Фотохимические свойства фолиевой кислоты и ее коферментных производных
на правах рукописи
ВЕЧТОМОВА ЮЛИЯ ЛЕОНАРДОВНА
ФОТОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА
ФОЛИЕВОЙ КИСЛОТЫ И ЕЕ КОФЕРМЕНТНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ
Специальность 03.00.04 – биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Москва – 2009
Работа выполнена в лаборатории эволюционной биохимии Учреждения
Российской академии наук Института биохимии им. А.Н.Баха Российской академии наук.
Научный руководитель: кандидат биологических наук, Т. А. Телегина
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор А. Я. Потапенко доктор биологических наук Н. А. Чеботарева
Ведущая организация:
Биологический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова
Защита состоится «18» июня 2009 года в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 002.247.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биохимии им. А.Н.Баха РАН по адресу: Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 2.
С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы по адресу: 119071 Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 1.
Автореферат разослан «» 2009 года
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук А.Ф. Орловский
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Фолиевая кислота (ФК, птероил-L-глутаминовая кислота, витамин Bc или B9) составляет структурную основу коферментов, обя зательных участников переноса и трансформации одноуглеродных (метильных и формильных) групп в биосинтезе нуклеотидов и аминокислот. Фолиевая ки слота, а в последнее время также некоторые её коферментные производные, на пример, фолиновая (5-формилтетрагидрофолиевая) кислота, используются в качестве витаминных препаратов. Обладающие цитостатическим действием ан тиметаболиты фолатов (метотрексат и др.) широко применяют в терапии онко заболеваний (Андреева и др., 1982, Calabr and Sternber, 2007).
Характеристика фотохимических свойств фолатов представляет интерес для ряда областей фотобиологии и фотомедицины, например, для формирова ния представлений о молекулярных мишенях воздействия УФ-излучения на ор ганизм. Вместе с тем, информация относительно этих свойств фолатов, как и других биологических птеринов, до последнего времени носила фрагментарный характер. Лишь сравнительно недавно обнаружено, что возбужденные состоя ния окисленных и дигидроформ неконъюгированных птеринов (т.е. птеринов, имеющих короткий заместитель в положении С6) могут окислять молекулы до норов электрона и превращаться в более восстановленные формы (Kritsky et al., 1997). Для фолиевой кислоты и ее производных подобные реакции известны не были, а автоматический перенос на фолаты сведений, накопленных при изуче нии неконъюгированных птеринов, был некорректен, поскольку наличие у фо латов в положении С6 гетероцикла объемного п-аминобензоилглутаминового заместителя существенно модифицирует их свойства по сравнению с неконъю гированными птеринами (Cabrerizo et al., 2005, Thomas et al., 2002).
Таким образом, возникла необходимость исследования фотохимических свойств ФК, в частности, способности ее фотовосстановления. Можно было ожидать, что результаты такого исследования будут полезны для совершенст вования технологий синтеза лекарств на основе фолатов.
Еще одно обстоятельство, определяющее интерес к фолатам как объектам фотобиохимического исследования - это участие одного из коферментов - 5,10 метенилтетрагидрофолиевой кислоты (5,10-метенил-ТГФК) в физиологической ФК, фолиевая кислота;
ТГФК, 5,6,7,8-тетрагидрофолиевая кислота;
ДГФК, дигидрофолиевая ки слота;
ПАБГ, п-аминобензоилглутаминовая кислота;
ЭДТА, Na2-этилендиаминтетрауксусная кислота;
НАД-H, никотинамидадениндинуклеотид, восстановленная форма;
ВЭЖХ, высокоэф фективная жидкостная хроматография;
5,10-метенил-ТГФК, 5,10-метенилтетрагидрофолиевая кислота;
5-формил-ТГФК, 5-формилтетрагидрофолиевая кислота;
Ф, квантовый выход продук тов реакции.
рецепции света. 5,10-Метенил-ТГФК входит в состав ДНК-фотолиаз, фермен тов, катализирующих фоторепарацию поврежденной ультрафиолетом ДНК.
Кроме того, данное соединение обнаружено в качестве хромофора белков одно го из семейств рецепторов синего света – криптохромов. Эти фоторецепторы участвуют в регуляции светозависимых процессов онтогенеза у растений, а также, по-видимому, осуществляют контроль над проявлением циркадных рит мов у высших эукариот. В составе белков - рецепторов света фотовозбужденная 5,10-метенил-ТГФК непосредственно не вступает в химические реакции, а функционирует как светосборщик, энергия возбуждения которого передается на молекулу флавина, выполняющего в активном центре роль редокс агента (Sancar, 2003). Важным условием осуществления такой «антенной» функции является химическая стабильность молекулы при воздействии на нее света. Не смотря на то, что данное свойство молекулы могло иметь серьезное значение для эволюционного отбора, ранее не предпринималось попыток исследовать фотоустойчивость 5,10-метенил-ТГФК и сопоставить ее с фотоустойчивостью других фолатных коферментов.
Таким образом, по своей проблематике диссертационное исследование ориентировано на решение ряда актуальных задач биохимии. Среди этих задач – исследование свойств фотовозбужденных молекул фолатных коферментов, которые могут функционировать как низкомолекулярные биорегуляторы, а также формирование представлений о химических основах биологической ре цепции света и воздействии на организм ультрафиолетового излучения.
Цель и задачи исследования.
Цель диссертационной работы – исследование фотохимических свойств фолиевой кислоты и ее коферментных производных, использование полученных результатов для развития представлений об эволюции фоторецепторов УФА-излучения, а также для совершенствования метода получения лекарственного средства – кальция фолината.
В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:
1. Изучить процессы образования восстановленных форм фолиевой кислоты под действием ультрафиолетового излучения.
2. Исследовать фотоустойчивость восстановленных форм фолатов. Выявить связь фотохимических свойств 5,10-метенилтетрагидрофолиевой кислоты с ее эволюционным отбором на роль антенны УФ-А света в фоторецеп торных белках (в фотолиазах и криптохромах).
3. Изучить влияние УФ-облучения на формилирование тетрагидрофолиевой кислоты и переход 5,10-метенилтетрагидрофолиевой кислоты в 5 формилтетрагидрофолиевую кислоту.
4. Использовать полученные данные при разработке способа получения ле карственного средства – кальция фолината (кальциевой соли 5 формилтетрагидрофолиевой кислоты).
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Возбужденная УФА-излучением фолиевая кислота может взаимодейст вовать с различными донорами электрона с образованием дигидрофолие вой и тетрагидрофолиевой кислот (ДГФК и ТГФК). Фотовосстановление фолиевой кислоты, а также других биологических птеринов, протекает по свободнорадикальному механизму. Фотохимическое восстановление фо лиевой кислоты в присутствии муравьиной кислоты ведет к образованию 5,10-метенил-ТГФК.
2. УФА-излучение в присутствии кислорода воздуха усиливает фотоокис ление тетрагидрофолиевой кислоты и практически не влияет на устойчи вость к окислению 5,10-метенил-ТГФК в условиях близких к природным.
3. Результаты исследования фолиевой кислоты и ее коферментных произ водных позволяют усовершенствовать технологию получения фолината кальция.
Научная новизна. Впервые проведено фотовосстановление фолиевой кислоты с образованием дигидрофолиевой и тетрагидрофолиевой кислот, а в присутст вии муравьиной кислоты - с образованием кофермента 5,10-метенил-ТГФК. На основании изучения свойств свободных радикалов, образующихся в исследуе мых системах, предложен свободнорадикальный механизм фотохимического синтеза ДГФК и ТГФК. Показана высокая устойчивость 5,10-метенил-ТГФК к УФА-облучению в присутствии кислорода, которая могла служить одним из факторов эволюционного отбора этого кофермента на роль фотоантенны в ре цепторах УФА-света.
