Влияние 2-гидроксипропил-циклодекстрина на термостабильность и агрегацию белков
На правах рукописи
Малолеткина Ольга Игоревна
ВЛИЯНИЕ 2-ГИДРОКСИПРОПИЛ--ЦИКЛОДЕКСТРИНА НА
ТЕРМОСТАБИЛЬНОСТЬ И АГРЕГАЦИЮ БЕЛКОВ
специальность 03.01.04 – биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Москва – 2012
Работа выполнена в лаборатории ферментных систем Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук
Научный руководитель:
доктор биологических наук К.А. Маркосян
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор Н.П. Юрина доктор биологических наук, профессор Е.Н. Добров
Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский университет дружбы народов»
Защита состоится «» 2012 г. в час. на заседании диссертационного совета Д 002.247.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора и кандидата наук при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, стр. 2.
С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071 Москва, Ленинский пр. 33, корп. 1.
Автореферат разослан «» 2012 г.
Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук А.Ф. Орловский
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Интерес к проблеме агрегации белков возник в последние годы в связи с обнаружением большого числа наследственных заболеваний, известных как «конформационные болезни» и возникающих в тех случаях, когда те или иные белки подвергаются структурной перестройке, способствующей их агрегации (болезни Альцгеймера, Паркинсона, Хантингтона, прионные энцефалопатии и др.). Агрегация белков является также важной проблемой для биотехнологии, т.к. агрегацией сопровождаются все стадии производства белковых лекарственных препаратов. Известно, что присутствие низкомолекулярных веществ (например, сахаров, многоатомных спиртов, солей, аминокислот и т.д.) оказывает значительное влияние на стабильность белка в растворе. В связи с этим добавки, подавляющие агрегацию, часто используются во время производства, очистки и приготовления лекарственных форм и до настоящего времени являются наиболее эффективным способом борьбы с проблемой агрегации. Поскольку в продажу поступает все большее количество белковых препаратов, промышленность нуждается в новых антиагрегационных агентах для разработки технологии производства, позволяющей получать стабильные, правильно свернутые активные продукты.
Для подавления агрегации белков часто используют циклодекстрины (ЦД) и их производные. Способность ЦД подавлять агрегацию белков объясняется их способностью связываться с остатками гидрофобных аминокислот в ненативных (частично развернутых) формах белков, что приводит к подавлению процесса агрегации. Однако имеются данные, демонстрирующие стимуляцию агрегации белков в присутствии ЦД. Действие ЦД и их производных испытывают в различных тест-системах, каждая из которых имеет свои ограничения. В тест-системах, основанных на рефолдинге белков, ренатурация идет через стадию образования интермедиатов, склонных к агрегации. Используемый агент может оказывать влияние на стадию образования интермедиата из денатурированного белка. Возможно наложение эффектов агента на эту стадию и на стадию агрегации интермедиата.
Таким образом, не представляется возможным использовать модель рефолдинга для изучения влияния агентов на стадию агрегации. В качестве тест-систем, пригодных для испытания эффективности подавления агрегации белков ЦД и их производными, применяются также системы, основанные на тепловой агрегации белков. В таких тест-системах также возможно влияние агентов на стадию денатурации нативного белка, и исследование чистого эффекта на стадию агрегации невозможно без предварительной проверки термостабильности белка в присутствии агента.
Цели и задачи работы. Целью настоящей работы является изучение механизмов разнонаправленного (подавляющего и ускоряющего) действия циклодекстринов (на примере 2-гидроксипропил--циклодекстрина;
ГПЦД) на процесс агрегации белков и разработка тест-системы, позволяющей оценивать влияние различных агентов непосредственно на стадию агрегации белковых молекул.
В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:
1. Изучить влияние ГПЦД на термостабильность и кинетику тепловой агрегации креатинкиназы из скелетных мышц кролика.
2. Изучить влияние ГПЦД на термостабильность и кинетику тепловой агрегации глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы из скелетных мышц кролика.
3. Исследовать агрегацию УФ-облученной глицеральдегид-3 фосфатдегидрогеназы.
4. Изучить влияние ГПЦД на кинетику агрегации УФ-облученной глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы.
Научная новизна. При изучении кинетики тепловой агрегации креатинкиназы из скелетных мышц кролика методом динамического светорассеяния установлено, что механизм тепловой агрегации креатинкиназы включает стадию образования стартовых агрегатов. Показано, что тепловая агрегация креатинкиназы протекает в реакционно-контролируемом режиме.
На основании сопоставления процессов тепловой инактивации и денатурации креатинкиназы в присутствии ГПЦД сделан вывод о том, что ГПЦД не влияет на термостабильность белка. Методом динамического светорассеяния показано подавляющее действие ГПЦД на тепловую агрегацию креатинкиназы.
Показано, что стимуляция агрегации глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы из скелетных мышц кролика в присутствии ГПЦД вызвана дестабилизацией белка под действием ГПЦД. Ускорение денатурации глицеральдегид-3 фосфатдегидрогеназы в присутствии ГПЦД «перекрывает» возможный защитный эффект ГПЦД на стадии агрегации и общим эффектом является ускорение агрегации.
Разработана новая тест-система для скрининга антиагрегационных агентов, основанная на агрегации УФ-облученной глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы.
Показано, что в результате УФ-облучения в растворе образуются развернутые молекулы белка, что дает возможность исследовать влияние различных агентов, обладающих шапероноподобной активностью, непосредственно на стадию агрегации белка в условиях, близких к физиологическим (37 С). С помощью такой тест-системы показано защитное действие ГПЦД на агрегацию глицеральдегид-3 фосфатдегидрогеназы.
