Сравнительный анализ родительских линий и гибридов подсолнечника на основе двух типов цитоплазматической мужской стерильности – pet1 и rig0
На правах рукописи
ТИХОНОВА
МАРИНА АЛЕКСАНДРОВНА
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ РОДИТЕЛЬСКИХ ЛИНИЙ И
ГИБРИДОВ ПОДСОЛНЕЧНИКА НА ОСНОВЕ ДВУХ ТИПОВ
ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МУЖСКОЙ СТЕРИЛЬНОСТИ –
PET1 И RIG0
03.02.07 – Генетика
06.01.05 – Селекция и семеноводство
сельскохозяйственных растений
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Санкт-Петербург – 2011 2
Работа выполнена на кафедре генетики и в НИИ биологии Южного федерального университета, на Кубанской опытной станции и в отделе генетики Всероссийского научно-исследовательского института растениеводства им. Н.И. Вавилова Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Александр Вячеславович Усатов доктор биологических наук Вера Алексеевна Гаврилова
Официальные оппоненты: доктор биологических наук Юрий Валентинович Чесноков кандидат биологических наук Любовь Петровна Бекиш
Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский институт масличных культур им. Г.В. Пустовойта Россельхозакадемии
Защита состоится «02» февраля 2011 г. в 16 часов на заседании диссертационного совета Д 006.041.01 при Всероссийском научно исследовательском институте растениеводства им. Н.И. Вавилова по адресу:
190000, г. Санкт-Петербург, ул.Б. Морская, д. 44, тел. 314-78-36, факс 571-87-
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИ растениеводства им.
Н.И. Вавилова
Автореферат разослан и размещен на сайте www.vir.nw.ru «24» декабря 2010 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук В.А. Гаврилова ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ Актуальность темы. Подсолнечник - основная масличная культура в Российской Федерации. На его долю приходится около 80 % площади посевов всех масличных культур и до 90 % производимого растительного масла (Келигов, 2009;
Повстяной, 2009). В настоящее время для этой культуры актуальна проблема повышения урожайности, валового сбора семян с высокими технологическими качествами. Одним из путей ее решения является возделывание новых высокопродуктивных гетерозисных гибридов (Плачек, 1936;
Перстенева, 2009;
Fernandez-Martinez et al., 2009). Для их промышленного производства используют материнские линии с цитоплазматической мужской стерильностью (ЦМС) и отцовские формы, несущие гены-восстановители фертильности пыльцы (Rf) (Serieys, 1999;
Гаврилова, Рожкова, 2005).
В настоящее время в коммерческом производстве семян подсолнечника преобладают гетерозисные гибриды, полученные на основе ЦМС типа РЕТ1, открытой у межвидового гибрида Helianthus petiolaris Nutt. H. annuus L.
П. Леклерком еще в 1966 г. (Leclerq, 1969). Унификация типа ЦМС РЕТ1, может привести к негативным явлениям, например, массовым эпифитотиям. Аналогичный случай уже имел место при широкомасштабном поражении гельминтоспориозом гибридов кукурузы с техасским типом ЦМС, тогда как другие типы ЦМС оказались менее восприимчивы к этому заболеванию (Levings, 1990). Следовательно, для создания новых систем ЦМС-Rf с целью увеличения генетического разнообразия и уменьшения опасной унификации семенного материала, актуален поиск и внедрение в гетерозисную селекцию новых источников ЦМС и, соответственно, восстановителей фертильности пыльцы (Чепурная, 2002;
Шерстюк, 2004;
Гаврилова, Рожкова, 2005;
Venkanna et al., 2008). На Кубанской опытной станции ВИР созданы линии на основе нового источника ЦМС RIG0 (на основе цитоплазмы H. rigidus Desf.), комплексное изучение которого ранее не проводилось.
ЦМС растений представляет собой феномен ядерно-цитоплазматического взаимодействия, в котором участвуют как гены органелл (митохондрий), так и ядра.
Линии-аналоги с различными типами ЦМС являются удобной моделью для исследования фундаментальной проблемы механизмов взаимодействия генов ядра и цитоплазмы и вычленения из общей генотипической изменчивости вклада цитоплазмона в формирование количественных морфобиологических признаков.
Цель и задачи исследования. Целью работы является исследование по комплексу морфобиологических и молекулярно-генетических характеристик новых систем ЦМС – Rf, их родительских форм на основе двух типов ЦМС - РЕТ1 и RIG0 и выявление возможности их практического использования.
Исходя из поставленной цели, были сформулированы следующие задачи:
1. Изучить влияние ЦМС типа РЕТ1 и RIG0 на формирование морфобиологических признаков инбредных линий и гибридов F1 подсолнечника.
2. Исследовать методами световой и электронной микроскопии особенности микроспорогенеза у фертильного и стерильных аналогов РЕТ1 и RIG0 линии ВИР 109.
3. Провести сравнительный анализ морфобиологических признаков у линий – восстановителей фертильности пыльцы из коллекции ВИР.
4. Исследовать ДНК ЦМС линий и восстановителей фертильности пыльцы с помощью специфических маркеров, основанных на ПЦР.
5. Провести скрининг дикорастущего подсолнечника из коллекции ВИР по наличию SCAR-маркеров гена Rf1, контролирующего восстановление фертильности пыльцы.
Научная новизна работы. Впервые с помощью полевых, молекулярно генетических и микроскопических методов детально исследованы инбредные линии подсолнечника, представленные тремя аналогами: один – с фертильным цитоплазмоном и два других – со стерильными РЕТ1 и RIG0. Выявлено влияние нового типа ЦМС RIG0 на формирование морфобиологических признаков у материнских линий и гибридов. С помощью световой и электронной микроскопии выявлено сходство процессов дегенерации пыльцы в результате абортивного микроскопрогенеза при ЦМС РЕТ1 и RIG0, и установлены особенности нарушения ультраструктуры огранелл и клеток тканей пыльника, возникающие при ЦМС RIG0.
Показано фенотипическое разнообразие линий восстановителей фертильности пыльцы из коллекции ВИР и определена их селекционная ценность. Выявлены SCAR маркеры гена восстановления фертильности пыльцы (Rf1) в генотипах однолетних и многолетних видов подсолнечника.
Практическая значимость. В результате проведенных исследований показано, что линии и гибриды на основе ЦМС RIG0 по изученным хозяйственно ценным признакам не уступают своим аналогам на основе ЦМС РЕТ1, в связи с чем новый тип ЦМС - RIG0 можно рекомендовать для использования в гетерозисной селекции подсолнечника наряду с традиционным - РЕТ1. Выделены новые перспективные высокоурожайные гетерозисные гибриды на основе ЦМС РЕТ1. Показано, что праймеры, комплементарные сцепленным с геном Rf1 последовательностям ДНК, являются информативными маркерами новых восстановителей фертильности пыльцы к ЦМС РЕТ1 среди культурного и дикорастущего подсолнечника.
