Оптимизация способов получения антигенных комплексов туляремийного микроба и конструирование на их основе диагностических препаратов
На правах рукописи
КУЗНЕЦОВА Екатерина Михайловна
ОПТИМИЗАЦИЯ СПОСОБОВ ПОЛУЧЕНИЯ
АНТИГЕННЫХ КОМПЛЕКСОВ ТУЛЯРЕМИЙНОГО МИКРОБА
И КОНСТРУИРОВАНИЕ НА ИХ ОСНОВЕ
ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ
03.02.03 – микробиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Саратов – 2011
Работа выполнена в ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
Научный руководитель:
кандидат биологических наук Волох Оксана Александровна
Официальные оппоненты:
Щербаков Анатолий Анисимович доктор биологических наук, профессор ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова»
Минсельхоза Российской Федерации, заведующий кафедрой микробиологии, вирусологии и иммунологии Матора Лариса Юрьевна доктор биологических наук, старший научный сотрудник ФГБУН Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, заместитель директора по научной работе
Ведущая организация:
ФКУЗ «Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора
Защита состоится « 21 » марта 2012 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 208.078.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» (410005, г. Саратов, Университетская, 46).
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора.
Автореферат разослан « 8 » февраля 2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, старший научный сотрудник Слудский А. А.
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Туляремия – зоонозная природно-очаговая ин фекция. Эндемичные очаги туляремии характеризуются стабильностью проявления и ши роко распространены, в том числе на территории Российской Федерации и соседних стран [Trnvik A. et al., 2004;
Топорков В.П. и др., 2007, Мещерякова И. С. и др., 2007;
Безсмерт ный В.Е. и др., 2008;
Wang Y. et al., 2011]. Возбудитель туляремии - Francisella tularensis включен в высшую категорию А как потенциальный агент биотерроризма [Dennis D. et al., 2001;
Gallagher-Smith M. et al., 2004]. Несмотря на достигнутые успехи в исследовании осо бенностей строения и биологии туляремийного микроба, факторы патогенности этого воз будителя, состав капсулы и протективные антигены окончательно не изучены [Havlasova J.
et al., 2002;
Sjstedt A., 2003;
Eyles J.E., 2007;
Oyston P.C.F., 2008;
Santic M., 2010;
Broms J.
E. et al., 2011].
Лабораторная диагностика туляремии основывается на иммунологических (сероал лергологическая диагностика) и бактериологических методах, в настоящее время дополнена молекулярно-генетическими методами [Лаб. диагност. ООИ, 2009]. В области разработки новых способов детекции туляремийного микроба ведутся активные исследования [Splettstoеsser W. D. et al., 2005;
Осина Н. А. и др., 2007;
Романова Л. В., 2008;
Johansson A.
et al., 2010;
Ветчинин С. С. и др., 2011;
Larson M. F. et al., 2011].
У возбудителя туляремии липополисахарид (ЛПС) и белки внешней мембраны (ВМ) влияют на специфичность иммунного ответа макроорганизма, обладают уникальной поли эпитопной антигенной структурой и рассматриваются как основа для создания профилак тических и диагностических препаратов [Хлебников В.С. и др., 1992, 1993;
Аронова Н. В., Павлович Н. В., 2000;
Ellis J. et al., 2002;
Conlan J.W., 2004;
Oyston P.C.F., 2008, Beasley A.S.
et al., 2011, Zarella T.M. et al., 2011]. Большое внимание уделяется исследованию комплекс ных антигенов F. tularensis [Trnvik A., Berglund L., 2003;
Splettstoеsser W. D. et al., 2005;
Pierson T. et al., 2011]. Получаемые по классическому методу А. Boivin (1933) липополиса харидо-белковые комплексы (ЛПБК) возбудителя туляремии содержат до 10 % белка и ха рактеризуются высокой серологической активностью [Родионова И.В., Шипицина Г.К., 1967]. В зависимости от способа получения ЛПБК имеют различный состав, молекулярную массу и свойства. В частности, установлена высокая иммунобиологическая активность ЛПБК ВМ F. tularensis, полученного с помощью обработки бактериальных клеток ультра звуком с последующим ультрацентрифугированием, с содержанием 12-22 % белка (25 бел ковых фракций) и 40 % липидов [Хлебников В.С. и др., 1991]. При обработке ВМ раствора ми детергентов с последующей гель-фильтрацией был получен высокоактивный ЛПБК (IV фракция, 15-35 кДа) с соотношением ЛПС:белок 1:1 [Хлебников В.С. и др., 1992, Кулевац кий Д.П., 1994]. Показано, что в составе препаратов ЛПБК присутствуют иммунодоминант ные белки с молекулярными массами 17 и 43 кДа [Аверин С.Ф. и др., 1992;
Кулевацкий Д.П., 1994] и белок-шаперон 63 кДа (GroEL) [Коровина О.В., 1993]. Комплекс ЛПС-17кДа белок рассматривается в качестве прототипа химической туляремийной вакцины [Khlebni kov V.S. et al., 1996], также как и один из препаратов ЛПБК ВМ F. tularensis – С-комплекс [Жемчугов В.Е., 2004;
патенты РФ 2147234, 2221591]. При оптимизации схемы выделения С-комплекса туляремийного микроба в условиях масштабированного культивирования штамма-продуцента F. tularensis 15 НИИЭГ был разработан метод его изоэлектрической преципитации [Шепелв И.А., 2005]. С использованием этого подхода нами был получен препарат ЛПБК туляремийного микроба, отличающийся от остальных ранее описанных в литературе комплексных антигенов молекулярной массой, увеличением белкового компо нента (более 60 %) и высокой протективной активностью при экспериментальной туляре мии. Этот препарат ЛПБК получил авторское название протективный антигенный комплекс – ПАК [Кузнецова Е.М. и др., 2011].
Несмотря на достигнутые успехи в исследовании антигенных комплексов ВМ F. tularensis важными условиями при разработке современных эффективных медицинских иммунобиологических препаратов, остаются совершенствование приемов выделения анти генов в иммунологически активной форме. Изучение особенностей состава и свойств ком плексных антигенов туляремийного микроба разных подвидов позволит провести их де тальную характеристику.
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ. Получить диагностически значимые антигенные ком плексы F. tularensis и сконструировать на их основе экспериментальные иммунодиагности ческие препараты.
ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:
1. Оптимизировать способы получения иммунохимически активных антигенных комплексов туляремийного микроба.
2. Провести сравнительный анализ полученных препаратов антигенных комплексов туляремийного микроба разных подвидов.
3. Получить высокоактивные поликлональные иммунные сыворотки к протективно му антигенному комплексу туляремийного микроба и сконструировать на их основе экспе риментальные иммунодиагностикумы для детекции возбудителя туляремии.
