 50% этанольных экстрактов наибольшей ингибирующей активностью обладает экстракт корня Gl. glabra из Астраханского региона в отношении E. coli.
7. Предложены биотехнологические схемы производства жидких экстрактов соцветий тысячелистника мелкоцветкового Achillea micrantha, соцветий цмина песчаного Helichrysum arenarium и корня солодки голой Glycyrrhiza glabra для производства в качестве антибактериальных компонентов биопрепаратов.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Астафьева О.В., Сухенко Л.Т., Егоров М.А. Особенности 1.
экстрагирования и применения БАВ с противомикробным действием // Биотехнологические процессы в народном хозяйстве: Материалы Региональной научной конференции, 15—16 апреля 2008 г. — Астрахань: Издательский дом «Астраханский университет», 2008. — С. 6—8.
Блинников В.В., Астафьева О.В., Сухенко Л.Т., Егоров М.А.
2.
Использование противомикробных биологически активных веществ растений в косметических моющих средствах // Материалы Международной конференции с элементами научной школы для молодежи, 7-10 декабря 2010 г. — Астрахань:
Издательский дом «Астраханский университет», 2010. — С. 323—325.
Астафьева О.В., Сухенко Л.Т. Исследование свойств противомикробных 3.
компонентов растений Астраханской области и возможность их использования в косметических продуктах // Настоящее и будущее биотехнологии в решении проблем экологии, медицины, сельского, лесного хозяйства и промышленности: Сборник научных трудов научно-практического семинара с международным участием, 18— мая 2011г. — Ульяновск: УлГУ, 2011. — С. 98—100.
Астафьева О.В., Новиченко О.В. Применение экстрактов из высших 4.
водных и наземных растений Астраханского региона для нужд косметологии // VI Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития»: материалы VI Московского международного конгресса, часть 1, 21— марта, 2011 г. – М.: ЗАО «Экспо-биохим-технологии», РХТУ им Д.И. Менделеева, 2011. — С. 307—308.
Астафьева О.В., Новиченко О.В. Изучение возможности применения 5.
в косметических средствах экстрактов некоторых водных и наземных растений Астраханской области // Естественные науки. — 2011. — № 3 (36). — С. 76—81 (из перечня ВАК РФ).
Астафьева О.В., Сухенко Л.Т. Исследование свойств и химического 6.
состава экстрактов растений Астраханской области с противомикробными свойствами и возможности их применения в косметических средствах // Актуальные проблемы науки, Сборник научных трудов по материалам Международной научно практической конференции 27 сентября 2011 г., часть 6. — Тамбов: Изд-во ТРОО «Бизнес-Наука-Общество», 2011. — С. 12—13.
7. Astafieva O.V., Novichenko O.V., Egorov M.A. The Possibility of Use of Extracts from Higher Hydrophytes and Geophytes of the Astrakhan Region for the Needs of Cosmetology // Biochemistry and Biotechnology: Research and Development Binding: Hardcover. — USA, 2012. — P. 147—152.
Астафьева О.В. Исследование свойств выделенных биологически 8.
активных веществ экстрактов некоторых растений Астраханского региона // Биотехнология. Взгляд в будущею. Сборник трудов международной Интернет коференции, 17—19 апреля 2012 г. — Казань: Изд-во «Казанский университет», 2012.
— С. 27—28.
Астафьева О.В. Исследование противомикробных свойств биологически 9.
активных компонентов растительных экстрактов и возможности их применения // «Биология – наука XXI века»: материалы международной конференции, 24 мая года, ред. Р.Г. Василов. — М.:МАКС Пресс, 2012. — С.71—73.
Арзамаскова Е.А., Астафьева О.В. Исследование противомикробной 10.
активности водных экстрактов и эфирных масел из растительного сырья на примере шалфея сухостепного (Salvia tesquicola) и солодки голой (Glycyrrhiza glabra) // Интеллектуальный потенциал XXI века: ступени познания: Сборник материалов ХI Молодежной международной научно-практической конференции / Под общ. ред. С.С.
Чернова. — Новосибирск: Издательство НГТУ, 2012. — С. 13—16.
Астафьева О.В. Исследование противомикробных свойств биологически 11.