Практическое значение работы. Новая тест-система, основанная на агрегации УФ-облученного белка, может быть использована для поиска антиагрегационных агентов и оценки их шапероноподобной активности. Результаты исследований механизма действия ГПЦД на агрегацию белков могут быть учтены при решении биотехнологических задач и создании белковых препаратов медицинского назначения. Понимание механизмов агрегации белков и механизмов, предотвращающих агрегацию, на молекулярном уровне открывает перспективы для исследования и лечения большого ряда наследственных заболеваний, известных как «конформационные болезни».
Апробация работы. Результаты диссертационной работы представлены на Международных конференциях студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов» (Москва, 2008;
2009), конференции молодых ученых в рамках V Международного Симпозиума «Российско-Европейское сотрудничество в области «Биотехнология, сельское хозяйство и пища» в седьмой рамочной программе ЕС»
(Пущино, 1-3 октября, 2008), VIII и IX Европейских Симпозиумах Общества Белка (Цюрих, Швейцария, 2009 и Стокгольм, Швеция, 2011).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ ( статьи в рецензируемых журналах, статья в сборнике трудов и 5 тезисов).
Объем и структура работы. Работа изложена на 122 страницах, содержит рисунков и 12 таблиц. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (5 глав), описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения (3 главы), выводов и списка цитируемой литературы (231 источник).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В работе использовали лиофилизованный препарат цитоплазматической креатинкиназы (КФК;
КФ 2.7.3.2) из скелетных мышц кролика («Sigma», США) и сухой коммерческий препарат ГПЦД (CycloLab, Венгрия). Препарат NAD-зависимой глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (ГАФД;
КФ 1.2.1.12) из скелетных мышц кролика был любезно предоставлен к.б.н. Р.А. Асриянц (Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского -Кристаллин государственного университета имени М.В. Ломоносова). из хрусталиков глаза молодых бычков был любезно предоставлен д.б.н.
К.О. Мурановым (Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук).
УФ-облучение ГАФД было выполнено совместно с д.б.н. К.О. Мурановым в лаборатории физико-химических основ рецепции (Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук). УФ-облучение образцов (концентрация ГАФД 2 мг/мл, объем 2 мл) проводили в кварцевой кювете с длиной оптического пути 1 см с помощью 1000 Вт ртутной лампы (ДРШ-1000, Россия). Температура образцов не превышала 10 C.
Эксперименты по скоростной седиментации были выполнены совместно с д.б.н. Н.А. Чеботаревой (Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук) на аналитической ультрацентрифуге «Spinco E» (Beckman, США) с использованием абсорбционной оптической сканирующей системы при длине волны 280 нм, при 20-48 C и скоростях вращения ротора от 1000 до 40000 об/мин. Коэффициенты седиментации рассчитывали c помощью программы SEDFIT. Полученные коэффициенты седиментации приводили к стандартным условиям (плотность и вязкость растворителя брали для водного раствора при 20 C).
Калориметрические исследования проводили совместно с к.б.н.
С.Ю. Клейменовым (Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук) и к.б.н. В.Н. Орловым (НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова) на дифференциальном адиабатическом сканирующем микрокалориметре ДАСМ-4М (ИБП РАН, Пущино).
Растворы белка нагревали с постоянной скоростью 1 или 2 C/мин в температурном интервале от 15 до 90 C при постоянном давлении 2,2 атмосферы.
Кинетику агрегации белков изучали методом динамического светорассеяния.
Измерения проводили при помощи коммерческой установки фотометра рассеянного лазерного света Photocor (Photocor Instruments Inc., США) с He–Ne лазером мощностью 10 мВт и длиной волны падающего света 632,8 нм (Coherent, США, модель 31-2082). Температуру образцов поддерживали при помощи пропорционально-интегрально-дифференциального регулятора PhotoCor-TC в пределах 0,1 C. Автокорреляционные функции измеряли при помощи Photocor-FC в режиме multiple-tau с использованием 288 каналов. Обработку автокорреляционных функций и расчёт размеров гидродинамического радиуса Rh проводили при помощи программы DynaLS (Alango, Израиль).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Влияние ГПЦД на тепловую инактивацию, денатурацию и агрегацию креатинкиназы из скелетных мышц кролика Для выяснения характера влияния ГПЦД на тепловую инактивацию КФК (0,2 мг/мл) нами была изучена кинетика 1, инактивации фермента при 48 С в присутствии ГПЦД. Концентрацию ГПЦД 0, варьировали в диапазоне 10-76 мМ. Как 0, A/A видно из рис. 1, в присутствии ГПЦД 0,4 кинетика инактивации не изменялась.
Термостабильность КФК была 0, исследована методом дифференциальной 0, 300 сканирующей калориметрии (ДСК).
0 100 t, мин Положение максимума на ДСК-профиле Рис. 1. Зависимость остаточной ферментативной (Tmax) в отсутствие ГПЦД соответствует активности КФК (0,2 мг/мл) от времени в отсутствие () и в присутствии 76 мМ ГПЦД () 53,7 ± 0,1 С (рис. 2). Имеются данные, что при 48 С.
форма ДСК профилей КФК остается неизменной при варьировании концентрации белка [Lyubarev et al., 1999]. Это означает, что процесс денатурации КФК не включает кинетически значимую стадию обратимой диссоциации КФК на мономеры.
