Дивинилэфирсинтаза cyp74b16 листьев льна: обнаружение, молекулярное клонирование и свойства
На правах рукописи
Горина Светлана Сергеевна
ДИВИНИЛЭФИРСИНТАЗА CYP74B16 ЛИСТЬЕВ ЛЬНА:
ОБНАРУЖЕНИЕ, МОЛЕКУЛЯРНОЕ КЛОНИРОВАНИЕ И СВОЙСТВА
03.01.05 – физиология и биохимия растений
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Казань – 2013
2
Работа выполнена в лаборатории оксилипинов Федерального государственного бюджетно го учреждения науки Казанского института биохимии и биофизики Казанского научного центра Российской академии наук (КИББ КазНЦ РАН)
Научный руководитель: академик РАН, директор института КИББ КазНЦ РАН Александр Николаевич Гречкин
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, доцент руководитель группы ИФР им. К.А. Тимирязева РАН, г. Москва Ирина Васильевна Голденкова-Павлова доктор биологических наук, заведующий лабораторией КИББ КазНЦ РАН, г. Казань Фарида Вилевна Минибаева
Ведущая организация: Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Казанский (Приволжский) Федеральный Университет», г. Казань
Защита состоится 25 апреля 2013 г. в 1100 часов на заседании диссертационного совета Д002.005.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соис кание ученой степени доктора наук при КИББ КазНЦ РАН по адресу: 420111, г. Казань, ул.
Лобачевского, д. 2/31, а/я № 30, тел/факс (843)2927347, [email protected]
С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке Казанского на учного центра РАН.
Автореферат разослан «_» марта 2013 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Анастасия Анатольевна Пономарева
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Постановка проблемы и ее актуальность. Липоксигеназный каскад является одной из важных сигнальных систем растений. В результате функционирования этого каскада происходит образование физиологически активных веществ – оксилипинов [Тарчевский, 2001]. Оксилипины обнаружены у животных, протеобактерий, бурых и красных водорос лей, а также у всех наземных растений [Lee et al., 2008]. У высших растений они участву ют в регуляции роста, дифференцировке клеток, морфогенезе, органогенезе, а также в формировании устойчивости растений к различным биотическим и абиотическим стрессо рам [Itoh et al., 2002;
Stumpe, Feussner, 2006]. Ключевыми ферментами липоксигеназного каскада, обеспечивающими разнообразие оксилипинов, являются липоксигеназы, катали зирующие первую реакцию каскада – образование гидроперекисей жирных кислот, и фер менты уникального семейства CYP74 цитохромов Р450, ответственные за их дальнейшее превращение. Семейство CYP74 включает три типа ферментов: алленоксидсинтазы (АОС) и дивинилэфирсинтазы (ДЭС), которые являются дегидразами, а также гидропероксидлиа зы (ГПЛ), относящиеся к изомеразам. Множество неохарактеризованных генов ферментов CYP74 в геномах различных организмов свидетельствует о вероятности существования в данном семействе ферментов с другими типами катализа.
Ранее было показано, что в листьях льна-долгунца (Linum usitatissimum L.) содержит ся значительное количество дивинилового эфира – (9Z,11E,1Z,3Z)-12-(1,3 гексадиенилокси)-9,11-додекадиеновой ((5Z)-этероленовой) кислоты. Образование (5Z) этероленовой кислоты наблюдалось также in vitro в результате инкубации экзогенной 13 гидроперекиси -линоленовой кислоты – (9Z,11E,13S,15Z)-13-гидроперокси-(9,11,15) октадекатриеновой кислоты (13-ГПОТ) – с экстрактом листьев льна [Chechetkin et al., 2008]. Однако до выполнения настоящей работы у льна был известен единственный пред ставитель семейства CYP74 – алленоксидсинтаза LuAOS (GenBank: AAA03353.1), продук том реакции которого является окись аллена, но не дивиниловый эфир [Song et al., 1993].
К настоящему времени изучено несколько десятков гидропероксидлиаз и алленоксид синтаз. В то же время, клонировано только четыре гена, кодирующих дивинилэфирсинта зы [Itoh, Howe, 2001;
Stumpe et al., 2001;
Fammartino et al., 2007;
Stumpe et al., 2008;
Gullner et al., 2010]. Существует мнение, что ферменты этого класса не имеют широкого распро странения в природе. Исследованные до сих пор рекомбинантные ДЭС синтезируют диви ниловые эфиры, имеющие транс-двойные связи по обе стороны от эфирного мостика. Ни один из ферментов, синтезирующих дивиниловые эфиры с цис-двойной связью по одну сторону от эфирной связи, до сих пор изучен не был.
Цель и задачи исследования. Целью наших исследований явилось выявление и структурно-функциональная характеристика фермента, ответственного за синтез (5Z) этероленовой кислоты в листьях льна-долгунца. Для достижения данной цели были по ставлены следующие задачи:
1. Выявление, характеристика и клонирование открытой рамки считывания гена, ко дирующего фермент, ответственный за биосинтез (5Z)-этероленовой кислоты у льна долгунца.
2. Получение очищенного препарата функционально активного рекомбинантного фермента, ответственного за биосинтез (5Z)-этероленовой кислоты в растениях льна долгунца.
3. Выяснение особенностей каталитического действия исследуемого фермента льна долгунца. Определение субстратной специфичности и кинетических параметров катализа для данного фермента.
4. Характеристика структуры каталитически значимых доменов целевого фермента.
5. Определение вклада отдельных аминокислотных остатков в формирование типа ка тализа целевого фермента методом сайт-направленного мутагенеза: получение мутантных форм фермента и сравнение особенностей каталитического действия фермента дикого типа и его мутантных форм.
Научная новизна работы. Впервые выявлен ген дивинилэфирсинтазы LuDES льна долгунца (Linum usitatissimum L.) и клонирована его открытая рамка считывания. Получен очищенный препарат функционально активного рекомбинантного фермента. Предпочти тельными субстратами фермента являются 13-гидроперекиси жирных кислот, что отличает его от ранее изученных дивинилэфирсинтаз.
LuDES идентифицирована как первый фермент CYP74B, гомологичный 13 гидропероксидлиазам подсемейства CYP74B и, вместе с тем, являющийся дивинилэфир синтазой.
Впервые получена мутантная форма дивинилэфирсинтазы LuDES E292G. В отличие от LuDES дикого типа, мутантная форма E292G проявляла активность алленоксидсинтазы, а не дивинилэфирсинтазы. Тем самым продемонстрировано, что для определения типа ка тализа критически важным является не гомология ферментов CYP74, определяемая по об щему сходству аминокислотных последовательностей, а тонкое строение отдельных кон сервативных доменов.
Научно-практическая значимость работы. Полученные данные расширяют знания о ферментах семейства CYP74 и вносят вклад в понимание функционирования липоксиге назной сигнальной системы растений, способствующей их адаптации к неблагоприятным условиям.
Применение разработанной технологии получения и очистки цитохромов растений, основанной на использовании различных систем экспрессии рекомбинантных генов, дает возможность получения препаративных количеств рекомбинантных белков для после дующего использования в промышленности, часто ограниченного низкой доступностью природных ферментов. Новые рекомбинантные ферменты с измененными каталитически ми свойствами могут быть использованы для создания генетически модифицированных растений, удовлетворяющих требованиям современного сельскохозяйственного производ ства и стать основой инновационных технологий переработки сырья с использованием биокатализаторов, в том числе иммобилизованных ферментов.