Научно-практическая ценность. На основании результатов исследования фо тохимических свойств фолиевой кислоты и ее производных разработан новый способ получения лекарственного средства – кальция фолината (кальциевой соли 5-формил-ТГФК).
Апробация работы. Основные результаты работы представлены на 13 научных конференциях в нашей стране и за рубежом. Лично автором диссертации они доложены на: XIV Зимней международной молодежной научной школе “Пер спективные направления физико-химической биологии и биотехнологии” (Мо сква, 2002);
Международной конференции «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования» (Пущино, 2003);
V Съезде Российского фо тобиологического общества (Пущино, 2008);
Международной научной конфе ренции «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем» и VIII съезде Белорусского общества фотобиологов и биофизиков (Минск, Беларусь, 2008);
12th ISSOL Meeting and 15th International Conference on the Origin of Life (Флоренция, Италия, 2008).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи в рецензи руемых журналах, 2 статьи в научных сборниках, 1 патент и 15 тезисов.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литера туры (1 глава), описания материалов и методов исследования (1 глава), изложе ния результатов и их обсуждения (1 глава), выводов, приложения (_ страниц) и списка цитируемой литературы (_ источников). Диссертация изложена на _ страницах, содержит _ рисунков и _ таблиц.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы.
Установки для УФ-облучения образцов Источником излучения служил осветитель ОИ-18 с ртутной лампой среднего давления ДРК-120 или ртутная лампа ДРЛ-400, из спектра которых с помощью светофильтра УФС-6 выделяли область 310 - 390 нм ( 350 ± 40 нм), либо со светофильтром УФС-5 область 280 - 390 нм. Облучение также проводили в установке, состоящей из спектрофотометра СФ 2000 и источника возбуждающего света - ксеноновой лампы ДКсШ-150 с монохроматором. В опытах по фотовосстановлению и фотодеструкции восстановленных фолатов интенсивность облучения, падающего на образец (энергетическая освещенность), была одинаковой и составляла 0,4 ± 0,2 Вт·м-2. В некоторых опытах по фотодеструкции 5,10-метенил-ТГФК интенсивность света составляла 20 Вт·м-2 (ртутная лампа ДРЛ-400).
Анализ продуктов фотохимических реакций Для ВЭЖХ разделения продуктов реакций (хроматограф «Стайер» фир мы “Аквилон”, Россия) нами разработаны следующие методики: (1) Для анали за ТГФК и ДГФК использовали обращенно-фазную колонку Luna C18. Под вижная фаза содержала 2,5х10-2 М КН2РО4, рН 2,5 и 2,0х10-4 М унитиол, с гра диентом ацетонитрила (5 % - 20 %). Детекцию этих соединений осуществляли по поглощению элюатов при 300 нм, а также по их флуоресценции.
(2) Содержание 5,10-метенил-ТГФК определяли на обращенно-фазной колонке Synergi Hydro-RP. Подвижная фаза содержала 5,0х10-2 М КН2РО4, рН 3,0 с 10 % ацетонитрила. Подвижную фазу перед началом и в процессе разделения насы щали аргоном. Соединения детектировали по поглощению элюата при двух длинах волн - 280 нм и 350 нм. (3) 5-формил-ТГФК идентифицировали на об ращенно-фазных колонках Luna C18 и Synergi Hydro-RP в 5,0х10-2 М КН2РО4, рН 4,5 с 6 % ацетонитрила. Детекцию проводили по поглощению при 280 нм.
Количество фолиевой кислоты, разложившейся под действием света на птерин и п-аминобензоил-L-глутаминовую кислоту (ПАБГ), определяли по ре акции азосочетания аминогруппы ПАБГ с N-(1-нафтил) этилендиаминдигидрохлоридом (Коренман, 1975).
Результаты и их обсуждение.
Возможность фотовосстановления фолатов представляет принципиаль ный интерес, в частности, в связи с изучением возможности образования под действием света восстановленных коферментных форм ФК. На рис. 1 представ лены запланированные нами основные этапы работы по фотовосстановлению ФК до ДГФК и ТГФК и образованию восстановленных коферментных произ водных - 5,10-метенил-ТГФК и 5-формил-ТГФК.
Фотовосстановление ФК и влияние доноров электрона.
Фотовосстановление ФК исследовали в 0,1 М калий-фосфатном буфере (рН 7,0), деаэрированном продувкой аргоном или вакуумированием. При облу чении УФ-светом ( 350 ± 40 нм) в течение одного часа раствора ФК (5х10-5 М), содержавшего ЭДТА (5х10-3 М), который широко используется как донор при исследовании фотохимии флавинов и птеринов, происходило выцветание поло сы поглощения ФК с максимумом в области 350 нм и увеличивалось поглоще ние в области 280 320 нм, соответствующее поглощению восстановленных форм ФК (рис. 2). Эти изменения особенно наглядны в разностном спектре «свет минус темнота» (рис. 2, вставка). Такой характер изменения спектра по глощения указывал на образование ДГФК. Положение изобестической точки при 325 нм соответствовало превращению ФК в ДГФК. Константа начальной скорости (k) восстановления ФК в этих условиях составляла 0,010 ± 0,005 мин-1.
Без облучения изменений в спектре не происходило.
На фотовосстановление ФК указывало также появление характерной для ДГФК флуоресценции в области 425 нм (возб = 315 нм). ДГФК была идентифи цирована в продуктах фотохимической реакции с помощью ВЭЖХ (рис. 3). Со гласно результатам этого анализа, после одного часа облучения ее выход (в расчете на моль исходной ФК) составил 5 ± 2%.
O O 3' H 2 10 2' N CN N CHCOOH C 4 3 4а HN H H CH Ф олиевая кислота 6' 5' (Ф К ) H2N N N8 C H 2 COOH h Д онор электрона и водорода O O 2' 3' H 2 H N CN N CHCOOH C HN H H CH Д игидроф олиевая 5 6' 5' кислота (Д Г Ф К ) 8 H2N N1 N C H H COOH h Д онор электрона и водорода O O 2' 3' H 2 H C 5N C9 N N CHCOOH HN H H CH Тетрагидроф олиевая 6' 5' кислота (ТГФ К ) H2N 2 N N C H H COOH муравьиная кислота 2' 3' O H C O O - N N CHCOOH O C H CH 5,10-м етенил-ТГ Ф К 5 N+ CH 3 6' 5' HN CH H2N N COOH N H OH CHO H O O 2' 3' 2 C N C9 N N CHCOOH 3 HN H H CH 5-ф орм ил-ТГФ К 6' 5' H2N N N CH H COOH Рис.1. Предполагаемая последовательность этапов фотовосстановления ФК до ДГФК и ТГФК и образования восстановленных коферментных форм ФК: 5,10 метенил-ТГФК и 5-формил-ТГФК.
При более продолжительном облучении длинноволновая полоса погло щения ФК полностью исчезала (рис. 2). Наряду с этим в течение второго часа облучения снижалась интенсивность коротковолнового максимума поглощения и его сдвиг в сторону 270 нм (270 нм - максимум поглощения ПАБГ). Это ука зывало на то, что параллельно с восстановлением ФК происходило разложение фолатов с образованием неконъюгированных птеринов и ПАБГ. Определение содержания ПАБГ в продуктах реакции подтвердило это предположение: после двух часов облучения 28 ± 2 % молекул исходной ФК разрушалось с образова нием ПАБГ.