[ГПЦД], мМ:
-1 - 250 Cp, кДжмоль K Для выяснения характера влияния 200 ГПЦД на термостабильность КФК мы 150 сравнили ДСК профили в отсутствие и в 100 присутствии ГПЦД (рис. 2). Значение Tmax ex 50 в присутствии ГПЦД практически не изменялось и составило 53,8 ± 0,1, 53,6 ± 0,1 С 40 45 50 55 60 65 53,6 ± 0,1 и при Температура, °C концентрациях ГПЦД 15, 38 и 76 мМ, Рис. 2. Профили ДСК для КФК (0,5 мг/мл;
соответственно. Таким образом, ГПЦД в 30 мM Hepes-NaOH, 0,1 М NaCl, pH 8,0), концентрациях вплоть до 76 мМ не полученные при различных концентрациях ГПЦД. Скорость нагревания раствора оказывает влияния на тепловую фермента 1 С/мин.
денатурацию КФК.
8 Действие ГПЦД на агрегацию КФК было исследовано методом I10, фотоотсчет/с динамического светорассеяния. На рис. представлен прирост интенсивности светорассеяния для агрегации КФК при 48 С в отсутствие и в присутствии ГПЦД.
- 2 Добавление ГПЦД вызывает снижение 0 прироста интенсивности светорассеяния.
0 10 30 40 50 60 Как видно из рис. 3, кинетические кривые t, мин Рис. 3. Зависимости интенсивности агрегации КФК характеризуются светорассеяния от времени для тепловой наличием лаг-периода. Для вычисления агрегации КК (0,2 мг/мл) при 48 С, полученные в присутствии различных длительности лаг-периода (t0), мы концентраций ГПЦД: (1) 0, (2) 8, (3) 38, (4) проанализировали начальные участки и (5) 76 мМ.
зависимости интенсивности A светорассеяния от времени с помощью 0, I10, фотоотсчет/с эмпирического уравнения, предложенного ранее [Курганов, 1998;
Eronina et al., 2009;
0, Bumagina et al., 2010b]:
0, - I = Kagg(t t0)2, (t t0) (1) 0, где I – интенсивность светорассеяния, 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2, Kagg – константа с размерностью Б 1, (фотоотсчет/с) мин-2, характеризующая I10, фотоотсчет/с 0,8 начальную скорость агрегации.
Применимость этого уравнения 0, показана для начальных участков 0, зависимостей I от времени, полученных в - 0, отсутствие (рис. 4А) и в присутствии 0, 38 мМ ГПЦД (рис. 4Б). Величины 0 1 2 3 4 5 6 7 параметров t0 и Kagg, рассчитанные с t, мин Рис. 4. Начальные участки зависимостей помощью уравнения (1), приведены в интенсивности светорассеяния от времени таблице 1. Как видно из таблицы, для тепловой агрегации КФК при 48 С в концентраций длительность лаг-периода (t0) присутствии следующих ГПЦД: (А) 0 и (Б) 38 мМ. Сплошные кривые увеличивается с ростом концентрации проведены в соответствии с уравнением (1).
Вертикальные стрелки обозначают момент ГПЦД. Уменьшение значения Kagg в времени t = t0.
присутствии ГПЦД указывает на подавление агрегации КФК под действием ГПЦД.
Таблица 1. Параметры тепловой агрегации КФК (0,2 мг/мл) при 48 C в присутствии различных концентраций ГПЦД (30 мM Hepes-NaOH, 0,1 М NaCl, pH 8,0) Kagg, (фотоотсчет/с) мин-2 1/t2R, мин - [ГПЦД], мМ t0, мин Rh,0, нм (132 4) 0,84 0,02 32 2 0,81 0, (44 1) 1,05 0,04 46 1 0,40 0, (69 2) 1,39 0,03 58 5 0,37 0, (38 1) 2,07 0,02 82 5 0,24 0, (31 1) 2,07 0,02 74 4 0,28 0, (22 1) 2,41 0,03 89 4 0,20 0, (10,8 0,3) 2,44 0,05 129 7 0,102 0, (2,0 0,1) 2,69 0,05 138 6 0,081 0, A Метод динамического Относительная интенсивность 0, светорассеяния позволяет определить размер агрегатов, образующихся при 0, нагревании КФК. На рис. 5 показано распределение по размеру частиц, 0,2 полученных при различных временах инкубации КФК при 48 C в отсутствие и 0,0 1 2 3 10 10 10 10 в присутствии ГПЦД. Как видно, Б Относительная интенсивность 34 распределение частиц по размеру является 0, унимодальным и средние величины 0,3 2 гидродинамического радиуса агрегатов белка увеличиваются с увеличением 0, времени инкубации. При одинаковых 0, временах инкубации в присутствии ГПЦД 0,0 1 образуются агрегаты меньшего размера.
2 3 10 10 10 R h, нм На рис. 6 представлены Рис. 5. Тепловая агрегация КФК (0,2 мг/мл) при 48 C в отсутствие (А) и в присутствии зависимости гидродинамического радиуса 76 мМ ГПЦД (Б). Распределения частиц по (Rh) белковых агрегатов КФК от времени, размеру получены при следующих временах инкубации: А – (1) 1,5, (2) 5, (3) 20, (4) 40 и полученные в отсутствие ГПЦД (кривая 1) (5) 60 мин;
Б - (1) 5, (2) 20, (3) 40 и (4) 60 мин.
и в присутствии ГПЦД в концентрациях 38 и 76 мМ (кривые 2 и 3, соответственно). Анализ начальных участков зависимостей Rh от времени показал, что они следуют экспоненциальному закону:
ln Rh Rh,0 exp (t t0 ). (t t0) (2) t2R Применимость данного уравнения A показана для начальных участков 2000 2 зависимостей Rh от времени, полученных R h, нм в отсутствие (рис. 6Б) и в присутствии 38 мМ ГПЦД (рис. 6В). При известных значениях t0 могут быть найдены параметры уравнения (2), а именно Rh,0 – гидродинамический радиус стартовых 0 10 20 30 40 50 60 агрегатов, т.е. агрегатов, присутствующих Б в системе в момент времени, в который регистрируется начальный прирост R h, нм интенсивности светорассеяния, и t2R интервал времени, на протяжении которого гидродинамический радиус агрегатов увеличивается в 2 раза.
