Структурно-функциональный анализ ингибитора днк-гиразы микроцина б
На правах рукописи
Гиляров Дмитрий Алексеевич
СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ИНГИБИТОРА ДНК-ГИРАЗЫ
МИКРОЦИНА Б
Специальность 03.01.07 - молекулярная генетика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Москва
2011
Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики микроорганизмов Учреждения Российской академии наук Института биологии гена РАН.
Научный руководитель:
доктор биологических наук, профессор Северинов Константин Викторович
Официальные оппоненты:
чл.-корр. РАН, доктор физико-математических наук, профессор Гурский Георгий Валерианович доктор биологических наук, профессор Хмель Инесса Александровна
Ведущая организация:
Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. М.М.
Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН
Защита диссертации состоится _ 2011 года в _ на заседании Диссертационного совета Д 002.037.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биологии гена РАН по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, д.34/5.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва, ул.
Вавилова, д.32.
Автореферат разослан _ 2011 года.
Ученый секретарь диссертационного совета канд. фарм. наук Грабовская Л.С.
I.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность работы. ДНК-топоизомеразы управляют топологическим состоянием ДНК и делают возможным протекание фундаментальных клеточных процессов, таких как репликация, транскрипция и сегрегация хромосом. Изучение ингибиторов топоизомераз важно как с точки зрения понимания механизмов действия этих ферментов, так и для разработки новых лекарств. Топоизомераза II человека является мишенью противоопухолевых препаратов, а бактериальная топоизомераза II типа – ДНК-гираза является мишенью фторхинолонов, наиболее мощных из используемых в настоящее время антибиотиков широкого спектра действия. Поиск, изучение и целенаправленное создание новых ингибиторов ДНК-топоизомераз является важной научной задачей.
Данная работа посвященa исследованию природного пептидного антибиотика микроцина Б. Гены, отвечающие за продукцию и устойчивость к микроцину Б закодированы на плазмиде, присутствующей в некоторых штаммах E. сoli. Антибиотик обладает бактерицидным действием и активен в отношении большинства грамотрицательных бактерий. Зрелый микроцин представляет собой интенсивно пост-трансляционно модифицированный 47-аминокислотный пептид. Модификации микроцина включают в себя циклизации остатков серина и цистеина, приводящие к появлению ароматических оксазольных и тиазольных гетероциклов в составе молекулы. Такой тип модификации является широко распространенным в природе;
за последние несколько лет было выявлено множество классов природных соединений, синтезируемых на рибосомах и модифицируемых аналогичным образом. Выбор аминокислот, подвергаемых циклизации определяется контекстом, тем не менее, подробности этого процесса остаются загадкой.
Мишенью микроцина Б является ДНК-гираза. Связывание микроцина с комплексом гираза ДНК приводит к ингибированию реакции переноса участка сверхспирализованной ДНК через двухцепочечный разрыв, образуемый ДНК-гиразой. Накопление двуцепоченых разрывов приводит к остановке репликации ДНК и к гибели бактериальной клетки. Точный механизм ингибирования ДНК-гиразы микроцином Б неизвестен, также как и район ДНК-гиразы, с которым взаимодействует микроцин.
Цели и задачи исследования.
Целью работы являлось проведение структурно-функционального анализа микроцина Б.
Для достижения цели работы были поставлены следующие задачи:
1) Охарактеризовать естественное природное разнообразие форм микроцина Б;
2) Исследовать значение двойных тиазол-оксазольных гетероциклов для функционирования микроцина Б;
3) Определить минимальный фрагмент микроцина Б, способный подавлять рост клеток и ингибировать ДНК-гиразу.
Научная новизна и практическая значимость работы.
Впервые было установлено, что большая часть выделяемого из клеток зрелого микроцина Б несет ранее неизвестную модификацию – сложноэфирную связь, соединяющую аминокислотные остатки 51 и 52. Эта модификация является результатом NО-пептидил изомеризации остатка Ser52, находящегося непосредственно за одним из тиазольных гетероциклов в составе микроцина. Сложноэфирная связь является одним из продуктов работы ферментного комплекса, в норме осуществляющего циклизацию остатков серина и цистеина в составе микроцина. Этот результат представляет большой интерес для понимания процессов, приводящих к синтезу ароматических гетероциклов в подобных микроцину природных соединениях.
Впервые с помощью исчерпывающего ПЦР-мутагенеза были систематически проанализированы синтез гетероциклов и их функциональная роль, для чего было получено около сотни генетически модифицированных пептидов. Полученные результаты существенно дополняют известные данные и прямо указывают на неполноту существующих представлений о работе синтетазного комплекса, модифицирующего микроцин Б.
Понимание функционирования McbBCD синтетазного комплекса позволит создавать генно инженерным путем принципиально новые биологически активные вещества и является актуальной задачей большой практической и научной значимости. Полученные в результате работы химически модифицированные производные микроцина Б могут быть в дальнейшем использованы для детальной характеризации взаимодействия пептида с гиразой.