А mV без облучения A A ФК 0. 1.5 0. Обл. 1ч.
0. -0. -0. 1.0 Обл. 2ч.
-0.3 0 10 20 30 40 50 время удерживания, мин -0. 250 300 350 400 450 mV Б облучение, нм Исходный 0. ФК Облучение 1ч.
Облучение 2ч.
ДГФК 0. 250 300 350 400 450, нм 0 10 20 30 40 50 время удерживания, мин Рис. 2. Изменение спектра поглощения Рис. 3. ВЭЖХ хроматограммы реакционной смеси 5х10-5 М ФК, 5х10-3 М продуктов фотовосстановления ФК, ЭДТА в 0,1 М калий-фосфатном буфере рН 7 детектирование при 300 нм. А – при облучении УФ-светом ( 350 ± 40 нм) в без облучения, Б - после облучения условиях деаэрации. На вставке: разностный УФ-светом ( 350 ± 40 нм) в спектр "свет минус темнота". течение одного часа.
Облучение растворов ФК в диапазоне 280 - 390 нм, т.е. в области, захва тывающей коротковолновый максимум поглощения ФК ( 280 нм), отличаю щийся высоким значением молярного коэффициента экстинкции (макс = моль-1 ·см-1 вместо 7000 моль-1 ·см-1 при 350 нм) приводило к тому, что уже по сле 40 мин облучения количество молекул ФК, разложившихся с образованием ПАБГ, в полтора раза превышало их количество при облучении светом 310 390 нм. Образование ДГФК при этом не увеличилось. Следовательно, возбуж дение ФК в коротковолновом максимуме ( 280 нм) ускоряет деградацию фо латов.
Помимо ЭДТА (Ео = +0,40 В), в качестве доноров электрона для фото восстановления ФК исследовали соединения с более отрицательными значе ниями электродного потенциала НАД-Н (Ео = -0,32 В) и боргидрид натрия (Ео = -0,48 В или -1,24 В, в зависимости от условий восстановления).
НАД-Н является природным донором электрона и протона в реакциях темнового ферментативного восстановления ФК и ДГФК. В его присутствии возбуждение в области 310 - 390 нм индуцировало в растворах ФК спектраль ные изменения, указывающие на присутствие ДГФК и ТГФК. Образование в фотореакции ТГФК подтвердили спектрофлуориметрические измерения, вы явившие наличие в продуктах реакции характерной для ТГФК флуоресценции с возб = 295 нм и эм = 360 нм. Следует учитывать, что образование восстановлен ных форм ФК могло быть результатом фотохимической активности не только фолатов, но и НАД-Н (Красновский и др., 1980, Никандров и Красновский, 1978). В присутствии НАД-Н, донора с более отрицательным значением Ео по сравнению с ЭДТА возрастала начальная скорость фотовосстановления и по вышался выход продуктов (табл. 1).
В отличие от рассмотренных выше доноров электрона боргидрид (силь ный восстановитель и антиоксидант) способен восстанавливать ФК и в отсутст вие облучения. Поэтому, одной из задач было выяснить, влияет ли ультрафио лет на скорость образования и выход ДГФК и ТГФК. Чтобы минимизировать темновое восстановление ФК, концентрация боргидрида в опытных пробах бы ла в два раза ниже концентрации фолата. При этом количество восстановитель ных эквивалентов и фолата было эквимолярным (по 4 на каждую молекулу ФК). Во время облучения водного раствора ФК, содержавшего незначительное количество (10-5 М) боргидрида, рН не поднимался выше 7,5 - 8,0 и, следова тельно, разложение боргидрида с высвобождением электронов и водорода про ходило по уравнению:
ВН4 + 3Н2О = В(ОН)3 + 7Н+ + 8 Ео = - 0,48 В В этих условиях восстановление ФК при отсутствии облучения не происходи ло. Облучение растворов в течение 10 мин приводило к падению поглощения в длинноволновом максимуме ФК при 350 нм и возрастанию поглощения при 282 нм и 310 нм, характерных для ДГФК и ТГФК. Сохранность очень лабиль ной ТГФК в данных условиях обеспечивал мощнейший антиоксидант NaBH4.
Таким образом, при использовании низкой концентрации боргидрида, удалось показать возможность фотовосстановления ФК до дигидро- и тетрагидроформ.
При восстановлении ФК (10-4 М) избытком боргидрида 7,5х10-2 М (эта концентрация близка к концентрации других доноров электрона – ЭДТА и НАД-Н) имел место другой характер процесса восстановления ФК по сравне нию с восстановлением в нейтральной среде. При таком избытке восстановите ля рН раствора равен 9,5 и наблюдается совсем другой характер разложения боргидрида:
ВН4 + 8ОН = Н2ВО3 + 5Н2О + 8е Ео = - 1,24 В В данных условиях восстановление ФК происходило и в отсутствие облучения с образованием ТГФК. В этом случае ультрафиолет может ускорять протекание реакции восстановления. Как видно из двумерных спектров флуоресценции, количество ТГФК (возб = 300 нм, эм = 360 нм) в облученных образцах (выход 45 ± 5 %) в полтора раза больше, чем без облучения (выход 30 ± 5 %) (рис. 5).
Облучение Без облучения А Б 10 ТГФК Интенсивность ТГФК 5 500 300 ие Флу400 де н ие Флу оре де н уж сце оре озб ж нци с це з бу В я нци Во я Рис. 5 Флуоресценция продуктов восстановления ФК (10-4 М) с боргидридом натрия (7,5х10-2 М) в 0,1 М калий-фосфатном буфере (рН 9,5). А - После облучения ( 350 ± 40 нм) в течение 20 мин, Б – Контроль без облучения.
Исследование процесса фотовосстановления ФК в присутствии разных доноров электрона показало, что его эффективность, т.е. начальная скорость реакции и выход продуктов восстановления, возрастают с понижением значе ния электродного потенциала донора электрона (табл. 1).
Таблица 1. Эффективность доноров электрона при фотовосстановлении ФК k, мин- Донор Ео, В Продукты Выход электрона продуктов*, % ЭДТА +0,40 0,010 ± 0,005 ДГФК 5± НАД-Н -0,32 0,063 ± 0,011 ДГФК и ТГФК 15 ± Боргидрид** -0,48 0,087 ± 0,017 ДГФК и ТГФК 23 ± * - максимальный выход восстановленных форм ФК в данных условиях ** - в случае эквимолярного количества восстановительных эквивалентов и фолата Таким образом, можно заключить, что фотовозбужденная ФК (в разбав ленных нейтральных растворах) способна окислять донор электрона с образо ванием восстановленных форм ДГФК и ТГФК.
Формилирование как методический подход для идентификации ТГФК в продуктах фотовосстановления.
Быстрое окисление ТГФК кислородом воздуха затрудняло ее хромато графическую регистрацию методом ВЭЖХ в продуктах фотовосстановления и количественную оценку ее выхода. Это затруднение можно было обойти, ис пользуя химическую ловушку, т.е. реакцию, трансформирующую ТГФК в бо лее стабильное производное. В качестве такой ловушки мы использовали фор милирование ТГФК муравьиной кислотой, приводящее к образованию 5,10 метенил-ТГФК (рис. 1), отличающейся высокой стабильностью в кислой среде (Rabinowitz, 1963). Формилирование с целью перевода ТГФК в 5,10-метенил ТГФК исследовано нами как отдельная реакция, а также в рамках процесса, со пряженного с фотовосстановлением фолата.