Расширение сведений о генах и белках одного семейства облегчает идентификацию и характеристику новых представителей;
кроме того, это позволяет усовершенствовать клас сификацию и проясняет эволюционное происхождение и значение при первоначальном появлении семейств ферментов и структурных белков. Полученные знания приближают нас к ответам на многие фундаментальные вопросы эволюции и экологии.
Экспериментальные данные и методические приемы, изложенные в работе, могут ис пользоваться в учреждениях медицинского, сельскохозяйственного, биологического и био технологического профилей, занимающихся получением рекомбинантных ферментов, ис следованием взаимосвязи структуры и функций белков, а также в учебном процессе при чтении курсов лекций по биохимии, физиологии растений, биотехнологии и молекулярной биологии в ВУЗах.
Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследо вания. Работа проводилась с 2009 по 2013 гг. в соответствии с планом научных исследо ваний КИББ КазНЦ РАН по теме «Липоксигеназы и цитохромы семейства CYP74: струк тура и роль в катализе биосинтеза оксилипинов – эндогенных биорегуляторов растений»
(гос. регистрационный номер: 01200901959). Исследования автора частично поддержаны грантами РФФИ № 09-04-00915-а, № 11-04-01601-а, МК-1439.2011.4, АНТ № 14-33/2011, государственными контрактами № 16.740.11.0197 и № 14.740.11.0797, а также грантом ве дущей научной школы НШ-825.2012.4. Научные положения диссертации и выводы бази руются на результатах собственных исследований автора.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы доложены на 13-ом еже годном симпозиуме студентов-биологов Европы «SymBioSE 2009» (Казань, 2009);
на 13-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2009);
на II Всероссийском с международным участием конгрессе студен тов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2009» (Пермь, 2009);
на Российской школе молодых ученых «Актуальные проблемы современной биохимии и молекулярной биоло гии» (Казань, 2010);
на V Всероссийской конференции молодых ученых «Стратегия взаи модействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2010);
на 36-ом конгрессе FEBS «Biochemistry for Tomorrow’s Medicine» (Италия, Турин, 2011);
на VII Съезде общества физиологов растений России «Физиология растений – фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий» (Нижний Новгород, 2011);
на V Рос сийском симпозиуме «Белки и пептиды» (Петрозаводск, 2011);
на 3-ем Международном симпозиуме «Клеточная сигнализация у растений» (Казань, 2011);
на конгрессе FESPB и EPSO «Plant Biology Congress Freiburg 2012» (Германия, Фрайбург, 2012);
а также на ито говых конференциях Казанского института биохимии и биофизики КазНЦ РАН (2010, 2013).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 16 работ, из них три статьи в отечественных и зарубежных рецензируемых изданиях.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 161 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследова ния, изложения и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы, а также приложения. В работе представлено 10 таблиц, 1 схема и 34 рисунка. Список лите ратуры включает 204 источника;
из них 196 – иностранных.
1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 1.1. Растительный материал. Объектом исследований служили растения льна долгунца (Linum usitatissimum L.) сорта Новоторжский. Растения выращивали в течение дней в открытом грунте при ежедневном поливе и естественном освещении. Для индукции экспрессии генов ферментов CYP74 растения инокулировали клетками штамма Pectobacte rium atrosepticum SCRI1043, полученного из коллекции Белорусского государственного университета (г. Минск).
1.2. Определение последовательности и клонирование целевого гена. Тотальную РНК из листьев льна выделяли с помощью набора RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Герма ния). Полноразмерную двуцепочечную кДНК (дц-кДНК) получали с использованием ком мерческого набора MINT (Евроген, Москва). Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) про водили в амплификаторе DNAEngine (Bio-Rad, США). Все праймеры синтезировали в НПО «Синтол» (Москва). Для клонирования амплифицированной ДНК использовали век тор pGem-T Easy (Promega, США). Нуклеотидные последовательности ДНК определяли с помощью ДНК-анализатора 3130 Genetic Analyser (Applied Biosystems, США).
1.3. Модификация первичной структуры целевого фермента. Плазмидную ДНК выделяли с помощью набора AxyPrep Plasmid Miniprep Kit (Axygen, США) согласно про токолу производителя. Предварительный анализ ДНК проводили после ее электрофорети ческого разделения в агарозных гелях с помощью системы Gel-Doc и пакета программ Quantity One (Bio-Rad, США). Для сайт-направленного мутагенеза целевого гена использо вали ПЦР с модифицированными праймерами.
1.4. Получение рекомбинантных ферментов. Для экспрессии рекомбинантного гена использовали вектор рЕТ-32 Ek/LIC (Novagen, США), реципиентами которого служили клетки штаммов E. coli NovaBlue и Tuner(DE3)pLysS (Novagen, США). Культуры клеток E.
coli выращивали в питательных средах М9 [Маниатис и др., 1984], SOC и Luria-Bertani [Гловер, 1988]. Компетентные клетки E. coli для трансформации плазмидами получали с использованием ДМСО [Inoue et al, 1990]. Наработку целевого белка индуцировали добав лением в среду 0,5 мМ изопропил--тиогалактозида (ИПТГ).
Клеточные лизаты получали с использованием коммерческого стабилизирующего раствора BugBuster (Invitrogene, США). Очистку рекомбинантного белка проводили метал лоаффинной хроматографией на колонках Bio-Scale Mini Profinity IMAC в хроматографи ческой системе BioLogic LP (Bio-Rad, США). Целевой белок элюировали Na-фосфатным буфером (рН 7.5), содержащим 30мМ гистидина и 0.5 % 3-[(3 холамидопропил)диметиламмоний-]-1-пропансульфонат (ХАПС). Электрофорез белков проводили в денатурирующих условиях в полиакриламидном геле (ПААГ) по Лэмли [Ос терман, 1981] в системе PowerPac Universal MiniProtean (Bio-Rad, США). Гели окрашивали Coomassie R250.
Ферментативную активность очищенных препаратов LuDES определяли по сниже нию оптического поглощения субстрата при 234 нм, измеряемого с помощью спектрофо тометра Lambda 25 (Perkin-Elmer, США). Km и kcat рассчитывали с использованием пакета программ SigmaPlot 11 (Systat Software Inc., США).
1.5. Получение субстратов для исследования каталитического действия целевых ферментов. Гидроперекиси жирных кислот получали инкубацией линолевой и линоленовой кислот с соевой и томатной липоксигеназами. Полученные в результате ре акции гидроперекиси очищали высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) на колонках с обращенной фазой Nucleosil 5 ODS (2504.6 мм) (Macherey-Nagel, Герма ния), на колонках с нормальной фазой Separon SIX (1503.2 мм;
5 мкм) (TESSEK Ltd, Че хия), на колонках для хирально-фазовой ВЭЖХ Chiralcel OD-H и Chiralcel OВ-H (Daicel Chemical Industries Ltd., Япония).
1.6. Условия проведения и анализ продуктов реакций, катализируемых целевы ми ферментами. Гидроперекись (3 мкМ) инкубировали с ферментом 15 мин при 20 С в 10 мл 100 мМ Na-фосфатного буфера (рН 7.0). Реакционную смесь экстрагировали смесью гексана с этилацетатом (1:1) при комнатной температуре. Затем растворитель выпаривали, а продукты реакции растворяли в 1,5 мл метанола и восстанавливали, выдерживая в тече ние 30 минут в присутствии NaВН4. Восстановленные продукты метилировали диазомета ном, после чего диазометан выпаривали, продукты растворяли в метаноле и гидрировали водородом над PtO2. После удаления катализатора продукты высушивали и триметилсили лировали. После упаривания силилирующей смеси продукты экстрагировали гексаном.