Публикации и апробация работы. По результатам диссертационной работы было опубликовано 8 печатных работ, в том числе 1 статья в международном рецензируемом журнале и 7 тезисов международных конференций. Основные положения и результаты работы были представлены на следующих конференциях: 1) «TOPO-2008», July 20-24, 2008, Norwich, UK;
2) Первый Международный форум по нанотехнологиям «Rusnanotech-2008», 3 5 декабря, 2008, Москва, Россия;
3) «FEMS-2009», June 28-July 02, 2009, Gothenburg, Sweden;
4) «34th FEBS Congress», July 4-9, 2009, Prague, Czech Republic;
5) Второй Международный форум по нанотехнологиям «Rusnanotech-2009», Oct 6-8, 2009, Москва, Россия;
6) «International Congress of Young Scientists», April 13-14, 2010, Yerevan, Armenia;
7) «36th FEBS Congress», June 20-25, 2011, Turin, Italy.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и обсуждений, заключения, а также выводов, благодарностей и списка литературы. Работа изложена на 97 страницах машинописного текста, включая 26 рисунков и 1 таблицу. Список цитируемых литературных источников включает 146 наименований.
II. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Введение Тиазольные и оксазольные гетероциклы широко распространены в биоактивных соединениях и могут участвовать в выполнении самых разных функций в натуральных и синтетических веществах. Такими веществами являются, например, ингибитор рибосомы тиострептон, антираковое вещество транкамид, ингибитор ДНК-гиразы микроцин Б, индуктор вторичного метаболизма гоадспорин, сидерафор ерсиниабактин и ингибитор протеазы ВИЧ Ритонавир. Целый ряд недавних биоинформатических и биохимических исследований говорит о распространенности пептидов, содержащих пост-трансляционно образованные тиазольные и оксазольные гетероциклы (тиазол-оксазол модифицированные микроцины, ТОММ) в природе. К таким пептидам относятся цианобактины, стрептолизин, тиациллины и др. Биохимические детали формирования ароматических гетероциклов из полипептидных цепей представляют значительный интерес, так как многие модифицированные пептиды обладают потенциально интересными фармакологическими свойствами. Предполагается, что ферментативные комплексы, осуществляющие модификацию пептидов, могут быть использованы для получения новых синтетических биологически активных веществ. На сегодняшний день описаны два типа таких комплексов, наиболее изучен комплекс, осуществляющий модификацию микроцина Б – McbBCD синтетаза. Микроцин Б это пептид массой 3094 Да, содержащий тиазолы и оксазолы, который ингибирует бактериальную топоизомеразу типа II ДНК-гиразу. Производство и иммунность к микроцину Б требует присутствия семи генов: mcbA, mcbB, mcbC, mcbD, mcbE и mcbG. Эти гены образуют оперон, который встречается на природных плазмидах. Микроцин Б синтезируется из продукта гена mcbA – глицин-богатого полипептида длиной 69 а.к (рис.
1). Активность ферментативного комплекса McbBCD превращает некоторые из серинов и все цистеины в этом предшественнике в оксазольные и тиазольные гетероциклы. Структурный белок McbD узнает лидерный пептид предшественника микроцина и движется вдоль него в NC направлении. Встречая дипептиды Gly-Ser или Gly-Cys, циклодегидратаза McbC превращает остаток серина или цистеина в оксазолиновый или тиазолиновый цикл, соответственно, после чего дегидрогеназа McbB окисляет цикл до ароматического оксазола или тиазола.
Вариантов микроцина с оксазолиновыми или тиазолиновыми кольцами не было обнаружено, поэтому считается, что ароматизация следует непосредственно за циклизацией без диссоциации ферментного комплекса. После образования модифицированного микроцина Б (промикроцина), протеазы TldD и TldE отщепляют лидерный пептид и зрелый микроцин транспортируется из клетки с помощью ABC-зависимых транспортеров McbD и McbE. Продукт гена mcbG, принадлежащего к семейству белков с пентапептидными повторами, взаимодействует с ДНК-гиразой, предоставляя дополнительную защиту клетки от производимого микроцина. Проведенные биохимические исследования позволили установить, что микроцин Б способствует стабилизации переходных комплексов гиразы с расщепленной ДНК, что в дальнейшем приводит к накоплению двухцепочечных разрывов ДНК, ингибированию репликации и индукции SOS-ответа. Таким образом, действие микроцина напоминает действие клинически значимых фторхинолоновых антибиотиков.
Тем не менее, механизм действия микроцина отличается от механизма действия хинолонов.
Фактический сайт взаимодействия микроцина Б с гиразой не известен.
В данной работе структура микроцина Б была проанализирована при помощи масс спектрометрических и химических методов, а также с помощью систематического мутационного анализа. Мы установили ранее неизвестные детали структуры антибиотика и получили большое количество данных по влиянию первичной структуры на синтез и антибактериальную активность микроцина Б in vivo и in vitro.