Апробация диссертации. Результаты исследования и основные положения диссертации были представлены и обсуждены на VIII съезде Украинского общества генетиков и селекционеров им. Н.И.Вавилова (г. Алушта, Украина, 2007);
VI съезде физиологов растений России (г. Сыктывкар, 2007);
IX съезде Белорусского общества генетиков и селекционеров (г. Гомель, Беларусь, 2007);
II Вавиловской международной конференции «Генетические ресурсы культурных растений в ХХI веке: состояние, проблемы, перспективы» (г. Санкт-Петербург, 2007);
IV съезде общества биохимиков и молекулярных биологов (г. Новосибирск, 2008);
Международной научной конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (г. Ростов-на-Дону, 2008;
2009);
V съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (г. Москва, 2009);
I Молодежной экологической конференции МЭК-2009 (г. Ростов-на-Дону, 2009);
Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия» (г. Пермь, 2009;
Г. Нижний Новгород, 2010);
Международной научной конференции «Роль Вавиловской коллекции генетических ресурсов в меняющемся мире» (г. Санкт Петербург, 2009);
шестой Всероссийской дистанционной научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых учных «Современные проблемы устойчивого развития агропромышленного комплекса России» (пос. Персиановский, 2009);
второй Московской международной конференции «Молекулярная филогенетика» (г. Москва, 2010);
14-ой Пущинской международной школы конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (г. Пущино, 2010);
3-й Международной телеконференции (г. Томск, 2010);
научных конференциях по генетике и селекции Ростовского отделения ВОГиС (2007-2010).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 24 работы, из них 6 – в журналах, рекомендованных ВАК.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, приложения. Работа изложена на 190 страницах, содержит 29 таблиц и 46 рисунков. Список литературы включает 311 источников, из которых 101 на русском языке.
Исследование выполнено при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ (грант «Развитие научного потенциала высшей школы 2009 2019 гг», №2.1.1/4947).
ГЛАВА 1. СОВРЕМЕННЫЕ ДОСТИЖЕНИЯ В ГЕНЕТИКЕ И СЕЛЕКЦИИ ПОДСОЛНЕЧНИКА Основными направлениями современной селекции подсолнечника являются масличное, кондитерское, кормовое и декоративное. Различают также селекцию сортов-популяций и селекцию гетерозисных гибридов (Гаврилова, 2003;
Fernandez Martinez et al., 2009).
В настоящее время в селекции подсолнечника для получения гетерозисных гибридов широко используют только ЦМС РЕТ1. Однако, ведется интенсивный поиск новых источников ЦМС, и на сегодняшний день их идентифицировано около 70 (Serieys, 2002). В природных популяциях растений разных видов рода Helianthus L.
выявляют ядерные гены Rf, контролирующие полное или частичное восстановление фертильности пыльцы, независимо от происхождения ЦМС. В восстановлении фертильности пыльцы ЦМС РЕТ1 участвуют гены Rf1 и Rf2. В коллекции ВИР имеется образец с ЦМС типа RIG0. В его восстановлении принимают участие 3 Rf гена (Гаврилова, Рожкова, 2005).
ДНК-маркирование хозяйственно-ценных признаков позволяет вовлечь их в маркер опосредованную селекцию (MAS - marker assisted selection), призванную обеспечить более высокую эффективность, меньшую стоимость и меньшую продолжительность получения новых сортов и гибридов по сравнению с традиционными методами селекции (Fernandez-Martinez et al., 2009). Маркирование различных типов ЦМС облегчает их идентификацию (Schnabel et al., 2008).
Использование маркеров Rf-генов ускоряет поиск их доноров среди культурного и дикорастущего подсолнечника (Horn et al., 2003;
Feng, Jan, 2008;
Yue et al., 2010).
Маркеры гетерозиса помогают в подборе родительских форм для создания высокопродуктивных гибридных комбинаций (Gvozdenovic et al., 2009).
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Объектом исследования служили 4 линии подсолнечника с ЦМС типа РЕТ1 и RIG0, их фертильные аналоги, 15 линий – возможных восстановителей фертильности пыльцы, 26 многолетних и 5 однолетних видов дикорастущего подсолнечника, а также 21 межлинейный гибрид ЦМС линий с восстановителями фертильности пыльцы и 12 межвидовых гибридов культурных ЦМС РЕТ1 линий с многолетними видами. Все исследованные образцы являются частью коллекции генетических ресурсов ВНИИР им. Н.И. Вавилова и выращиваются на Кубанской опытной станции института. Стандартом служил районированный в Краснодарском крае и выращиваемый на КОС ВИР сорт Мастер (селекции ВНИИМК). Кроме того, урожайность гибридов сравнивали со средними показателями по Северо-Кавказскому региону у гибрида Кубанский 930 (селекции ВНИИМК).
Полевые измерения и гибридизацию растений проводили по стандартной методике (Анащенко, 1976). Морфологические признаки описывали согласно Международному классификатору (Descriptors for cultivated and wild sunflower, 1985).
Общую комбинационную способность (ОКС) родительских форм гетерозисных гибридов по урожайности определяли по методу Д.Б. Гриффинга (Griffing, 1956).
Эффект гетерозиса рассчитывали по общепринятой формуле (Marinkovic et al., 2000).
Лузжистость семян определяли весовым методом (Хантургаев и др., 2006).
Масличность семян измеряли на лабораторном ЯМР-анализаторе АМВ-1006М согласно ГОСТ Р 8.620-2006. Жирнокислотный состав масла из семян линий-аналогов определяли методом газо-жидкостной хроматографии согласно ГОСТ Р 51483-99 на хроматографе «Кристалл» (модель 2000М). Фертильность пыльцы исследовали ацетокарминовым методом (Навашин, 1936).
Пыльники аналогов ЦМС и фертильных линий на разных стадиях развития изучали с помощью световой (микроскоп Carl Zeiss AG, Германия) и электронной (микроскоп Philips, Голландия) микроскопии. Цветки подсолнечника фиксировали по общепринятой методике (Усатов и др., 2009) в 2,5%-ном глютаровом альдегиде, с последующей дофиксацией 2%-ным OsO4, затем обезвоживали, заливали в эпон и получали ультратонкие срезы на ультратоме EM UC26 (Leica, Германия).
Для молекулярно-генетических исследований ДНК из листьев и проростков подсолнечника выделяли по модифицированной методике Шагай-Маруфа (Saghai Maroof et al., 1984;
Анисимова и др., 2010) и сорбентным методом (Boom et al., 1990).