Очистку продуктов проводили с помощью ВЭЖХ, после чего проводили их анализ мето дом газовой хромато-масс-спектрометрии (ГХ-МС) с помощью масс-спектрометра QP5050A, соединенного с газовым хроматографом GC-17A (Shimadzu, Япония).
1.7. Статистический анализ данных проводили с применением стандартных мате матических методов (расчет среднеквадратического отклонения, сравнение средних по критерию Стьюдента). Данные представлены в виде средних значений из 4 измерений в трех независимых биологических повторностях.
2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 2.1. Выявление и клонирование последовательностей генов ранее не охарактери зованных ферментов CYP74 льна-долгунца Обнаружение в листьях льна-долгунца дивинилового эфира – (5Z)-этероленовой ки слоты [Chechetkin et al., 2008] – позволило предположить, что ранее обнаруженная ал леноксидсинтаза LuAOS [Song et al., 1993] является не единственным представителем CYP74 у данного растения. Недостаточный объем данных о геноме льна ограничивал воз можности выявления гена фермента, отвечающего за синтез дивиниловых эфиров – диви нилэфирсинтазы. В связи с этим, нами была предпринята попытка поиска и идентифика ции гена, кодирующего предполагаемую дивинилэфирсинтазу льна, по гомологичным по следовательностям ДНК других растений.
Ключевым моментом исследования являлся выбор участков кодирующих последова тельностей генов ферментов CYP74, которые отличались бы от последовательностей генов других цитохромов Р450, но, вместе с тем, были достаточно консервативными для генов семейства CYP74. В дальнейшем эти последовательности использовали при конструирова нии вырожденных праймеров для амплификации фрагментов целевых генов в ПЦР.
Для выбора праймируемых участков проводили сравнительный анализ аминокислот ных последовательностей известных ферментов CYP74 разных видов растений. В зависи мости от степени сходства аминокислотных последовательностей все ферменты разделили на три группы. В каждой группе выделяли и сравнивали каталитически важные домены, из которых наиболее консервативными оказались B-спираль и ERR-триада. По их аминокис лотным последовательностям с учетом частоты встречаемости кодонов у высших растений определили наиболее вероятные кодирующие нуклеотидные последовательности, на осно ве которых сконструировали три пары олигонуклеотидных праймеров.
Ферменты разделили на группы следующим образом. В первую группу (ДЭС) вклю чили охарактеризованные к настоящему времени дивинилэфирсинтазы растений семейства пасленовых (Solanaceae). Праймеры LDF (gTCAAAATCAACATggCACC) и LDR (gTTTCCCTTCCATTAgACC) оказались строго комплементарны выбранным участкам ге нов данной группы. Вторую группу (ГПЛ) составили гидропероксидлиазы люцерны (Medi cago truncatula), апельсина (Citrus sinensis), гуавы (Psidium guajava), дыни (Cucumis melo), померанца (Citrus aurantium), поскольку по сравнению с другими гидропероксидлиазами эти ферменты обладают наибольшим сходством первичной структуры и субстратной спе цифичности с известными дивинилэфирсинтазами. На основе последовательностей коди рующих их генов сконструировали вырожденные праймеры LHF (gA(A/g)AAg(C/g)ACAAgAgCAC(g/C)gT(g/T)TTC) и LHR (CA(T/A)Ag(A/C)A(g/A)CTC(C/g/A)CCTTTCTTg). Третья группа (АОС) включала алле ноксидсинтазу льна (Linum usitatissimum, GenBank ID: U00428.1) и гидропероксидлиазу тополя (Populus trichocarpa, GenBank ID: EF145878), который среди растений с расшифро ванным геномом оказался таксономически наиболее близким видом для льна. Считается, что у таксономически близких видов аминокислотные последовательности гомологичных белков обладают высокой степенью сходства даже при функциональной дивергенции (в данном случае проявляющейся в предполагаемом различии типов каталитической актив ности ферментов). На основе нуклеотидных последовательностей генов третьей группы сконструировали праймеры LAF (CCAACATgCC(T/A)CC(T/g/C)ggCCC(C/T/A)TTC) и LAR (gTCTC(A/C)(C/g)gC(T/C)C(A/g)TT(T/C)gACC). Сконструированные праймеры ис пользовали для выявления последовательностей, гомологичных генам семейства CYP74, в библиотеке кДНК.
Тотальную РНК выделяли из листьев льна. За сутки до выделения РНК растения ино кулировали суспензией клеток P. atrosepticum SCRI1043. На основе выделенной РНК по лучали библиотеку двуцепочечной кДНК с помощью реакции обратной транскрипции.
Смесь кДНК использовали в качестве источника матрицы для гнездовой ПЦР с различны ми комбинациями праймеров.
При использовании вырожденных праймеров LAF-LAR (группа АОС) и LHF-LHR (группа ГПЛ) происходило образование продуктов реакции размером около 1000 п.н., что соответствует расчетной протяженности центральных областей генов CYP74 при их ам плификации с используемыми праймерами. Полученные фрагменты клонировали в векто ре pGem-T Easy (Promega, США), после чего определили их нуклеотидную последователь ность. При использовании в ПЦР праймеров LDF-LDR (группа ДЭС) образование продук тов амплификации не происходило.
Последовательности фрагментов LHF-LHR имели высокую степень сходства с генами ферментов подсемейства CYP74B многих видов растений. Это подсемейство включает в себя 13-специфичные гидропероксидлиазы. До настоящего времени для льна не было опи сано ни одного представителя подсемейства CYP74B.
Следующим этапом определения структуры новых генов подсемейства CYP74B льна стала амплификация последовательностей 5- и 3-концевых участков их кДНК методом RACE. Амплифицированные концевые участки клонировали и определяли их последова тельности.
Известно, что цитохромы Р450 растений часто представлены множеством изоформ, кодируемых семействами генов. Поскольку клонированные нами 5- и 3-фрагменты могли соответствовать генам разных изоформ, проводили дополнительный раунд амплификации полноразмерных кДНК, соответствующих транскриптам генов подсемейства CYP74B льна. Для этого использовали праймеры, комплементарные 5- и 3-концевым участкам.
Полученные ампликоны также клонировали с использованием вектора pGem-T Easy;
их последовательности определили. На рис. 1 представлена полная последовательность одно го из клонов гена подсемейства CYP74В льна, предварительно обозначенного нами как ген изоформы 1 фермента CYP74В.
Открытая рамка считывания (ОРС) данного гена размером 1419 п.о. ограничена стар товым и терминирующим кодонами ATG и TGA, соответственно. Полученная кДНК, соот ветствующая полноразмерной мРНК, фланкирована 5- и 3-нетранслируемыми областями и полиадениновой последовательностью, что типично для зрелой мРНК растений. Возле стартового кодона расположена последовательность Козака, распознаваемая рибосомами при инициации трансляции у эукариот [Ltcke et al., 1987]. Представленная последова тельность содержит гуанин в положении +4, что характерно для мРНК высших растений. В положении –3 от предполагаемой ОРС находится консервативный тимин. Совокупность выявленных особенностей анализируемой последовательности позволила заключить, что полученная кДНК соответствует функциональному гену, кодирующему полипептид раз мером 473 аминокислотных остатка (рис. 1). Трансляция полученной нуклеотидной после довательности выявила наличие консервативных доменов, характерных для ферментов се мейства CYP74, а именно – центрального домена I-спирали (I-helix central domain, IHCD), ERR-триады, PPV-домена и консервативного остатка цистеина.
