Использование молекулярных маркеров для анализа полиморфизма генома перца и оптимизации селекционного процесса
На правах рукописи
СНИГИРЬ ЕКАТЕРИНА АНДРЕЕВНА
Использование молекулярных маркеров для анализа полиморфизма
генома перца и оптимизации селекционного процесса
Специальности: 03.02.07 – генетика
06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Москва – 2013 1
Работа выполнена в лаборатории селекции и семеноводства пасленовых культур Всероссийского научно-исследовательского института селекции и се меноводства овощных культур Российской академии сельскохозяйственных наук и в лаборатории системной биологии растений Учреждения Российской академии наук Центр «Биоинженерия» РАН Научные руководители:
доктор биологических наук, профессор Кочиева Елена Зауровна доктор сельскохозяйственных наук Пышная Ольга Николаевна
Официальные оппоненты:
Кудрявцев Александр Михайлович, доктор биологических наук, Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук, заместитель директора по научной работе Игнатова Светлана Ильинична, доктор сельскохозяйственных наук, профессор, Всероссийский научно-исследовательский институт овощеводства Российской академии сельскохозяйственных наук, заведующая лабораторией селекции пасленовых культур
Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский институт растениеводства им. Н.И. Вавилова Российской академии сельскохо зяйственных наук
Защита состоится 25 сентября 2013 г. в 14-30 часов на заседании диссерта ционного совета Д220.043.10 при Российском государственном аграрном уни верситете – МСХА имени К.А.Тимирязева по адресу 127550, г. Москва, ул. Прянишникова, д. 15, тел/факс (499) 976-24-92, e-mail: [email protected]
С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке им. Н.И. Железнова РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева.
Автореферат разослан 23 августа 2013 г.
Ученый секретарь диссертационного совета Л.С. Большакова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Перец (род Capsicum) в настоящее время является одной из основных овощных культур. В настоящее время перец (как острый, так и сладкий) возделывается во всех странах земного шара, где климатические условия позволяют вести промышленную культуру. Площадь под перцем в мире в 2010 году составила 1,86 миллионов гектар, а мировое товарное производство перца составляет около 27,55 миллионов тонн (FAO, 2010). Перец является «рекордсменом» среди овощей по содержанию витамина С и Р-активных веществ, в 5-10 раз превосходя такие традиционные овощные культуры, как томат и баклажан. Хорошие вкусовые и диетические качества плодов обеспечивают устойчивый постоянный спрос на них в течение всего года, - и это приводит к востребованности новых сортов с различными характеристиками. Ежегодно создаются десятки новых сортов и гибридов перца классическими методами с комплексом хозяйственно ценных признаков.
В настоящее время для ускорения отдельных этапов селекционного процесса и повышения эффективности отбора наиболее рациональным считается применение высокоточных, быстрых и надежных молекулярно-генетических методов. В семеноводстве для определения степени гибридности при получении коммерческих гибридов, а также для контроля сортовой чистоты при размножении сортов, отдельное значение приобретают молекулярные маркеры и разработанные на их основе молекулярно-генетические паспорта. В связи с введением в действие законов РФ «О селекционных достижениях» создание молекулярно-генетических паспортов сортов сельскохозяйственных культур имеет особое значение, в том числе и для защиты авторских прав селекционеров.
На сегодняшний момент оценка полиморфизма как всего генома, так и его отдельных функциональных участков осуществляется с помощью современных методов молекулярного маркирования (AFLP, SSR, RAPD, SSAP, ISSR, SNP и др.).
Полученные данные применяются для подбора родительских форм, генотипирования сортов и линий, идентификации ценных генотипов, а также для маркирования отдельных генов и локусов растений. В последние годы в связи с тенденцией увеличения потребления перца и количества новых сортов проблема геномной идентификации сортов становится особенно актуальной, но, несмотря на это, в России не проводилось целенаправленной научно-исследовательской работы по созданию систем молекулярного маркирования генотипов сортов перца отечественной селекции. Молекулярная идентификация сортов с помощью созданных маркерных систем могла бы стать основой Государственного реестра отечественных сортовых стандартов.
Все вышесказанное определяет актуальность разработки систем молекулярной идентификации геномов отечественных сортов перца и оценку их геномной вариа бельности.
Цель и задачи работы. Цель работы - разработка систем маркирования генома культурных видов Capsicum для оценки генетического полиморфизма и получения молекулярных маркеров для идентификации сортов перца отечественной селекции, а ткже для ускорения отдельных этапов селекционного процесса.
В соответствии с целью поставлены следующие задачи:
Используя молекулярные системы маркирования (мультилокусное AFLP маркирование, система микросателлитных SSR маркеров) определить уровни вариабельности генома образцов рода Capsicum, включающих сорта C.annuum отечественной и зарубежной селекции, а также гибриды F1;
Для каждого микросателлитного локуса определить аллельный состав и частоту встречаемости каждого аллеля у сортов перца отечественной и зарубежной селекции;
На основе определенных аллельных вариантов микросателлтиных локусов составить молекулярно-генетические паспорта анализируемых сортов;
По результатам молекулярно-генетического анализа подобрать родительские пары и провести скрещивания;
определить ОКС и СКС родительских форм и эффект гетерозиса у гибридных комбинаций;
Определить и проанализировать последовательности генов глюканфосфорилазы, инвертазы и сахарозосинтазы у перца, выявить уровень полиморфизма и аллельные варианты.
Научная новизна. Впервые с помощью молекулярных методов маркирования (SSR, AFLP) генома охарактеризовано генетическое разнообразие сортов Capsicum annuum отечественной селекции, а также образцов родственных видов. С использованием отобранных SSR маркеров разработана система (минимальный набор локусов) для идентификации сортов перца и анализа гибридных комбинаций.
Для каждого сортообразца получены индивидуальные SSR спектры, которые могут стать основой паспортизации сортов.