Как отдельная реакция данный методический прием использовался при анализе продуктов восстановления ФК с избытком боргидрида. Формилирова ние продуктов восстановления проводили, добавляя к пробам после инкубации муравьиную кислоту до концентрации 50 % (рН 1,1) и оставляя их в темноте под аргоном на ночь. ВЭЖХ анализ продуктов формилирования показал, что выход 5,10-метенил-ТГФК в расчёте на исходную ФК составил 26 ± 2% для опытов без облучения и 38 ± 2 % для восстановления под воздействием УФ облучения.
Второй вариант использования химической ловушки для ТГФК примени ли в опытах с ЭДТА и НАД-Н. При этом процесс фотовосстановления ФК про водили в среде муравьиной кислоты. В случае с ЭДТА концентрация муравьи ной кислоты была 30 % (рН 1,5) и выход 5,10-метенил-ТГФК был очень незна чительным (3 ± 1 %). Мы полагаем, что такой невысокий процент выхода 5,10 метенил-ТГФК, помимо высокого потенциала донора электрона, объясняется тем, что в присутствии муравьиной кислоты в исходной реакционной смеси происходит конкурентное формилирование исходной ФК. Наличие же фор мильного заместителя может быть причиной затруднений при взаимодействии молекул образующейся при этом 10-формил-ФК и ЭДТА из-за образования во дородных связей между ними. Это было доказано в экспериментах по облуче нию 10-формил-ФК с ЭДТА в качестве донора электрона, в которых фотовос становление 10-формил-ФК не происходило.
В случае фотовосстановления ФК с НАД-Н в присутствии муравьиной кислоты в опыт брали 10 - 15 % муравьиную кислоту (рН 2,0), чтобы обеспе чить достаточное количество формиат-иона, но, учитывая лабильность НАД-Н в кислой среде, перед облучением рН реакционной смеси доводили до трех. Де аэрированные опытные растворы, содержащие ФК и НАД-Н, облучали УФА mV ( ) - облучение 10 мин;
Б А A ( ) - облучение 20 мин;
5,10-метенил-ТГФК ( ) - облучение 30 мин;
0. ( ) - после добавления муравьиной кислоты до 50 %.
0. 0 3 6 9 мин 0. Рис. 6. А - Разностный спектр поглощения "свет минус темнота" реакционной смеси (10-4 М ФК и 10- -0. М НАД-Н в 15 % муравьиной кислоте, доведенной до рН 3,0) при облучении УФ ( 350 ± 40 нм). Б - ВЭЖХ нм 300 350 продуктов реакции фотохимического синтеза.
светом ( 350 ± 40 нм) (рис.6, А). По окончании процесса фотовосстановления, концентрацию муравьиной кислоты доводили до 50 % и выдерживали смесь в темноте для завершения процесса формилирования с образованием 5,10 метенил-ТГФК.
По спектральным данным рассчитали, что выход 5,10-метенил-ТГФК (в расчете на исходную ФК) равен 26 ± 2 %. Эти данные были подтверждены ВЭЖХ анализом (рис. 6, Б). Сравнение этих данных с данными по фотовосста новлению ФК с НАД-Н в нейтральной среде, когда выход достигал только 15 ± 2 %, говорит о том, что повышение выхода восстановленных форм ФК можно достичь переводом образующейся ТГФК в устойчивое соединение, каковым является 5,10-метенил-ТГФК.
Таким образом, фотовосстановление ФК в растворе муравьиной кислоты приводит к образованию тетрагидровосстановленной коферментной формы ФК - 5,10-метенил-ТГФК, и данный методический прием может быть использован для подтверждения образования ТГФК в исследуемых фотопроцессах.
С целью выяснения механизма фотовосстановления ФК до ТГФК, было исследовано фотовосстановление ДГФК. Показано, что в присутствии донора электрона - ЭДТА облучение ультрафиолетом в области 300 - 340 нм раствора дигидоформы ФК (исследовали устойчивую 7,8-ДГФК) образование ТГФК не наблюдали. Это может указывать на то, что при фотовосстановлении ФК до ТГФК интермедиатом может служить более активная и менее стабильная 5,8 дигидроформа (Kwee and Lund, 1979).
Участие свободных радикалов в фотовосстановлении фолиевой кислоты.
Отсутствие сведений о связи свободнорадикальных механизмов с процес сом фотовосстановления фолатов побудило нас исследовать способность воз бужденных птериновых молекул генерировать свободные радикалы. Для реги страции свободных радикалов ФК, а также неконъюгированых птеринов (6 метилптерина и 6,7-диметилптерина) использовали метод электронного пара магнитного резонанса (ЭПР). Фотовозбуждение ( 320 - 390 нм) замороженных водно-спиртовых (v/v 1:2) растворов этих соединений (10-2 М) в присутствии донора электрона (цистеин, аскорбат, ЭДТА в концентрации 10-2 М или в на сыщающей концентрации) приводило к генерации радикалов, которые регист рировали по спектрам ЭПР, имевшим вид синглетной линии полушириной Эрстед со слаборазрешенной сверхтонкой структурой с g = 2,0031 (рис. 7, А).
Образование радикалов проходило более активно при использовании аскорбата либо цистеина в качестве донора электрона по сравнению с ЭДТА.
Анализ кинетики изменения сигнала ЭПР показал, что возбуждение мо лекул ФК и птеринов в присутствии донора при 163 К сопровождалось накоп лением свободных радикалов, сохранявших устойчивость при этой температу ре. При повышении температуры до 183 К происходила деградация радикалов, о чем свидетельствовало снижение интенсивности и, далее, исчезновение сиг I, отн. един.
А Б 163 К Облучение Без облучения 6,7-Диметилптерин Фолиевая кислота 163 К 183 К 10 20 30 40 мин - Рис. 7. А – Спектр ЭПР 10 М 6,7-ДМП и ФК в растворе (вода-этанол 1:1) с цистеином (насыщающая концентрация), облученного в резонаторе радиоспектрометра ксеноновой лампой ДКСШ-200 (облучение в ампуле в диапазоне от 320 до 400 нм) при 163 К;
Б – влияние температуры на изменение во времени интенсивности сигнала ЭПР (I, отн. ед.) при облучении и в его отсутствие.
нала (рис. 7, Б).
Начальная скорость фотовосстановления птеринов коррелировала с ин тенсивностью сигнала ЭПР. Так, более высокой интенсивности сигнала ЭПР для фотовозбужденного 6,7-диметилптерина по сравнению с ФК соответство вала более высокая скорость фотовосстановления этого птерина (k = 0,03 мин-1) по сравнению с ФК (k = 0,01 мин-1).
Таким образом, показана способность возбужденных птеринов, в том числе фолиевой кислоты, генерировать свободные радикалы, а корреляции ме жду активностью радикалов и скоростью восстановления указывают на свобод норадикальный механизм этого фотохимического процесса.
Исследование влияния УФ-облучения на трансформацию одноуглеродных производных фолатов.
Для формирования представлений о фотохимических свойствах фолатов важно было выяснить, влияет ли возбуждение их молекул на ковалентное свя зывание одноуглеродных фрагментов, а также последующую трансформацию этих производных. С этой целью исследовано влияние УФ-облучения на про цесс формилирования ТГФК, а также превращение 5,10-метенил-ТГФК в 5 формил-ТГФК (рис. 1).
Формилирование ТГФК с образованием 5,10-метенил-ТГФК.