Величина 1/t2R характеризует начальную 0 1 2 3 скорость агрегации. Полученные значения В Rh,0 и 1/t2R представлены в таблице 1. Как видно, гидродинамический радиус R h, нм стартовых агрегатов увеличивается с ростом концентрации ГПЦД от Rh,0 = 32 2 нм при [ГПЦД] = 0 до 138 6 нм при [ГПЦД] = 76 мМ. В присутствии 76 мМ ГПЦД наблюдается 0 2 4 6 t, мин десятикратное уменьшение значения Рис. 6. Зависимости гидродинамического радиуса белковых агрегатов от времени для параметра 1/t2R по сравнению с контролем тепловой агрегации КФК при 48 C.
([ГПЦД] = 0). Уменьшение значения 1/t2R (А) Зависимости Rh от времени, полученные в присутствии различных концентраций ГПЦД: отражает подавление агрегации КФК под (1) 0, (2) 38 и (3) 76 мМ. Сплошная кривая действием ГПЦД.
вычислена по уравнению (3). Начальные Экспоненциальный характер участки зависимостей Rh от времени, полученные в отсутствие (Б) и в присутствии 38 мМ ГПЦД (В). Кривые проведены в зависимости гидродинамического радиуса соответствии с уравнением (2). Вертикальные от времени на начальном участке стрелки обозначают момент времени t = t0.
указывает на то, что процесс агрегации протекает в режиме reaction-limited cluster-cluster aggregation (RLCA), т.е. в режиме, при котором вероятность слипания частиц при столкновении меньше единицы.
Теория предсказывает, что с ростом размеров агрегатов режим RLCA сменяется режимом diffusion-limited cluster-cluster aggregation (DLCA), при котором скорость агрегации определяется диффузией взаимодействующих частиц и каждое столкновение частиц приводит к их слипанию [Weitz and Lin, 1986]. Смена режимов агрегации происходит вследствие роста агрегатов, приводящего к увеличению поверхности сталкивающихся частиц, и, следовательно, к увеличению вероятности слипания. При выполнении режима DLCA зависимость гидродинамического радиуса от времени следует степенному закону [Khanova et al., 2005;
Markossian et al., 2006]:
Rh Rh [1 K (t t * )]1/ df, (t t*) * (3) * где Rh – значение Rh при t = t*, K – константа, df – фрактальная размерность агрегатов. Для режима DLCA характерно универсальное значение df, равное 1, [Weitz et al., 1985;
Weitz and Lin, 1986]. Анализ зависимости Rh от времени для агрегации КФК в отсутствие ГПЦД показывает, что при довольно высоких значениях времени (t 10 мин) эта зависимость удовлетворительно описывается уравнением (3).
При этом фрактальная размерность равна 1,81 0,02.
Основные характеристики агрегации КФК также получены в режиме нагревания с постоянной скоростью. Агрегация КФК при нагревании с постоянной скоростью может быть использована для создания тест-системы скрининга агентов, оказывающих влияние на агрегацию белков.
Подавление тепловой агрегации КФК под действием ГПЦД согласуется с результатами работ, в которых защитное действие циклодекстринов было показано для тепловой агрегации цитратсинтазы, алкогольдегидрогеназы из печени лошади, гормонов роста норки и свиньи и -амилазы [Toda et al., 2007;
Sigurjonsdottir et al., 1999;
Samra et al., 2010;
Bajorunaite et al., 2009].
Представляло интерес сравнить эффективность подавления агрегации КФК шапероноподобным агентом ГПЦД с действием молекулярных шаперонов, представителем которых является -кристаллин. Добавление в систему каждого из этих агентов вызывает значительное увеличение длительности лаг-периода и параметров Kagg и 1/t2R, что количественно характеризует снижение начальной скорости агрегации. Однако при изучении действия ГПЦД приходится использовать значительно более высокие молярные концентрации, чем в случае -кристаллина.
2. Влияние ГПЦД на тепловую инактивацию, денатурацию и агрегацию ГАФД из скелетных мышц кролика 1, Для выяснения характера влияния ГПЦД на термостабильность ГАФД была 0, изучена кинетика термоинактивации A/A 0, ГАФД и проведено исследование 1, 0, тепловой денатурации фермента методом 0,2 ДСК в отсутствие и в присутствии ГПЦД.
Зависимость остаточной ферментативной 0, 0 100 200 300 активности (А/А0) ГАФД от времени t, мин инкубации при 45 С в отсутствие и в Рис. 7. Влияние ГПЦД на кинетику термоинактивации ГАФД (0,4 мг/мл) при присутствии различных концентраций 45 С (10 мМ Na-фосфатный буфер, pH 7,5, ГПЦД представлена на рис. 7.
0,1 М NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ).
Зависимости остаточной ферментативной Скорость инактивации можно активности A/A0 от времени получены в охарактеризовать с помощью параметра отсутствие ГПЦД (1) и в присутствии 4, 31, 76 мМ ГПЦД (2–4, соответственно). t0,5, соответствующего времени падения активности на 50%. Значение t0,5, полученное в присутствии 4 мМ ГПЦД, не отличалось от контроля в отсутствие ГПЦД и составляло 240 мин. Полученный результат показывает, что низкие концентрации ГПЦД не влияют на термостабильность ГАФД. Относительно высокие концентрации ГПЦД вызывают ускорение инактивации. Значение t0, 1 снижается до 125 и 25 мин в присутствии - 3 31 и 76 мМ ГПЦД, соответственно Cp, кДж моль К - (кривые 3 и 4 на рис. 7).