Специфические участки ДНК, связанные с геном Rf1 подсолнечника, амплифицировали, используя SCAR-маркеры – HRG02/OPY10 и HRG01/OPK13, разработанные Р. Хорн с сотр. (Horn et al., 2003). Для проведения SSR-анализа в предварительных экспериментах нами были выбраны восемь наиболее воспроизводимых и информативных праймеров. ЦМС РЕТ1 идентифицировали с помощью маркера митохондриального гена orfH522, разработанного У. Шнабелем с сотр. (Schnabel et al., 2008). Амплификацию проводили в термоциклере Palm Cycler (Corbett Research, Австралия). Термальный режим реакций подбирали для каждой пары праймеров с учетом их нуклеотидного состава. Продукты реакции амплификации разделяли методом электрофореза в агарозном геле и окрашивали бромистым этидием. После окончания электрофореза гели фотодокументировали с помощью видеосистемы GelDoc 2000 (BioRad, США).
Экспериментальные данные статистически обрабатывали с помощью программы Excel пакета Microsoft Office и программного пакета Statistica 9.0 for Windows.
ГЛАВА 3. СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЛИНИЙ С РАЗЛИЧНЫМИ ТИПАМИ ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МУЖСКОЙ СТЕРИЛЬНОСТИ Для изучения влияния разных типов ЦМС на формирование морфобиологических признаков у инбредных линий подсолнечника были отобраны линии (ВИР 109 и ВИР 151), имеющие по 3 аналога – один фертильный и два ЦМС (РЕТ1 и RIG0), и 2 линии (ВИР 116 и ВИР 471) с 2-мя аналогами – фертильным и ЦМС РЕТ1. Анализировали показатели следующих признаков: высота растений, диаметр корзинки, количество и размеры листьев, масса 1000 семянок, продолжительность вегетационного периода, продуктивность растения, лузжистость и масличность семян. Измерения проводили в 2007-2009 гг. Для 3-х аналогов линий ВИР 109 и ВИР 151 определили жирнокислотный состав масла семян.
Все исследованные линии имеют фенотип культурного подсолнечника с крупной центральной корзинкой и широкими сердцевидными листьями. Фертильные и ЦМС аналоги линий по габитусу практически не отличаются друг от друга (за исключением наличия/отсутствия пыльцы), что свидетельствует об успешном применении метода многократного беккроссирования для создания таких аналогов.
При проведении молекулярно-генетического анализа с использованием SSR-маркеров ядерной ДНК различий между линиями-аналогами не обнаружено (рис. 1).
Амплификация с STS-маркером митохондриальной ДНК подтверждает, что исследованные линии-аналоги различаются типами цитоплазмонов (рис. 2).
Рис. 1. Результат амплификации ДНК ЦМС линий ВИР 109 и ВИР 151 и их фертильных аналогов с SSR-праймерами ядерной ДНК: Линии: 1, 7, 13, 19 – ВИР Б;
2, 8, 14, 20 – ВИР 109 А РЕТ1;
3, 9, 15, 21 - ВИР 109 А RIG0;
4, 10, 16, 22 – ВИР Б;
5, 11, 17, 23 – ВИР 151 А РЕТ1;
6, 12, 18, 24 - ВИР 151 RIG0. Праймеры: 1-6 - На 514;
7-12 – На 1442;
13-18 - На 1608;
19-24 – IUB 4.
Для большинства изученных признаков отмечена незначительная или средняя степень изменчивости. По результатам трехлетних наблюдений стерильные митотипы оказала влияние у большинства линий на продолжительность фенофаз и массу семянок, лишь у некоторых – на размеры листьев. У линий ВИР 109, ВИР 151 и ВИР 116 возможное влияние обоих типов ЦМС на показатели морфологических признаков в основном выражается в их уменьшении (диаметр корзинки, количество листьев, размеры листа, вегетационный период). У линии ВИР 471, напротив, влияние цитоплазмона РЕТ1 проявляется как увеличение показателей исследованных признаков (высота растений, диаметр корзинки, количество листьев, размеры листьев, вегетационный период, продуктивность растения). Однако при изолированном цветении и контролируемом опылении в 2007-2008 гг. у ВИР 471 А РЕТ наблюдалось уменьшение массы 1000 семянок относительно фертильного аналога.
Значительным было влияние ЦМС на показатели лузжистости в сторону уменьшения у ВИР 109 А РЕТ1, ВИР 151 А РЕТ1, ВИР 471 А РЕТ1, в сторону увеличения у ВИР A RIG0 151. Масличность у ВИР 116 А РЕТ1 и ВИР 471 А РЕТ1 увеличилась по сравнению с фертильными аналогами.
У стерильных RIG0 линий уменьшаются сроки начала цветения и созревания. У РЕТ1 аналога ВИР 109 продолжительность вегетационного не изменяется, но увеличивается период созревания у ВИР 151 и ВИР 471 c данным типом ЦМС.
Рис. 2. Результат амплификации ДНК ЦМС линий и их фертильных аналогов с маркером гена orfH522: 1-3 – ВИР 109 ферт.;
4-6 – ВИР 109 РЕТ1;
7-9 – ВИР RIG0;
10-12 – ВИР 116 ферт.;
13-15 - ВИР 116 РЕТ1;
16-18 - ВИР 116 RIG0;
19-21 ВИР 151 ферт.;
22-24 - ВИР 151 РЕТ1;
25-27 - ВИР 151 RIG0;
28-30 - ВИР 471 ферт.;
31-33 – ВИР 471 РЕТ1;
34-36 – ВИР 471 RIG0;
М – маркер молекулярной массы.
ЦМС типа РЕТ1 оказывает в большинстве случаев негативное влияние на показатели диаметра корзинки и массы 1000 семянок, за исключением корзинки у линии ВИР 471 в 2009 году и семянок ВИР 151 в 2008. Размер семянок под влиянием ЦМС RIG0, за исключением этого показателя у ВИР 109 в 2008 году, увеличивается.
В среднем ЦМС РЕТ1 аналог линии ВИР 109 и ЦМС RIG0 аналог ВИР 151 по показателям большинства морфобиологических признаков не отличаются от фертильной формы, наибольшее количество отличий было обнаружено между фертильным и ЦМС РЕТ1 аналогами линии ВИР 471.
При сравнении жирнокислотного состава масла семян линий-аналогов наибольшие различия обнаружены у ВИР 109, RIG0 и РЕТ1 аналоги которой превосходили фертильный по содержанию линолевой кислоты и уступали ему по содержанию насыщенных жирных кислот. Семена аналогов линии ВИР 151 по жирнокислотному составу масла были сходны. Часть изменчивости по жирнокислотному составу масла семян обусловлена неконтролируемым опылением при свободном цветении.
Пыльца фертильных аналогов четырех исследованных линий была высоко жизнеспособной, ее фертильность варьировала в пределах от 80,3 до 97,0 %.