Характеризация выделяемого из клеток микроцина Б Основная форма микроцина, выделяемая из клеток, содержит 8 гетероциклов:
четыре оксазола и четыре тиазола. В дальнейшем мы будем обозначать эту форму как принято в литературе (Sinha Roy et al., 1999) – 0. Также распространены не полностью процессированные пептиды, в которых некоторые остатки серина не циклизованы. Эти вещества не имеют одного или двух С-концевых оксазолов (-1, -2), но тем не менее обладают антибактериальной активностью. Модификация трипептидов Gly-Ser-Cys и Gly-Cys Ser приводит к появлению двух слитых 4,2-оксазол-тиазол и 4,2-тиазол-оксазол бис гетероциклов. В дальнейшем мы будем называть их сайт «А» и сайт «Б».
Еще один трипептид Gly-Cys-Ser - сайт «С» - расположен между сайтами «А» и «Б». Тем не менее, большинство молекул микроцина содержат в этом месте одиночный тиазольный гетероцикл. Ser52 модифицируется лишь в небольшой фракции микроцина, содержащей, таким образом, слитый бис-гетероцикл в сайте «С» (+1) (см. рис. 1). Такой «гипермодифицированный» микроцин, по литературным данным, на 40% более активен чем микроцин с 8 циклами.
Рис. 1. Структура и созревание микроцина Б.
Финальной стадией выделения микроцина Б из культуры клеток-продуцентов является обратнофазовая ВЭЖХ. На рис. 2 представлена типичная хроматограмма, включающая три основных пика. По данным МALDI анализа, пики 1 и 2 содержали масс ионы со значением m/z = 3094, соответствующим зрелому микроцину 0 (см. рис. 1), тогда как пик 3 содержал масс-ионы с m/z = 3074, соответствующие микроцину +1 с дополнительным двойным гетероциклом в сайте «С». Минорные плохо разрешенные пики соответствовали незрелым формам микроцина (-1, -2, -3). Дополнительный минорный пик, выходивший между пиками 1 и 2 также содержал масс-ионы соответствующие (-1) микроцину. Таким образом, вещества, обладающие одинаковой массой, обладали разной хроматографической подвижностью.
Чтобы определить причины этого необычного поведения, материал из разных фракций был подвергнут MS-MS анализу. Материал из пика 2 был однозначно подтвержден как микроцин 0, в то же время, материал из пика 1 обладал необычным спектром фрагментации (см. рис.
2). Главной характеристикой этого спектра являлся очень интенсивный пик m/z = 1393. Также отсутствовал Y-ион с m/z = 1324 от разрыва пептидной связи между Ser и Asn. Масс-ион m/z=1393 не мог быть сопоставлен ни с одним из продуктов возможного расщепления пептида. Ближайшим соответствием являлся ион m/z=1395, являющийся продуктом расщепления N-C (Ser52) связи. Возможный парный N-концевой ион с массой 1702 был также обнаружен. В дальнейшем мы будем обозначать микроцин со стандартным характером фрагментации как «N», а микроцин с характерным интенсивным разрывом – как «Х».
Существование сайта предпочтительной фрагментации указывало на наличие значительно более лабильной связи, чем пептидная. Масс-ионы, соответствующие вариантам микроцина (-1), по-разному ведущим себя на хроматографии, были также проанализированы с помощью тандемного MS. В обоих случаях отсутствовал С-концевой оксазольный гетероцикл, что могло быть детектировано по увеличению массы y7 иона на единиц. Материал с большим временем удерживания обладал типичным спектром фрагментации, материал с меньшим временем удерживания – аномальным спектром, содержавшим интенсивный пик фрагментации (m/z = 1413, т.е 1393+20) (см. рис. 2).
Материал, соответствующий веществам (-2) и (-3) был также проанализирован (рис. 2);
было обнаружено, что он не содержит двух или трех С-концевых оксазолов (что следует из сдвига на 20 и 40 единиц масс-иона y10). В этом материале также были представлены интенсивные пики m/z = 1434 и m/z = 1454. Анализ фрагментации формы (-3) также выявил фрагмент m/z = 1112, который мог являться продуктом расщепления N-C связи Ser (ожидаемая масса z15 иона – 1114). Соответствующий парный N-концевой ион был также обнаружен. Ser56 при обычных условиях входит в бис-гетероцикл сайта “Б”, но в (-3) форме остается недоциклизованным. Таким образом, структура сайта «Б» в веществе (-3) (тиазольный цикл, за которым следует серин) идентична структуре сайта «С» в веществе (0).
Можно предположить, что модификация трипептидов Gly-Ser-Cys McB-синтазой в некоторых случаях приводит к образованию необычной структуры, не описанной в литературе.
Рис. 2. Обнаружение новой формы микроцина Б. А-ВЭЖХ-профиль микроцина Б на финальной стадии очистки. Б-MS-MS спектры микроцина 0 из пика 2 (верхняя панель) и из пика 1 (вторая сверху панель) и фрагментирующиеся по X-типу интермедиаты производства микроцина.
Химические модификации микроцина Б Наблюдаемые на MS-MS спектрах вещества «X» фрагменты, в принципе, могли быть продуктами расщепления депсипептидной (сложноэфирной) связи между Cys и Ser в Gly-Cys Ser трипептидах сайта «Б» или сайта «С». Сложноэфирная связь является более лабильной, чем амидная и легче разрывается во время MS-фрагментации. Мы получили результаты, подтверждающие это предположение.