На основе систем AFLP и SSR маркирования впервые проведено молекулярное генотипирование сортов перца отечественной селекции.
Впервые были определены и проанализированы последовательности генов глюканфосфорилазы, инвертазы и сахарозосинтазы у перцев, определен уровень полиморфизма и аллельные варианты.
Практическая значимость. Результаты AFLP анализа позволяют обоснованно подходить к подбору родительских форм для скрещиваний, прогнозировать эффект гетерозиса и оптимизировать селекционный процесс за счет сокращения вовлекаемого в него селекционного материала.
Молекулярные микросателлитные маркеры и разработанные на их основе молекулярно–генетические паспорта сортов могут применяться для контроля сортовой чистоты и определения степени гибридности при получении коммерческих гибридов, а также обеспечивают защиту авторских прав селекционера.
Исследование вариабельности генов может быть использовано для выявления и маркирования аллельных вариантов ассоциированных с содержанием сахаров в плодах и холодоустойчивостью.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на II Международной конференции «Современные тенденции в селекции и семеноводстве овощных культур» (Москва, 2010), III Moscow International Conference «Molecular Phylogenetics III» (Moscow, 2012), 16th Evolutionary Biology meeting (France, 2012).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ, из них 4 - в рецензируемых научных журналах и 3 – в сборниках статей материалов конференций.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 155 печатных стра ницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, из ложения результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 194 наименования. Работа содержит 33 таблицы и 27 ри сунков.
Объекты и методы исследования.
Объекты исследования. В работе были использованы образцы перца сладкого C.annuum (26 сортов отечественной селекции и 19 сортов зарубежной) и видов C.frutescens, C.chinense, C.baccatum, C.pubescens, C.galapagoense, C.eximium, C.cardenasii, C.chacoense, C.praetermissum, C. tovarii, а также 21 комбинация межсортовых гидридов F1.
Обработку экспериментальных данных проводили методами дисперсионного анализа по Б.А. Доспехову (1985) с помощью программы Мicrosoft Excel. Анализ комбинационной способности родительских линий определяли по методу Б. Гриф финга (Griffing, 1956). Эффект гетерозиса определялся как достоверное превышение гибридом лучшего родителя (истинный гетерозис). Степень доминантности количе ственных признаков определялась по формуле Д. Брюбейкера (1966).
SSR анализ проводили по стандартной методике (Minamiyama et al., 2006).
Анализ микросателлитов проводили в денатурирующем 6%-ном ПААГ с последующей визуализацией ДНК фрагментов путем окрашивания геля нитратом серебра. Результаты анализа фрагментов в ПААГ были подтверждены анализом первичных последовательностей выявленных аллельных вариантов, - методом прямого сиквенирования.
AFLP анализ проводили по стандартной схеме (Vos et al., 1995) Разделение и анализ AFLP фрагментов в 6%-ном ПААГ проводили с использованием системы LI COR DNA Аnalyzer 4300 (Biosciences, USA). В качестве метки для AFLP праймеров использовали флуорофоры IRD700 и IRD800.
Статистическая обработка спектров. Определение генетических различий ис следованных генотипов перца проводили с использованием программ MEGA 5.0, TREECON, STATISTICA, PAUP.
Результаты исследований и их обсуждение Анализ генома сортов перца Capsicum annuum и его близкородственных видов методом AFLP Для оценки вариабельности всего генома в целом был использован метод AFLP анализа. Из 20, взятых в анализ вариантов праймер/фермент, было отобрано восемь EcoRI/TruI праймерных комбинаций, которые характеризовались достаточным уров нем информативности, то есть позволяли детектировать оптимальное число фрагмен тов на полиакриламидном геле и выявлять межсортовой полиморфизм. Использова ние отобранных праймерных комбинаций позволило получить для каждого образца перца воспроизводимые специфичные полиморфные спектры AFLP фрагментов (рис.1).
Общее число выявленных AFLP фрагментов составило 1009, длины которых ва рьировали от 80 до 550 н.п. Для всего набора генотипов было обнаружено 956 поли морфных фрагментов и, таким образом, полиморфизм составил 94,8 %.
-450 п.н.
- 200 п.н.
виды перца сорта С.anuumm Рис. 1. AFLP-спектры видов и сортов Capsicum, полученные при использовании праймерной комбинации E-AGG/T-CTG (представлен фрагмент геля) Таблица Характеристика AFLP-комбинаций праймер/фермент Комбинация Число амплифицированных фрагментов Число сорто праймер/фермент спе Сорта C.annuum+виды Сорта C.annuum цифичных Полиморфные Всего Полиморфные(%) Всего (EcoRI/TruI) фрагментов (%) E-ACA/T-ACT 129 (97,7%) 132 35 (53%) 66 E-AGG/T-ACT 133 (95,7%) 139 36 (56,3%) 64 E-ACA/T-CGA 97 (97%) 100 13 (35,1%) 37 E-AGG/T-CGA 97 (95,1%) 102 15 (38,5%) 39 E-ACA/T-CTA 99 (86,8%) 114 9 (19,2%) 47 E-AGG/T-CTA 151 (97,4%) 155 27 (49,1%) 55 E-ACA/T-CTG 106 (96,4%) 110 7 (31,8%) 22 E-AGG/T-CTG 144 (91,7%) 157 40 (57,1%) 70 Всего: 956 (94,8%) 1009 182 (45,5%) 400 Для сортов C.annuum было получено 182 полиморфных фрагмента (табл.1).
При этом каждый из исследованных генотипов был дифференцирован. Наибольшую эффективность в выявлении сортового полиморфизма показали праймерные комби нации E-AGG/T-CTG и E-ACA/T-ACT. Процент полиморфных фрагментов, детекти рованных с их помощью, составил 57,1 и 53,0 соответственно. Для всего набора гено типов, включающих как сорта, так и образцы видов, наиболее информативными ока зались праймерные пары Е-ACA/T-ACT и E-ACA/T-CTA, и выявленный с их помо щью полиморфизм составил 97,7% и 86,8%, соответственно.