100 Термостабильность ГАФД исследовали методом ДСК. В отсутствие ex ГПЦД положение максимума на профиле ДСК (Tmax) равно 55,6 C (кривая 1 на 30 40 50 60 70 рис. 8). Форма ДСК профиля практически Температура, °C не изменяется в присутствии 4 мМ ГПЦД (кривая 2;
Tmax = 55,4 C). Для смеси Рис. 8. Профили ДСК для ГАФД (0,4 мг/мл), полученные при следующих концентрациях ГАФД с 76 мМ ГПЦД наблюдается ГПЦД: (1) 0, (2) 4 и (3) 76 мМ. Скорость нагревании раствора фермента 1 С/мин. значительный сдвиг Tmax в область более низких температур (кривая 3;
Tmax = 52,8 C). Полученные данные свидетельствуют, что относительно высокие концентрации ГПЦД снижают термостабильность ГАФД.
Тепловая агрегация ГАФД в присутствии ГПЦД была изучена методом динамического светорассеяния. На рис. 9 показаны зависимости интенсивности светорассеяния от времени в присутствии различных концентраций ГПЦД. Как видно из рисунка, ГПЦД стимулирует тепловую агрегацию ГАФД. Следует отметить, что ускорение агрегации наблюдается даже при довольно низких концентрациях ГПЦД (4 мМ;
кривая 2 на рис. 9А). На первый взгляд этот результат противоречит данным по термоинактивации и ДСК, согласно которым в присутствии 4 мМ ГПЦД термостабильность ГАФД не меняется.
А 400000 Это противоречие объясняется высокой чувствительностью метода регистрации I, фотоотсчет/с белковых агрегатов по измерению интенсивности светорассеяния. Метод динамического светорассеяния позволяет регистрировать агрегаты белка при их 0 20 40 60 80 содержании около 0,01% [Philo, 2006].
Б Начальные участки зависимостей I, фотоотсчет/с интенсивности светорассеяния от времени проанализированы с помощью уравнения (1) (рис. 9Б). Полученные значения параметров t0 (длительность лаг-периода) и Kagg (характеристика начальной скорости 5 агрегации) приведены в таблице 2.
1 2 3 Длительность лаг-периода уменьшается с t, мин Рис. 9. Влияние ГПЦД на тепловую увеличением концентрации ГПЦД. Рост агрегацию ГАФД (0,4 мг/мл) при 45 C. (А) значений Kagg с увеличением Зависимости интенсивности светорассеяния от времени для агрегации в отсутствие концентрации ГПЦД свидетельствует о (кривая 1) и в присутствии 4, 31, 46 и 76 мМ ГПЦД (кривые 2-5). (Б) Анализ начальных стимуляции агрегации ГАФД под участков зависимостей I от времени с действием ГПЦД.
помощью уравнения (1) при следующих Измерение гидродинамического концентрациях ГПЦД: (1) 0, (2) 4, (3) 31 и (4) 61 мМ. радиуса агрегатов белка показало, что в присутствии ГПЦД образуются белковые агрегаты более крупных размеров. На рис. 10А представлены зависимости гидродинамического радиуса агрегатов ГАФД от времени, полученные при различных концентрациях ГПЦД. Анализ зависимости Rh от времени в отсутствие ГПЦД (кривая 1) показал, что, начиная с определенного момента (t 10 мин), эта зависимость описывается уравнением (3) с df = 1,78 0,02. Это означает, что агрегация ГАФД протекает в диффузионно-контролируемом режиме (DLCA).
Полученные результаты согласуются с ранее полученными данными [Markossian et al., 2006;
Markossian et al., 2010].
Таблица 2. Параметры тепловой агрегации ГАФД (0,4 мг/мл) при 45 C в присутствии различных концентраций ГПЦД (10 мM Na-фосфатный буфер, 0,1 М NaCl, pH 7,5) Kagg, (фотоотсчет/с) мин- [ГПЦД], мМ t0, мин K1, нм/мин (0,47 0,01) 3,03 0,05 34 (0,77 0,02) 2,06 0,05 47 (1,23 0,06) 1,78 0,04 53 (1,53 0,07) 1,60 0,04 58 (1,6 0,1) 1,62 0,04 62 (2,1 0,1) 1,55 0,04 70 (2,3 0,1) 1,63 0,04 72 А Начальные участки зависимостей Rh от времени при различных концентрациях 3 ГПЦД (рис. 10Б) линейны и могут быть R h, нм 2 проанализированы с использованием уравнения:
1000 Rh Rh,0 K1 (t t0 ), (t t0) (4) где Rh,0 - гидродинамический радиус 0 20 40 60 стартовых агрегатов, t0 – момент времени Б появления стартовых агрегатов и K1 – константа, характеризующая скорость R h, нм увеличения размеров белковых агрегатов.
Параметр K1 соответствует наклону 200 начальных участков зависимости гидродинамического радиуса от времени 0 2 4 6 8 10 (K1 (dRh/dt)0). Полученные значения t, мин параметра представлены в таблице 2.
Увеличение значения K1 характеризует Рис. 10. Зависимости гидродинамического радиуса белковых агрегатов от времени для стимуляцию агрегации ГАФД под тепловой агрегации ГАФД (0,4 мг/мл) при действием ГПЦД.