Изомеризация пептидной связи в депсипептидную приводит к образованию свободной аминогруппы. Присутствие дополнительных аминогрупп может быть выявлено с помощью химических модификаций. Мы использовали два типа реагентов для модификации «X» и «N» форм микроцина: пропионовый ангидрид, способный реагировать с амино- и сульфгидрильными группами, а также, с меньшей эффективностью, с гидроксигруппами и N-гидроксисукцинимидный эфир биотина (NHS-биотин), который является более селективным N-ацилирующим реагентом. Так как депсипептидные связи способны изомеризоваться в пептидные при нейтральном или щелочном pH, реакции модификации выполнялись при pH 4 и при pH 7.4. Условия низкого pH являются менее благоприятными для протекания реакции ацилирования, но должны были предотвратить обратную изомеризацию депсипептидной связи в амидную связь. В случае вещества типа «N» мы рассчитывали получить моноацилированные по N-концу производные. Это предсказание выполнилось лишь частично. С пропионовым ангидридом при обоих pH наблюдалась смесь моно- и диацилированных производных, причем при pH 7.4 количество диацилированных продуктов увеличивалось. С NHS-биотином при pH 7.4 наблюдались преимущественно моно-модифицированные продукты, тогда как при pH 4 модификации не происходило. С микроцином (+1), использовавшимся в качестве контроля, были обнаружены только моно-модифицированные производные, что указывало на то, что для вторым сайтом модификации обоими реагентами является Ser52. MS-MS анализ подтвердил это предположение. Этот результат являлся неожиданным, так как указывал на необычно высокую реакционную способность Ser52. Вслед за этим были выполнены модификации вещества X. С пропионовым ангидридом при pH 7.4 были обнаружены только ди- и триацилированные продукты, при pH 4 были получены моно- и димодифицированные продукты, как и в случае вещества N.
Ser52;
Диацилированные продукты содержали модификации по N-концу и триацилированные дополнительную модификацию по Ser67. Модификация микроцина X NHS-биотином при pH 7.4 приводила к появлению моно- и диацилированных продуктов, тогда как модификация при pH 4 привела к появлению небольшого количества моноацилированного продукта. По результатам тандемного MS-анализа модификация была отнесена к остатку Ser52. Данный результат подразумевает наличие в веществе X химически активной группы, которая в условиях эксперимента была более реакционноспособна, чем N концевая аминогруппа.
Щелочной гидролиз модифицированного по Ser52 микроцина подтверждает наличие сложноэфирной связи в микроцине «X»
Присутствие функциональной группы с высокой реакционной способностью в боковой цепи Ser52 согласовывалось с идеей формирования сложноэфирной (N-O пептидной связи) в микроцине X между Cys51 и Ser52. Такая связь должна быть чувствительной к мягкому щелочному гидролизу. Продукты реакций модификации X- и N форм микроцина NHS-биотином при pH 4 были инкубированы в 10% водном аммиаке, полученные вещества проанализированы с помощью MALDI (рис. 3). Непрореагировавшее вещество N не гидролизуется, но подвергается деамидированию (изменение массы на единицы). Деамидирование происходит по двум остаткам аспарагина и было ранее показано Parks et al.(2007). Более сложная картина наблюдается при анализе продуктов гидролиза биотинилированного вещества X. Оставшееся непрореагировавшее вещество деамидировалось и, по данным MS-MS, изомеризовалось в вещество «N». Интенсивность пика монобиотинилированного X во много раз уменьшилась, при этом появилось два новых пика. Пик (m/z = 1701.7) соответствовал амидированному по С-концу N-концевому фрагменту микроцина, образовавшемуся в результате разрыва связи Cys51Ser52. Пик (m/z = 1639.6) соответствовал С-концевому фрагменту микроцина, биотинилированному по Ser Аналогичные результаты были получены и при гидролизе продуктов реакции модификации пропионовым ангидридом.
Рис. 3. Мягкий щелочной гидролиз химически модифицированного микроцина Б.
Микроцин типа «N» (слева) или «X» (справа) был модифицирован NHS-биотином при pH 4. На панелях А и Б представлен MALDI анализ проведенных реакций (см. также рис. 3). Продукты реакций были подвергнуты мягкому щелочному гидролизу и проанализированы с помощью MALDI анализа (панели В и Г).
Данные результаты подтверждают наличие сложноэфирной связи между остатками Cys51 и Ser52 в микроцине Б X-типа. Эта связь не присутствует в микроцине N-типа. Нужно отметить, что гидролиз моно-модифицированного микроцина X не является следствием модификации per se, так как ни одна из моно-модифицированных производных вещества N не гидролизовалась. Таким образом, основываясь на приведенных выше данных, мы заключаем, что большая часть микроцина Б, выделяемого из клеток по стандартной процедуре, имеет структуру, отличающуюся от представленной на рис. и содержит сложноэфирную пептидную связь – продукт N-O ацильного сдвига Ser52. В результате данной изомеризации боковой радикал Ser52 содержит аминогруппу вместо гидроксильной.