Рис. 1. Нуклеотидная и транслированная аминокислотная последовательности изоформы представителя подсемейства CYP74В льна. Стартовый и терминирующий кодоны отмечены звездочками;
последовательность Козака подчеркнута;
домен IHCD выделен серым фоном;
по ложение ERR-триады обозначено символом ;
PPV-домен обозначен символом ;
символ по казывает положение консервативного остатка цистеина – гемового лиганда.
Анализ последовательностей, полученных от разных клонов итоговой библиотеки кДНК, подтвердил предположение о существовании нескольких вариантов гена, вероятно, кодирующих не сколько изоформ фермента подсе мейства CYP74В льна. На рис. представлены вариабельные области трех изоформ.
Дальнейшая работа была сосре доточена на изучении гена и белка изоформы 1 фермента подсемейства Рис. 2. Аминокислотные последовательности ва CYP74В льна. Последовательность риабельных участков полипептидных цепей изоформ гена зарегистрирована в базе 1, 2 и 3 нового фермента CYP74 льна.
данных GenBank под идентификаци онным номером HQ286277.1 (GI:310687282). Предполагаемому белку было присвоено на звание CYP74B16 [Nelson, личное сообщение]. Проведенное нами сопоставление амино кислотной последовательности изоформы 1 с описанными ферментами CYP74 с помощью программы BLAST также показало, что новый фермент CYP74B16 льна относится к под семейству CYP74B и проявляет высокую степень сходства первичной структуры с 13-ГПЛ.
2.2. Получение рекомбинантного белка CYP74B Для получения рекомбинантного белка CYP74B16 ОРС соответствующего гена по местили в экспрессирующий вектор рЕТ-32 Ek/LIC (Novagen,США) методом безлигазного клонирования. Для наработки и очистки рекомбинантного фермента разработали ориги нальную методику, составленную на основе нескольких протоколов.
Для разрушения ассоциации белка с фрагментами мембран бактерий и предотвраще ния его агрегации в растворах во всех процедурах выделения и очистки фермента CYP74B16 предусматривалось использование различных детергентов. Были испытаны различные концентрации Тритона X-100 (0.3-1%), полиоксиэтилен-10-тридецил-эфира (ПОЭТЭ) (0.3-1%) и ХАПС (0.1-1%). Наилучшие результаты были достигнуты при исполь зовании ХАПС в концентрации 0.5 %.
С использованием вектора рЕТ-32 Ek/LIC получили рекомбинантный белок, содер жащий дополнительную последовательность из шести гистидинов на С-конце, что позво лило провести очистку фермента с помощью металлоаффинной хроматографии. Осветлен ный центрифугированием лизат наносили на колонку Bio-Scale Mini Profinity IMAC (Bio Rad, США), уравновешенную 10 объемами буфера трис-HCl (рН 7.5, 50 мМ), содержащего 300 мМ NaCl и 0.5 % ХАПС. После нанесения лизата колонку промывали тем же буфером до достижения устойчивого минимума оптической плотности раствора при 280 нм. После этого колонку промывали Na-фосфатным буфером (рН 7.5, 50 мМ), содержащим 100 мМ NaCl и 3 мМ гистидина, для освобождения от неспецифически связанных белков. Целевой белок элюировали с колонки Na-фосфатным буфером (рН 7.5, 50 мМ), содержащим мМ NaCl, 30 мМ гистидина и 0.5 % ХАПС, и концентрировали ультрафильтрацией через центрифужный фильтр AmiconUltra 50k (Millipore, США).
2.3. Исследование кинетики реакций, катализируемых рекомбинантным фер ментом CYP74B16, с различными субстратами На первом этапе исследования каталитических свойств рекомбинантного фермента CYP74B16 подбирали оптимальные условия проведения реакции. Для этого испытывали реакционные смеси с различными значениями рН (рис. 3). В результате установили, что рекомбинантный белок CYP74B16 проявляет каталитическую активность в широком диа пазоне рН, с выраженным максимумом активности в слабощелочных условиях, при значе ниях рН от 7.5 до 8.0 (рис. 3). Дальнейшие исследования проводили при рН 7.5.
Каталитическую активность и субстратную специфичность фермента описывают константа каталитическая и константа Михаэлиса. Для построения графиков зависимостей начальных скоростей реакций от концентраций субстратов (9- и 13-гидроперекисей лино левой (ГПОД) и -линоленовой (ГПОТ) кислот) измерения проводили по 6-9 точкам. О превращении субстрата свидетельствовало постепенное снижение в ходе реакции харак терного для гидроперекисей оптического поглощения при 234 нм в ходе реакции.
Рис. 3. Зависимость каталитической активности рекомбинантного фермента CYP74B16 от значения рН реакционной смеси. Белый треугольник – Na-ацетатный буфер (рН 5.0);
черные треугольники – Na фосфатный буфер (рН 6.0-8.0);
черные кружки – буфер трис-HCl (рН 7.5-8.5);
бе лый кружок – буфер глицин-NaOH (рН 9.0).
Из полученных данных сделали вывод, что сродство рекомбинантного фермента CYP74B16 к (13S)-ГПОТ значительно выше, чем к (13S)-ГПОД, (9S)-ГПОД (табл. 1) и (9S) ГПОТ (данные не представлены). В то же время, максимальную каталитическую актив ность рекомбинантный фермент CYP74B16 проявляет по отношению к (13S)-ГПОД. Соот ношение kcat/Km свидетельствует, что 13-гидроперекиси -линоленовой и линолевой кислот являются предпочтительными субстратами (табл. 1). Такие субстратные предпочтения ха рактерны для большинства ГПЛ, относящихся к подсемейству CYP74B.
Таблица 1. Константы каталитические и константы Михаэлиса рекомбинантного фермента, рассчитанные для каждого субстрата с помощью пакета программ SigmaPlot 11 software (Systat Software Inc., USA).
kcat/Km Субстрат Константа ката- Константа Субстратная (сек1мкмоль1) литическая, Михаэлиса, специфич kcat (сек ) Km (мкмоль) ность, % (13S)-ГПОТ 545.8±12.9 28.0±1.9 19.5 (13S)-ГПОД 956.4±31.7 132.5±5.8 7.22 (9S)-ГПОД 33.7±1.1 122.4±8.6 0.28 1. 2.4. Идентификация рекомбинантного фермента CYP74B16 льна как дивинилэ фирсинтазы нового типа Для определения типа каталитической активности проводили характеристику продук тов превращения 13-гидроперекисей жирных кислот при участии рекомбинантного фер мента CYP74B16. Продукты инкубации (13S)-ГПОТ с рекомбинантным ферментом CYP74B16 переводили в триметилсилильные производные метиловых эфиров (Me/ТМС) и подвергали анализу методом ГХ-МС (рис. 4).
Анализ выявил наличие одного преобладающего продукта, в спектре которого имеет ся молекулярный ион [M]+ при m/z 306. Его масс-спектр был идентичен спектру, описан ному ранее для метилового эфира (5Z)-этероленовой кислоты [Hamberg, 1998;
Chechetkin et al., 2008] и этероленовой кислоты [Grechkin et al., 1995]. Время удерживания основного продукта соответствовало таковому для (5Z)-этероленовой кислоты. Анализ продуктов реакции в виде Me/ТМС после восстановления боргидридом натрия и каталитического гидрирования выявил полностью гидрированный дивиниловый эфир – 13 оксанонадекановую кислоту (рис. 4) – и продукт фрагментации цепи – 12-гидрокси додеканоевую кислоту (Me/ТМС).