Для изучения влияния УФ-облучения ( 300 ± 20 нм) на процесс форми лирования раствор ТГФК (3х10-5 М) в 5 или 50 % муравьиной кислоте, содер жавший антиоксидант дитиотреитол (5х10-3 М), облучали в течение 20 минут.
За это время, как в темноте, так и при облучении образовывалось 1,5 ± 0,5 % и 12,0 ± 1,0 % 5,10-метенил-ТГФК в 5 и 50 % муравьиной кислоте, соответствен но. Из этого можно заключить, что свет не влияет на процесс формилирования ТГФК.
Превращение 5,10-метенил-ТГФК в 5-формил-ТГФК.
В метаболизме фолатов 5,10-метенил-ТГФК может превращаться в тер модинамически устойчивую 5-формил-ТГФК, выполняющую резервные функ ции. Данное соединение используется также в качестве лекарственного средст ва. Вопрос о том, влияет ли свет на процесс превращения 5,10-метенил-ТГФК в 5-формил-ТГФК, представляет интерес не только в плане фундаментального изучения фотохимических свойств фолатов, но и в связи с лекарственным при менением 5-формил-ТГФК.
Изучение влияния ультрафиолета ( 350 ± 40 нм) и температуры на пере ход 5,10-метенил-ТГФК в 5-формил-ТГФК проводили при рН 4,5, чтобы ис ключить превращение 5,10-метенил-ТГФК в 10-формил-ТГФК, происходящее при рН 6,0. В темноте, в условиях аэрации в разбавленном растворе (5х10-5 М, в 0,05 М калий-фосфатном буфере, рН 4,5), около пятнадцати процентов 5,10 метенил-ТГФК превращалось в 5-формил-ТГФК. При этом около 10 ± 2 % ис ходного вещества подвергалось разложению. Методами спектрофотометрии и ВЭЖХ показано, что облучение практически не влияло на скорость перехода и выход 5-формил-ТГФК, как в условиях аэрации, так и в отсутствие кислорода.
Эффективным способом превращения 5,10-метенил-ТГФК в 5-формил-ТГФК оказалось температурное воздействие. Инкубация 5,10-метенил-ТГФК в де аэрированном растворе (рН 4,5) при 50 оС в течение одного часа приводила к превращению 30 ± 4 % 5,10-метенил-ТГФК в 5-формил-ТГФК вместо 15 ± 3 % при комнатной температуре.
Восстановленные фолаты как объекты деградирующего воздействия ультрафиолета. Роль кислорода.
Для характеристики фолатов как участников фотобиологических процес сов, а также в связи с перспективой применения фотохимических стадий в син тезе лекарственных форм фолатов, важно знать, в какой мере свет повреждает структуру молекул этих соединений. В работе исследована устойчивость к УФ облучению ДГФК, ТГФК и некоторых ее одноуглеродных производных.
5,10-Метенил-ТГФК функционирует в качестве фотоантенны в составе фоторецепторов в ДНК-фотолиазах и криптохромах. Для молекулы, выпол няющей антенную функцию, важным свойством является фотоустойчивость, т.е. сохранность молекулы под воздействием облучения. В водных растворах молекула 5,10-метенил-ТГФК стабильна при рН 3,0. В работе исследована фотоустойчивость 5,10-метенил-ТГФК в растворах с рН 3,0. При этих усло виях фотохимические свойства 5,10-метенил-ТГФК (max 360 нм) наиболее близко соответствуют свойствам этой молекулы в составе белков (max 370 - нм). Проведено сравнение фотоустойчивости 5,10-метенил-ТГФК и ТГФК при рН 2,7. Параллельно сравнивали между собой фотоустойчивость восстановлен ных форм фолатов (7,8-ДГФК, ТГФК и 5-формил-ТГФК), не участвующих в физиологической рецепции света. Исследование проводили в растворах при рН 7,0, что соответствует условиям существования вышеперечисленных фолатов в организме.
Фотодеградация дигидрофолиевой, тетрагидрофолиевой и 5-формилтетрагидрофолиевой кислот.
В отсутствие облучения в деаэрированных (вакуумированных) растворах ДГФК, ТГФК и 5-формил-ТГФК (5х10-5 М) в 0,05 М калий-фосфатном буфере (рН 7,0) деградация вещества после 10 мин инкубации не превышала 4 %. Под воздействием ультрафиолета ( 290 ± 20 нм) она дополнительно увеличивалась только на 1-2 %. Квантовый выход продуктов фотодеградации (Ф) не превышал 0,01 (рис. 9). В аэрированных растворах этих соединений УФ-облучение ( мин, 290 ± 20 нм) ускоряло процессы окисления и разложения ТГФК и 5 формил-ТГФК (рис. 9). Квантовый выход продуктов фотодеструкции ТГФК со ставлял 0,075 ± 0,005, а в случае 5-формил-ТГФК - 0,027 ± 0,005. Следователь но, наличие формильного заместителя в положении N5 в молекуле 5-формил ТГФК препятствует темновому окислению и способствует устойчивости моле кулы к воздействию УФ света. Облучение практически не влияло на окисление ДГФК (Ф = 0,008 ± 0,005).
В кислой среде (рН 2,7) в присутствии кислорода квантовый выход про дуктов фотодеструкции ТГФК (Ф = 0,005 ± 0,005) был на порядок ниже, чем при рН 7,0 (Ф = 0,075 ± 0,005) (рис. 10). Повышение в кислой среде устойчиво сти ТГФК к окислению молекулы кислородом воздуха обусловлено протониро ванием по N5 положению птеринового кольца, что препятствует присоедине нию кислорода в С4а положение из-за электроноакцепторных свойств обра зующейся положительно заряженной аминогруппы (Pfleiderer, 1978;
Пюльман и Пюльман, 1965). На примере модельного соединения 6,7- диметилтетрагидроп терина, показано, что при рН 3,0, когда молекула протонируется по пятому положению птеринового кольца, это соединение устойчиво к фотоокислению кислородом воздуха, тогда как при нейтральных рН (pH 4,0) свет ускоряет процесс окисления (Людникова и др., 2009).
Ф = 0,075 облучение темновой Рис. 9. Влияние УФ-излучения Деструкция, % от исходного ( 290 ± 20 нм) на деградацию ДГФК, ТГФК и 5-формил ТГФК в 0,05 М калий фосфатном буфере (рН 7,0) в присутствии и в отсутствие ки слорода воздуха (деструкция в процентах от исходного коли 10 чества по данным спектрофо тометрии и спектрофлуори Ф = 0, 5 Ф = 0,005 Ф = 0,008 Ф = 0, метрии).
Ф = 0, вакуум воздух вакуум воздух вакуум воздух ДГФК ТГФК 5-формил-ТГФК На рис. 10 для сравнения приведены квантовые выходы фотолиза 5,10 метенил-ТГФК (рН 2,7) в присутствии кислорода и в анаэробных условиях. По сравнению с квантовым выходом фотолиза ТГФК в нейтральных условиях (ус ловия работы этого кофермента в клетках) квантовый выход продуктов фотоде градации 5,10-метенил-ТГФК (рН 2,7 - условия, сравнимые с условиями работы этого кофермента в составе белков) очень незначительный, что говорит о ее высокой устойчивости к УФ облучению по сравнению с ТГФК. Далее мы изу чили вопросы, связанные с фотоустойчивостью 5,10-метенил-ТГФК.