Таким образом, влияние стерильных митотипов на количественные признаки инбредных линий подсолнечника оказывается разнонаправленным в зависимости от генотипа ядра, с которым они взаимодействуют, и условий произрастания.
ГЛАВА 4. ИЗУЧЕНИЕ МИКРОСПОРОГЕНЕЗА У ЛИНИЙ С РАЗЛИЧНЫМИ ТИПАМИ ЦМС С ПОМОЩЬЮ СВЕТОВОЙ И ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ Исследование процесса микроспорогенеза с помощью световой и электронной микроскопии проводили у фертильного и стерильных аналогов (на основе РЕТ1 и RIG0) линии ВИР 109. Для сравнения использовали данные литературы, полученные для других инбредных линий, представленных фертильными и ЦМС РЕТ1 аналогами.
На ранней предмейотической стадии развития пыльники ЦМС и фертильных форм линии ВИР 109 не отличаются друг от друга. Они состоят из четырех микроспораниев, стенки которых четырехслойные, представлены эпидермисом, эндотецием, промежуточным слоем и тапетумом. Внутри гнезда пыльника находятся многочисленные спорогенные клетки.
У фертильных растений в процессе формирования микросопор тапетальные клетки увеличиваются в размерах радиально, по направлению к центру гнезда пыльника. Затем клеточные стенки лизируются, и тапетальный плазмодий проникает между клетками спорогенного комплекса. По мере роста микроспор вещество тапетального плазмодия расходуется на питание формирующихся пыльцевых зерен, и к концу развития в гнездах зрелых пыльников находятся лишь трехъядерные пыльцевые зерна с характерными удлиненными спермиями и шипиками на поверхности экзины.
В целом структурные изменения клеток и органелл, выявленные при абортивном микроспорогенезе у растений линии ВИР 109 с ЦМС РЕТ1 и RIG0, сходны с таковыми, описанными в литературе и для других линий с ЦМС РЕТ1. А именно, четко фиксируется спорофитный характер действия факторов ЦМС, выражающийся, прежде всего, в развитии тапетальной ткани, ее гипертрофии уже на стадии спорогенных клеток, что приводит к постепенной дегенерации последних. Кроме того, наблюдаются изменения в строении органелл клеток тапетума и микроспороцитов (нарушение структуры митохондрий и пластид, расширение каналов ЭПР, вакуолизация цитоплазмы, появление амебоидных ядер) стерильных форм по сравнению с фертильной (рис. 3-5).
Рис. 3. Спорогенные клетки фертильной линии ВИР 109: Я – ядра.
Рис. 4. Фрагмент клетки микроспороцита ЦМС РЕТ1 аналога линии ВИР 109:
Я – ядро;
В – вакуоли;
П – пластиды.
КЗ Рис. 5. Фрагмент микроспороцита ЦМС RIG0 аналога линии ВИР109: Я – ядро;
П – пластиды;
В – вакуоли;
Л – липидные капли;
КЗ – крахмальные зерна.
Однако, в микроспорогенезе у ЦМС РЕТ1 формы ВИР 109 нами выявлен и ряд отличий в строении ядер, пластид и митохондрий клеток тапетума и микроспор от стерильных растений других линий с ЦМС РЕТ1, описанных в литературе. Эти особенности могут свидетельствовать о влиянии ядерных генов на протекание абортивного микроспорогенеза у ЦМС-форм подсолнечника.
Отличие ЦМС RIG0 аналога линии ВИР 109 от ЦМС РЕТ1 заключается в более ранней гипертрофии тапетума, а также в ультраструктуре: на стадии диад форма ядер микроспороцитов изменяется, становится неправильной, в их пластидах содержатся крахмальные зерна (рис. 4, 5) и в цитоплазме микроспороцитов и тапетума отсутствуют диктиосомы аппарата Гольджи. Кроме того, в микроспороцитах линии ВИР 109 с ЦМС RIG0 не обнаружено концентрически расположенных каналов ЭПР.
ГЛАВА 5. СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЛИНИЙ – ВОССТАНОВИТЕЛЕЙ ФЕРТИЛЬНОСТИ ПЫЛЬЦЫ Для сравнительного анализа по показателям морфобиологических признаков были отобраны 15 линий – потенциальных восстановителей фертильности пыльцы селекции ВИР и INRA (Франция).
Фенотипический анализ линий свидетельствует, что все они могут быть эффективными восстановителями фертильности пыльцы для различных ЦМС линий.
Изученные восстановители по высоте растений разделены на 4 класса: очень низкие, низкорослые, средне низкие и средние, что дает возможность подобрать оптимальный по высоте восстановитель для различных материнских форм гибридов. По длине вегетационного периода линии отнесены к 4 группам: ультраскороспелые, скороспелые, раннеспелые и среднеспелые. Но т.к. ветвление большинства потенциальных восстановителей обеспечивает увеличение длительности периода цветения – это позволяет использовать их для скрещивания с более позднеспелыми материнскими линиями. Фертильность пыльцы исследованных линий высокая (80,3 – 98,7 %), что является необходимым условием хорошей завязываемости семян при опылении. Наилучший для созревания семян угол наклона корзинки (135°) отмечен у линий ВИР 631, ВИР 755, ВИР 900, ВИР 901, RIL 38, RIL 100, RIL 130, RIL 228.
Лузжистость варьировала от 28,5 ± 0,3 % у RIL 100 до 33,5 ± 0,2 % у ВИР 900, масличность – от 37,4 ± 0,1 % у ВИР 900 до 47,5 ± 0,1 % у RIL 100.
Сравнение 14-ти предполагаемых восстановителей фертильности по наличию у них SCAR-маркера гена Rf1 показало, что маркер HRG02/OPY10 присутствует у линий ВИР 631, ВИР 637, ВИР 755, ВИР 766, ВИР 771, ВИР 792, ВИР 793 и ВИР 900, а также у французских линий RIL 38, RIL 130, RIL 228. Маркер отсутствует у линий ВИР 160 и ВИР 365 (рис. 6).
Рис. 6. Электрофореграмма продуктов амплификации геномной ДНК линий потенциальных восстановителей фертильности пыльцы с праймером HRG02/OPY10:
1 - ВИР 792;
2 - ВИР 793;
3 – RIL 38;
4 – RIL 228;
5 – RIL 130;
6 - ВИР 365;
7 - ВИР 160;
8 - ВИР 637;
9 - ВИР 900;
10 – контроль;
М – маркер молекулярной массы.
Данные по способности изученных линий восстанавливать фертильность пыльцы гибридов на основе ЦМС РЕТ1 представлены в главе 7.