4. Разработать на основе антигенных комплексов туляремийного микроба экспери ментальные препараты для детекции специфических антител.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Оптимизированы способы получения биомассы F. tularensis для последующего выделения биологически активных антигенов. Приоритетность работы в данном направлении подтверждена оформлением заявки № 2010131275 на изобретение «Способ получения биомассы туляремийного микроба» (приоритет от 26.07.10 г). Для по лучения иммунохимически активных антигенных комплексов туляремийного микроба были усовершенствованы способы их выделения и количественного определения. Выделен и охарактеризован гликозилированный белковый комплекс туляремийного микроба, облада ющий выраженной иммуногенностью и высокой специфичностью, хроматографически го могенный, с молекулярной массой (57±1) кДа, состоящий из двух белковых субъединиц ( и 14-17 кДа). Выделен протективный антигенный комплекс, установлен его компонентный состав: субъединицы с молекулярными массами более 23 кДа имеют белковую природу, 14 17 кДа – липопротеидную. С помощью протеомного анализа в составе протективного анти генного комплекса впервые показано наличие следующих идентифицированных белков:
белков-шаперонов (GroES и GroEL), ферментов (GAPDH, KatG, AcpP), белков ВМ (OmpH, FTL_0617) и регуляторных белков (EF-Tu, RplL). Установлено, что протективный антиген ный комплекс является видоспецифичным антигеном, регистрируется у F. tularensis незави симо от подвидовой принадлежности штамма, формы ЛПС бактериальной клетки и наличия капсулы.
Впервые на основе сравнительного анализа структуры и свойств препаратов протек тивного антигенного комплекса, полученных из штаммов F. tularensis subsp. holarctica биоваров eryR, eryS, japonica, subsp. nearctica, subsp. mediаasiatica, установлено, что все препараты обладают иммуногенностью, сходны по химическому составу и содержат имму нохимически активные субъединицы (10-85 кДа). Антигенный комплекс из F. tularensis subsp. novicida отличается от ПАК других подвидов более низкой (в 5 раз) иммунохимиче ской активностью, увеличением содержания углеводной части на (70±3) %, наличием субъ единиц с молекулярной массой более 110 кДа и отсутствием иммунореактивных белков в области 57-85 кДа.
Сконструированы экспериментальные антительные и антигенные туляремийные диа гностикумы. Использование ПАК и гликозилированного белкового комплекса в качестве маркерных антигенов в иммуноблоттинге, ИФА и ДИА позволяет определять туляремий ные антитела в крови вакцинированных и экспериментально зараженных лабораторных жи вотных. Чувствительность экспериментальных антительных диагностикумов для детекции возбудителя туляремии разных подвидов иммунодиагностическими методами (ИФА, ДИА) составляет 104-105 м.к./мл. Сконструированный иммуносуспензионный диагностикум в ре акции латекс агглютинации (РЛА) позволяет выявлять содержащие капсулу (Cap+) и бес капсульные (Cap-) штаммы F. tularensis в отличии от коммерческого диагностикума для ре акции непрямой гемагглютинации (РНГА), выявляющего только Cap+-штаммы.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. По результатам проведенных научных иссле дований разработаны методические рекомендации «Применение антител к С-комплексу ту ляремийного микроба для детекции возбудителя туляремии методами иммуноанализа» и «Получение гликозилированного белкового комплекса внешних мембран клеток туляре мийного микроба», одобренные Ученым советом РосНИПЧИ «Микроб» (протокол № 2 от 17.04.2008 г. и протокол № 5 от 22.09. 2011 г., соответственно) и утвержденные директором института.
В Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» депонирован бескап сульный штамм F. tularensis holarctica КМ 9, производный вакцинного штамма F. tularensis 15 линии НИИЭГ, который может быть использован при создании диагностических туля ремийных тест-систем для детекции Cap- штаммов.
Выделенные препараты ПАК разных подвидов используются при выполнении науч но-экспериментальных работ в лабораториях вакцинологии и иммунопрофилактики, имму нодиагностики и молекулярной диагностики РосНИПЧИ «Микроб». Научные данные об особенностях антигенного строения туляремийного микроба, полученные в результате ра боты, включены в теоретический материал при чтении лекций цикла «Микробиология и ла бораторная диагностика туляремии» на курсах первичной специализации врачей и биологов по особо опасным инфекциям и курсах усовершенствования по специальности «бактерио логия» в институте «Микроб».
ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:
1. Оптимизированный метод выделения комплексных антигенов туляремийного микроба, основанный на комбинировании способов химического и ферментативного гидро лиза с последующей хроматографической очисткой, позволяет получать иммунохимически активные препараты.
2. Протективный антигенный комплекс является общим антигеном для туляремий ного микроба основных подвидов (subsp. holarctica, nearctica, mediаasiatica), обладает сходной структурой и свойствами.
3. Особенности биохимического и иммунохимического строения протективного ан тигенного комплекса из F. tularensis subsp. novicida обусловливают снижение его иммуно генности по сравнению с аналогичными антигенами, выделенными из штаммов других подвидов.
4. Экспериментальные антительные препараты на основе гипериммунных поликло нальных кроличьих сывороток к протективному антигенному комплексу туляремийного микроба позволяют выявлять в различных вариантах иммуноанализа клетки F. tularensis разных подвидов в минимальном количестве 104-105 м.к./мл, а также антиген в минималь ной концентрации (0,5±0,1) нг/мл.
5. Экспериментальные иммунодиагностические препараты на основе антигенных комплексов позволяют выявлять специфические противотуляремийные антитела у лабора торных животных (вакцинированных, инфицированных и переболевших) и в гипериммун ных сыворотках.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации были представлены и обсужда лись на VI Межгосударственной научно-практической конференции «Санитарная охрана территорий государств-участников СНГ: проблемы биологической безопасности и проти водействия биотерроризму в современных условиях», Волгоград, 2005, на Российской научно-практической конференции «Инфекционные болезни: проблемы здравоохранения и военной медицины», Санкт-Петербург, 2006, на VII Межгосударственной научно практической конференции «Чрезвычайные ситуации международного значения в обще ственном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников СНГ», п. Оболенск, 2006, на IХ Съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Москва, 2007, на научно-практической конференции «Современные аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на Юге России», Ставрополь, 2007, на IX Межгосударственной научно-практической конференции «Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств-участников СНГ», Волгоград, 2008, на научно практической конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских учреждений Роспотребнадзора «Биологическая безопасность в современном мире», п. Обо ленск, 2009, на Всероссийской научно-практической конференции «Научное обеспечение противоэпидемической защиты населения», Нижний Новгород, 2009, на X Межгосудар ственной научно-практической конференции «Актуальные проблемы предупреждения и ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций в области санитарно-эпидемического бла гополучия населения государств-участников СНГ», Ставрополь, 2010, на научно практической конференции молодых ученых Роспотребнадзора «Инновационные техноло гии в противоэпидемической защите населения», Н. Новгород, 2011, на III научно практической школе-конференции молодых ученых и специалистов научно исследовательских учреждений Роспотребнадзора, п. Оболенск, 2011, на ежегодных науч но-практических конференциях РосНИПЧИ «Микроб», Саратов, 2005-2011 гг.
ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 18 научных работ, из них статей в изданиях, рекомендованных «Перечнем…» ВАК России.
СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертация состоит из введения, обзора ли тературы, материалов и методов, четырех глав собственных исследований, заключения, вы водов и списка использованных источников. Объем диссертации 150 страниц. Список лите ратуры содержит 321 источник, из них 177 зарубежных. Работа иллюстрирована 22 рисун ками и 18 таблицами.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы.
Работа выполнена с использованием 65 штаммов F. tularensis разных подвидов и биоваров (holarctica: eryR, eryS, japonica;
nearctica, mediаasiatica, novicida), а также 30 гете рологичных микроорганизмов. Все штаммы микроорганизмов получены из Государствен ной коллекции патогенных бактерий «Микроб». Культивирование туляремийного микроба проводили при 37 оС на плотных и жидких питательных средах FT, T и LB. Анализ коэф фициентов сходства фенограмм штаммов F. tularensis рассчитывали по формуле Дисе [Звя гинцева И. С. и др., 1999].
Для получения препаратов ПАК разных подвидов использовали методику, разрабо танную ранее для выделения антигенного комплекса из вакцинного штамма [Шепелв И.А., 2005] в нашей модификации.
Концентрацию белков, углеводов, липидов, нуклеиновых кислот определяли обще принятыми методами [Спирин А.С., 1958;
Amenta J., 1964;
Сборник инструкций по мето дам контроля…, 1983;
Скоупс Р., 1985]. Электрофорез в полиамилакридном геле в присут ствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) проводили по U. Laemmli [1970] в 4 % концен трирующем и 10-12,5 % разделяющих гелях. Для детекции белков использовали окрашива ние Кумасси яркосиним R-250, для ЛПС-содержащих компонентов – азотнокислым сереб ром. Иммуноблоттинг проводили по методу H. Towbin [1979].
Протеомный анализ ПАК был проведен в ФГУ НИИ физико-химической медицины ФМБА России (г. Москва) по договору о научно-исследовательском сотрудничестве. Белки идентифицировали с помощью программы Mascot в базе данных NCBI (National Center for Biotechnology Information, 2010 г.). Надежно идентифицированными (p 0,05) считались белки с критерием достоверности score 74.
Для получения сывороток к антигенным комплексам туляремийного микроба исполь зовали взрослых (2 кг) кроликов породы «Шиншилла». Иммуноглобулиновые фракции (Ig «ПАК») выделяли по L. Rane, L. Newhauser [1954]. Для постановки метода флуоресци рующих антител (МФА) использовали препарат Ig «ПАК» и его F(ab,)2-фрагменты, мечен ные флуоресцеинизотиоцианатом по методу J. Marshall et al. [1958]. Иммунопероксидазный конъюгат получали методом перйодатного окисления [Фримель Г., 1987]. Для прямого ДИА использовали антитела, конъюгированные с коллоидными металлами (серебром - про ведено в РосНИПЧИ «Микроб» Н.А. Шараповой, золотом – в ИБФРМ РАН д.б.н. Л.А.
Дыкманом).
Для очистки препаратов антигенов и иммуноглобулинов, разделения их компонентов применяли колоночную хроматографию с использованием различных носителей на хрома тографе низкого давления Biologic LP фирмы «Bio-RAD» (США). В работе использовали РНГА с иммуноглобулиновым и антигенным диагностикумами («48 ЦНИИ МО РФ» г. Ки ров, СтавНИПЧИ г. Ставрополь), ИФА и ДИА с экспериментальными препаратами и ком мерческими тест-системами (СтавНИПЧИ).
Для изучения иммуногенности полученных препаратов использовали беспородных белых мышей (19±1 г) и морских свинок (250±20 г). Среднюю заражающую дозу (LD50) ви рулентных штаммов F. tularensis и среднюю иммунизирующую дозу (ED50) антигенных препаратов рассчитывали по методу Кербера. Работу с животными проводили по стандарт ным методикам [МУ 3.3.1.2161-07].
При обработке полученных результатов применяли общепринятые статистические методы, вычисляя среднеарифметические величины, степень достоверности различий по t-критерию Стьюдента, исходя из уровня значимости (Р) 0,05 (95 %) [Ашмарин И. П., Во робьев А. А., 1962;
Рокицкий П.Ф., 1973].
Результаты исследований и их обсуждение Оптимизация способов получения антигенных комплексов туляремийного мик роба и характеристика их компонентного состава. Протективный антигенный комплекс туляремийного микроба, полученный из клеток вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ (ПАК-15), представляет собой антиген сложной химической природы, в состав которого входят белки, липиды и углеводы в соотношении 3:1:1. Данный препарат характеризуется высокой иммунохимической активностью. Особенности этого комплексного антигена по сравнению с другими ЛПБК представлены в таблице 1.
Таблица 1 - Сравнительная характеристика препаратов ЛПБК и ПАК F. tularensis 15.
М. масса, Белок, ED501, ИФА2, Препарат Способ получения кДа мкг мкг/м % л ЛПБК ВМ ультрацентрифугирование уль [Хлебников В.С. и др., тразвукового дезинтеграта бакте- — 12-22 720 риальных клеток 1991] ЛПС-17 кДа белок обработка ВМ детергентами, [Кулевацкий Д.П., ультрацентрифугирование, 15-35 50 25 0, колоночная гель-фильтрация 1994] дифференциальное центрифуги С-комплекс рование ультразвукового дезин [Патент РФ 2221591;
2000 15-26 261 теграта бактериальных клеток, Жемчугов В.Е., 2005] ультрафильтрация высаливание и изоэлектрическая ПАК-15 преципитация из водораствори- 280±10 60-65 2,4 0, мого пула ВМ 1 - ED50 препаратов при однократной подкожной иммунизации белых мышей с последующим за ражением F. tularensis 503 в дозе 80-100 м.к.;
2 - ИФА со специфическими антителами.
Была проведена работа по определению состава белковых субъединиц ПАК-15 и их идентификации. С помощью SDS-PAGE был установлен белковый спектр данного антиге на, представленный субъединицами с молекулярными массами от 10 до 85 кДа, мажорные из которых 81-85, 57-60, 43, 32, 23, 19 и 14 кДа были иммунохимически активны. Протеом ным анализом в составе ПАК были идентифицированы 9 биологически активных молекул, специфических для F. tularensis (рисунок 1). Высокую иммунобиологическую активность ПАК, возможно, обусловливает присутствие в его составе стрессовых белков-шаперонов (GroES и GroEL), регуляторных белков (EF-Tu и RplL), бактериальных ферментов (GAPDH, KatG, AcpP) и белков ВМ (OmpH, FTL_0617).