Биологическая активность вещества X и переход XN Мы проверили, действительно ли микроцин «X» является конечным или промежуточным продуктом созревания микроцина Б, или же это артефакт выделения.
Независимые эксперименты подтверждают, что микроцин X производится in situ. Во-первых, экспресс-MALDI-MS анализ производящих микроцин клеток, обработанных 70% ацетонитрилом и раствором матричного соединения показал, что эти клетки содержат вещество с массой 3094 и с характерным X-пиком фрагментации. Во-вторых, при кипячении микроцина N в 0.1 М уксусной кислоте в течении 20 минут (имитация процедуры выделения) не было замечено никаких следов образования вещества X.Ряд экспериментов был выполнен, для того, чтобы оценить антибактериальную активность веществ X и N подтвердить, что они имеют одну и ту же мишень. Используя стандартный тест (ингибирование роста газона чувствительных клеток в мягком агаре) на активность микроцина, мы показали, что равные концентрации веществ X и N приводят к образованию зон ингибирования роста одинакового размера. На газонах клеток E. coli, несущих в gyrB мутации, дающие частичную устойчивость к микроцину (gyrB Trp751Arg), эти зоны уменьшаются сходным образом для обоих веществ. Клетки у которых отсутствует транспортер микроцина через внешнюю мембрану – SbmA – полностью устойчивы к обоим соединениям. В качестве контроля мы использовали ципрофлоксацин (CFX), другой антибиотик, который ингибирует ДНК-гиразу, но взаимодействует с другим участком фермента и не требует SbmA для входа в клетки. Двухцепочечные разрывы в ДНК, вызываемые микроцином и CFX, приводят к активации у клеток состояния SOS-ответа, при котором активируется транскрипция генов, в норме репрессированных регулятором транскрипции LexA. Используя клетки, содержащие репортерный ген lacZ под контролем LexA-зависимого промотора sfiA, мы определили способность двух форм микроцина вызывать SOS-ответ. Для этого мы оценивали цвет вокруг зон ингибирования роста тестерного штамма в мягком агаре, приготовленном на среде МакКонки. Обе формы микроцина и CFX, но не ингибитор аминоацил-тРНК-синтетазы микроцин С, приводят к появлению ободков интенсивного красного цвета вокруг зон ингибирования роста клеток, что демонстрирует активацию SOS-ответа у клеток, получающих сублетальные дозы микроцинов «X» и «N» и CFX. Были также исследованы эффекты обоих веществ на катализируемую ДНК-гиразой реакцию суперскручивания ДНК. Добавление ципрофлоксацина и обеих форм микроцина Б вызывало ожидаемое накопление линейной формы ДНК, возникающей из-за опосредованной антибиотиками стабилизации комплексов гиразы с расщепленной ДНК.
Рис. 4. Микроцин «X» биологически активен. А, капли растворов микроцинов X и N определенной концентрации были нанесены на газон чувствительных клеток E. coli. Представлены средние размеры зон ингибирования роста после ночной инкубации чашек. Б, 10 мкМ растворы микроцинов «Х» и «N» и ципрофлоксацина были нанесены на газоны указанных штаммов E. coli.
Представлены средние размеры зон ингибирования роста после ночной инкубации чашек. В, капли 10µМ растворов микроцинов «X» и «N», а также ципрофлоксацина и 100 мкМ микроцина С были нанесены на газон индикаторного штамма клеток sfiAlacZ на среде МакКонки. После ночной инкубации чашка была сфотографирована. Г, реакция суперскручивания релаксированной плазмиды pBR322 ДНК-гиразой в присутствии 33 мкМ микроцинов (McB) «X» и «N», 5 мкМ ципрофлоксацина (CFX) или без ингибиторов. После инкубации с SDS и протеиназой К продукты реакции были разделены на агарозном геле. OC-открытая кольцевая форма ДНК, L - линейная, SC – суперскрученная.
Обе формы микроцина стабилизировали комплекс с одинаковой эффективностью.
Отсюда был сделан вывод, что «X»-форма микроцина биологически активна и действует на ДНК-гиразу.Депсипептидная связь также присутствует в промежуточных продуктах созревания микроцина, имеющих один тиазольный гетероцикл в сайте «Б».
Предположительно, он формируется, когда McbBCD синтетазный комплекс модифицирует трипептид Gly-Cys-Ser и завершает синтез тиазольного цикла. В случае сайта «Б» фермент с высокой эффективностью переходит к синтезу последующего оксазольного цикла, вслед за этим формируя еще несколько С-концевых оксазолов. В случае сайта «С», синтез слитого оксазольного цикла (приводящий к появлению вещества +1) проходит сравнительно неэффективно. Вместо этого идет конкурирующая реакция N-O-ацильного сдвига, приводящая к накоплению пептида со сложноэфирной связью между Cys51 и Ser52.