Ф 0, 0, Рис. 10. Кажущиеся интеграль рН 2, ные квантовые выходы продук рН 7, тов фотодеградации ТГФК и 0, 5,10-метенил-ТГФК в 0,05 М калий-фосфатном буфере рН 2, и 7,0 (облучение 10 мин в мак 0, симумах поглощения: 300 ± нм, 0,4 Вт·м-2) для ТГФК и ± 40 нм (20 Вт·м-2) для 5,10 0, метенил-ТГФК.
0,007 0, 0, Ф 0,001 Ф 0, 0, вакуум воздух вакуум воздух ТГФК 5,10-метенил-ТГФК Фотоустойчивость 5,10-метенил-ТГФК.
Структура 5,10-метенил-ТГФК в растворах сохраняется только при низ ких значениях pH 3,0. В белках эту структуру стабилизируют карбоксильные группы дикарбоновых аминокислот и –SH группа цистеина в сайте связывания 5,10-метенил-ТГФК (Huang et al., 2006). Повышение рН раствора приводит к разрыву имидазолинового цикла и трансформации 5,10-метенил-ТГФК в 5 формил-ТГФК или 10-формилТГФК. После 30 минут инкубации 5х10-5 М рас твора 5,10-метенил-ТГФК (рН 2,7) без облучения вне зависимости от доступа кислорода, деградация 5,10-метенил-ТГФК практически не проходила. В усло виях УФ-облучения с интенсивностью 0,4 ± 0,2 Вт·м-2 5,10-метенил-ТГФК так же проявляла стопроцентную сохранность вне зависимости от доступа кисло рода. Поскольку в отличие от ТГФК, облучение такой мощности оказалось не достаточно эффективно для фотодеградации 5,10-метенил-ТГФК, исследование её фотодеградации далее проводили, используя в 50 раз более высокую интен сивность света (до 20 Вт·м-2). После УФ облучения ( 350 ± 40 нм) в течение 5,10-метенил-ТГФК, % 100 0. А 0. 1. -0. -0. -0. 300 400 80 нм 0. 0.00 0.05 0.10 0.15 0. - Ионная сила раствора (Iс), моль·л 0. 300 400 500 нм облучениедеаэрированных растворов исходный, без облучения, облучение растворов на воздухе без облучения на воздухе, деаэрированный Рис. 12. Устойчивость 5,10-метенил Рис. 11. Зависимость фотодеградации ТГФК (5х10-5 М) в муравьиной кислоте 5,10-метенил-ТГФК (5х10-5 М) от ионной рН 2,7 (Ic = 0,184 моль·л-1) при облуче силы раствора муравьиной кислоты (рН нии ( 350 ± 40 нм, 20 Вт·м-2) в течение 2,7) при облучении ( 350 ± 40 нм) в тече ние 30 мин, с интенсивностью 20 Вт·м-2. 30 мин. На вставке разностные спектры «свет минус темнота».
мин деаэрированного раствора 5,10-метенил-ТГФК в 0,002 М HCl или в 0,05 М калий-фосфатном буфере (рН 2,7 в обоих случаях) оптическая плотность в мак симуме поглощения при 360 нм снижалась на 5 - 6 % (k = 2,0х10-3 мин-1), тогда как в условиях аэрации на 3 - 4 % (k = 1,3х10-3 мин-1). ВЭЖХ анализ подтвер дил, что фотоповреждение молекул 5,10-метенил-ТГФК проходит более интен сивно в деаэрированных растворах.
Наглядно подавляющее влияние аэрации на фотодеградационный про цесс проявилось при исследовании фотолиза 5,10-метенил-ТГФК в растворах формиата натрия различной ионной силы (Iс) при неизменном значении рН рас творов, равном 2,7. В условиях повышенной ионной силы (0,184 моль·л-1), ско рость фотолиза в деаэрированном растворе была в два раза выше, чем на возду хе (k = 8,7х10-3 мин-1 и 3,5х10-3 мин-1, соответственно) (рис. 11). Возрастание в облученных деаэрированных растворах поглощения при 300 нм (рис. 12, встав ка), а также появление интенсивной флуоресценции с эмиссией при 360 нм по сле возбуждения при 300 нм, указывало на образование в ходе фотолиза ТГФК (рис. 13).
С помощью ВЭЖХ в аэрированных и деаэрированных растворах после облучения (рис. 14) идентифицированы 10-формил-ДГФК, 10-формил-ФК, а также обнаружены продукты расщепления - ПАБГ и неконъюгированные пте рины. При этом в деаэрированных растворах количество ПАБГ и птеринов зна чительно превышало их количество в растворах, облученных на воздухе. Среди продуктов фотолиза в условиях деаэрации дополнительно обнаружена ДГФК, mV А Птерины А 5,10-метенил-ТГФК 5,10-М етенил-ТГФ К ПАБГ исходный ии нц це ДГФК 500 300 уорес 10-формил-ДГФК 400 л 350 ение ф Фл уо 300 10-формил-ФК ре д уж сц ен зб ци во я Б 0 5 10 15 20 на воздухе мин 5 mV Б ии ц 500 300ресцен 400 5,10-метенил-ТГФК 350е ф л уо Фл уо 400 ни ре де сц ен ж ци бу я з во ТГФ К 10-формил-ДГФК В Птерины 10-формил-ФК ПАБГ деаэрация 5 и ци ен 500 300оресц 400 350 ие ф л у 0 5 10 15 20 Фл уо н ре де мин сц уж ен б ци оз я в Рис. 14. Профили элюции продуктов фо Рис. 13. Двумерные спектры флуоресцен толиза 5,10-метенил-ТГФК (5х10-5 М) в ции 5х10-5 М раствора 5,10-метенил-ТГФК растворе 5 % муравьиной кислоты рН 2,7, в муравьиной кислоте, рН 2,7. А - до об ионная сила раствора 0,184 моль·л-1. Рас лучения, Б и В - после облучения ( 350 ± 40 нм, интенсивность 20 Вт·м-2) в течение твор облучали ( 350 ± 40 нм) в течение 30 мин, интенсивность 20 Вт·м-2. А - для 30 мин в аэрированном и деаэрированном деаэрированного образца, Б - для образца растворах.
на воздухе.
присутствие которой мы интерпретируем как результат окисления в ходе под готовки проб к анализу молекул ТГФК, образовавшихся при фотолизе. Разли чие продуктов фотолиза и скорости фотодеградции 5,10-метенил-ТГФК в аэри рованных и деаэрированных растворах отражает различие химических меха низмов её фотодеструкции.
Аппроксимируя данные по фотоустойчивости 5,10-метенил-ТГФК к ус ловиям близким к природным по ионной силе и интенсивности УФА-излучения (1 Вт·м-2), можно заключить, что 5,10-метенил-ТГФК обладает достаточно вы сокой фотоустойчивостью, особенно в присутствии кислорода, и это представ ляет интерес в плане анализа фотобиологических функций этого кофермента в организмах.
Суммируя полученные данные по фотохимии коферментных производ ных фолиевой кислоты (рис. 15), можно заключить, что УФ облучение оказы вает влияние на ряд процессов их взаимопревращения, которые могут происхо дить в живых организмах.
7,8-ДГФК h h -2e -2H, О -2e -2H, О NH NH NH 10 10 H H N N N CH2 CH2 CH 5 h h 7 8 N N N +2e +2H, +2e +2H, H H анаэроб анаэроб ФК ТГФК 5,8-ДГФК h деформилирование h формилирование Iс 0,1 М, вакуум НСООН HC N CHO NH N+ CH N Н+ CH 56 87 ОН - h N N H H 5-формил-ТГФК 5,10-метенил-ТГФК Рис. 15. Влияние УФ облучения на взаимопревращения коферментных производных фолиевой кислоты.