При использовании восьми праймерных комбинаций для 24 сортов C.annuum было выявлено 42 сортоспецифичных фрагмента, - и для каждого сорта были получе ны уникальные AFLP спектры. Наибольшее число специфических фрагментов харак теризовало геномы сортов Пирати, Каскад, Хризолит и Златозар. Идентифицирован ные сортоспецифичные AFLP фрагменты в дальнейшем могут быть модифицированы в SCAR маркеры этих сортов.
На основе комплекса полученных данных при использовании восьми AFLP праймерных комбинаций были рассчитаны коэффициенты межсортовых генетиче ских различий. Согласно рассчитанным коэффициентам уровень межсортовых гене тических различий был невысок и не превышал 0,07, - уровень межсортовых генети ческих различий варьировал в пределах от 0,005 (сорта Мазурка и Пурпурная краса вица) до 0,066 (сорта Каскад и Медаль), - что говорит о значительной консервативно сти генома C.annuum и, в частности, о генетической однородности используемых в мировой селекции сортов сладкого перца. Такой низкий уровень сортового генетиче ского полиморфизма, с одной стороны, может отражать консервативность генома культивируемого вида C.annuum, связанную с самоопылением, а с другой - может быть обусловлен ограниченностью генетического пула, используемого в селекции крупноплодных сортов перца сладкого. Полученные результаты подтверждают дан ные ряда авторов, использовавших для анализа техники мультилокусного маркирова ния RAPD и AFLP. В работе Paran et al., (1998) также отмечался крайне низкий уро вень генетического разнообразия, практически нулевого, между крупноплодными сортами перца. В работе Aktas et al. (2009) отмечено отсутствие значительных разли чий между европейскими крупноплодными сортами, при этом несколько больший полиморфизм был выявлен для местных сортов и образцов из Турции (GD=0,079), а также для некоторых мелкоплодных острых сортов перца различного происхождения (GD=0,07).
Как и ожидалось, выявленные генетические расстояния, характеризовавшие раз личия между сортами C.annuum и видами C.frutescens, C.chinense, C.baccatum, были существенно выше и составили 0,43, 0,46 и 0,43, соответственно. При достаточно вы соком родстве C.annuum- C.frutescens - C.chinense, относящихся к одному эволюцион но-филогенетическому комплексу annuum, детектированные различия между видами этого комплекса могут указывать на существование генетического потенциала разно образия, который может быть использован в селекции современных сортов перца C.annuum за счет межвидовой гибридизации.
Рис. 2. Дендрограмма генетических различий исследованных 48 генотипов перца, построенная на основе использования 8 AFLP праймерных пар (в узлах обозначены ИБ50%) На основе данных о генетическом полиморфизме сортов и образцов видов перца была построена дендрограмма, отражающая сходство изучаемых генотипов (рис. 2).
Как видно из дендрограммы, базальное положение занял представитель вида C.baccatum (генетический комплекс baccatum). Представители культурных видов (C.annuum, C.frutescens, C.сhinense), относимых к генетическому комплексу annuum, формировали один общий кластер, в котором C.frutescens и C.chinense объединяются вместе (ИБ 75%), в то время как сорта C.annuum образовывали отдельную малополи морфную группу (ИБ 100%). В целом топология кластера C.annuum в полной мере отражает низкий уровень детектированной сортовой вариабельности и консерватив ность генома C.annuum.
Таким образом, в результате AFLP маркирования 48 образцов рода Capsicum были подобраны комбинации AFLP праймеров и ферментов, позволяющих получить полиморфные ДНК спектры для сортов C.annuum наиболее широко используемых в отечественной селекции перца сладкого. Показано, что с помощью двух праймерных комбинаций можно дифференцировать генотипы всех 45 сортов. Для каждого сорта получены специфичные спектры фрагментов. Для 24 сортов получены сортоспеци фичные AFLP фрагменты, которые могут быть преобразованы сортоспецифичные монолокусные ДНК маркеры. При этом показан крайне низкий уровень генетического полиморфизма и высокая консервативность генома Очевидно, C.annuum.
что существует необходимость в расширении генетической основы для отечествен ных и зарубежных сортов перца с привлечением более полиморфных источников, близкородственных дикорастущих (C.baccatum) и культурных видов (C.annuum, C.frutescens, C.сhinense), образцов C.annuum из центров происхождения и других ди вергентных локальных популяций.
Микросателлитный SSR анализ генома сортов перца C.annuum и близкородственных видов Сapsicum.
Для проведения SSR маркирования генома 48 образцов рода Capsicum из 21 SSR локуса генома перца было отобрано четыре (С1а, С3, С5, С9а), наиболее информа тивных и локализованных на разных хромасомах. Для выявления аллельных вариан тов анализируемых микросателлитных локусов перца и верификации результатов анализа полученные ПЦР продукты амплификации разделялись на агарозном (рис. 3) и 6%-ном денатурирующем полиакриламидном геле (рис. 4).
Рис. 3. SSR аллели локуса C3 у 45 сортов C.annuum и образцов видов перца C.frutescens, C.chinense, C.baccatum (1.7% агарозный гель, маркер- 100bpLadder, Frementas) - 150 п.н.
Рис. 4. SSR аллели локуса С3 у 45 сортов C.annuum и образцов видов перца C.frutescens, C.chinense, C.baccatum (6% денатурирующий ПААГ) Для определения точных размеров аллельных вариантов SSR локусов проводили прямое секвенирование ПЦР продуктов амплификации. Были определены ДНК по следовательности отобранных локусов, каждая из полученных нуклеотидных после довательностей содержала ожидаемый микросателлит, длина которого у исследован ных образцов варьировала и определялась числом повторяющихся единиц микроса теллита. Кроме того были выявлены точковые замены, также определяющие аллель ный полиморфизм исследованных SSR локусов.