Соотношение 12-гидрокси-додеканоевой кислоты к гидрированному дивиниловому эфиру, определенное по интегрированию хроматограмм ГХ-МС, составляло 10:90. Диви ниловый эфир являлся преобладающим продуктом. Каких-либо продуктов алленоксидсин тазной реакции в результате проведенных экспериментов обнаружено не было.
Рис. 4. Результат анализа про дуктов инкубации рекомбинантного фермента CYP74B16 с 13 гидроперекисью -линоленовой ки слоты методом ГХ-МС: (А) хромато грамма продуктов инкубации (Me/ТМС) по полному ионному току (TIC), (Б) электронный масс-спектр метилового эфира основного продук та, (В) электронный масс-спектр ме тилового эфира основного продукта после каталитического гидрирования.
Образование С12-фрагмента может происходить двумя различными путями. Во первых, дивиниловые эфиры могут подвергаться частичному кислотному гидролизу. Во вторых, нельзя исключать, что фермент CYP74B16 может проявлять минорную гидропе роксидлиазную активность наряду с дивинилэфирсинтазной. При участии ДЭС чеснока (Allium sativum), алленоксидсинтаз риса (Oryza sativa) и резуховидки Таля (Arabidopsis thaliana) из (13S)-ГПОТ также образуются небольшие количества 13 гидропероксидлиазных продуктов [Сho et al., 2010].
Метиловые эфиры продуктов реакции анализировали также с помощью ВЭЖХ. Ана лиз подтвердил присутствие одного основного продукта с максимумом поглощения в ме таноле при 267 нм (рис. 5). Данное соединение очищали на обратной и нормальной фазах.
Его дальнейшее исследование проводили методом ЯМР-спектрометрии. 1H-ЯМР спектр исследуемого вещества оказался идентичным спектру (5Z)-этероленовой кислоты, полу ченному ранее [Chechetkin et al., 2008]. Таким образом, полученные данные позволили идентифицировать основной продукт преобразования (13S)-ГПОТ как (5Z)-этероленовую кислоту, а фермент CYP74B16 – как дивинилэфирсинтазу.
Рис. 5. Анализ продуктов, обра зующихся в результате инкубации (13S)-ГПОТ с рекомбинантным фер ментом CYP74B16, проведенный мето дом ВЭЖХ на нормальной фазе. УФ спектр выполнен с помощью диодного детектора. Вставка: УФ спектр основ ного продукта.
В соответствии с принятой номенклатурой ферментов CYP74, новому ферменту при своили тривиальное название LuDES (дивинилэфирсинтаза L. Usitatissimum L), также как и соответствующему гену – LuDES.
Известно, что активация биосинтеза (5Z)-этероленовой кислоты в листьях льна про исходит в ответ на инфицирование фитопатогенами [Chechetkin et al., 2009]. С этим согла суются результаты наших экспериментов, указывающие на увеличение уровня экспрессии гена LuDES в 300 раз через 24 часа после инфицирования растений клетками P. atrosepti cum.
Ранее было показано, что колнелевая, колнеленовая и этероленовая кислоты негатив но влияют на скорость роста ряда бактерий, грибов и оомицетов [Prost et al., 2005]. В про веденных нами экспериментах (5Z)-этероленовая кислота также негативно влияла на рост микроорганизмов: в присутствии 34 мкмоль (10 мг/л) (5Z)-этероленовой кислоты плот ность бактериальных культур через сутки после инокуляции составляла 4,4108 КОЕ/мл, в то время как в контроле она составляла 1,6109 КОЕ/мл. При этом -линоленовая кислота в той же концентрации не оказывала влияния на рост бактерий. Эти данные согласуются с представлением об участии ДЭС и дивиниловых эфиров в формировании устойчивости растений к патогенам [Williams et al., 2000;
Gobel et al., 2001;
Graner et al., 2003;
Cowley, Walters, 2005;
Fammartino et al., 2010].
Полученные результаты указывают на то, что LuDES является уникальным фермен том, представляющим особый интерес для изучения механизма катализа и филогении как представителей семейства CYP74, так и цитохромов Р450 в целом. По сходству первичной структуры белок относится к подсемейству CYP74B. Однако, в то время как все известные цитохромы подсемейства CYP74В являются гидропероксидлиазами, LuDES проявляет ди винилэфирсинтазную активность. Обнаружение данного фермента открывает новые воз можности для выявления особенностей структуры активного центра цитохромов CYP74, определяющих тип катализа.
2.5. Особенности первичной структуры и функции рекомбинантной LuDES Как указывалось выше, структура LuDES имеет высокую степень сходства со струк турами других членов подсемейст ва CYP74B (рис. 6). Однако ее по следовательность имеет несколько уникальных аминокислотных за мен, затрагивающих каталитически важные домены и субстрат распознающие сайты [Gotoh, 1992].
Особое внимание было уделено строению домена IHCD, для кото рого ранее было показано перво степенное значение для определе ния типа катализа [Toporkova et al., 2008]. Как у всех ферментов подсе мейства CYP74B, в первом сайте домена IHCD последовательности LuDES находится остаток лейцина (Leu-286) (рис. 6a, домен IHCD, по ложение 1). В следующем сайте на Рис. 6. Множественное выравнивание аминокис ходится остаток аланина, тогда как лотных последовательностей каталитически важных до у всех остальных ферментов менов ферментов CYP74: (А) I-спираль с доменом CYP74B в данном положении нахо IHCD, пронумерованным 1-6, (Б) ERR-триада, обозна дится остаток глицина (рис. 6a, до ченная символом и включающая PPV-домен, обозна мен IHCD, положение 2). Непо ченный символом, (В) гем-связывающий домен, средственно после домена IHCD, в включающий консервативный гем-связывающий лиганд положении 292, в последовательно – цистеин, обозначенный звездочкой.
сти LuDES находится остаток глу таминовой кислоты. У всех алленоксидсинтаз и гидропероксидлиаз (в том числе подсе мейства CYP74B) в этом положении находится консервативный остаток глицина (рис. 6a).
У всех дивинилэфирсинтаз в данном положении остаток глицина замещен остатком другой аминокислоты (рис. 6a).
Еще одной особенностью LuDES является геометрическая специфичность образуемо го дивинилового эфира – (5Z)-этероленовой кислоты. Эта особенность объединяет LuDES с дивинилэфирсинтазами растений рода лютик (Ranunculus), которые также лока лизованы в листьях и предпочтительно утилизируют (13S)-ГПОТ в качестве субстрата [Hamberg, 1998;
2002;
2004;
2005]. Синтез (5Z)-этероленовой кислоты и других подобных дивиниловых эфиров происходит у бурых водорослей рода ламинария (Laminaria) [Proteau, Gerwick, 1993], однако дивинилэфирсинтазы растений родов ламинария и лютик к настоя щему моменту не были выделены, а кодирующие их гены не были клонированы и секве нированы. Нельзя исключать, что данные дивинилэфирсинтазы также принадлежат к под семейству CYP74B.
2.6. Сайт-направленный мутагенез рекомбинантной LuDES и каталитические свойства мутантной формы LuDES E292G Для проверки гипотезы о центральной роли домена IHCD в определении типа катали за CYP74 в клонированном гене LuDES провели замену остатка глутаминовой кислоты в положении 292 на остаток глицина. Мы предположили, что подобная замена может при вести к конверсии дивинилэфирсинтазной активности фермента в гидропероксидлиазную.