Коферментные производные фолиевой кислоты в эволюции биологических рецепторов света.
5,10-Метенил-ТГФК функционирует в ДНК-фотолиазах и в криптохро мах в качестве антенного пигмента, т.е. энергия его возбужденного состояния мигрирует на флавин реакционного центра, индуцируя, тем самым, химиче скую активность флавина. Возникает вопрос: как можно объяснить эволюцион ный отбор соединения, выполняющего важнейшие коферментные функции в «темновом» метаболизме, для выполнения специфической фотосенсорной функции в белках? Анализ свойств 5,10-метенил-ТГФК, в том числе установ ленных в данной работе, указывает на уникальность фотохимических характе ристик этого соединения по сравнению с другими коферментными производ ными ФК.
Выполнение 5,10-метенил-ТГФК антенной функции обусловлено уни кальным сочетанием в молекуле высокой способности поглощать фотоны (max = 25000 моль-1 ·см-1) в физиологически приемлемом диапазоне спектра (max = 360 нм) с высокой фотохимической стабильностью. Определенный вклад в ста билизацию химической структуры 5,10-метенил-ТГФК вносит также взаимо действие с апобелком в сайте связывания, осуществляющееся за счет дикарбо новых аминокислот и цистеина. Высокая фотон-поглощающая способность на границе UV-A и видимой области, как и высокая устойчивость к фотолизу в присутствии кислорода, отличают 5,10-метенил-ТГФК от тетрагидрофолиевой кислоты и других ее одноуглеродных производных.
Имидазолиновый цикл, придавая жесткость структуре молекулы, обеспе чивает эффективную передачу энергии возбуждения на другие молекулы (ан тенная функция). Можно думать, что эти структурные особенности молекулы сыграли роль селективных факторов при отборе 5,10-метенил-ТГФК на роль фотосенсора в светочувствительных белках.
Фотохимические реакции фолатов как элемент новой технологии получения кальция фолината.
Результаты исследования фотохимических свойств фолатов использова ны при разработке технологии получения кальция фолината. Этот препарат, кальциевая соль 5-формил-ТГФК, неизменно входит в перечень жизненно не обходимых и важнейших лекарственных средств, утверждаемый Правительст вом Российской Федерации (последнее Распоряжение Правительства РФ от марта 2007 г. за № 376-р). Его широко используют при химиотерапии онкоза болеваний как антидот токсичных цитостатиков, а также для снятия токсиче ских эффектов сульфаниламидов при лечении ревматоидных артритов и прото зойных инфекций, например, токсоплазмозов у ВИЧ-инфицированных пациен тов и при осложнениях беременности. Кальция фолинат эффективен при лече нии ряда анемий, в том числе пострадиационных. За рубежом начато его при менение как высокоэффективного витаминного препарата.
В настоящее время промышленное получение кальция фолината базиру ется на химическом восстановлении ФК в ТГФК в присутствии избытка бор гидрида натрия. Далее, проводят формилирование ТГФК муравьиной кислотой и образовавшуюся 5,10-метенил-ТГФК посредством гидролиза в присутствии триэтиламина трансформируют в 5-формил-ТГФК (фолиновую кислоту), кото рую выделяют в виде кальциевой соли.
Установленное в работе превращение ФК в ТГФК путем фотовосста новления, а также возможность проводить (в присутствии муравьиной кислоты) параллельно с фотовосстановлением присоединение к молекуле ТГФК одноуг леродного фрагмента с образованием 5,10-метенил-ТГФК, побудили нас ис пользовать фотохимические реакции для совершенствования технологии полу чения кальция фолината. Предложено два варианта использования фотохими ческого процесса.
Первый вариант включает активацию ультрафиолетом молекул ФК в процессе восстановления, что позволило повысить выход ТГФК и в два раза снизить концентрацию экологически вредного боргидрида натрия по сравне нию с существовавшими методами.
Второй вариант предусматривает синтез 5,10-метенил-ТГФК из ФК не в две, а в одну стадию. Для этого фотовосстановление ФК проводится непосред ственно в растворе муравьиной кислоты и донора электрона (исследовали НАД-Н и ЭДТА). Достоинства метода очевидны - сокращение технологическо го процесса и полный отказ от экологически небезопасного боргидрида натрия.
Данный вариант рассматривается сегодня, как ориентированный на перспекти ву и нуждается в проведении дополнительных исследований с целью повыше ния выхода 5,10-метенил-ТГФК, пока не отвечающего современным требова ниям (достигнут выход только 15 %).
Нами также предложен ряд нововведений, обеспечивающих повышение выхода и чистоты конечного продукта. Среди них (1) использование на стадии формилирования ТГФК муравьиной кислотой антиоксиданта унитиола, предот вращающего ее деструкцию и повышающего выход 5,10-метенил-ТГФК. С це лью предотвращения деструкции 5,10-метенил-ТГФК требуется исключение воздействия света ( 300 - 420 нм), поскольку формилирование проводится в муравьиной кислоте высокой ионной силы. (2) Использование этилендиамина вместо триэтиламина при переводе 5,10-метенил-ТГФК в 5-формил-ТГФК, что ускоряет проведение реакции и значительно повышает выход конечного про дукта. Кроме того, предложен новый подход к очистке кальция фолината, обес печивающий 96 - 98 % чистоту препарата (метод не раскрывается в связи с оформлением патентной заявки). Результаты исследования, связанные с разра боткой новых элементов технологии, но непосредственно не касающиеся фото химических реакций фолатов, на защиту не выносятся и включены в диссерта цию в качестве Приложения.
Согласно результатам анализа, при использовании первого варианта фо тохимической технологии в сочетании с модифицированными нами приемами трансформации ТГФК в 5,10-метенил-ТГФК и, далее, в фолиновую кислоту, а также очистки кальция фолината, выход 5,10-метенил-ТГФК составлял 65 ± %, а выход кальция фолината – 52 ± 2 % (в расчете на исходную ФК). Часть разработанного нами метода получения субстанции кальция фолината с ис пользованием УФ-облучения запатентована (Патент РФ №2241711, 2002 г).
ВЫВОДЫ 1. Установлено, что активированная УФ-излучением фолиевая кислота, взаимодействуя с донорами электрона, фотовосстанавливается до дигид рофолиевой и тетрагидрофолиевой кислот. Впервые проведено фотовос становление фолиевой кислоты в присутствии муравьиной кислоты с обра зованием кофермента 5,10-метенилтетрагидрофолиевой кислоты.
2. Методом ЭПР показана генерация свободных радикалов фолатов в облу ченных системах и предложен свободнорадикальный механизм фотовос становления фолиевой кислоты.
3. Установлено, что УФА-излучение усиливает окисление кислородом тетра гидрофолиевой кислоты и практически не влияет на 5,10 метенилтетрагидрофолиевую кислоту. Фотохимические характеристики 5,10-метенилтетрагидрофолиевой кислоты, в том числе её фотоустойчи вость, рассматриваются как факторы эволюционного отбора кофермента 5,10-метенилтетрагидрофолиевой кислоты на роль антенны в фоторецеп торах УФА-света.
Показано, что УФ-облучение не влияет на формилирование 5,6,7,8 4.
тетрагидрофолиевой кислоты и переход кофермента 5,10 метенилтетрагидрофолиевой кислоты в 5-формилтетрагидрофолиевую ки слоту.
5. С учетом полученных результатов по фотобиохимии фолатов разработан новый способ получения лекарственного средства – кальция фолината (кальциевой соли 5-формилтетрагидрофолиевой кислоты).