ГЛАВА 6. ИСТОЧНИКИ ГЕНА Rf1 СРЕДИ ОДНОЛЕТНИХ И МНОГОЛЕТНИХ ВИДОВ ПОДСОЛНЕЧНИКА Скрининг образцов дикорастущего подсолнечника по признаку восстановления фертильности пыльцы проводили с помощью сцепленных с геном Rf1 SCAR маркеров - HRG01/ОРК13 и HRG02/OPY10 (Horn et al., 2003). Всего было исследовано 5 однолетних видов, представленных образцами разных лет поступления (до 5-ти у одного вида) и 26 многолетних видов, представленных от 1 до популяциями. Все исследованные виды выращивают в карантинном питомнике на Кубанской опытной станции ВНИИР им. Н.И. Вавилова (табл. 1).
С помощью молекулярно-генетического анализа установлено, что однолетние и многолетние виды подсолнечника являются источниками гена Rf1. Кроме того, показано, что несмотря на преимущественно вегетативное размножение, многолетние виды подсолнечника имеют высоко жизнеспособную пыльцу с фертильностью от 71, до 99,2 %, и 12 из них были использованы для создания новых восстановителей фертильности пыльцы к ЦМС РЕТ1 методом межвидовой гибридизации с культурным подсолнечником. Однако, среди различных популяций однолетних видов оба исследованных маркера гена Rf1, а среди многолетних - один из них (HRG01/OPК13) представлены неоднородно.
Таблица 1. Гетерогенность однолетних и многолетних видов подсолнечника по маркерам гена Rf Наличие Наличие Кол-во Виды маркера маркера популяций HRG01 HRG Однолетние 1 + +/ Helianthus annuus L.
2 +/- +/ H. praecox Englem.& Gray 1 +/- H. debilis Nutt. 3 + 1 + +/ H. petiolaris Nutt.
2 + H. argophyllus T. & G. 2 + Многолетние H. ciliaris DC., H. trachelifolius Mill., H. tиberosus L., H. multiflorus L., H. tomentosus Michx., H. nuttalii T. & G., H. hirsutus Raf., H. laevigatus T. & G., H. microcephalus T. & G., - + H. floridanus A.Gray ex Chapm., H. simulans E.Watson H. salicifolius Dietr., H. giganteus L., H. grosseserratus М.Martens H. decapetalus L., H. laetiflorus Heiser & D.M.Sm., 1 + + H. smithii Heiser, H. eggertii Small H. angustifolius L. 2 +/- + + 1 +/ H. divaricatus L.
+ + 2 + H. mollis Lam. + 1 2 H. occidentalis Riddel subsp. plantagineus (Torr.
+ & A.Gray) Heiser 1 + H. occidentalis Riddel subsp. occidentalis 1 +/- + 1 + H. strumosus L. 1 - + 1 +/ 1 + H. rigidus Desf. + 5 1 H. californicus DC., H. maximiliani Schrad. + 1 +/ Таким образом, на этапе подбора исходных форм для получения новых восстановителей фертильности пыльцы необходима индивидуальная оценка растений дикорастущего подсолнечника на наличие маркеров гена Rf1.
ГЛАВА 7. НОВЫЕ СИСТЕМЫ ЦМС-Rf Гибридологический анализ показал, что линии ВИР 792, ВИР 793, ВИР 900 и ВИР 901, а также RIL 38, RIL 100, RIL 130, RIL 228 восстанавливают фертильность пыльцы ЦМС РЕТ1. Для всех этих восстановителей установлено наличие SCAR маркера HRG02/OPY10 гена Rf1. Линия ВИР 160 закрепляет ЦМС РЕТ1, что согласуется с данными молекулярно-генетического анализа, продемонстрировавшего отсутствие маркера гена Rf1 у данного образца коллекции. Линия ВИР 365, не имеющая маркера гена Rf1, восстанавливает фертильность ЦМС PET1. Возможно, у этой линии восстановление фертильности пыльцы контролируют другие гены. Кроме того, в данном случае нельзя отрицать и возможность изменчивости самой маркерной последовательности. Несмотря на то, что ВИР 637 имеет маркер гена Rf1, она закрепила стерильность в результате скрещивания с ВИР 151 и восстановила фертильность при скрещивании с ВИР 471. Этому факту можно дать несколько объяснений: ВИР 637 может быть полиморфна по содержанию гена Rf1;
ген Rf1 у части растений этой линии может присутствовать в функционально неактивной форме, или его активность может подавляться генами-сайленсерами (Jan, 2003).
Также можно отметить, что маркер HRG02/OPY10 комплементарен не самому гену Rf1, а лишь сцепленной с ним последовательности, и это сцепление не является полным и возможна рекомбинация. Таким образом, молекулярно-генетический анализ удобно использовать для предварительного скрининга отцовских форм гибридов и планирования будущих скрещиваний, однако фенотипическая проверка результатов с помощью гибридологического метода по-прежнему остается необходимой процедурой для поиска новых доноров гена Rf1.
Была проведена морфобиологическая оценка 17-ти новых гибридных комбинаций, полученных в результате скрещивания материнских линий, несущих признак ЦМС РЕТ1, и отцовских, содержащих гены Rf, из коллекции ВИР. Урожай у всех исследованных гибридов и стандарта был получен в результате неконтролируемого опыления при свободном цветении.
Лучшей гибридной комбинацией в 2007 году была ВИР 109 ВИР 365. Этот гибрид продемонстрировал наибольшую урожайность (35,6 ± 1,5 ц/га) и был раннеспелым. Кроме того, отцовская форма гибрида линия ВИР 365 несет гены устойчивости к ЛМР и фомопсису и может передавать эти гены потомству. Лучшим гибридом в 2008 году мы сочли ВИР 116 RIL 100. И хотя по урожайности (36,5 ± 0,7 ц/га) он немного (1,4 ц/га) уступал лидеру ВИР 109 ВИР 365 (37,9 ± 1,3 ц/га), но созревал на 6 дней раньше (среднеспелый) и был ниже на 20 см (средней высоты), что является ценным для гибрида качеством, т.к. меньшая высота растений обеспечивает меньшее потребление питательных веществ из почвы для развития вегетативной массы (Гаврилова, Анисимова, 2003). В 2009 году лучшей по урожайности была комбинация ВИР 151 ВИР 365 (37,5 ± 1,2 ц/га), в тоже время этот гибрид отличался большой высотой растений - около 2 м, что является нежелательной характеристикой.
Но его родительские линии несут гены устойчивости к ЛМР и фомопсису.
Оптимальное соотношение высоты растений и урожайности демонстрировал гибрид ВИР 151 ВИР 900: при меньшей урожайности (35,5 ± 0,8 ц/га) по сравнению с ВИР 151 ВИР 365 (на 2 ц/га) он, в то же время, имеет значительно меньшую высоту растений (на 43,9 см). Хорошую урожайность (35,6 ± 1,0 ц/га) с высокой масличностью (52,7 ± 0,2 %) сочетал гибрид ВИР 471 RIL 130. Средний показатель урожайности стандартов за три года изучения составил 34,8 ц/га у сорта Мастер и 32,3 ц/га у гибрида Кубанский 930.