Характеристика полиморфизма микросателлитного локуса С3. Для микросателлитного локуса С3, локализованного в III хромосоме (Minamiyama et al., 2006), разброс длин варьировал в пределах 141-171 п.н. Всего было выявлено аллельных вариантов локуса (табл. 2,рис. 5). Размер наиболее часто встречающегося аллеля А составил 157 п.н., и он был идентифицирован у 18 сортов перца сладкого, а также у образца вида С.frutescens. Аллель С (159 п.н.) был характерен для 11 сортов C.annuum. Размер аллеля В составил 171 п.н. и он был идентифицирован у 14 сортов.
Среди сортов редкий аллель D размером 169 п.н. был детектирован у сорта Ежик.
Кроме того, у аллелей B и D была идентифицирована точковая замена Т/А, которая привела к возникновению нового типа микросателлита вместо основного (TС)n(TС)nAC(TС)n. Аллели E (147 н.п.) и F (141 п.н.) характеризовали генотипы образцов видов C.chinense и C.baccatum.
B D C A E F Рис. 5. Первичные последовательности аллельных вариантов микросателлита С Таблица Аллельный состав микросателлитного локуса С3 у 48 генотипов перца Тип локуса Размер локуса Состав локуса 157 пн (tс) A 171 пн (tс)20ac(tс) B 159 пн (tс) C 169 пн (tс)19ac(tс) D 147 пн Е (tс) 141 пн (tс) F Характеристика полиморфизма микросателлитного локуса С1а. Для локуса C1a, локализованного в I хромосоме (Minamiyama et al., 2006), разброс длин анализируемых образцов варьировал в пределах 243-259 п.н. Было выявлено аллельных вариантов (рис. 6, табл. 3). Наиболее распространённый аллель А (245 п.н.) был идентифицирован у 20 сортов. Размер аллеля В составил 243 п.н. и он был выявлен у 19 сортов. Редкий аллель D длиной 247 п.н. был детектирован только у сортов Медаль и Раиса. У сортов Здоровье, Мадона, Маркони пепер и Шарм был выявлен аллель C (259 п.н.). Уникальные аллель Е локуса С1а размером 600 п.н.
характеризовал генотип вида C.chinense.
E C D A B Рис. 6. Первичные последовательности аллельных вариантов микросателлита С1а Таблица Аллельный состав микросателлитного локуса С1а у 48 генотипов перца Тип локуса Размер локуса Состав локуса 245 пн (ta)7tgtc(tg)11aa (tg) A 243 пн (ta)6tgtc(tg)11aa (tg) B 259пн (ta)10 (tg)17aa (tg) C 247 пн (ta)8tgtc(tg)11aa (tg) D 600 пн Е (ta)14 (tg)16aa (tg) Интересно, что помимо специфического микростеллита этот локус у C.chinense содержал 335-нуклеотидную инсерцию. У видов и C.frutescens C.baccatum последовательность данного локуса не амплифицировалась, что, скорее всего, связано с точковыми мутациями во фланкирующих микросателлит последовательностях.
Характеристика полиморфизма микросателлитного локуса С5. Для локализованного в V хромосоме локуса С5 (Minamiyama et al., 2006) разброс длин варьировал в пределах 143-161 п.н. Локус был представлен четырьмя аллельными вариантами (рис. 7, табл. 4), наиболее часто встречающийся из которых был аллель А (161 п.н.), выявленный у 27 сортов сладкого перца (табл. 7). Размер аллеля В составил 155 п.н., и он был детектирован у 13 сортов, а также у образцов C.chinense и C.baccatum. Аллель С также размером 155 п.н. был идентифицирован у 5 сортов.
А B C D Рис. 7. Первичные последовательности аллельных вариантов микросателлита С Таблица Аллельный состав микросателлитного локуса С5 у 48 генотипов перца Тип локуса Размер локуса Состав локуса 161 пн (gt)3а(ta)7(tg) A 155 пн (gt)3а(ta)5(tg) B 155 пн (gt)3а(ta)4(tg) C 143 пн (ta)3(tg) D Данные аллели, несмотря на то, что имели одинаковую длину, представляли собой два разных по первичной последовательности микросателлита, различить которые на ПААГ было бы невозможно. Кроме того в последовательности фланкирующей микросателлитный локус в положении 94 была выявлена точковая замена A/G. Специфический аллель D размером 143 п.н. был обнаружен у вида C.frutescens. У этого аллеля, вследствие точковых замен, отсутствует первая часть микросателлита (GT)3A.
Характеристика полиморфизма микросателлитного локуса С9а. Для локуса С9а, локализованного в IX хромосоме (Minamiyama et al., 2006), разброс длин микросателлита варьировал в пределах 326-335 п.н. Было выявлено 4 аллельных варианта (рис. 8, табл. 5). У большинства сортов (31) был детектирован аллель А ( п.н.). Размер аллеля В составил 335 п.н. и он был идентифицирован у 9 сортов. Аллель С локуса С9а размером 329 п.н. был выявлен у сортов Раиса, Мазурка, Медаль и Пирати. Также был выявлен сортоспецифичный аллель D (326 п.н.) у сорта Каскад. У видов C.frutescens, C.chinense и C.baccatum локус С9а не амплифицировался.