А Б А - SDS-PAGЕ: 1 – белковый профиль, 2 – иммуноблоттинг с Ig «ПАК», М – маркеры молекулярной массы.
Б - Двумерный PAG-электрофорез и идентифицированные белки.
Рисунок 1 - Определение субъединичного состава и идентификация белковых компо нентов протективного антигенного комплекса туляремийного микроба.
Учитывая сложную химическую природу протективного антигенного комплекса ту ляремийного микроба, а также его высокую иммунохимическую активность, проводили ра боту по определению его активных компонентов. Было установлено, что ПАК-15 термоста билен, устойчив к действию кислот и щелочей в диапазоне рН от 1,0 до 13,0, обратимо пре ципитирует при 50-55 % насыщении сульфатом аммония. Химическим гидролизом раство рами детергентов была определена белковая природа его основных субъединиц с молеку лярными массами от 20 до 58 кДа. Наибольшей устойчивостью к действию детергентов об ладали субъединицы с молекулярной массой 81-85 и 14-17 кДа. Максимальной иммунохи мической активностью (титр в ДИА 1/102400) по сравнению с контрольным ПАК (1/51200) обладал модифицированный саркозилом препарат – ПАК-Д, который может использоваться как сенситин в ИФА и ДИА при определении специфических антител. Фенольная экстрак ция позволила разделить препарат ПАК-15 на две фракции: фенольную, на 70 % состоящую из углеводных и липидных компонентов, и водную, содержащую в своем составе мажорные белки ПАК-15 (78-80 % белка). Фенольная фракция обладала меньшей активностью (титр в ДИА 1/3200), чем водная (титр 1/25600). Присутствие в обеих фракциях двух иммунореак тивных компонентов с молекулярными массами в диапазоне 14-17 кДа свидетельствовало о липопротеидной природе этих субъединиц, что согласуется с данными литературы [Sjstedt A. et al., 1991].
Установлена высокая чувствительность ПАК к действию пепсина, вызывающего его полный гидролиз, и протеиназы К, приводящей к гидролизу только белковой части и позво ляющей получить компонент ЛПС природы, который имеет структуру, типичную для S-формы грамотрицательных бактерий. Иммунохимическая активность данного препарата по отношению к контролю была значительно ниже (титр в ДИА 1/800, по сравнению с кон трольным 1/51200), что указывает на зависимость серологической активности компонентов ПАК от содержания в них белка.
Разработанный нами метод ферментативного гидролиза ПАК-15 проназой Е позволил получить комплексный антиген углевод-белковой природы (гликозилированный белковый комплекс). Препарат является хроматографически гомогеным, его молекулярная масса око ло (57±1) кДа, и содержит в своем составе, по данным SDS-PAGE, мембранные белки 41- и 14-17 кДа (рисунок 2) и О-полисахаридный компонент. Соотношение белков и углеводов – 2:1.
А Б А – белковый профиль (1), иммуноблоттинг с Ig «ПАК» (2), иммуноблоттинг с МкАт к ЛПС F. tularensis 15 НИИЭГ (3), М – маркеры молекулярной массы.
Б - гель-хроматография на Sephacryl S-300: по оси абсцисс – время элюции, мин;
по оси ординат – оптическая плотность элюента при 280 нм (A.u.) Рисунок 2 - Результаты SDS-PAGE, иммуноблоттинга и гель-хроматографии глико зилированного белкового комплекса туляремийного микроба.
В экспериментах на лабораторных животных было установлено, что препарат глико зилированного белкового комплекса нетоксичен, безвреден, обладает высокой иммуноген ной активностью. После однократной подкожной иммунизации белых мышей (дозой мкг) и морских свинок (дозой 1 мг) антительный ответ регистрировался на 7-е и 22-е сутки соответственно. Реакция лейкоцитолиза была резко положительная у мышей к 7-м суткам (33 %), у морских свинок – к 28-м суткам (35 %). В «остром» опыте при заражении биомо делей вирулентным штаммом F. tularensis subsp. holarctica 503/840 (в дозе для белых мы шей 100 LD50, для морских свинок – 1000 LD50) было установлено достоверное увеличение продолжительности жизни иммунизированных углевод-белковым комплексом животных по сравнению с контрольной группой (Р0,05), ED50 для белых мышей составила (2,5±0,3) мкг, для морских свинок (200±10) мкг.
Учитывая поверхностное расположение ПАК, был проведен эксперимент по опреде лению участия данного антигена в формировании капсулоподобного вещества F. tularensis.
Нами с помощью обработки клеток акридиновым оранжевым [Sandstrm G. et al., 1988] из культуры F. tularensis 15 НИИЭГ были получены Сap- штамм F. tularensis КМ 9 (депониро ван в ГКПБ «Микроб») и субкультура в R-форме, которые взаимодействовали с Ig «ПАК» в ИФА, ДИА в концентрации 106 м.к./мл и иммуноблоттинге. При анализе состава ПАК из клеток бескапсульных штаммов F. tularensis LVS Сap- и КМ 9 было установлено, что по ос новным физико-химическим и иммунохимическим свойствам они сходны с аналогичными препаратами, выделенными из штаммов F. tularensis с Сap+ фенотипом. Полученные ре зультаты позволяют сделать вывод, что присутствие ПАК на поверхности клетки не зависит от формы ЛПС, и в его состав не входят антигенные компоненты капсулоподобного веще ства туляремийного микроба.
Основываясь на полученных данных о составе и свойствах протективного антигенно го комплекса туляремийного микроба, была проведена работа по оптимизации условий культивирования штамма-продуцента и схемы выделения ПАК. Введение дробной под кормки (глюкозы совместно с витаминами группы В) при выращивании на жидкой пита тельной среде увеличивало выход ПАК. Учитывая литературные данные, что в условиях повышенной температуры увеличивается экспрессия белков-шаперонов F. tularensis [Ро манова Л.В, 2008;
Savitt A.G. et al., 2009], было проведено культивирование при 42 оС и 52 оС (тепловой шок). В результате не получили ожидаемого увеличения выхода ПАК или его компонентов, что может свидетельствовать о стабильности этого антигена. Применение комплексного подхода, основанного на комбинировании способов химического и фермен тативного гидролиза ПАК с последующей хроматографической очисткой, позволило полу чить иммунохимически активные антигены – ПАК-Д и гликозилированный белковый ком плекс (рисунок 3). С целью повышения технологичности выделения ПАК была уменьшена кратность циклов гидродинамической обработки клеток до двух, а фракционирование сульфатом аммония с последующим осаждением в изоточке позволило более эффективно освобождаться от балластных веществ.
Осадок Гидродинамический Биомасса стресс 25 мин микробных F. tularensis Центрифугирование клеток 20000 об/мин., 20 мин.