По показателям высоты растений и диаметра корзинки большинство исследованных гибридов превосходили обоих родителей. Показатели истинного гетерозиса по высоте растений у большинства гибридов были более 20 %. Сроки созревания большинства гибридов были меньше, чем у родительских форм или имели промежуточное значение. Кроме того, в 2009 году промежуточное значение относительно родительских линий принимали показатели лузжистости семян гибридных комбинаций ВИР 151 ВИР 365, ВИР 151 ВИР 900, ВИР 471 ВИР 637, ВИР 471 ВИР 900 и ВИР 471 RIL 130. Значение масличности также было промежуточным, за исключением гибридов ВИР 471 ВИР 637 и ВИР 471 RIL 130, которые по этому показателю превышали как материнскую, так и отцовскую линии.
По массе тысячи семян все исследованные гибриды превосходили родительские формы.
Линии ВИР 109 и ВИР 471 на основе ЦМС типа РЕТ1, а также линии восстановители фертильности пыльцы ВИР 365 и ВИР 900 продемонстрировали хорошую ОКС по урожайности и могут быть рекомендованы для использования в гетерозисной селекции подсолнечника.
В нашей работе были проведены скрещивания линий-аналогов ВИР 109 и ВИР 151 с ЦМС РЕТ1 и RIG0 с 4-мя линиями-восстановителями фертильности пыльцы ЦМС РЕТ1: ВИР 160, ВИР 365, ВИР 637 и RIL 130 с целью изучения влияния различных типов ЦМС на формирование морфобиологических признаков гибридов.
Полученные гибриды-аналоги сравнивали между собой по высоте растений, диаметру корзинки, количеству и размерам листьев, а также анализировали вегетационный период, урожайность, наличие и фертильность пыльцы (табл. 2).
С целью анализа влияния агрометеорологических условий на формирование изучаемых признаков в зависимости от типа цитоплазмона в 2007 - 2008 гг. были высеяны одни и те же гибридные комбинации.
В 2007 году аналогичные гибриды по исследованным признакам достоверно не отличались друг от друга, за исключением наличия пыльцы. Гибридные комбинации ВИР 109 RIL 130 и ВИР 109 ВИР 365 на основе ЦМС типа РЕТ1 были фертильными, а на основе RIG0 – полностью стерильными. Гибриды, полученные в результате скрещивания обоих ЦМС аналогов линии ВИР 151 с ВИР 637 и ВИР 160, пыльцу не продуцировали.
Таблица 2. Хозяйственно ценные признаки гибридов подсолнечника на основе двух типов ЦМС – РЕТ1 и RIG0 (КОС ВИР, 2007-2009) Высота растения, Период всходы Урожайность, корзинки, см Фертильные растения, % созревание, цветение/ Диаметр Гибрид Аналог сутки ц/га см ВИР 109 RIL 130 РЕТ1 181,6±2,3 19,8±0,8 54/95 34,0±0,5 179,1±2,9 17,7±0, RIG0 54/95 33,1±0,3 ВИР 109 ВИР 365 РЕТ1 35,6±1,5 173,0±2,1 18,9±1,1 53/ 35,0±0, RIG0 177,5±1,5 17,8±0,8 53/95 ВИР 151 ВИР 637 РЕТ1 33,2±1, 162,9±2,0 17,4±0,7 50/87 162,9±1,7 18,9±0,7 31,5±1, RIG0 50/87 ВИР 151 ВИР 160 РЕТ1 30,8±0, 146,4±2,6 16,5±0,9 51/88 143,3±2,8 17,9±1,0 32,0±0, RIG0 51/88 ВИР 109 ВИР 365 РЕТ1 186,6±2,8* 17,1±0,6* 60/107 37,9±1,3 RIG0 196,7±2,4 14,6±0,4 39,4±0, 60/106 ВИР 151 ВИР 637 РЕТ1 166,8±2,7 17,4±0,6 59/101 33,2±0,3* 37,8±0, RIG0 167,9±3,6 17,5±0,6 59/100 ВИР 151 ВИР 160 РЕТ1 161,1±2,5 16,3±0,3* 31,2±0,8* 59/99 35,3±0, RIG0 165,7±3,0 13,8±0,5 59/99 ВИР 151 ВИР 365 РЕТ1 199,8±0,9* 18,8±0,4 37,5±0,7 55/ RIG0 189,3±1,4 19,6±0,6 53/102 - * - достоверные отличия при р 0,05 по сравнению с гибридом-аналогом на основе ЦМС RIG В 2008 году между гибридами-аналогами обнаружены различия по большинству исследуемых признаков. У гибридов ВИР 109 ВИР 365 и ВИР 151 ВИР 160 на основе ЦМС RIG0 диаметр корзинки был меньше по сравнению с РЕТ1 аналогами, у RIG0 аналогов гибрида ВИР 109 ВИР 365 высота растений, а у ВИР 151 ВИР и ВИР 151 ВИР 160 урожайность были больше. Признак наличие/отсутствие пыльцы имел одинаковое выражение у исследованных гибридов, как в 2007, так и в 2008 годах. По срокам вегетации гибриды-аналоги в первый и второй год изучения также не различались между собой, хотя 2008 год характеризовался более длительным вегетационным периодом у всех гибридов. Следовательно, влияние цитоплазмона на проявление большинства изученных морфобиологических признаков гибридов зависит от условий внешней среды.
В 2009 году была высеяна новая гибридная комбинация ВИР 151 ВИР 365, и отмечены достоверные отличия между ее аналогами: гибрид на основе ЦМС РЕТ имел большую высоту растений, но меньшие размеры листовой пластинки.
Комбинация ВИР 151 РЕТ1 ВИР 365 была фертильной по пыльце (96,5 ± 1,2 %), а ВИР 151 RIG0 ВИР 365 – стерильной.
Таким образом, несмотря на стерильность, гибриды на основе ЦМС RIG0 по исследованным хозяйственно ценным признакам практически не уступают аналогичным гибридам с митотипом РЕТ1, а по некоторым показателям, в том числе и по урожайности, превосходят их.
ВЫВОДЫ 1. Установлено, что новый тип ЦМС RIG0 на молекулярно-генетическом уровне не идентичен традиционному РЕТ1. Митохондриальная ДНК линий с ЦМС RIG характеризуется отсутствием специфичного для РЕТ1 ПЦР-маркера orfH522.