Получение препарата мутантной формы белка LuDES E292G и характеристику его катали тических свойств проводили, как описано выше для LuDES дикого типа.
Рис. 7. Хроматограммы продуктов инкубации (13S)-ГПОТ с LuDES дикого типа (A), му тантной формой LuDES E292G (Б) и ZmAOS1 дикого типа (В) в виде Ме/ТМС и электронные масс-спектры производных продуктов, образуемых в результате инкубации фермента дикого типа (Г) и его мутантной формы LuDES E292G (Д,Е) с (13S)-ГПОТ: (Г) (5Z)-этероленовая кислота (Ме);
(Д) 12-ОФДК (Ме);
(Е) -кетол (Me/ТМС).
Селективные ионные токи: m/z 306 – молекулярная масса (5Z)-этероленовой кислоты;
m/z 171 – базовый пик в спектре -кетола (Me/TMС), m/z 311 – характеристический пик (13S) ГОТ (Me/TMС), m/z 238 – характеристический пик 12-ОФДК (Ме/TMС).
Для сравнения каталитического действия LuDES дикого типа и ее мутантную форму LuDES E292G инкубировали со специфичным субстратом – (13S)-ГПОТ. Продукты реак ции анализировали с помощью ГХ-МС в виде Ме/ТМС (рис. 7). Результаты эксперимента указывают на то, что мутант LuDES E292G сохранил способность утилизировать (13S) ГПОТ. Однако анализ продуктов превращения гидроперекиси, катализируемого LuDES E292G, продемонстрировал кардинальные изменения в типе катализа модифицированного фермента. Основной продукт дивинилэфирсинтазной реакции – (5Z)-этероленовая кисло та – не был обнаружен. На рисунке 8Б приведен масс-спектр основного продукта реакции, катализируемой LuDES E292G, идентифицированного как -кетол – (9Z,15Z)-12-оксо-13 гидрокси-(9,15)-октадекадиеновая кислота (Ме/ТМС). Кроме того, в реакции образуются цис- и транс-изомеры 12-оксо-10,15-фитодиеновой кислоты (рис. 8Б). В качестве контроля (13S)-ГПОТ инкубировали с рекомбинантной алленоксидсинтазой ZmAOS1 (CYP74A19) кукурузы (Zea mays) (рис. 7В). Преобладающим продуктом превращения (13S)-ГПОТ при участии ZmAOS1 был тот же самый -кетол, что полностью подтверждает алленоксидсин тазную активность мутантной формы LuDES E292G.
Среди продуктов реакции, катализируемой LuDES E292G, обнаруживался продукт термического распада гидроперекиси – (9Z,12Z,15Z)-13-гидрокси-9,12,15 октадекатриеновая кислота (13-ГОТ) (рис. 7Б), что указывает на более низкую каталитиче скую активность по сравнению с ферментом дикого типа: активность мутантной формы составляла около 10 % от активности LuDES дикого типа.
Схема 1. Предполагаемые механизмы реакций, катализируемых LuDES дикого типа и мутантной формы LuDES E292G.
Алленоксидсинтаза (EC 4.2.1.92) и дивинилэфирсинтаза (EC 4.2.1.121) являются гид ропероксид-дегидратазами. Что отличает механизм действия этих двух ферментов? Первой стадией катализа у всех ферментов CYP74 является гомолиз гидроперокси-группы (Схема 1) с образованием эпоксиаллильного радикала и соединения II (Fe IV–OH, комплекс гидро ксильного радикала с гемовым железом). Второй стадией у АОС является отщепление атома водорода с образованием экзо-двойной связи при оксиране, т.о. синтезируется окись аллена. У ДЭС вторая стадия иная – гомолиз углерод-углеродной связи в оксиране с обра зованием винил-эфирного радикала. Третьим и заключительным этапом катализа является отщепление атома водорода от радикала с образованием второй двойной связи дивинило вого эфира. Переключение между этими механизмами и является последствием мутации E292G (Схема 1).
Полученные результаты позволяют заключить, что сделанное нами предположение о роли домена IHCD в определении типа катализа CYP74 оказалось верным. Кроме того, подтвердились результаты сравнительного анализа первичной структуры цитохромов CYP74, выявившие существенные аминокислотные остатки в определенных позициях.
На основании проведенных расчетов впервые была проведена конверсия дивинилэ фирсинтазы в алленоксидсинтазу в результате единичной замены аминокислотного остат ка. Этот результат вносит существенный вклад в представление об эволюции ферментов CYP74 и цитохромов Р450 в целом.
В то же время, следует признать, что наши знания о механизмах детерминации того или иного типа реакции являются неполными и исследования в этом направлении нужда ются в дальнейшем развитии. С учетом аналогичных данных, полученных ранее [Lee et al., 2008;
Toporkova et al., 2008], существенной корректировке может быть подвергнута также классификация цитохромов Р450.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ Количество исследованных ферментов CYP74 неуклонно возрастает. По мере накоп ления результатов структурно-функциональной характеристики ферментов CYP74 все яв ственнее становятся противоречия в существующей классификации семейства. Первона чально все описанные ферменты CYP74 четко разделяли на четыре подсемейства:
CYP74A, CYP74B, CYP74C и CYP74D [Itoh, Howe, 2001]. В последнее время появляется все большее количество ферментов CYP74, которые, согласно принятому критерию 55 % идентичности, не могут быть отнесены к описанным подсемействам. Примерами таких ферментов являются ДЭС чеснока, 9/13-ГПЛ однодольных, ферменты CYP74 фискомит реллы (Physcomitrella patens) и растений семейства сосновые (Pinaceae). Обнаруженные недавно [Lee et al., 2008] ферменты коралла (Acropora palmate), ланцетника (Branchiostoma floridae) и трихоплакса (Trichoplax adhaerens), а также представителей рода метилобакте рий (Methylobacterium), согласно принятому критерию 40 % идентичности, не являются членами семейства CYP74. В связи с этим Д. Нельсон счел целесообразным ввести поня тие клана CYP74 [Nelson, Werck-Reichhart, 2011]. По данной классификации CYP74 являл ся кланом, состоящим из единственного семейства [Nelson, Werck-Reichhart, 2011]. Однако недавно Д. Нельсон для ферментов протеобактерий и животных создал новые семейства (CYP440 – CYP444) [Nelson, 2013]. Автор отводит клану CYP74 одно из центральных мест в эволюции цитохромов Р450. При этом он полагает, что, возникнув у животных, гены этих ферментов были перенесены в растения посредством метилобактерий. Соответствен но разной эволюционной истории ферменты животных и растений отнесены к разным се мействам. С такой позицией не согласны некоторые исследователи [Lee et al., 2008]. В сво ей работе они идентифицировали рекомбинантные ферменты коралла, ланцетника и пред ставителей рода метилобактерия, как алленоксидсинтазу, эпоксиалкогольсинтазу и гидро пероксидлиазу, соответственно. Ли с сотр. считают, что функциональное сходство не ме нее важно для классификации, чем идентичность последовательности. Эти авторы также ссылаются на прецедент обширного семейства CYP51, члены которого, принадлежащие представителям различных царств, имеют идентичность значительно менее 40 %. Таким образом, в настоящее время нет единства мнений относительно классификации CYP74.