активных веществ из растительных компонентов // Всероссийская молодежная конференция «Инновации и технологии Прикаспия». Всероссийская научно практическая конференция «Исследования молодых ученых – вклад в инновационное развитие России» (г. Астрахань, 10 — 13 октября 2012г.). — Астрахань: Астраханский государственный университет, Издательский дом «Астраханский университет», 2012.
— Т. 1. — С. 234—235.
Астафьева О.В. Исследование возможности применения 12.
биологически активных компонентов растительных экстрактов в производстве препаратов для нужд косметологии и фармакологии // Современные проблемы науки и образования. — 2012. — №6. — URL: http://www.science education.ru/106-7480 (из перечня ВАК РФ).
13. Bataeva Y., Dzerzhinskaya I., Egorov M., Magzanova D., Astafyeva O.
Growth-Promoting and Fungicide Characteristics of Cyanobacterial Communities from Ecosystems of the Astrakhan Region // Journal of Agriculture and Food Technology. — 2012. — 2 (12). — P. 184—187.
14. Fabris S., Bertelle M., Astafyeva O., Gregoris E., Zangrando R., Gambaro A., Lima G. P. P., Stevanato R.. Antioxidant properties and chemical composition relationship of europeans and brazilians propolis // Pharmacology & Pharmacy. — 2013. — 4. — P. 46— 51.
Астафьева О.В., Егоров М.А., Сухенко Л.Т. Влияние растительных 15.
экстрактов и биокомпонентов из солодки голой Glycyrrhiza glabra, цмина песчаного Helichrysum arenarium и тысячелистника мелкоцветкового Achillea micrantha аридной зоны // VII Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития»: материалы VII Московского международного конгресса, часть 1 (Москва, 19-22 марта, 2013 г.). — М.: ЗАО «Экспо-биохим-технологии», РХТУ им Д.И. Менделеева, 2013. — С. 265—266.
Астафьева О.В. Исследование противомикробной активности и 16.
химического состава экстрактов корня солодки голой Glycyrrhiza glabra, соцветий цмина песчаного Helichrysum arenarium и тысячелистника мелкоцветкового Achillea micrantha для использования их в качестве противомикробных компонентов биопрепаратов // VII Московский международный конгресс «Биотехнология:
состояние и перспективы развития»: материалы VII Московского международного конгресса, часть 1 (Москва, 19-22 марта, 2013 г.). — М.: ЗАО «Экспо-биохим технологии», РХТУ им Д.И. Менделеева, 2013. — С. 279—280.
Астафьева О.В., Сухенко Л.Т. Сравнительная антибактериальная 17.
активность экстракта корня солодки голой Glycyrrhiza glabra L. и выделенных из него химических компонентов // Фундаментальные и прикладные проблемы получения новых материалов: исследования, инновации и технологии. Материалы VII международной научно-практической конференции для молодых ученых 23-25 апреля 2013 г. / сост. Матвеева Э.Ф., Садомцева О.С. — Астрахань: издатель Сорокин Роман Васильевич, 2013. — С. 15 —16.
Астафьева О.В., Сухенко Л.Т., Егоров М.А. Противомикробная 18.
активность выделенных биологически активных веществ и экстракта корня Glycyrrhiza glabra L. // Химия растительного сырья. — 2013. — №3.— С. 67— (из перечня ВАК РФ).
ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ ВКПМ - Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография ГОСТ - государственный стандарт ГФ - государственная фармакопея ГХ/МС - газовая хроматография-масс-спектрофотометрия ДЗЗР - диаметр зоны задержки роста КОЕ - колониеобразующая единица МИК - минимальная ингибирующая концентрация МУК - методические указания ОМЧ - общее микробное число ОСТ - отраслевой стандарт ТСХ - тонкослойная хроматография УФ - ультрафиолетовая область ФВ - флакон винтовой ФГУП - Федеральное государственное унитарное предприятие ГосНИИ Государственный научно-исследовательский институт генетики и Генетика селекции промышленных микроорганизмов - Линней L.
-УФ-видимая спектроскопия UV-Vis - разновидность var.
- Вильденов Willd.
Подписано в печать 16.10.2013 г. Формат 6090/ Гарнитура Times New Roman. Усл. печ. л. 1, Тираж 100 экз.
Отпечатано в Астраханской цифровой типографии (ИП Сорокин Роман Васильевич) 414040, Астрахань, пл. К. Маркса, 33, 5-й этаж Тел./факс (8512) 54-00-11, e-mail: [email protected]