Возможный механизм этого процесса изображен на рис. 5. Можно заметить, что процесс автопротеолизе и белковом сплайсинге. При этом нуклеофильное присоединение гидроксила серина к С атому приводит к формированию неустойчивого аддукта, который в дальнейшем может изомеризоваться разными способами. О-протонирование приводит к образованию оксазолинового цикла, тогда как N-протонирование – к формированию гетероциклизации сходен с процессами, происходящими при сложноэфирной связи. (В случае автопротеолиза эта связь подвергается дальнейшей трансэстерификации и в итоге расщепляется.) Известно, что McbBCD-комплекс взаимодействует с субстратом обратимо при образовании каждого цикла, но в то же время синтез гетероциклов происходит последовательно, от N к C концу. Нам кажется вероятным, что все присутствующее в клетках вещество «N» может являться продуктом обратной изомеризации N-O связи. Косвенно на это указывает кинетика накопления различных форм микроцина при росте культуры производящих клеток: вещество «X» накапливается быстрее, чем «N» и» +1. Тем не менее, нельзя и отвергнуть возможность «пропуска» синтетазой серина в трипептиде Gly-Cys-Ser.
Направленный мутагенез микроцина Б Эффективность формирования оксазольного цикла в трипептиде Gly-Cys-Ser очевидно зависит от контекста, то есть определяется аминокислотными остатками вне самого трипептида. Мы сделали попытку проанализировать влияние контекста на формирование гетероциклов с помощью сайт-специфического мутагенеза. В природе структурный ген микроцина mcbA находится на большой плазмиде в составе оперона, что затрудняет внесение мутаций методом ПЦР.
Поэтому нами была создана двуплазмидная система экспрессии микроцина Б, в которой структурный ген mcbA, кодирующий промикроцин Б, и гены его созревания, экспорта и иммунности (mcbBCDEFG) находятся на двух совместимых плазмидах, причем ген mcbA находится на высококопийной плазмиде pUC18, что позволяет легко вносить любые мутации методом ПЦР.
Для анализа влияния контекста Ser52 на циклизацию, мы сделали следующие Asn53Gly;
Cys51Gly;
инсерция двух остатков глицина между Ser52 и Asn мутации:
(имитируя контекст двойного гетероцикла в сайте «Б»). Замена Asn53 не привела к какому либо заметному эффекту на производство или на относительное количество разных форм микроцина. В то же время две другие мутации привели к сильному падению производства микроцина. В случае замены Cys51Gly мы смогли обнаружить масс-ионы ожидаемой массы (m/z = 3068), фрагментирующие как X и N формы микроцина. Соответствующая хроматографическая фракция обладала антибактериальной активностью. Тем не менее, очень слабый сигнал сделал невозможным дальнейший анализ относительного количества «X» и «N» форм. В случае инсерции глицинов мы не смогли детектировать присутствие ожидаемых масс-ионов. Таким образом, остаток Asn не участвует в формировании бис гетероцикла в сайте «С». Гетероциклизация цистеина оказывается важной для дальнейшего созревания микроцина, как и расстояние между разными сайтами гетероциклизации.
Структурно-функциональный анализ микроцина Б Мы использовали созданную нами систему мутагенеза структурного гена микроцина для дальнейшего исследования процессов гетероциклизации и связи структуры с функциональной активностью пептида. Мы поставили перед собой задачу произвести тотальный случайный мутагенез аминокислотных остатков, составляющих первый двойной гетероцикл – Ser40 и Cys41. (см. рис. 1). Мы хотели узнать, могут ли какие-то аминокислотные замены компенсировать отсутствие бис-гетероцикла и проверить предыдущие данные о том, что мутации в Ser40 полностью препятствуют образованию зрелого вещества *Sinha Roy 1999]. Для создания библиотеки мутантов мы проводили ПЦР с мутагенными праймерами.
Рис. 5. Предполагаемый механизм образования депсипептидной связи в микроцине Б Полученные данные представлены в табл. 1. Многие мутации сопровождались почти полным исчезновением антибактериальной активности одновременно с существенным (на порядок) понижением продукции по данным ВЭЖХ. Понижения продукции не происходило только в случае самых активных веществ. Для всех проанализированных мутантов активных in vivo удалось детектировать масс-ионы, соответствующие ожидаемым массам веществ. С другой стороны, для проанализированных мутантов из числа полностью потерявших антибактериальную активность ни ВЭЖХ пиков, ни масс-ионов детектировать не удалось.
На основании полученных данных можно сделать несколько выводов. Во-первых, в целом производство микроцина коррелирует со способностью производящих микроцин клеток ингибировать рост чувствительных штаммов E. сoli. Во-вторых, существуют аминокислотные замены в обоих положениях цикла (Gly, Ala) которые не снижают уровень продукции и лишь незначительно сказываются на антибактериальной активности. В то же время, не было найдено веществ, которые бы детектировались, и при этом не обладали бы антибактериальной активностью. Это означает, что наличие двойного гетероцикла в сайте «А» в целом не является необходимым для активности вещества, но явно тем или иным образом сказывается на его продукции (возможно, за счет блокирования комплекса McbBCD синтетазы при NC направленном внедрении гетероциклов). Наши данные находятся в противоречии с ранее опубликованными данными (Sinha Roy 1999). Авторы этой работы не смогли получить in vivo вещество с аминокислотной заменой Ser40Gly и сделали вывод о том, что любая мутация в данном аминокислотном остатке полностью препятствует созреванию вещества. В нашем исследовании показано, что это не так: вещество Ser40Gly образует пик на ВЭЖХ, детектируется масс-спектрометрически и, будучи выделенным в чистом виде, обладает антибактериальной активностью. Наша способность детектировать вещества со сформированным тиазольным гетероциклом при практически любых вариантах (кроме отрицательно заряженных) аминокислотных остатков на месте Ser40 говорит о достаточно широкой субстратной специфичности микроцин-синтетазного комплекса McbBCD т.к. пептидная связь вышестоящей аминокислоты участвует в образовании гетероцикла, и получается что даже при обширных боковых цепях вышестоящей аминокислоты (Trp, Leu) этот процесс оказывается возможным.