Результаты настоящей работы показывают, что среди хорошо изученных подсемейств CYP74 могут появляться новые члены, гомологичные другим членам подсемейства и при этом радикально отличающиеся от них по типу катализа. Так, LuDES, относящаяся к под семейству СYP74B по сходству первичной структуры, является ДЭС, в отличие от всех ос тальных изученных ферментов CYP74B, обладающих активностью 13-ГПЛ. Также как ге ны других представителей CYP74B, ген LuDES экспрессируется в листьях, и фермент предпочтительно использует 13-ГПОТ в качестве субстрата. Однако в отличие от ГПЛ, LuDES катализирует превращение 13-ГПОТ не в полуацеталь, а в (5Z)-этероленовую ки слоту.
В соответствии с имеющимися в нашем распоряжении данными, нами было предпри нято построение одного из возможных вариантов филогенетического древа клана CYP74.
Первоначальный отбор последовательностей был проведен с помощью программы BLAST.
В качестве референсной (внешней) последовательности использовали первичную структу ру фермента CYP74 (GI:170743950) метилотрофной бактерии (Methylobacterium sp. 4-46).
Этот подход «наиболее удаленного предка» позволил нам построить филогенетическое древо, которое включало не только известные ферменты CYP74 растений, но и последова тельности клана CYP74 протеобактерий и животных (рис. 9). Филогенетический анализ клана CYP74 показал, что члены подсемейства CYP74B наиболее близки к ферментам CYP74 голосеменных и членам клана CYP74 протеобактерий (Рис. 9). Этот результат в не которой степени согласуется с тем фактом, что недавно описанный рекомбинантный фер мент метилотрофной бактерии (Methylobacterium nodulans) – член клана CYP74 – был идентифицирован как 13-ГПЛ [Lee et al., 2008].
Недавние работы по сайт-направленному мутагенезу [Lee et al., 2008;
Toporkova et al., 2008] показали, что единичные аминокислотные замены в некоторых каталитически важ ных сайтах могут привести к превращению АОС в ГПЛ, но не в ДЭС. В то же время, все проведенные замены в последовательности ГПЛ приводили исключительно к нарушению катализа. Исходя из этого, было сделано предположение, что гипотетический предковый фермент CYP74 мог обладать активностью ГПЛ.
Предполагалось, что с точки зрения молекулярной эволюции гидропероксидлиазная реакция для ферментов CYP74 является базовой, а алленоксидсинтазная и дивинилэфир синтазная реакции формировались в процессе видоизменения этой базовой реакции в ре зультате дополнительного влияния боковых групп новых аминокислот, появляющихся в результате мутаций. Исходя из этого, в результате сайт-направленного мутагенеза наибо лее вероятно превращение ДЭС и АОС в ГПЛ, как результат реверсии. Конверсия дивини лэфирсинтазы LuDES в алленоксидсинтазу в результате единичной замены E292G может означать, что эволюция семейства состояла в последовательном превращении ГПЛ АОС ДЭС. В то же время, нельзя исключать, что у разных групп CYP74 был единый предко вый фермент с неизвестной каталитической функцией.
В предыдущих иссле дованиях разными автора ми было охарактеризовано несколько десятков ГПЛ и АОС. В то же время до на стоящей работы было изу чено только четыре ДЭС.
Три из них относятся к растениям семейства пас леновых (томат (Lycopersi cum esculentum) [Itoh, Howe, 2001], картофель tuberosum) (Solanum [Stumpe et al., 2001] табак (Nicotiana tabacum) [Fam martino et al., 2007]) и одна Рис. 9. Филогенетическое древо клана CYP74 цитохромов – к растению семейства P450. Обведены различные таксономические группы, в которых лилейных (Liliaceae) (чес члены клана были обнаружены. Древо было построено с исполь- нок [Stumpe et al., 2008]).
зованием программ ClustalX и TreeView. Предварительный анализ Некоторые исследователи проводили относительно последовательности фермента CYP74 полагают, что дивинилэ (GI:170743950) метилобактерии (Methylobacterium sp. 4-46) с ис- фирсинтазы не получили пользованием программы NCBI BLAST. широкого распростране ния в растениях. В настоящей работе впервые описана рекомбинантная 13-специфичная дивинилэфирсинтаза LuDES (CYP74B16), которая гомологична 13-ГПЛ (CYP74B) и отли чается от всех ранее описанных ДЭС по субстратной специфичности, продуктам реакции и органоспецифичности экспрессии гена.
Несмотря на то, что в систематике ферментов часто тип каталитической реакции при нято ассоциировать с определенным подсемейством, результаты, представленные в данной работе, показывают, что в случае семейства CYP74 это соответствие не соблюдается. Так, подсемейство CYP74C содержит и АОС, и ГПЛ, подсемейство CYP74B включает ГПЛ и ДЭС (Рис. 9). В то же время, члены подсемейства CYP74D имеют более 55 % сходства аминокислотной последовательности с представителями подсемейства CYP74C. Таким об разом, подсемейство CYP74D выделено лишь по функциональному признаку. Формально, CYP74C и CYP74D следовало бы рассматривать как единое подсемейство.
Круг секвенированных геномных последовательностей продолжает стремительно расширяться. При этом темп молекулярного клонирования и функционального изучения рекомбинантных белков все более отстает от темпа геномных исследований. Появляются новые подсемейства и даже семейства. Опыт настоящей работы показывает, что даже сре ди совершенно однородных подсемейств появляются ферменты (такие как LuDES (CYP74B16)) с каталитической функцией, принципиально отличной от той, которая может быть предсказана на основании сходства первичной структуры и другим формальным кри териям классификации.
Можно было бы предположить, что LuDES является природным мутантом 13-ГПЛ.
Хотя 13-ГПЛ льна до сих пор не изучена, проведенный нами анализ геномной базы данных льна выявил частичную последовательность (около 45 % полноразмерного представителя CYP74), которая по всем особенностям первичной структуры, в том числе каталитически важных сайтов, является типичной 13-ГПЛ (CYP74B). Эта последовательность имеет не более 76 % идентичности по отношению к LuDES. Таким образом, очевидно, LuDES явля ется не мутантом, а паралогом до сих пор не изученной и не полностью секвенированной гидропероксидлиазы LuHPL льна. Таким образом, если превращение ГПЛ в ДЭС имело место, начавшись с дупликации гена и единичной мутации, оно продолжилось значитель ной модификацией первичной структуры, приведшей к закреплению приобретенного типа катализа.
LuDES – не единственная ДЭС, катализирующая образование (5Z)-этероленовой ки слоты или родственных (5Z)-дивиниловых эфиров. Такие дивиниловые эфиры выявлены у трех видов бурых водорослей, а также двух видов рода лютик (Ranunculus). Сходный ди виниловый эфир с (Z,Z)-бутадиеновым фрагментом был обнаружен также в красной водо росли полинейра (Polyneura latissima) [Grechkin, 2002]. Соответствующие дивинилэфир синтазы остаются совершенно неизученными. Они могут оказаться либо ортологами LuDES, либо представителями других (возможно, новых) подсемейств CYP74.
ВЫВОДЫ 1. Методами биоинформатики выявлены консервативные последовательности генов семейства CYP74 цитохромов P450 и разработаны универсальные праймеры для амплифи кации кДНК, соответствующих транскриптам данных генов.
2. Клонированы нуклеотидные последовательности, соответствующие трем полнораз мерным мРНК генов подсемейства CYP74B, обнаруженным в транскриптоме растений льна (Linum usitatissimum L.), инокулированных клетками фитопатогенного штамма Pectobacterium atrosepticum SCRI1043. Получен очищенный препарат функционально ак тивного рекомбинантного фермента CYP74B16 (GenBank ID: HQ286277.1).