Культуральная Метод Супернатант жидкость изоэлектрической преципитации Фракционирование сульфатом диализ (рН 4,3) аммония до 50-55 % насыщения Ферментативный Гликозилированный ПАК гидролиз проназой Е белковый комплекс Обработка 2 % саркозилом NL30 ПАК-Д Рисунок 3 - Схема получения диагностически значимых антигенных комплексов ту ляремийного микроба.
Сравнительный анализ препаратов протективного антигенного комплекса ту ляремийного микроба, полученных из штаммов-продуцентов разных подвидов.
Для оценки возможности получения ПАК из штаммов-продуцентов разных подвидов туляремийного микроба был проведен электрофоретический анализ суммарных клеточных белков 65 штаммов F. tularensis. Коэффициент сходства суммарных клеточных белков F. tularensis внутри подвида в среднем составлял 99 %, между подвидами – 95 %, что соот ветствует литературным данным [Sjstedt A. B., 2003;
Svensson K. et al., 2005]. Имму ноблоттингом доказано наличие белковых фракций протективного антигенного комплекса туляремийного микроба в составе всех исследуемых штаммов.
По оптимизированной методике, представленной на рисунке 3, нами были получены препараты ПАК из следующих штаммов-продуцентов: F. tularensis subsp. holarctica eryR 503/840 (ПАК-503), holarctica eryS В-300 (ПАК-В 300), holarctica japonica Miura (ПАК-Miura), nearctica В399 A`Сole (ПАК-A`Сole), mediаasiatica А 179 (ПАК-А 179), mediаasiatica А-61 (117) КМ 4 (ПАК-А 61), novicida Utah 112 (ПАК-Utah 112). Все штаммы по проведенным биохимическим тестам внутривидового типирования соответствовали сво ему подвиду. В результате сравнительного анализа физико-химических, антигенных и био химических свойств было установлено, что все протективные антигенные комплексы, кро ме ПАК-Utah 112, сходны по составу с препаратом ПАК-15 и содержат в среднем (61,8±2,7) % белков, (15,1±1,6) % углеводов, (23,6±2,3) % липидов. Иммунохимическая ак тивность ПАК F. tularensis основных подвидов и биоваров в ИФА составила около (0,5±0,1) нг/мл. Препарат из подвида novicida отличался большим содержанием углеводной части до (26,5±1,2) % и снижением белковой до (45,5±4,1) %, его иммунохимическая активность бы ла в 4 раза ниже.
Электрофоретический белковый профиль ПАК из клеток вирулентных штаммов (503, В 300, Miura, A`Cole, А 179, А 61) не отличался от препарата, полученного из клеток вак цинного штамма. Было установлено наличие во всех полученных препаратах ПАК компо нентов липополисахаридной природы, которые представлены липидом А с коровым оли госахаридом и боковыми цепями. Показано, что иммунохимическая активность этих ком плексных антигенов связана с их белковой частью, в составе которой были определены им мунодоминантные полипептиды, характерные для всех исследованных препаратов и анало гичные ПАК-15 (рисунок 4).
А Б А - белковый профиль;
Б - иммуноблоттинг с Ig «ПАК» препаратов: 1 - ПАК-15;
2 ПАК-В 300;
3 - ПАК-503;
4 - ПАК-Мiura;
5 - ПАК- А 179;
6 - ПАК-A`Cole;
7 - ПАК-Utah 112. М - маркеры молекулярной массы.
Рисунок 4 - SDS-PAG электрофорез и иммуноблоттинг препаратов протективного ан тигенного комплекса туляремийного микроба разных подвидов.
Препараты ПАК-15, ПАК-503, ПАК-В 300, ПАК-А 179, ПАК-А 61 и ПАК-A`Сole, по данным гель-хроматографии на Sephacryl S-300, были хроматографически гомогенными, представлены одним мажорным пиком с молекулярной массой около 280 кДа. Профиль ПАК-Utah 112 имел два пика с молекулярными массами около 280 и 160 кДа, состав кото рых отличался: в первом были белки с молекулярной массой более 43 кДа, а во втором – менее 23 кДа. Установлено, что ПАК-Utah 112 взаимодействовал со специфическими анти телами, но не был иммунохимически идентичен препаратам ПАК других подвидов. Элек трофоретический профиль препарата ПАК-Utah 112 также отличался наличием дополни тельных белков с молекулярной массой более 110 кДа и отсутствием иммунореактивных белков в диапазоне от 50 до 90 кДа (рисунок 4).
Поскольку важным условием при использовании антигенов для получения специфи ческих сывороток является их высокая иммунологическая эффективность и отсутствие ток сичности для животных-продуцентов, была проведена работа по оценке иммунобиологиче ских свойств полученных препаратов. Было показано, что все препараты ПАК, независимо от подвидовой принадлежности штамма-продуцента, обладают выраженной антигенной ак тивностью. Их однократное введение биомоделям (мыши, морские свинки, кролики) вызы вало формирование выраженного антительного ответа, независимо от способа иммуниза ции. Все препараты ПАК были нетоксичны для лабораторных животных, не оказывали вы раженного повреждающего действия на спленоциты и тимоциты белых мышей. Положи тельная реакция лейкоцитолиза у белых мышей на 14-21 сутки после введения препаратов ПАК подтверждала их высокую иммуногенность. Максимальной иммуномодулирующей активностью обладал препарат, полученный из вакцинного штамма. В частности, при одно кратной подкожной иммунизации белых мышей препаратом ПАК-15 в дозе 10 мкг отмече но формирование антительного ответа в ранние сроки (на 3-7 сутки). При иммунизации морских свинок (доза 100 мкг) антительный ответ также регистрировался в ранние сроки, стабилизировался на высоком уровне к 42-м суткам (титр в ИФА 1/640-1/960) и сохранялся до 4,5 месяцев.
Показано, что все препараты ПАК защищают белых мышей от гибели при экспери ментальной туляремии, вызванной вирулентными штаммами голарктического, неарктиче ского и среднеазиатского подвидов (заражающая доза 100 LD50), а также большими дозами (107 м.к.) вакцинного штамма. Во всех случаях отмечено достоверное увеличение продол жительности жизни иммунизированных ПАК животных по сравнению с контрольными группами (Р0,05). Было установлено, что препарат ПАК-15 обладал максимальной протек тивной активностью при заражении штаммами голарктического подвида (ED50 = 3, (2,411,3) мкг для F. tularensis 503/840 и ED50 = 1,4 (0,62,9) мкг для F. tularensis НИИЭГ). При заражении F. tularensis subsp. nearctica В399 A’Cole максимальная протек тивная активность отмечена у препарата ПАК-А 179 (ED50 = 16,21 (9,225,1) мкг). Мини мальной протективной активностью по отношению к F. tularensis subsp. holarctica 503/ обладал препарат ПАК-Utah 112 (ED50 = 155,9 (66,7469,4) мкг). Это может быть связано с особенностями его строения, в частности с большим содержанием углеводного компонента и с отсутствием ряда иммунореактивных белков.