B A C D Рис. 8. Первичные последовательности аллельных вариантов микросателлита С9а Таблица Аллельный состав микросателлитного локуса С9а у 48 генотипов перца Тип локуса Размер локуса Состав локуса 332 пн (aag)21aac(aag)10aac(aag) A 335 пн (aag)22aac(aag)10aac(aag) B 329 пн (aag)21aac(aag)9aac(aag) C 326 пн (aag)20aac(aag)9aac(aag) D В результате маркирования 48 образцов рода были SSR Capsicum амплифицированы и, путем прямого секвенирования ПЦР фрагментов, определены ДНК последовательности 4 SSR локусов С1а, С3, С5 и С9а. Каждая из полученных нуклеотидных последовательностей содержала ожидаемый микросателлит, длина которого у исследованных образцов варьировала и определялась числом повторяющихся единиц микросателлитной последовательности. Кроме того, были выявлены точковые замены, также определяющие аллельный полиморфизм исследованных микростеллитных локусов. При этом были определены преобладающие и уникальные аллели исследованных локусов и установлены их точные размеры. Всего по четырем микросателлитным локусам у исследованного набора образцов перца было выявлено 19 аллелей (в среднем 4,7 аллелей на локус).
Наибольшее число аллелей (6) для данного набора генотипов было детектировано для локуса С3, наименьшее (4) для локусов С5 и С9а.
Сравнение частот встречаемости аллелей SSR локусов сортов перца C.annuum отечественной и зарубежной селекции Частоты встречаемости выявленных аллелей несколько различались у отечественных и зарубежных сортов. По локусам С1а и С3 у российских сортов преобладал аллель А, а у европейских сортов наиболее часто встречался аллель В. По локусу С5 у отечественных сортов преобладал аллель В, в то время как у всех исследованных европейских сортов присутствовал только аллель А этого локуса. По локусу С9а и у всех сортов наиболее часто встречающимся был аллель A (рис. 9).
Частоты аллелей SSR локусов у сортов перца Частоты аллелей SSR локусов у европейских сортов C.annuum отечественной селекции перца C.annuum A 80 A A 60 A Частота, % Частота, % B A 50 B B A A 40 B A B B B C C C B B C A A 20 C C 20 C D D 10 D CD D CD D BC D 0 C1a C3 C5 C9a C1a C3 C5 C SSR локусы SSR локусы а) б) Рис. 9. Частоты встречаемости SSR локусов у сортов перца C.annuum а)отечественной селекции;
б) европейских сортов Были определены коэффициенты информативности исследованных микросателлитных локусов, которые также различались для групп российских и европейских сортов. Наиболее информативным в выявлении сортового полиморфизма российских сортов оказались локусы С3 и С5, а для европейских сортов наиболее эффективными оказались локусы С1а и С3 (табл. 6).
Таблица Коэффициенты информативности микросателлитных локусов С1а, С3, С5 и С9а Локус Число аллелей Величина PIC Число аллелей Величина Величина PIC Величина PIC (весь набор) (весь набор) (сорта PIC (сорта (отечественные (европейские С.annuum) сорта) сорта) C.annuum) 5 0.63 4 0.61 0. C1a 0. 6 C3 0.69 0.67 0.62 0. 4 0.58 3 0.55 0. C5 0. 4 0.47 4 0.47 0.43 0. C9a Таблица 7. Аллельные варианты микросателлитных локусов сортов C.annuum Сорта и виды рода С 1а С3 С5 С9а Capsicum A B C D A B C D A B C A B C D Размеры SSR фрагмента, п.н. 245 243 259 247 157 171 159 169 161 155 155 332 335 329 Калифорнийское Чудо + + + + Мадонна + + + + Spady + + + + Рубин + + + + SaladFestival + + + + Marconipepper + + + + Chimes + + + + Раиса + + + + Пурпурная красавица + + + + Мазурка + + + + Оранжевое Чудо + + + + Pirati + + + + Memphis + + + + RS 87001 + + + + Гибрид 167 + + + + Болеро + + + + Шарм + + + + Шрегеда + + + + Бенда + + + + Медаль + + + + Екатерина + + + + Белоснежка + + + + Мария + + + + Желтый букет + + + + Ежик + + + + Маяк + + + + Каскад + + + + Золотой Дождь + + + + Хризолит + + + + Очарование + + + + Карлик + + + + Сибиряк + + + + Малыш + + + + Руза + + + + Ария + + + + Изабелла + + + + Златозар + + + + Линия 71 + + + + Сирень + + + + Агаповский + + + + Здоровье + + + + Мавр + + + + Родник + + + + Нежность + + + + Сиреневый туман + + + + Применение исследованных микросателлитных локусов для паспортизации сортов перца C.аnnuum и видов C.frutescens, C.chinense, C.baccatum По данным проведенного SSR анализа все отобранные локусы показали высо кую эффективность в выявлении внутривидового полиморфизма и идентификации сортов перца отечественной и зарубежной селекции. Определен диагностический набор наиболее информативных локусов, позволяющих дискриминировать все гено типы взятых для анализа сортов перца. Для каждого исследованного сорта установле на аллельная SSR формула (табл. 7), которая может быть использована в качестве ос новы его молекулярного паспорта.
Подбор компонентов скрещиваний на основе данных SSR и AFLP маркирования и прогнозирование эффекта гетерозиса Проведенный молекулярно-генетический анализ позволил отобрать для дальнейшей работы 7 сортов перца сладкого (Мадона, Чаймс, Пирати, Екатерина, Желтый букет, Оранжевое чудо, Мемфис), которые располагались в различных кластерах дендрограммы, построенной на основе AFLP маркирования, и обладали различным набором аллелей четырех SSR локусов. Была проведена 21 комбинация диаллельных скрещиваний, в которых данные сорта использовались в качестве родительских компонентов, и были получены гибридные растения F1.
На основе предварительного сортоиспытания определена общая (средняя величина гетерозиса данного сорта в гибридных комбинациях) и специфическая комбинационная способность (величина гетерозиса в конкретной гибридной комбинации) и показано, что по ряду хозяйственно ценных признаков выделились Желтый букет, Мемфис, Пирати, Мадона и Оранжевое чудо.