45 C. (А) Полные кинетические кривые, полученные при различных концентрациях ГПЦД: (1) 0, (2) 4, (3) 31 и (4) 61 мМ.
При объяснении характера влияния Сплошная кривая проведена в соответствии с уравнением (3). (Б) Начальные участки ГПЦД на тепловую денатурацию и кинетических кривых. Прямые проведены в агрегацию ГАФД следует принимать во соответствии с уравнением (4).
внимание, что денатурация ГАФД протекает по диссоциативному механизму, согласно которому начальные стадии разворачивания белка включают диссоциацию исходного тетрамера на олигомерные формы меньшего размера (димеры и мономеры). Таким образом, можно предположить, что уменьшение термостабильности ГАФД в присутствии ГПЦД связано с диссоциацией тетрамерной формы ГАФД под действием ГПЦД.
Интересно сравнить влияние ГПЦД на тепловую агрегацию ГАФД с шаперонной активность малых белков теплового шока (sHsps). -Кристаллин, представитель семейства sHsps, подавляет тепловую агрегацию ГАФД, несмотря на то, что, судя по данным ДСК, -кристаллин дестабилизирует молекулу белка [Khanova et al., 2007;
Markossian et al., 2010]. Методом аналитического ультрацентрифугирования подтверждено образование комплексов между продуктами диссоциации ГАФД, с одной стороны, и продуктами диссоциации -кристаллина, с другой [Чеботарёва и соавт., 2009;
Markossian et al., 2010]. Согласно этим данным, -кристаллин индуцирует диссоциацию ГАФД на более лабильные димеры и мономеры. Тем не менее, образование комплексов -кристаллина с интермедиатами разворачивания ГАФД эффективно подавляет агрегацию. Логично предположить, что дестабилизация ГАФД в присутствии ГПЦД также вызвана образованием более лабильных мономерной и димерной форм. Однако, в отличие от -кристаллина, ускорение денатурации ГАФД в присутствии ГПЦД «перекрывает» возможный защитный эффект ГПЦД на стадии агрегации и общим эффектом является ускорение агрегации. Таким образом, чтобы увидеть эффект ГПЦД непосредственно на стадию агрегации, необходимо устранить его эффект на стадию денатурации. Для этого, в свою очередь, требуется разработка новой тест-системы, в которой под действием температуры будет агрегировать предварительно денатурированный белок.
3. Агрегация УФ-облученной глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы из скелетных мышц кролика УФ-облучение образцов ГАФД вызывает потерю ферментативной активности.
Установлено, что процесс инактивации следует экспоненциальному закону.
Методом ДСК мы определили долю белка, оставшегося в нативном состоянии, в УФ-облученных препаратах. На рис. 11 показаны ДСК профили нативной ГАФД и фермента, облученного различными дозами УФ. Площадь под кривой дает общую теплоту денатурации и пропорциональна количеству нативного белка. Как видно из рисунка, УФ-облучение приводит к уменьшению площади под кривой, что свидетельствует об уменьшении доли нативного белка в УФ-облученных образцах.
Уменьшение площади под кривой с увеличением дозы облучения сопровождается 500 сдвигом максимума (Tmax) на ДСК -1 - профиле в область более низких Cp, кДжмоль K температур. Значение Tmax для необлученной ГАФД составило 63,8 C.
При дозе УФ 60 Дж/см2 максимум 100 5 3 сдвигался до 53,5 C.
ex 0 По результатам 80 УФ-индуцированной инактивации и 30 40 50 60 Температура, °C данным ДСК для изучения агрегации Рис. 11. Профили ДСК для ГАФД (2 мг/мл), облученной следующими дозами УФ света: УФ-облученной ГАФД мы выбрали дозу (1) 0, (2) 15, (3) 25, (4) 40 и (5) 60 Дж/см2. 40 Дж/см2.
ex C p вычислено для тетрамера ГАФД.
На рис. 12 представлено дифференциальное распределение по коэффициентам седиментации c(s) для нативной (А) и УФ-облученной ГАФД (Б) при 20 C. Основной пик с s20,w = 8,18 0,13 S соответствует тетрамерной форме ГАФД (рис. 12А).
Распределения для УФ-облученной ГАФД (рис. 12Б) довольно широкие и полидисперсные, средневесовые значения коэффициента седиментации (sav) составили 8,6 2,6 S и 9,0 2,6 S для концентраций 0,2 и 0,8 мг/мл, соответственно.
По-видимому, увеличение полидисперности УФ-облученной ГАФД связано с тем, что облучение вызывает не только денатурацию фермента, но также диссоциацию тетрамера и агрегацию денатурированных форм. На присутствие диссоциированных форм указывает минорный пик с коэффициентом седиментации 5,0 S на распределениях c(s). Основные пики на распределениях c(s) со значениями 8,06 и 8, S (рис. 12Б) не сильно отличаются от пика нативной ГАФД (8,18 S). Можно А 2,0 Б 8, 0, 8, 1, 0, c (s) c (s) 1,0 8, 0,1 5, 0, 0,0 0, 0 5 10 15 20 0 5 10 15 s 20,w (S) s 20,w (S) Рис. 12. Седиментационный анализ нативной ГАФД и фермента, облученного дозой УФ Дж/см2, при 20 C. Дифференциальные распределения по коэффициентам седиментации c(s) нативной (А) и УФ-облученной ГАФД (Б). Концентрация нативного фермента 0,4 мг/мл, концентрации УФ-облученной ГАФД 0,8 (сплошная кривая) и 0,2 (пунктир) мг/мл. Скорость вращения ротора 48000 об/мин.
предположить, что часть УФ-облученной ГАФД существует в тетрамерной форме.