Разработка экспериментальных иммунодиагностических препаратов для детек ции возбудителя туляремии и специфических антител. Для получения гипериммунных туляремийных поликлональных сывороток были разработаны две схемы иммунизации кро ликов. Был получен ряд сывороток к каждому препарату ПАК основных подвидов (ПАК-15, ПАК-503, ПАК-A`Cole). Показано, что все сыворотки этого ряда иммунохимически иден тичны и выявляют иммунодоминантные субъединицы всех препаратов, независимо от под видовой принадлежности штамма-продуцента, что наряду с данными сходства строения и свойств свидетельствует о видовой специфичности протективного антигенного комплекса.
Установлено, что применение на первых этапах иммунизации кроликов комплекса водно фенольных экстрактов штаммов F. tularensis различной подвидовой принадлежности (subsp.
mediаasiatica A-61 (117) КМ 4, subsp. nearctica В399 A`Cole, subsp. holarctica 503/840 и НИИЭГ) с последующим внутривенным введением препарата ПАК-15 позволило увеличить специфичность сывороток, которые использовались в нашей дальнейшей работе.
На следующем этапе был проведен анализ чувствительности и специфичности полу ченных иммунных сывороток в сравнении с коммерческой туляремийной сывороткой - КТС (сыворотка диагностическая туляремийная агглютинирующая, Иркутский НИПЧИ). При этом в ДИА чувствительность КТС при разведении 1/100 для штаммов F. tularensis состав ляла 107 м.к./мл, тогда как экспериментальные сыворотки при тех же разведениях выявляли возбудителя в концентрации 106 м.к./мл. Специфичность последних составила 100 % при концентрации гетерологичных штаммов 108 м.к./мл, тогда как при использовании КТС были отмечены перекрестные реакции с клетками Yersinia pestis, Y. pseudotuberculosis, Escherichia coli и Salmonella paratyphi в концентрации 107 м.к./мл. Для повышения специфичности экспериментальных сывороток была проведена сорбция перекрестнореагирующих антител с применением в качестве адсорбентов микробных клеток чумного и псевдотуберкулезного микробов. Из цельной гипериммунной сыворотки были получены Ig «ПАК», которые ис пользовали при конструировании экспериментальных антительных препаратов для детек ции возбудителя.
Чувствительность экспериментальной иммуноферментной тест-системы (ИФА, ДИА) анализировали на расширенной панели штаммов F. tularensis разных подвидов (50 штам мов). В среднем этот показатель составил в ИФА (3,2±0,3)105 м.к./мл, в ДИА – (6,5±0,4)105 м.к./мл (таблица 2). Специфичность экспериментальных антительных препа ратов была проверена на панели из 30 гетерологичных штаммов и составила 100 % при концентрации 108 м.к./мл и 84 % при концентрации 109 м.к./мл.
При определении влияния способа инактивации бактериальных клеток на чувстви тельность экспериментальных ИФА и ДИА было установлено, что экспериментальные тест системы в 100 раз чувствительнее при обработке культур F. tularensis фенолом без нагрева ния, чем формалином с прогреванием. Пороговый уровень чувствительности эксперимен тальной иммуноферментной тест-системы в модельных опытах: пробы почвы, речной воды, суспензии паренхиматозных органов и сыворотки белых мышей, искусственно контамини рованные различными концентрациями вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ, соста вил 2105 м.к./мл. При апробации разработанной экспериментальной тест-системы для вы явления возбудителя туляремии в смешанных культурах использовали взвесь клеток F. tularensis 15 НИИЭГ с Y. pestis EV, Y. pseudotuberculosis I серовара, Y. enterocolitica 121 и Brucella abortus 19BA. В этом случае чувствительность составила 6105 м.к./мл при 100 % специфичности для гетерологичных штаммов в концентрации 108 м.к./мл.
Таблица 2 - Чувствительность (м.к./мл) экспериментальных антительных препаратов.
Подвидовая Количество штаммов в %, выявляемых в принадлежность ИФА ДИА штаммов 1106 5105 1105 5104 1106 5105 1105 F. tularensis holarctica eryR 100 100 35 12 100 41 18 holarctica eryS 100 100 25 13 100 63 25 holarctica japonica 100 100 0 0 100 100 33 nearctica 100 100 67 0 100 33 11 mediаasiatica 100 100 45 0 100 55 9 novicida 100 0 0 0 100 0 0 Экспериментальный латексный диагностикум на основе Ig «ПАК» выявлял Сap+ и Сap- штаммы F. tularensis в РСА на стекле и РЛА микрометодом. Чувствительность РЛА для Сap+ штаммов составила 5106 м.к./мл, для Сap- - 107 м.к./мл, тогда как коммерческий диагностикум для РНГА не выявлял Сap- штаммы F. tularensis в концентрации 109 м.к./мл.
На основе Ig «ПАК» и его F(ab’)2-фрагментов получены экспериментальные конъ югаты: иммунопероксидазные и с коллоидными металлами, позволившие повысить чув ствительность ИФА и ДИА для клеток F. tularensis до 104 м.к./мл и упростить методику по становки анализа, используя прямой вариант. Эти экспериментальные препараты отлича лись низкой стабильностью (менее 3 месяцев) и нуждаются в дальнейшем усовершенство вании. Также были получены экспериментальные ФИТЦ-конъюгаты Ig «ПАК» и F(ab’)2 фрагментов. При постановке МФА с использованием экспериментальных препаратов было отмечено специфическое свечение возбудителя в мазках-отпечатках органов, зараженных вирулентными штаммами F. tularensis разных подвидов белых мышей на 3 креста так же, как при использовании коммерческого диагностикума (ИДТЛ, производство НИИЭМ им.
Н.Ф. Гамалеи). При бактериологическом анализе отпечатков этих органов в 100 % проб был отмечен рост туляремийного микроба, а при их бактериоскопии (окраска мазков-отпечатков по Романовскому-Гимзе) возбудитель обнаруживали только в некоторых пробах, что согла суется с данными литературы [Олсуфьев Н.Г., 1975].
Были проведены лабораторные испытания сконструированных антительных иммуно диагностикумов (ИФА и ДИА) для обнаружения возбудителя туляремии у эксперименталь но зараженных лабораторных животных и в природном материале. Исследование суспензии паранхематозных органов от 21 белой мыши, инфицированной F. tularensis 503/840 и B A`Cole в дозе 100 LD50, и 20 мышей, вакцинированных F. tularensis 15 НИИЭГ в дозе 104 м.к., показало, что возбудитель туляремии выявлялся с помощью ИФА в 34 пробах (83 %), ДИА – в 29 пробах (71 %), тогда как бактериологическим методом – только в пробах (36,6 %). В период от 1 до 8 суток после заражения была отмечена 100 % корреля ция между результатами бактериологического анализа и экспериментальным ИФА и ДИА.