По результатам анализа было установлено, что гибриды, полученные при использовании в качестве родительских форм сортов со сходными геномами (расположенными близко на дендрограмме), например, таких как Пирати и Желтый букет, не дают эффекта гетерозиса. Эффект гетерозиса определялся по четырем признакам (табл. 8). У данной комбинации эффект гетерозиса отсутствовал по признакам: «продолжительности периода всхожесть – биологическая спелость» 97,6%;
«ранняя урожайность» - 95,73%;
«общая урожайность» – 87,89%;
«содержание аскорбиновой кислоты» - 91,7%.
В случае использования в качестве родительских компонентов сортов, геномы которых менее схожи (на дендрограмме расположены в отдаленных кластерах), например, таких как Екатерина и Мемфис (рис. 2), то гибриды F1 показывают достаточно высокий эффект гетерозиса. По следующим признакам у данной комбинации эффект гетерозиса составил: «продолжительность периода всхожесть – биологическая спелость» - 109,6 %;
«ранняя урожайность» - 106,52 %;
«общая урожайность» – 115,48 %;
«содержание аскорбиновой кислоты» - 137 %.
Гибридные комбинации, полученные на основе генетически более отдаленных родительских форм, различающихся по ряду хозяйственно ценных признаков, выявили наибольший эффект гетерозиса по скороспелости, урожайности и содержанию витамина С. Так, по комплексу этих признаков с высоким эффектом гетерозиса были отобраны четыре гибридные комбинации: F1 Екатерина х Мемфис, F1 Пирати х Мемфис, F1 Мадона х Мемфис, F1 Мадона х Желтый букет.
Таблица Эффект гетерозиса по количественным признакам гибридных комбинаций F1 перца сладкого в условиях малообъемной гидропоники Гибридные комбинации Эффект гетерозиса, % Продолжительность Ранняя уро- Общая уро- Витамин периода «всхожесть - жайность жайность С биологическая спе лость»
F1 Мадона х Чаймс 100 135,44 85,62 89, F1 Мадона х Пирати 97,5 95,24 92,27 90, F1 Мадона х Екатерина 105,5 154,18 94,92 76, F1 Мадона х Желтый букет 99,3 96,21 91,37 102, F1 Мадона х Оранжевое чудо 102 105,61 91,77 83, F1 Мадона х Мемфис 104,1 143,69 106,36 71, F1 Чаймс х Пирати 102,5 83,65 82,38 103, F1 Чаймс х Екатерина 104,1 181,21 124,40 106, F1 Чаймс х Желтый букет 102,8 85,84 100,41 100, F1 Чаймс х Оранжевое чудо 102,1 114,51 87,95 89, F1 Чаймс х Мемфис 99,4 70,34 118,95 105, F1 Пирати х Екатерина 103,5 120,24 105,41 105, F1 Пирати х Желтый букет 97,6 95,73 87,89 91, F1 Пирати х Оранжевое чудо 101,9 113,07 88,38 104, F1 Пирати х Мемфис 101,6 157,14 129,69 128, F1 Екатерина х Желтый букет 99,1 86,20 85,02 75, F1 Екатерина х Оранжевое чудо 103,3 125,90 92,29 82, F1 Екатерина х Мемфис 109,6 106,52 115,48 137, F1 Желтый букет х Оранжевое чудо 104,6 58,91 88,54 97, F1 Желтый букет х Мемфис 100,4 94,57 93,32 125, F1 Оранжевое чудо х Мемфис 101,2 55,09 62,50 80, По скороспелости, урожайности, качеству плодов, высокой товарности, физио логической засухоустойчивости была выделена гибридная комбинация F1 Мадона х Желтый букет. Данная гибридная комбинация передана на Государственное сорто испытание под названием F1Мила.
Анализ полиморфизма генов углеводного обмена альфа-глюканфосфорилазы, инвертазы и сахарозосинтазы Одним из перспективных направлений селекции новых сортов перца является повышенное содержание сахаров в плодах, а также холодоустойчивость сортов, что способствует продвижению данной культуры в северные широты. Поиск потенциальных источников новых генов, вовлеченных в метаболизм сахаров и крахмала, и их аллельных вариантов, которые можно ввести в селекционный процесс, является наиболее актуальным направлением в современных исследованиях. Так, например, для ряда пасленовых было показано, что гены углеводного обмена альфа глюканфосфорилаза, сахарозосинтаза и инвертаза могут определять такие важные хозяйственные признаки как содержание сахаров и крахмала, а также вовлечены в формирование устойчивости растений к холоду (Chen et al. 2001;
Menendez et al. 2002;
Gebhardt et al. 2005;
Li et al., 2008). Последовательности этих генов у Capsicum не были известны, поэтому представляет особый интерес анализ полиморфизма последовательностей данных генов с целью выявления уровня вариабельности и определения их аллельных вариантов, в том числе и ассоциированных с содержанием сахаров и крахмала, для их дальнейшего использования в селекционной практике.
Для работы были выбраны участки данных генов, кодирующие их основные функциональные домены: для гена Stp23 - глюканфосфорилазный домен (последова тельность экзонов II–IV), для гена Pain-1 - ключевая часть инвертазного домена (по следовательность экзонов III–V), для гена Sus4 - ключевая часть сахарозосинтазного домена (последовательность экзонов II–VI), а также гликозилрансферазный домен (экзон XII).
На основе сравнительного анализа последовательностей генов-гомологов у картофеля и томата были разработаны 8 специфичных праймеров для амплификации и секвенирования выбранных последовательностей функциональных доменов данных генов у представителей рода Capsicum. У полученных последовательностей генов были определены экзон-интронные границы и охарактеризованы первичная нуклеотидная и аминокислотная последовательности.
Анализ полиморфизма гена альфа-глюканфосфорилазы Stp23 у представителей рода Capsicum Общая длина полученных нуклеотидных последовательностей исследуемого участка гена Stp23 видов Capsicum составила 696-705 п.н. В последовательностях экзонов и интронов изучаемых образцов в общей сложности было детектировано сайтов единичных нуклеотидных замен (SNP) и 4 индели различной длины и локализации (табл. 9).