Рассмотрим кинетику агрегации A 5 1, УФ-облученной ГАФД при различных I10, фотоотсчет/с концентрациях белка. На рис. 13 показаны 1, зависимости интенсивности 0, светорассеяния от времени, полученные - для концентраций УФ-облученной ГАФД 0, в диапазоне от 0,2 до 1,0 мг/мл при 37 C.
0, 0 10 20 30 40 50 Начальные участки этих кривых были t, мин проанализированы с помощью уравнения Б (1). Полученные значения параметров t0 и Kagg представлены на рис. 13 Б и В как функция от концентрации УФ-облученной t0, мин ГАФД (УФ-ГАФД). Длительность лаг-периода (параметр t0) уменьшается с увеличением концентрации белка (рис. 13Б). Зависимость параметра Kagg 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1, (мера начальной скорости агрегации) от [УФ-ГАФД], мг/мл В - 2,5 концентрации белка (УФ-ГАФД) K agg 10, (фотоотсчет/с) мин нелинейна и следует степенному закону:
2, Kagg = const [УФ-ГАФД]n. (5) 1, Параметр n равен 2,1 0,2. По сути, 1, этот параметр представляет собой порядок 0, агрегации по белку. Интересно сравнить - 0,0 полученное значение параметра n с 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 соответствующим значением для [УФ-ГАФД], мг/мл необлученной ГАФД. Зависимость Kagg от Рис. 13. Кинетика агрегации УФ-облученной [ГАФД] линейна вплоть до концентрации ГАФД при различных концентрациях белка при 37 C. (А) Зависимости интенсивности 1 мг/мл. Это означает, что порядок светорассеяния (I) от времени для агрегации ГАФД, облученной дозой 40 Дж/см2, при агрегации по белку (n) равен единице.
следующих концентрациях фермента: (1) 0,2, Такая ситуация происходит, когда стадия (2) 0,4, (3) 0,6, (4) 0,8 и (5) 1 мг/мл. (Б и В) Зависимости параметров t0 и Kagg от разворачивания молекулы белка идет со концентрации УФ-облученной ГАФД значительно более низкой скоростью, чем (УФ-ГАФД). Сплошная кривая на рис. В стадия агрегации молекул проведена в соответствии с уравнением (5) при n = 2,1.
денатурированного белка.
В образцах УФ-облученной ГАФД присутствуют молекулы, предварительно денатурированные УФ излучением, т.е. в данной тест-системе отсутствует стадия разворачивания белка. Следовательно, можно ожидать, что порядок агрегации по белку больше единицы. Найденное значение n для агрегации УФ-облученной ГАФД действительно близко к 2. Таким образом, тест-системы такого типа можно использовать для исследования влияния различных агентов непосредственно на стадию агрегации.
3.1. Влияние ГПЦД на агрегацию УФ-облученной ГАФД 1, A Мы исследовали влияние ГПЦД на I10, фотоотсчет/с 0, агрегацию УФ-облученной ГАФД при 0, 37 C в разработанной тест-системе.
4 Как показано выше, стимуляция 0, - тепловой агрегации ГАФД в присутствии 0, ГПЦД вызвана дестабилизацией молекулы 0, белка. Поскольку процесс агрегации 0 10 20 30 t, мин УФ-облученной ГАФД не содержит Б стадии разворачивания белка, можно ожидать, что в этой системе проявится t0, мин защитный эффект ГПЦД. И 4 действительно, ГПЦД подавляет агрегацию УФ-облученной ГАФД.
Защитный эффект усиливается с 0 20 40 60 80 100 увеличением концентрации ГПЦД В [ГПЦД], мМ - K agg 10, (фотоотсчет/с) мин (рис. 14А). Начальные участки 6, зависимостей интенсивности 4, светорассеяния от времени, полученные в присутствии различных концентраций 3, ГПЦД, были проанализированы с - 1, помощью уравнения (1). Как видно из рис. 14Б, длительность лаг-периода 0, 0 20 40 60 80 100 (параметр t0) линейно возрастает с [ГПЦД], мМ увеличением концентрации ГПЦД. С Рис. 14. Влияние ГПЦД на агрегацию ГАФД (0,4 мг/мл), облученной дозой 40 Дж/см2. увеличением концентрации ГПЦД (А) Зависимости интенсивности наблюдается также уменьшение значения светорассеяния от времени при следующих концентрациях ГПЦД: (1) 0, (2) 4, (3) 15, параметра Kagg (рис. 14В). Измерение (4) 38, (5) 61, (6) 76 и (7) 114 мМ.
размера белковых частиц в системе Температура 37 C. (Б и В) Зависимости параметров t0 и Kagg от концентрации ГПЦД, показало, что снижение прироста соответственно.
интенсивности светорассеяния при добавлении ГПЦД связано с образованием агрегатов меньшего размера (рис. 15).
-кристаллин Показано, что подавляет агрегацию УФ-облученной 1500 ГАФД, и эффективность подавления Rh, нм возрастает при увеличении концентрации -кристаллина. Определение размера белковых частиц в системе показало, что снижение прироста интенсивности светорассеяния в присутствии 0 10 20 30 -кристаллина обусловлено образованием t, мин агрегатов меньшего размера.
Рис. 15. Зависимости гидродинамического радиуса (Rh) белковых агрегатов от времени для агрегации УФ-облученной ГАФД (0,4 мг/мл;
40 Дж/см2) при 37 C, полученные Повышенная способность в отсутствие () и в присутствии 61 мМ УФ-облученных белков к агрегации ГПЦД ().
позволяет создавать на их основе тест-системы для испытания действия различных агентов (например, белковых шаперонов, «искусственных шаперонов», таких как циклодекстрины и др.) на агрегацию белков. В настоящей работе предложена тест-система, основанная на агрегации УФ-облученной ГАФД. При изучении влияния УФ излучения на термостабильность ГАФД было показано, что УФ вызывает образование поврежденных молекул белка с меньшей термостабильностью.