При сравнении полученных результатов с использованием коммерческой диагностической тест-системы для выявления возбудителя туляремии в ИФА (ИФА-Тул-СтавНИПЧИ) было показано, что возбудитель обнаруживался только в 22 пробах из 41 (54 %). В ранние сроки (до 8 сут.) корреляция полученных с помощью ИФА-Тул-СтавНИПЧИ результатов с дан ными бактериологического анализа и экспериментальными антительными препаратами со ставила 95 %.
Поскольку Саратовская область относится к энзоотичным по туляремии территориям [Федорова З. П., 1995;
Матросов А. Н. и др., 2007], представляло интерес использовать раз работанные экспериментальные иммунодиагностические препараты для анализа природно го материала. При эпизоотологическом обследовании зеленой зоны г. Саратова на обнару жение антигенов туляремийного микроба было проанализировано 106 проб от фоновых жи вотных данного региона. Положительные результаты получены в ИФА и ДИА в 17 и случаях, соответственно (таблица 3). Было отмечено, что положительные пробы зареги стрированы в трех из 15 исследованных природных эпитопах.
Таблица 3 – Результаты обнаружения антигенов туляремийного микроба в суспензии печени и селезенки в различных объектах эпизоотологического обследования.
Коли- Количество положительных проб Вид исследуемого чество ИФА-Тул материала ИФА ДИА проб СтавНИПЧИ Рыжая полевка 51 10 9 Обыкновенная полевка 3 2 2 Желтогорлая мышь 18 5 4 Лесная мышь 22 0 0 Домовая мышь 1 0 0 Обыкновенная бурозубка 7 0 0 Малая бурозубка 1 0 0 Большая синица 3 0 0 Сконструированные антигенные препараты для ИФА на основе ПАК выявляли спе цифические антитела как в гипериммунных туляремийных сыворотках (в титрах 1/51200 1/204800), так и у зараженных, иммунизированных и вакцинированных лабораторных жи вотных (в титрах 1/800- 1/3200). Использование гликозилированного белкового комплекса в качестве сенситина в ИФА также давало возможность выявления туляремийных антител (у лабораторных животных в титре 1/100-1/400, в сыворотках – 1/3200). Специфичность экс периментальных антигенных диагностикумов в обоих случаях составила 100 % в отноше нии нормальных сывороток и коммерческих гетерологичных антительных препаратов. По казана возможность использования ПАК-15 в иммуноблоттинге для регистрации туляре мийной инфекции у лабораторных животных. Идентификацию проводили по антигенам с молекулярной массой около 43 и 17 кДа. Этим методом в течение 2-х месяцев регистриро вали туляремийные антитела у белых мышей, вакцинированных F. tularensis 15 НИИЭГ в дозе 104 м.к. Применение препаратов антигенных комплексов в качестве маркерных анти генов в иммуноблоттинге может быть использовано как подтверждающий тест при поста новке ИФА и ДИА.
Полученные данные представляют научный и практический интерес, поскольку впервые было показано, что протективный антигенный комплекс является общим антиге ном для туляремийного микроба, независимо от подвида возбудителя. Были получены пре параты ПАК из штаммов F. tularensis subsp. holarctica, nearctica, mediаasiatica и novicida, проведен сравнительный анализ их структуры, антигенных, биохимических и иммунологи ческих свойств. Разработанные способы получения и выявления антигенных комплексов туляремийного микроба и специфических антител могут служить основой для создания но вых средств диагностики туляремии.
ВЫВОДЫ 1. С помощью оптимизированного метода выделения комплексных антигенов туля ремийного микроба, основанного на способах химического и ферментативного гидролиза с последующей колоночной хроматографией, были получены иммунохимически активные препараты: протективный антигенный комплекс и гликозилированный белковый комплекс.
2. Выявлена высокая иммунохимическая активность и антигенная идентичность препаратов протективного антигенного комплекса, полученных из клеток штаммов F. tularensis subsp. holarctica биоваров eryR, eryS, japonica, subsp. nearctica и subsp.
mediаasiatica. Протективный антигенный комплекс регистрируется у туляремийного мик роба независимо от формы липополисахарида и наличия капсулы.
3. Выявлены особенности протективного антигенного комплекса F. tularensis subsp.
novicida, состоящие в преобладании углеводного и липидного компонентов над белковым и отсутствии иммунодоминантных полипептидов с молекулярной массой в диапазоне от до 90 кДа, которые приводят к снижению его иммуногенности.
4. Разработанная схема гипериммунизации кроликов-продуцентов с последователь ным использованием в качестве иммуногена смеси водно-фенольных экстрактов клеток F. tularensis subsp. holarctica, nearctica, mediaаsiatica и протективного антигенного ком плекса, позволяет получать активные туляремийные сыворотки с минимальным уровнем содержания гетерологичных антител. Сконструированные на основе полученных поликло нальных антител экспериментальные иммунодиагностикумы (иммуноферментные, иммуно суспензионные, иммунофлуоресцентные) выявляют возбудитель туляремии в концентраци ях, соответствующих чувствительности методов.
5. Лабораторные испытания экспериментальных антительных препаратов для детек ции F. tularensis в ИФА и ДИА на чистых и смешанных культурах, в искусственно конта минированных пробах биологического материала и внешней среды показали их высокую специфичность и чувствительность. При исследовании органов инфицированных лабора торных животных была отмечена 100 % корреляция результатов экспериментального ИФА с данными бактериологического анализа в ранние сроки после заражения. Эффективность применения экспериментальных иммуноферментных тест-систем подтверждена исследова ниями полевого материала, собранного при эпизоотологическом обследовании зеленой зо ны г. Саратова.
6. Применение антигенных комплексов туляремийного микроба в качестве сенсити нов в ИФА и ДИА и маркерных антигенов в иммуноблоттинге позволяет определять спе цифические антитела в гипериммунных туляремийных сыворотках и при изучении динами ки образования антител у иммунизированных, вакцинированных и экспериментально зара женных лабораторных животных.
Список работ, опубликованных по материалам диссертации 1. Волох О.А., Шепелв И.А., Храмкова (Кузнецова) Е.М., Ермин С.А., Дятлов И.А.
Разработка иммуноферментного анализа на основе «С»-комплекса туляремийного микроба // Санит. охрана террит. государств участников СНГ: пробл. биол. безоп. и противодействия биотерроризму в совр. условиях: Матер. VI Межгосуд. науч.-практ. конф. – Волгоград, 2005. – С. 217-219.