Далее мы проводили полный мутагенез аминокислотных остатков, составляющих двойной гетероцикл “Б”– Cys55 и Ser56. (см. рис. 1). Мы хотели узнать, могут ли какие-то аминокислотные замены компенсировать отсутствие бис-гетероцикла и проверить предыдущие данные о значимости бис-гетероцикла сайта «Б» для антибактериальной активности вещества *Sinha Roy 1999, Zamble 2001].
Табл. 1. Полученные мутанты по бис-гетероциклам в сайтах «А» (слева) и «Б» (справа).
Активность in vivo (+/-)–штамм клеток-продуцентов данного вещества обладает/не обладает антимикробной активностью. MS(+/-) – удалось/не удалось детектировать данное вещество с помощью MALDI. Пустое поле в столбце MS – анализ не проводился.
Сайт «А» Сайт «Б»
Ser Cys Cys Ser Активность Активность Активность Активность MS MS MS MS in vivo in vivo in vivo in vivo V - - V + V - - V - C + + - - - S + + - - - - - S + + - - C + + Q + Q + Q - Q D - - D - - D - - D - H + + H + + H - H M + + M + + M - M R - - R + + R - R F - - F + + F - F L - - L + + L - L N + + N + + N - + N + + K - K + K - K Y - Y + Y - Y P - - P - - P - - P - G + + G + + G - + G + + T - - T + T - - T + E - - E - - E - - E - W - W + W - W I - - I - - I - I - A + + A + + A - + A + + Схема получения мутантов использовалась та же, что и для сайта «А». Все мутанты, обладающие антибактериальной активностью, и ряд мутантов, полностью потерявших активность, были выделены и охарактеризованы с помощью MALDI. Полученные в ходе мутагенеза данные представлены в табл. 1. В первом положении гетероцикла, все мутации, кроме сохраняющей гетероцикл (т.е. Cys на Ser), сопровождались полным исчезновением антибактериальной активности. При этом некоторые мутанты были успешно выделены и их продукция была не намного ниже продукции дикого микроцина по данным ВЭЖХ. Для этих веществ удалось детектировать масс-ионы, соответствующие ожидаемым массам. Во втором положении цикла,помимо сохраняющей гетероцикл мутации Ser55 на Cys, мутации Ser55Asn и Ser55Gly позволяли веществам сохранить частичную антибактериальную активность. Эти вещества также удалось выделить и найти масс-ионы, соответствующие ожидаемым массам веществ с помощью MALDI анализа. Таким образом, в отличие от сайта «А», в сайте «Б» производство микроцина не строго связано со способностью производящих микроцин клеток ингибировать рост чувствительных штаммов E. сoli. Следовательно, именно сайт «Б» является возможной детерминантой связывания антибиотика с мишенью и это подтверждает ранее высказанные предположения (Zamble 2001).
Для дальнейшего функционального анализа микроцина, мы получили набор укороченных с С-конца пептидов. Таким образом, мы планировали установить минимальный фрагмент микроцина, способный входить в клетку и ингибировать ДНК гиразу. Для создания каждого мутанта мы проводили ПЦР с мутагенными праймерами, амплифицируя всю плазмиду pUC-mcbA. Всего было получено 9 мутантов (Рис. 6).
Минимальный фрагмент микроцина, который удалось получить таким образом, содержал гетероциклов (McB 1-59). Более короткие фрагменты не детектировались на хроматограмме и масс-спектрометрически. У всех протестированных веществ за исключением варианта 1- антибактериальная активность in vivo практически отсутствовала;
у мутанта 1- антибактериальная активность детектировалась, но была снижена по сравнению с исходным веществом. Потеря антибактериальной активности могло быть связана с нарушением способности мутантов проникать внутрь клеток через специфичный транспортер SbmA. Для проверки этого предположения оценивалась способность микроцинов ингибировать репликацию ДНК по включению радиоактивной метки в пермеабилизованных клетках E. coli.
Результаты этого опыта приведены на рис. 7. Единственным укороченным вариантом микроцина, способным ингибировать репликацию ДНК наравне с исходным веществом, является самый длинный вариант 1-68. Таким образом, отсутствие антибактериальной активности у большинства укороченных вариантов микроцина является следствием нарушения способности мутантов ингибировать ДНК-гиразу. При этом снижение антибактериальной активности мутанта 1-68 in vivo является доказательством того, что последняя аминокислота микроцина необходима для попадания вещества в клетки.