Таблица Длина и уровень полиморфизма исследуемых последовательностей экзонов и интронов гена Stp Участок гена Длина выровненной Число Число Полиморфизм(%) последовательности, вариабельных инделей п.н. сайтов Фрагмент экзона II 45 1 5, Интрон II 189-190 9 1 Экзон III 101 2 11, Интрон III 203-211 4 3 22, Экзон IV 158 2 11, Все экзоны 304 5 27, Все интроны 392-401 13 4 72, Весь фрагмент гена 696-705 18 4 Как и ожидалось, у анализируемых последовательностей гена Stp23 наиболее консервативными были экзоны. В последовательностях экзонов II, III и IV было детектировано 5 SNP, в интронах - 13 SNP. Последовательности экзонов были инвариабельны по длине, в то время как в интронных последовательностях были выявлены индели (рис. 10).
Рис. 10. Нуклеотидная последовательность интрона III гена Stp23 у представителей рода Capsicum Наиболее полиморфным из интронов оказался интрон II, который помимо точковых нуклеотидных замен содержал также индели. В последовательности интрона III у видов C.eximium, C.tovarii, C.pubescens также была выявлена инсерция, длина которой составляет семь нуклеотидов (ТАТCTTC).
Анализ аминокислотной последовательности фрагмента белка Stp23. Экзонные нуклеотидные последовательности гена Stp23 изучаемых образцов перца были транслированы. Анализ транслированных экзонных последовательностей показал, что 5 полиморфных нуклеотидных позиций в экзонах не привели к аминокислотным заменам у видов и сортов Capsicum, однако дополнительный анализ, включающий представителей других родов Solanaceae, позволил выявить целую группу родоспецифичных для Capsicum аминокислотных замен (рис. 11).
Рис. 11. Аминокислотные замены у представителей рода Capsicum в белке Stp Анализ полиморфизма гена инвертазы Pain-1 у представителей рода Capsicum Общая длина полученных нуклеотидных последовательностей исследуемого участка гена Pain-1, включающего последовательность экзон III–V, кодирующую ключевую часть инвертазного домена, составила 1741-1778 п.н. В последовательно стях экзонов и интронов изучаемых образцов в общей сложности было детектировано 60 сайтов единичных нуклеотидных замен (SNP) и 16 инделей различной длины и ло кализации (табл. 10).
Таблица Длина и уровень полиморфизма исследуемых последовательностей экзонов и интронов гена Pain- Участок гена Длина выровненной Число вариабель- Число Полиморфизма(%) последователь- ных сайтов инделей ности, п.н.
Экзон III 778-784 21 4 35, Интрон III 482-512 30 11 50, Экзон IV 168 3 5, Интрон IV 77-78 2 1 3, Экзон V 236 4 6, Все экзоны 1182-1188 28 4 46, Все интроны 559-590 32 12 53, Весь фрагмент гена 1741-1778 60 16 В последовательностях экзонов III, IV и V гена было детектировано 28 SNP, а в интронах – 32 SNP. Наибольшее число замен локализовалось в области интрона III (табл. 10). В последовательности экзона III выявлен 21 вариабельный сайт и индели, а также инсерция GGACCG у вида C.tovarii (рис. 12).
Рис. 12. Нуклеотидная последовательность экзона III гена Pain-1 у представителей рода Capsicum Анализ вариабельности интронных последовательностей показал, что наиболее полиморфным был интрон III, в составе которого обнаружено 30 единичных нук леотидных замен и 11 инделей, а также протяженная 33-нуклеотидная делеция у ви да С. pubescens.
Анализ аминокислотной последовательности белка Pain-1. Анализ транслиро ванных экзонных последовательностей гена Pain-1 изучаемых образцов показал, что из 28 полиморфных нуклеотидных позиций 12 приводили к аминокислотным заме нам, 11 из которых были несинонимичными. Также дополнительный сравнительный анализ позволил выявить целую группу родоспецифичных для Capsicum аминокис лотных замен (рис. 13).
Рис. 13. Аминокислотная последовательность инвертазного домена гена Pain- Анализ полиморфизма гена сахорозосинтазы Sus4 у представителей рода Capsicum Общая длина полученных нуклеотидных последовательностей исследуемых участков гена Sus4, включающих последовательность экзон II–VI, кодирующую ключевую часть сахарозосинтазного домена и последовательность экзона XII, коди рующую гликозилтрансферазный домен, составила 1526-1552 п.н. В последователь ностях экзонов и интронов изучаемых образцов в общей сложности было детектиро вано 93 SNP и четыре индели различной длины и локализации (табл. 11).
Таблица Длина и уровень полиморфизма исследуемых последовательностей экзонов и интронов гена Sus Участок гена Длина выровненной Число Число Полиморфизма(%) последовательности, вариабельных инделей п.н. сайтов Фрагмент экзона II 31 1 1, Интрон II 135-137 11 1 11, Экзон III 127 4 4, Интрон III 91-92 16 1 17, Экзон IV 152 7 7, Интрон IV 88 8 8, Экзон V 202 13 14, Интрон V 217-240 12 2 12, Фрагмент экзона VI 48 0 Экзон XII 435 21 22, Все экзоны 995 46 49, Все интроны 531-557 47 4 50, Весь фрагмент гена 1526-1552 93 4 У анализируемых последовательностей гена Sus4 и в экзонах, и в интронах уро вень полиморфизма был примерно одинаков - 49,5 % и 50,5 %, соответственно. Инте ресно, что экзонные последовательности характеризовались высоким уровнем поли морфизма: в последовательностях экзонов II, III, IV, V, VI и XII было детектировано 46 SNP. Наибольшее число замен локализовалось в области XII экзона (рис. 14).