Главное преимущество тест-систем, основанных на агрегации УФ-облученных белков, заключается в том, что они позволяют исследовать влияние различных агентов непосредственно на стадию агрегации. Порядок агрегации УФ-облученной ГАФД по белку близок к 2. Это свидетельствует о том, что скорость-лимитирующей стадией процесса агрегации является стадия агрегации денатурированных молекул. В настоящей работе показано защитное действие ГПЦД и-кристаллина на агрегацию УФ-облученной ГАФД. Подавление агрегации ГПЦД особенно интересно, поскольку ГПЦД стимулировал агрегацию необлученной ГАФД в связи с дестабилизацией молекулы фермента. В соответствии с общепринятым мнением можно предположить, что подавление агрегации УФ-облученной ГАФД в присутствии ГПЦД вызвано комплексообразованием ГПЦД с гидрофобными боковыми цепями аминокислотных остатков в белках [Aachman et al., 2003].
ВЫВОДЫ 1. На основании изучения кинетики тепловой агрегации креатинкиназы из скелетных мышц кролика методом динамического светорассеяния получены доказательства того, что механизм тепловой агрегации белка включает стадию образования стартовых агрегатов.
2. Показано, что 2-гидроксипропил--циклодекстрин подавляет тепловую агрегацию креатинкиназы и не влияет на термостабильность белка.
3. Установлено, что 2-гидроксипропил--циклодекстрин ускоряет тепловую агрегацию глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы из скелетных мышц кролика.
Этот эффект связан с дестабилизацией белка под действием 2-гидроксипропил- циклодекстрина.
4. Предложена новая тест-система для испытания соединений, обладающих шапероноподобной активностью, основанная на агрегации УФ-облученной глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы при 37 С. С использованием этой тест системы продемонстрировано защитное действие 2-гидроксипропил- циклодекстрина непосредственно на стадию агрегации УФ-облученной глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы.
Работа выполнена при финансовой поддержке грантами РФФИ, Программы «Молекулярная и клеточная биология» Президиума РАН, ФЦП "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009 – 2013 годы" ГК № П1356 и Фонда некоммерческих программ Дмитрия Зимина «Династия».
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Статьи в рецензируемых журналах:
1. Малолеткина О.И., Маркосян К.А., Асриянц Р.А., Орлов В.Н., Курганов Б.И.
Антишаперонная активность производных циклодекстринов. Докл. Академ. Наук, 2009, т. 427, № 4, с. 549–552.
2. Maloletkina O.I., Markossian K.A., Belousova L.V., Kleimenov S.Y., Orlov V.N., Makeeva V.F., Kurganov B.I. Thermal stability and aggregation of creatine kinase from rabbit skeletal muscle. Effect of 2-hydroxypropyl-beta-cyclodextrin. Biophys. Chem., 2010, v. 148, p.121–130.
3. Maloletkina O.I., Markossian K.A., Asryants R.A., Semenyuk P.I., Makeeva V.F., Kurganov B.I. Effect of 2-hydroxypropyl-beta-cyclodextrin on thermal inactivation, denaturation and aggregation of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from rabbit skeletal muscle. Int. J. Biol. Macromol., 2010, v. 46, p. 487–492.
4. Eronina T., Borzova V., Maloletkina O., Kleymenov S., Asryants R., Markossian K., Kurganov B. A protein aggregation based test for screening of the agents affecting thermostability of proteins. PLoS One, 2011, v. 6, e22154.
Статьи в сборниках:
1. Maloletkina O.I., Muranov K.O., Poliansky N.B., Markossian K.A., Kleymenov S.Yu., Asryants R.A., Ostrovsky M.A., Kurganov B.I. Mechanism of aggregation of UV-irradiated proteins. Сборник статей Международной научной конференции «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем» и IX съезда Белорусского общественного объединения фотобиологов и биофизиков, Минск, 2010, с. 98–100.
Материалы конференций:
1. Малолеткина О.И. Влияние 2-гидроксипропил--циклодекстрина на тепловую денатурацию и агрегацию глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы из скелетных мышц кролика. Тезисы докладов Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2008», 2008, с. 41.
2. Малолеткина О.И. Агенты, подавляющие агрегацию белков, для биотехнологических целей. Материалы конференции молодых ученых в рамках V Международного Симпозиума «Российско-Европейское сотрудничество в области «Биотехнология, сельское хозяйство и пища» в седьмой рамочной программе ЕС», 2008, с. 21–24.
3. Maloletkina O.I., Markossian K.A. and Kurganov B.I. Effect of 2-hydroxypropyl- cyclodextrin on thermostability of proteins. VIII European Symposium of The Protein Society, 2009, Final Program & Book of Abstracts,
Abstract
no. P 469, P. 61–62.
4. Малолеткина О.И. Влияние 2-оксипропил--циклодекстрина на тепловую инактивацию, денатурацию и агрегацию креатинкиназы из скелетных мышц кролика.
Тезисы докладов Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2009», 2009, с. 55–56.
5. Maloletkina O.I., Markossian K.A. and Kurganov B.I. Aggregation of UV-irradiated glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from rabbit skeletal muscles. IX European symposium of The Protein Society, 2011, Abstract no. 1040, P. 29.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ГАФД — глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа ДСК — дифференциальная сканирующая калориметрия КФК — креатинкиназа УФ-ГАФД — УФ-облученная глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа NAD — никотинамидадениндинуклеотид RLCA — reaction limited cluster-cluster aggregation