2. Волох О.А., Ермин С.А., Шепелв И.А., Храмкова (Кузнецова) Е.М., Авдеева Н.Г., Дятлов И.А. Разработка комплексного профилактического препарата против чумы и туляремии // Инф. болезни: пробл. здравоохр. и военной медицины: Матер. Рос. науч. практ. конф. – СПб, 2006. – С. 70.
3. Храмкова (Кузнецова) Е.М., Волох О.А., Шепелв И.А., Ермин С.А. Использова ние препарата С-комплекса Francisella tularensis для определения противотуляремийных антител // Чрезвыч. ситуации междунар. значения в общественном здравоохр. и санит.
охрана террит. государств-участников СНГ: Матер. VII Межгосуд. науч.-практ. конф. – п.
Оболенск, 2006. – С. 254-255.
4. Храмкова (Кузнецова) Е.М., Волох О.А., Шепелв И.А., Ермин С.А., Дятлов И.А. Использование С-комплекса туляремийного микроба для создания диагностиче ских тест-систем // Биотехнология. - 2007. - №2. – С. 72-77 (из перечня ВАК).
5. Храмкова (Кузнецова) Е.М., Волох О.А., Шепелв И.А., Ермин С.А., Авдеева Н.Г. Использование антител к С-комплексу Francisella tularensis для выявления возбудите ля туляремии // Матер. IX съезда Всерос. науч.-практ. об-ва эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. – Москва, 2007. – С. 91.
6. Храмкова (Кузнецова) Е.М., Шепелв И.А., Волох О.А., Кузнецов О.С., Алшина Ю.А., Ермин С.А. Изучение ответных реакций макроорганизма на введение С-комплекса туляремийного микроба // Совр. аспекты эпид. надзора за особо опасными инф. заболевани ями на Юге России: Матер. науч.-практ. конф. – Ставрополь, 2007. – С. 152-154.
7. Волох О.А., Шепелв И.А., Фирстова В.В., Храмкова (Кузнецова) Е.М., Авде ева Н.Г., Самохвалова Ю.И., Ермин С.А., Дятлов И.А. Оценка иммунобиологической активности препаратов С-комплекса возбудителя туляремии как перспективного компонента химических вакцин // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. – 2007. - № 3. - С. 16-21 (из перечня ВАК).
8. Храмкова (Кузнецова) Е.М., Уткин Д.В., Шепелв И.А., Авдеева Н.Г., Волох О.А.
Оценка чувствительности и специфичности антительных препаратов к «С»-комплексу ту ляремийного микроба // Совр. технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инф. бол. на террит. государств-участников СНГ: Матер. IX Межгосуд. науч.-практ. конф. – Волгоград, 2008. – С. 143-144.
9. Кузнецова Е.М., Волох О.А., Шепелв И.А., Авдеева Н.Г. Разработка препарата для иммунодиагностики возбудителя туляремии // Биол. безоп. в совр. мире: Матер. науч. практ. конф. молодых ученых и специалистов науч.-исслед. учрежд. Роспотребнадзора. – п.
Оболенск, 2009. – С. 129-131.
10. Кузнецова Е.М., Волох О.А., Шепелв И.А. Актуальные вопросы дифференциа ции подвидов Francisella tularensis // Научное обеспечение противоэпид. защиты населения:
Мат. юбил. Всерос. науч.-практ. конф., посв. 90-летию ННИИЭМ им. акад. И.Н. Блохиной Роспотребнадзора и 20-летию Приволжского окружного центра по профилакт. и борьбе со СПИД. – Н. Новгород, 2009. – С. 143-146.
11. Волох О.А., Кузнецова Е.М., Ермин С.А., Гусева Н.П., Шепелв И.А., Авдеева Н.Г. Перспективы создания химической туляремийной вакцины // Научное обеспечение противоэпид. защиты населения: Мат. юбил. Всерос. науч.-практ. конф., посв. 90-летию ННИИЭМ им. акад. И.Н. Блохиной Роспотребнадзора и 20-летию Приволжского окружного центра по профилакт. и борьбе со СПИД. – Н. Новгород, 2009. – С. 329-331.
12. Кузнецова Е.М., Шепелв И.А., Волох О.А. Структурно-функциональная ха рактеристика основных антигенов Francisella tularensis // Проблемы особо опасных инфекций – 2009. – Вып. 2 (100). - С. 44-49 (из перечня ВАК).
13. Кузнецова Е.М., Волох О.А., Терехова И.В., Сырова Н.А., Шепелв И.А. Получе ние и характеристика модифицированного С-комплекса туляремийного микроба // Акту альные проблемы предупреждения и ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций в области санитарно-эпидемического благополучия населения государств-участников СНГ:
Мат. X Межгосуд. науч.-практ. конф. государств-участников СНГ. – Ставрополь, 2010. – С.
198-199.
14. Смолькова Е.А., Щуковская Т.Н., Кравцов А.Л., Кузнецова Е.М., Волох О.А., Ни кифоров А.К. Апоптоз и пролиферативная активность иммунокомпетентных клеток биомо делей при иммунизации С-комплексом туляремийного микроба различных подвидов // Ак туальные проблемы предупреждения и ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций в области санитарно-эпидемического благополучия населения государств-участников СНГ:
Мат. X Межгосуд. науч.-практ. конф. государств-участников СНГ. – Ставрополь, 2010. – С.
269-270.
15. Смолькова Е.А., Щуковская Т.Н., Кравцов А.Л., Кузнецова Е.М., Волох О.А., Никифоров А.К. ДНК-цитометрия иммунокомпетентных клеток биомоделей в усло виях иммунизации препаратами С-комплекса туляремийного микроба различных подвидов // Проблемы особо опасных инфекций – 2011. – Вып. 1 (107). - С. 74-76 (из пе речня ВАК).
16. Кузнецова Е.М., Волох О.А., Шепелв И.А., Авдеева Н.Г. Гликозилированный белковый комплекс Francisella tularensis // Инновационные технологии в противоэпид. за щите населения: Мат. науч.-практ. конф. молодых ученых Роспотребнадзора. – Н. Новго род, 2011. – С. 93-95.
17. Кузнецова Е.М., Волох О.А., Смолькова Е.А., Щуковская Т.Н., Шепелв И.А., Авдеева Н.Г., Кравцов А.Л., Никифоров А.К. Иммунобиологические свойства антигенных комплексов туляремийного микроба // Проблемы особо опасных инфек ций – 2011. – Вып. 3 (109). - С. 46 – 49 (из перечня ВАК).
18. Шепелв И.А., Волох О.А., Самохвалова Ю.И., Кузнецова Е.М., Еремин С.А. Ис пользование феномена QS в технологии культивирования штаммов-продуцентов протек тивных антигенов // Современные технологии обеспечения биологической безопасности:
Мат. III науч.-практ. школы-конф. молодых ученых и специалистов науч.-исслед. организа ций Роспотребнадзора. – п. Оболенск, 2011. – С. 301-304.