Список работ, опубликованных по теме диссертации Статьи в рецензируемых журналах:
1. Крицкий М.С., Телегина Т.А., Людникова Т.А., Умрихина А.В., Земскова Ю.Л. (2001) Участие свободных радикалов в фотовосстановлении птеринов и фолиевой кислоты. Доклады РАН. Т. 380, № 3, С. 408 - 410.
2. Телегина Т.А., Людникова Т.А., Земскова Ю.Л., Свиридов Е.А., Крицкий М.С. (2005) Устойчивость 5,10-метенил-тетрагидрофолиевой кислоты к действию ультрафиолетового излучения. Прикладная биохимия и микро биология. Т. 41, № 3, С. 315 - 325.
Статьи в научных сборниках и периодических научных изданиях 1. Kritsky M.S., Telegina T.A., Lyudnikova T.A., Zemskova Yu.L. Coenzymes in evolution of the RNA world. (2004) In: J. Chela-Flores et al. (eds.) Life in the Universe. Kluwer Acad. Publ. P. 115 - 118.
2. Крицкий М.С., Телегина Т.А., Людникова Т.А., Колесников М.П., Вечтомо ва Ю.Л., Дашина О.А., Свиридов Е.А. (2008) Фотохимия коферментов как область эволюционных исследований. В сборнике «Проблемы зарождения и эволюции биосферы», под редакцией академика Э.М. Галимова, Москва, Книжный дом «ЛИБРОКОМ», С. 97 - 110.
Патент:
1. Крицкий М.С., Телегина Т.А., Земскова Ю.Л., Колесников М.П., Рудакова И.П., Надточий М.А. (2004) “Способ получения кальция фолината”, RU 2241711 C2.
Тезисы докладов:
1. Kritsky M.S., Telegina T.A., Lyudnikova T.A., Kolesnikov M.P., Umrikhina A.V., Vechtomova Yu.L., Mironov E.A. (2000) The photochemical properties of pterins relevant to function in early evolution. Abstracts of the ISSOL’99 meeting (San Diego, California, U.S.A., 11 - 16 July, 1999), in Origins of Life and Evolu tion of the Biosphere, 30 № 2 - 4, Р. 262.
2. Telegina T.A., Lyudnikova T.A., Zemskova Yu.L., Kritsky M.S. (2001) Photo chemical properties of 5,10-methenyltetrahydrofolate, a chromofore of plant pho toreceptors. Abstracts of International Symposium “Signalling Systems of plant cells” (Moscow, 5 - 7 June 2001), P. 112 - 113.
3. Телегина Т.А., Людникова Т.А., Земскова Ю.Л., Крицкий М.С. (2001) Фото химические аспекты фотобиологической активности фолатов. Материалы III съезда фотобиологов России. (Воронеж, 28 июня - 4 июля 2001), С. 126 127.
4. Телегина Т.А., Крицкий М.С., Земскова Ю.Л. (2001) Фотохимическая трансформация фолиевой кислоты в фармакологические средства, исполь зуемые в терапии онкозаболеваний и анемий. Тезисы докладов VI Между народной конференции РФФИ “Результаты фундаментальных исследований для инвестиций”. (Пущино, Московской области. 12 - 14 сентября 2001), С.
75 - 76.
5. Земскова Ю.Л., Телегина Т.А., Крицкий М.С. (2002) Некоторые кофермент ные формы птеринов и фолатов как рецепторы длинноволнового УФ-света.
Тезисы докладов и стендовых сообщений XIV Зимней международной мо лодежной научной школы “Перспективные направления физико химической биологии и биотехнологии”. (Москва, 2002), С. 85.
6. Земскова Ю.Л., Телегина Т.А., Колесников М.П., Людникова Т.А., Умрихи на А.В., Свиридов Е.А., Крицкий М.С. (2003) Фотобиохимия фолиевой ки слоты и её коферментных форм. Материалы международной конференции «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования», (Пущино, Московской области, 9 - 14 июня 2003), Т. 3. С. 67 - 70.
7. Телегина Т.А., Земскова Ю.Л., Колесников М.П., Людникова Т.А., Крицкий М.С. (2005) Исследование фотохимических свойств коферментных произ водных фолиевой кислоты. Материалы IV съезда фотобиологов России, (Саратов, 26 - 30 сентября 2005), С. 210 - 212.
8. Kritsky M.S., Telegina T.A., Kolesnikov M.P., Lyudnikova T.A., Zemskova Yu.L., Sviridov E.A. (2005) Nucleotide like coenzymes in the formation of primitive metabolic systems. Abstracts of the 11th ISSOL Meeting and 14th ICOL, (Beijing, China. 19 - 24 June 2005), P. 123 - 124. (in Origins of Life and Evolution of the Biosphere, 36 № 3, Р. 237 - 238).
9. Telegina T.A., Lyudnikova T.A., Vechtomova Yu.L., Kolesnikov M.P., Kritsky M.S. (2006) Photonics of pteridine coenzyme derivatives in relation to their func tions in organisms. Abstracts of the International Symposium on Molecular Pho tonics, (St. Petersburg. 28 June - 2 July 2006), P. 148 - 149.
10. Телегина Т.А., Людникова Т.А., Колесников М.П., Вечтомова Ю.Л., Даши на О.А., Крицкий М.С. (2007) Фотобиохимия птеридиновых коферментов.
Тезисы докладов XVIII Менделеевского Съезда по общей и прикладной хи мии, (Москва. 23 - 28 сентября 2007), Т. 4. С. 595.
11. Kritsky M.S., Telegina T.A., Lyudnikova T.A., Kolesnikov M.P., Vechtomova Yu.L., Dashina O.A. (2007) Photonics of pteridine and benzopteridine derivatives as an area of evolutionary studies. Abstracts of the International symposium “Origin and Evolution of Biosphere and Photonics of nucleic acids”, (Terskol, Kabardino-Balkaria. 6 - 10 august 2007), P. 34.
12. Вечтомова Ю.Л., Телегина Т.А., Колесников М.П., Умрихина А.В., Е.А.Свиридов, М.С. Крицкий (2008), Фотохимия фолиевой кислоты и ее коферментных форм, Тезисы докладов V Съезда Российского фотобиологи ческого общества (Пущино, Московской области, 8 - 13 июня 2008), С. 46.
13. Телегина Т.А., Крицкий М.С., Колесников М.П., Вечтомова Ю.Л., Шейман Б.М., Будков В.А., Хомутова Е.Д. (2008), Новая технология производства субстанции кальция фолината, Материалы симпозиума «Результаты фунда ментальных и прикладных исследований для создания новых лекарствен ных средств» (Москва, 9 - 11 июня 2008), С. 203 - 204.
14. Вечтомова Ю.Л., Телегина Т.А., Колесников М.П., Свиридов Е.А., Крицкий М.С. (2008), Фотобиохимия фолатов, Сборник статей Международной на учной конференции «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем» и 8 съезда Белорусского общественного объединения фотобиологов и биофизиков (Минск, Беларусь, 25 - 27 июня 2008), Ч. 2, С. 177 - 179.
15. Vechtomova YL., Telegina TA. and Kritsky MS. (2008) Photonics of folate coenzymes in relation to evolution, Abstracts of the 12th ISSOL Meeting and 15th International Conference on the Origin of Life (Florence, Italy, 24 - 29 au gust 2008), Р. 196 - 197.
Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных иссле дований и Программы фундаментальных исследований № 18 «Проблемы заро ждения биосферы Земли и ее эволюции» Президиума РАН.