2. Линии и гибриды F1, полученные на основе нового типа ЦМС RIG0 по комплексу хозяйственно ценных признаков (показателям габитуса и компонентам урожая) не уступают своим аналогам с ЦМС РЕТ1. У большинства исследованных гибридов на основе двух типов ЦМС установлена высокая степень гетерозиса по высоте растений. Урожайность гибридов на основе ЦМС РЕТ1 варьировала от 30, (ВИР 151 ВИР 160) до 37,9 ц/га (ВИР 109 ВИР 365), а их аналогов на основе ЦМС RIG0 – от 31,5 (ВИР 151 ВИР 637) до 39,4 ц/га (ВИР 109 ВИР 365), тогда как средняя урожайность стандартов за три года изучения составила: сорт Мастер - 34, ц/га, гибрид Кубанский 930 – 32,3 ц/га.
3. Дегенерация пыльцы при абортивном микроспорогенезе у аналогов линии ВИР 109 на основе ЦМС РЕТ1 и RIG0 в целом протекает сходно. Однако эти типы ЦМС различаются на уровне электронной микроскопии. Для ЦМС RIG0 по сравнению с РЕТ1 характерна более ранняя гипертрофия тапетальной ткани пыльников, а также на стадии диад изменение формы ядер микроспороцитов, наличие крахмальных зерен в строме их пластид и отсутствие в цитоплазме микроспороцитов и клеток тапетума диктиосом аппарата Гольджи. Выявленные различия не оказывают критического влияния на процесс микроспорогенеза.
4. Среди проанализированных линий-восстановителей фертильности пыльцы к ЦМС РЕТ1 выявлено разнообразие по высоте растений (очень низкие - ВИР 792;
низкорослые - ВИР 793, ВИР 900, ВИР 901, RIL 38, RIL 100, RIL 130;
средне низкие RIL 228;
средние – ВИР 365) и продолжительности вегетационного периода (ультраскороспелые - ВИР 792;
скороспелые - ВИР 793;
раннеспелые - ВИР 900, ВИР 901, RIL 38, RIL 100;
среднеспелые - ВИР 365, RIL 130, RIL 228). Высокие показатели фертильности пыльцы (более 80 %) позволяют использовать их в гибридной селекции в качестве отцовских форм к широкому спектру ЦМС РЕТ1 линий.
5. SCAR-маркер HRG02/OPY10 гена Rf1, контролирующего восстановление фертильности пыльцы ЦМС РЕТ1, обнаружен в геноме 12-ти линий подсолнечника из 14-ти проанализированных. Результаты молекулярно-генетического анализа совпали с данными фенотипического учета восстановления фертильности пыльцы F за исключением двух линий (ВИР 365, ВИР 637).
6. Впервые показано, что SCAR-маркер гена Rf1 HRG02/OPY10 представлен в геномах всех исследованных растений 26-ти многолетних видов подсолнечника и только у ряда растений 2-х однолетних видов из коллекции ВИР. Маркер HRG01/OPK13 присутствует в геноме всех однолетних видов (с наличием внутрипопуляционного полиморфизма у 2-х из них) и только у 12-ти многолетних видов (с внутрипопуляционным полиморфизмом у 6-ти и межпопуляционным у 2-х видов). У 12-ти многолетних видов способность восстанавливать фертильность пыльцы ЦМС РЕТ1 была подтверждена в результате скрещивания с культурным подсолнечником.
РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ СЕЛЕКЦИИ И ПРОИЗВОДСТВА Для промышленного производства семян подсолнечника рекомендуются гибридных комбинаций на основе ЦМС РЕТ1, которые по урожайности превзошли на 0,7 – 9,6 ц/га средний показатель стандартов сорта Мастер (34,8 ц/га) и гибрида Кубанский 930 (32,3 ц/га): ВИР 109 ВИР 365, ВИР 471 ВИР 793, ВИР 471 ВИР 365, ВИР 116 RIL 228, ВИР 116 RIL 100, ВИР 151 ВИР 365, ВИР 151 ВИР 900, ВИР 471 RIL 130. Одна из высокоурожайных комбинаций, ВИР 109 ВИР 365, является раннеспелой.
СПИСОК ОСНОВНЫХ ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ I. В журналах, рекомендованных ВАК РФ 1. Тихонова, М.А. Молекулярные маркеры в идентификации генов восстановления фертильности пыльцы у подсолнечника / И.Н. Анисимова, В.А.
Гаврилова, В.Т. Рожкова, Г.И. Тимофеева, М.А. Тихонова // Доклады РАСХН. – 2009.
- № 6. – С. 6-9.
2. Тихонова, М.А. Scar-маркер гена rf1 подсолнечника у линий восстановителей фертильности пыльцы растений с различными типами ЦМС / Н.В. Маркин, М.А.
Тихонова, И.Н. Анисимова, В.Т. Рожкова, В.А. Гаврилова, А.В. Усатов // Масличные культуры. Научно-технический бюллетень ВНИИМК. – 2009. – Вып. 2 (141). – С. 3-5.
3. Тихонова, М.А. Кодоминантные маркеры гена Rf1 культурного подсолнечника / Н.В. Маркин, О.Ф. Горбаченко, М.А. Тихонова, А.В. Усатов // Масличные культуры. Научно-технический бюллетень ВНИИМК. - 2010. – Вып. (142-143). – С. 3-8.
4. Тихонова, М.А. Получение гетерозисных гибридов на основе новых ЦМС линий подсолнечника / А.В. Усатов, М.А. Тихонова, В.А. Гаврилова, В.Т. Рожкова, Н.В. Маркин // Масличные культуры. Научно-технический бюллетень ВНИИМК. – 2010. – Вып. 1 (142-143). – С. 19-23.
5. Тихонова, М.А. Полиморфизм геномной ДНК однолетних видов подсолнечника / Н.В. Маркин, В.Е. Тихобаева, М.А. Тихонова, В.А. Гаврилова, Т.Т.
Толстая, А.В. Усатов // Масличные культуры. Научно-технический бюллетень ВНИИМК. – 2010. – Вып. 2 (143). – С. 3-7.
6. Тихонова, М.А. Морфологические особенности микроспорогенеза у фертильного и стерильного - ЦМС РЕТ1 аналогов инбредных линий подсолнечника / А.В. Усатов, Г.М. Федоренко, М.А. Тихонова, В.А. Гаврилова, Н.В. Маркин // Масличные культуры. Научно-технический бюллетень ВНИИМК. – 2010. – Вып. (143). – С. 8-12.
II. Другие издания 7. Тихонова, М.А. Межвидовой и внутривидовой полиморфизм многолетнего подсолнечника (род Helianthus L.) по данным RAPD-анализа / Н.В. Маркин, В.А.
Гаврилова, М.А. Тихонова, А.В. Усатов // Достижения и проблемы генетики, селекции и биотехнологии. Материалы VIII съезда Украинского общества генетиков и селекционеров им. Н.И.Вавилова. - Алушта, 2007. - Т. 2. - С. 127-128.