3. Установлено, что предпочтительными субстратами рекомбинантного фермента CYP74B16 являются 13-гидроперекиси -линоленовой и линолевой кислот, продуктами превращения которых являются дивиниловые эфиры (5Z)-этероленовая и (5Z) этеролевая кислоты, соответственно. Фермент CYP74B16 идентифицирован как 13 специфичная дивинилэфирсинтаза, которой присвоено тривиальное название LuDES.
4. По критериям молекулярной филогении дивинилэфирсинтаза LuDES льна отнесена к подсемейству CYP74B, включавшему до настоящего времени исключительно 13 специфичные гидропероксидлиазы.
5. Впервые осуществлено превращение дивинилэфирсинтазы в алленоксидсинтазу в результате сайт-направленного мутагенеза. Получена мутантная форма LuDES с заменой E292G, у которой необычный для этого сайта остаток глутаминовой кислоты замещен на консервативный для алленоксидсинтаз и гидропероксидлиаз остаток глицина. Мутантная форма E292G, в отличие от дикой формы, превращает 13-гидроперекись -линоленовой кислоты в алленоксидсинтазные продукты (-кетол и 12-оксо-10,15-фитодиеновую кисло ту), но не в дивиниловый эфир.
6. Продемонстрировано участие LuDES в ответных реакциях растений на патогены (Pectobacterium atrosepticum SCRI1043): после инфицирования растений клетками пато генного микроорганизма происходит активация экспрессии гена LuDES в листьях льна;
а продукт реакции, катализируемой LuDES – (5Z)-этероленовая кислота – сдерживает рост клеток бактерий в культурах in vitro.
Список работ, опубликованных по теме диссертации Статьи, опубликованные в журналах, рекомендованных ВАК 1. Выявление и первичная характеристика нового цитохрома CYP74B1 льна (Linum usitatissimum) / Ю. В. Гоголев, С. С. Горина, Н. Е. Гоголева, Я. Ю. Топоркова, Л. Ш.
Мухтарова, И. Р. Чечеткин, А. Н. Гречкин // Доклады Академии Наук. – 2011. – Т.440. – С.540-543.
2. Novel allene oxide synthase product formed via Favorskii rearrangement: mechanistic implica tions for 12-oxo-10,15-phytodienoic acid biosynthesis / A.N. Grechkin, N.V. Lantsova, Y.Y.
Toporkova, S.S. Gorina, F.K. Mukhitova, B.I. Khairutdinov// Chembiochem. – 2011. – V. 12. – P.2511-2517.
3. Green leaf divinyl ether synthase: gene detection, molecular cloning and identification of the unique CYP74B subfamily member / Y.V. Gogolev, S.S. Gorina, N.E. Gogoleva, Y.Y. Topork ova, I.R. Chechetkin, A.N. Grechkin // BBA – Molecular and Cell Biology of Lipids. – 2012. – V. 1821. – P. 287-294.
Работы, опубликованные в материалах научных мероприятий 1. Gorina, S.S. Detection and characterization of a new CYP74 transcript in flax (Linum usita tissimum) leaves / S.S. Gorina, N.E. Mukhametshina, Yu.V. Gogolev // Abstracts / Изд-во КГУ.
– Kazan, 2009. – P. 54.
2. Горина, С.С. Обнаружение и характеристика гена CYP74 льна-долгунца (Linum usita tissimum) / С.С. Горина, Н.Е. Мухаметшина, Ю.В. Гоголев // Сб. тезисов / Изд-во Пущин ского НЦ РАН. – Пущино, 2009. – С. 12-13.
3. Характеристика транскриптома представителей семейства CYP74 льна-долгунца (Linum usitatissimum) / С.С. Горина, Р.Т. Габбасов, Н.Е. Мухаметшина, Ю.В. Гоголев // Материа лы конгресса / РИО ПГУ. – Пермь, 2009. – С.207-208.
4. Молекулярное клонирование гена дивинилэфирсинтазы льна-долгунца (Linum usitatis simum) / С.С. Горина, Н.E. Гоголева, Ю.В. Гоголев, И.Р. Чечеткин, А.Н. Гречкин // Сб. Те зисов / Изд-во: Каз.ун-т. – 2010. – С. 17.
5. Клонирование гена дивинилэфирсинтазы льна-долгунца (Linum usitatissimum) / С.С.
Горина, Н.Е. Гоголева, Ю.В. Гоголев, И.Р. Чечеткин, А.Н. Гречкин // Материалы конфе ренции / Научная книга. – Саратов, 2010. – С. 45.
6. The unique enzyme of the CYP74B subfamily from flax (Linum usitatissimum L.) / S.S.
Gorina, Y.Y. Toporkova, N.E. Gogoleva, L.S. Mukhtarova, I.R. Chechetkin, Y.V. Gogolev and A.N. Grechkin // Abstracts / Wiley Blackwell, FEBS. – Torino, Italy, 2011. – P. 314.
7. Characterization of cytochromes P450 of the CYP74 family by the example of maize / Y.Y.
Toporkova, S.S. Gorina, L.S. Mukhtarova, Y.V. Gogolev and A.N. Grechkin. // Abstracts / Wiley Blackwell, FEBS. – Torino, Italy, 2011. – P.319.
8. Дивинилэфирсинтаза LuDES льна – новый фермент подсемейства CYP74B / С.С. Го рина, Я.Ю.Топоркова, Н.Е. Гоголева, Л.Ш. Мухтарова, И.Р. Чечеткин, Ю.В. Гоголев, А.Н.
Гречкин // Тезисы докладов / Нижегородского государственного университета им.
Н.И.Лобачевского. – Нижний Новгород, 2011. – С. 196.
9. Характеристика семейства CYP74 цитохромов Р450 кукурузы (Zea mays) / Я.Ю. Топор кова, С.С. Горина, Л.Ш. Мухтарова, Ю.В. Гоголев, А.Н. Гречкин // Тезисы докладов / Ни жегородского государственного университета им. Н.И.Лобачевского. – Нижний Новгород, 2011. – С. 702.
10. Характеристика дивинилэфирсинтазы LuDES льна – нового представителя неклассиче ских цитохромов Р450 подсемейства CYP74B / С.С. Горина, Я.Ю. Топоркова, Н.Е. Гого лева, Л.Ш. Мухтарова, И.Р. Чечеткин, Ю.В. Гоголев, А.Н. Гречкин // Тезисы докладов / Карельского НЦ РАН. – Петрозаводск, 2011. – С. 364.
11. Цитохромы Р450 семейства CYP74 кукурузы / Я.Ю. Топоркова, С.С. Горина, Л.Ш.
Мухтарова, Ю.В. Гоголев, А.Н. Гречкин // Тезисы докладов / Карельского НЦ РАН. – Пет розаводск, 2011. – С. 292.
12. Дивинилэфирсинтаза LuDES льна (Linum usitatissimum L.) уникальный фермент подсе мейства CYP74B цитохромов Р450 / С.С. Горина, Топоркова Я.Ю., Гоголева Н.Е., Мухта рова Л.Ш., Чечеткин И.Р., Гоголев Ю.В., Гречкин А.Н. // Тезисы докладов / «Клеточная сигнализация у растений». – Казань, 2011. – С.42.
13. Structural and functional characteristics of new divinyl ether synthase (CYP74B16) from flax (Linum usitatissimum L.) / S.S. Gorina, Y.Y. Toporkova, L.S. Mukhtarova, Y.V. Gogolev, A.N.
Grechkin // Abstracts / Plant Biology Congress. – Freiburg, Germany. – 2012. – P. 14.