Рис. 14. Нуклеотидная последовательность гликозилтрансферазного домена гена Sus Из интронных последовательностей наиболее полиморфным оказался интрон III, уровень его полиморфизма составляет 17,2 % и в его составе обнаружено 16 еди ничных нуклеотидных замен. Наиболее вариабельным по длине оказался интрон V, последовательность которого варьировала у разных образцов от 217 до 240 п.н. и со держала протяженную 23-нуклеотидную делецию GTTTTTTCACGCCACTATACGTA у видов С.сardenasii и С.рubescens (рис. 15).
Анализ аминокислотной последовательности белка Sus4. Анализ транслирован ных экзонных последовательностей гена Sus4 изучаемых образцов показал, что из полиморфных нуклеотидных позиций в экзонах 11 приводили к аминокислотным заменам, 10 из которых были несинонимичными. Также дополнительный сравни тельный анализ, включающий представителей других родов Solanaceae позволил вы явить группу родоспецифичных для Capsicum аминокислотных замен (рис. 14).
Рис. 15. Аминокислотная последовательность гликозилтрансферазного домена гена Sus В результате проделанной работы впервые для видов Capsicum были получены фрагменты генов Stp23, Sus4 и Pain-1 кодирующие их основные функциональные домены, охарактеризованы их первичные нуклеотидные и аминокислотные последовательности, выявлен уровень их вариабельности и аллельные варианты.
Полиморфизм у анализируемых последовательностей генов определялся не только точковыми нуклеотидными заменами, а также инделями, в том числе и в экзонных последовательностях. Анализ транслированных последовательностей исследуемых генов позволил детектировать группу родоспецифичных для Capsicum аминокислотных замен. Для последовательностей белков Sus4 и Pain-1 у видов и сортов перца были обнаружены как синонимичные, так и несинонимичные аминокислотные замены, которые, возможно, могут изменять функции данных белков,- и будут использованы в дальнейшей работе для выявления аллельных вариантов, ассоциированных с содержанием сахаров и холодоустойчивостью, и которые могут быть введены в селекционный процесс.
ВЫВОДЫ 1. Разработана система AFLP маркирования, позволившая оценить генетическое разнообразие представителей рода Capsicum:
- идентифицировано 956 полиморфных AFLP фрагмента, определены уровни межвидовой и внутривидовой вариабельности ДНК последовательностей перца.
- показано, что с помощью двух праймерных комбинаций можно дифференциро вать генотипы всех 45 сортов и для каждого из них получены специфичные спектры фрагментов;
-для 24 сортов получены сортоспецифичные фрагменты, которые могут быть преобразованы в монолокусные SCAR маркеры;
- выявлены наиболее генетически родственные и отдаленные группы сортов для оптимизации селекционного процесса.
2. Методом SSR анализа четырех микросателлитных локусов у 45 сортов и видов рода Capsicum выявлено 19 аллельных вариантов, определены их точные размеры и нуклеотидные последовательности, частоты встречаемости и коэффициенты информативности.
Показана возможность использования разработанных систем 3.
микросателлитного и AFLP маркирования при подборе родительских пар для получения гибридов с высоким эффектом гетерозиса.
4. Для защиты авторских прав селекционера составлены молекулярно генетические паспорта сортов перца сладкого, представленные сортоспецифичными формулами аллельных вариантов четырех микросателлитных локусов.
5. Определены и проанализированы последовательности функциональных участков генов альфа-глюканфосфорилазы, инвертазы и сахарозосинтазы у видов и сортов Capsicum, выявлен уровень полиморфизма нуклеотидных и аминокислотных последовательностей.
Список опубликованных работ 1. Снигирь Е.А. Характеристика полиморфизма микросателлитного локуса CAMS-336 у сортов перца. /Е.А. Снигирь, О.Н. Пышная, Е.З. Кочиева, Н.Н. Рыжова // Сельскохозяйственная биология.- 2011. - № 6.- С.45-50.
2. Снигирь Е.А. AFLP-анализ сортового полиморфизма Capsicum annuum L.
/Е.А. Снигирь, О.Н. Пышная, Е.З. Кочиева, Н.Н. Рыжова// Сельскохозяйственная био логия.- 2013. - № 1.-С.53-60.
3. Снигирь Е.А. Изучение эффекта гетерозиса перца сладкого при подборе ро дительских пар с использованием данных молекулярного анализа. /Е.А. Снигирь, Е.З.
Кочиева, М.И. Мамедов, Т.П. Супрунова, Н.А. Шмыкова, О.Н. Пышная //Овощи Рос сии. – 2012.-№ 4.- С.25-28.
4. Снигирь Е.А. Структура и полиморфизм фрагмента локуса Pain-1, кодирую щего вакуолярную инвертазу видов Solanum. / М.А. Слугина, Е.А. Снигирь, Н.Н. Ры жова, Е.З. Кочиева//Молекулярная биология. – 2013.-№ 2.- С.1-8.
5. Снигирь Е.А. Микросателитный анализ сортов перца овощного./Е.А. Снигирь, Н.Н. Рыжова//Материалы II Международной научно-практической конференции «Современные тенденции в селекции и семеноводстве овощных культур. Традиции и перспективы» М.: Издательство ВНИИССОК, 2010.-Том II. – С.507- 509.
6. Snigir E.A. Polymorphisms and phylogeny of -glucanphosphorilase gene (Stp 23) in Solanaceae. /M.A. Slugina, E.A. Snigir, E.Z. Kochieva//III Moscow International Conference «Molecular Phylogenetics MolPhy - 3». Moscow. 2012. P. 108.
7. Snigir E.A. The glucosyl-transferase domain of sucrose synthase: variability in Capsicum species. /N.N. Ryzhova, E.A. Snigir, K.V. Boris//16th Evolutionary Biology meeting, Marseilles, France. 2012. P.156.