8. Тихонова, М.А. RAPD-анализ геномов и морфофизиологические особенности культурной и дикорастущей форм подсолнечника (Helianthus annuus L.) / Н.В.
Маркин, В.А. Даниленко, М.А. Тихонова, А.В. Усатов // Современная физиология растений: от молекул до экосистем. Материалы VI съезда физиологов растений России. - Сыктывкар, 2007. - Ч. 1. - С. 196-197.
9. Тихонова, М.А. RAPD-анализ ДНК образцов Helianthus rigidus (Cass.) Desf. из коллекции ВИР / Н.В. Маркин, Т.Т. Толстая, М.А. Тихонова // От классических методов генетики и селекции к ДНК-технологиям. Материалы IX съезда Белорусского общества генетиков и селекционеров. - Гомель, 2007. – C. 162.
10. Тихонова, М.А. Маркин Н.В., Тихонова М.А., Толстая Т.Т., Гаврилова В.А., Усатов А.В. Молекулярно-генетический полиморфизм многолетних видов подсолнечника по данным RAPD-анализа / Н.В. Маркин, М.А. Тихонова, Т.Т.
Толстая, В.А. Гаврилова, А.В. Усатов // Генетические ресурсы культурных растений в ХХI веке: состояние, проблемы, перспективы. Материалы II Вавиловской международной конференции. - Санкт-Петербург, 2007. – С. 311-312.
11. Tihonova, M.A. Genotyping of perennial wild sunflower (Helianthus L.) samples from the world collection of N.I. Vavilov All-Russian Scientific Research Institute of Plant Industry / N.V. Markin, M.A. Tihonova, V.A. Gavrilova, A.V. Usatov // Материалы IV съезда общества биохимиков и молекулярных биологов. - Новосибирск, 2008. – С.
268.
12. Тихонова, М.А. Исследование дикорастущих многолетних видов подсолнечника как потенциальных доноров гена-восстановителя (Rf1) к ЦМС (PET1) / М.А. Тихонова, В.Т. Рожкова, Т.Т. Толстая, И.Н. Анисимова, А.В. Усатов // Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины. Материалы II Международной научной конференции. – Ростов-на-Дону, 2008. – С. 82-83.
13. Тихонова, М.А. Новый тип ЦМС — RIG0 как источник изменчивости цитогенов в селекции подсолнечника / М.А. Тихонова, В.Т. Рожкова, А.В. Усатов // Материалы I Молодежной экологической конференции МЭК-2009. - Ростов-на-Дону, 2009. - С. 65-66.
14. Тихонова, М.А. Получение и анализ гибридов подсолнечника на основе нового типа цитоплазматической мужской стерильности - RIG0 / М.А. Тихонова, В.Т.
Рожкова, В.Е. Тихобаева // Симбиоз Россия 2009. Материалы II Всероссийского с междунар. участием конгресса студентов и аспирантов-биологов. – Пермь, 2009. – С.
249-250.
15. Тихонова, М.А. Изучение восстанавливающей способности доноров Rf-генов для нового типа цитоплазматической мужской стерильности подсолнечника - RIG0 / М.А. Тихонова, Т.К. Сумина, В.Т. Рожкова, О.Н. Воронова // Симбиоз Россия 2009.
Материалы II Всероссийского с междунар. участием конгресса студентов и аспирантов-биологов. – Пермь, 2009. – С. 251-252.
16. Тихонова, М.А. Использование SCAR маркера гена Rf1 для выявления доноров восстановителей фертильности пыльцы ЦМС на основе Helianthus rigidus / М.А. Тихонова, Н.В. Маркин, И.Н. Анисимова, В.Т. Рожкова, В.А. Гаврилова // Материалы V съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров, посвященного 200-летию со дня рождения Чарльза Дарвина. – Москва, 2009. – С. 341.
17. Тихонова, М.А. Идентификация генотипов линий – восстановителей фертильности пыльцы разных типов ЦМС подсолнечника / В.А. Гаврилова, И.Н.
Анисимова, М.А. Тихонова // Материалы V съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров, посвященного 200-летию со дня рождения Чарльза Дарвина. – Москва, 2009. – С. 202.
18. Тихонова, М.А. Скрининг многолетних дикорастущих видов подсолнечника с помощью SCAR-маркеров гена Rf1-восстановителя фертильности пыльцы / М.А.
Тихонова, Т.Т. Толстая, Н.В. Маркин, А.В. Усатов // Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины. Материалы III Международной научно-практической конференции. - Ростов-на-Дону, 2009. – С. 56-57.
19. Тихонова, М.А. Влияние ядерно-цитоплазматических комбинаций на формирование фенотипа некоторых линий подсолнечника / М.А. Тихонова, В.Т.
Рожкова // Современные проблемы устойчивого развития агропромышленного комплекса России. Материалы шестой Всероссийской дистанционной научно практической конференции студентов, аспирантов и молодых учных. – Персиановский, 2009. - С. 37-40.
20. Тихонова, М.А. Многолетние виды подсолнечника как потенциальные доноры гена Rf1 / Н.В. Маркин, М.А. Тихонова, В.А. Гаврилова, В.Т. Рожкова, Т.Т.
Толстая, И.Н. Анисимова, А.В. Усатов // Труды по прикладной ботанике, генетике и селекции. Материалы международной научной конференции «Роль Вавиловской коллекции генетических ресурсов в меняющемся мире». - Санкт-Петербург, 2009. - Т.
166. - С. 177-179.
21. Тихонова, М.А. Исследование микроспорогенеза у стерильной формы подсолнечника с новым типом ЦМС – RIG0 / М.А. Тихонова, В.Т. Рожкова А.В.
Усатов // Симбиоз Россия 2010. Материалы III Всероссийского с междунар. участием конгресса студентов и аспирантов-биологов. – Нижний Новгород, 2010. – С. 77-78.
22. Tikhonova, M.A. The RAPD-analysis of perennial sunflower species Helianthus rigidus Desf. / N.V. Markin, M.A. Tikhonova, V.A. Gavrilova, A.V. Usatov // Contributions to the 2nd Moscow International Conference «Molecular Phylogenetics». – Moscow, 2010. – P. 137.
23. Тихонова, М.А. Определение гена Rf1 у однолетних дикорастущих видов подсолнечника / М.А. Тихонова, В.Е. Тихобаева, Т.Т. Толстая // Биология – наука XXI века. Материалы 14-ой Пущинской международной школы-конференции молодых ученых. – Пущино, 2010. – С. 187-188.
24. Тихонова, М.А. Инбредные линии подсолнечника с различными типами цитоплазматической мужской стерильности / М.А. Тихонова, В.Т. Рожкова // Фундаментальные науки и практика. Сборник научных трудов 3-й Международной телеконференции. – Томск, 2010. – С. 157-158.