McB MELKASEFGVVLSVDALKLSRQSPLGVGIGGGGGGGGGGSCGGQGGGCGGCSNGCSGGNGGSGGSGSHI McB 1-68 MELKASEFGVVLSVDALKLSRQSPLGVGIGGGGGGGGGGSCGGQGGGCGGCSNGCSGGNGGSGGSGSH McB 1-67 MELKASEFGVVLSVDALKLSRQSPLGVGIGGGGGGGGGGSCGGQGGGCGGCSNGCSGGNGGSGGSGS McB 1-63 MELKASEFGVVLSVDALKLSRQSPLGVGIGGGGGGGGGGSCGGQGGGCGGCSNGCSGGNGGSG McB 1-60 MELKASEFGVVLSVDALKLSRQSPLGVGIGGGGGGGGGGSCGGQGGGCGGCSNGCSGGNG McB 1-59 MELKASEFGVVLSVDALKLSRQSPLGVGIGGGGGGGGGGSCGGQGGGCGGCSNGCSGGN McB 1-58 MELKASEFGVVLSVDALKLSRQSPLGVGIGGGGGGGGGGSCGGQGGGCGGCSNGCSGG McB 1-57 MELKASEFGVVLSVDALKLSRQSPLGVGIGGGGGGGGGGSCGGQGGGCGGCSNGCSG McB 1-55G M E L K A S E F G V V L S V D A L K L S R Q S P L G V G I G G G G G G G G G G S C G G Q G G G C G G C S N G C G McB 1-54 MELKASEFGVVLSVDALKLSRQSPLGVGIGGGGGGGGGGSCGGQGGGCGGCSNGC Рис. 6. С-концевые мутанты микроцина.
Ингибирование синтеза ДНК в пермеабилизованных DSbmA клетках, обработанных микроцином дикого типа и укороченными микроцинами 10, 9, Включение a - P-dATP (ед.) 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0, 0 15 30 Время (мин.) McB wt McB 1-68 McB 1-67 McB 1-63HI McB1-63 McB 1- Рис. 7. Ингибирование репликации ДНК укороченными с С-конца микроцинами.
III. ВЫВОДЫ 1. Обнаружены новые природные варианты микроцина Б, содержащие сложноэфирные связи.
2. Показано, что остатки серина в составе трипептидов Gly-Cys-Ser в составе микроцина Б подвергаются ранее неизвестной для данного вещества модификации – N-O пептидильному сдвигу.
3. Систематически проанализировано влияние мутаций в двойных гетероциклах на продукцию и антимикробную активность микроцина Б.
4. Продемонстрировано, что в процессе гетероциклизации остатков Ser и Cys могут участвовать карбонильные атомы аминокислотных остатков, отличных от Gly.
5. Определены минимальные фрагменты микроцина Б, способные проникать в клетки и способные ингибировать ДНК-гиразу.
IV. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Публикации в журналах 1. Ghilarov D., Serebryakova M., Shkundina I. and Severinov K. A major portion of DNA gyrase inhibitor microcin B undergoes an N,O-peptidyl shift during synthesis. J Biol Chem, 2011, 286, 26308-26318.
Тезисы докладов международных конференций 1. Ghilarov D., Serebryakova M., Shkundina I, Severinov K. A major portion of DNA gyrase inhibitor microcin B undergoes an N,O-peptidyl shift during synthesis.
Abstract
book of the 36th FEBS Congress, pp, Turin, Italy, June 25-30, 2011.
2. I. Shkundina, D. Ghilarov, A. Ershov, G. Pashvikina, and K. Severinov. Structure-function analysis of Microcin B17. The New Armenian Medical Journal 4 (1), pp 130-131 – Abstracts of the International Congress of Young Scientists, April 13-14, 2010, Yerevan, Armenia.
3. Д.А.Гиляров, Г.В. Пашвыкина, А.Н. Ершов, И.С. Шкундина. Структурно функциональный анализ пептидного антибиотика микроцина B17. Сборник тезисов докладов участников Второго международного конкурса научных работ молодых ученых в рамках международного форума по нанотехнологиям Rusnanotech 2009, 6- октября 2009. Секция 17 «Биологические молекулярные машины», стр. 3-5.
4. I. Shkundina, D. Ghilarov, A. Ershov, and K. Severinov. Structure-function analysis of Microcin B17. Late Abstract Book of the 34th FEBS Congress, pp 58-59, Prague, Chezh Republic, July 4-9, 2009.
5. I. Shkundina, D. Ghilarov, A. Ershov, and K. Severinov. Structure-function analysis of Microcin B17. Compact disc of FEMS 2009, 3rd Congress of European Microbiologists, Gothenburg, Sweden, June 28-July 2, 2009.
6. Гиляров Д. А., Пашвыкина Г. В., Шкундина И. С. Создание новых эффективных ингибиторов ДНК-топоизомераз с помощью молекулярной машины процессинга промикроцина B. Сборник тезисов докладов участников международного конкурса научных работ молодых ученых в рамках международного форума по нанотехнологиям Rusnanotech 2008, 3-5 декабря 2008. Секция 8 «Биологические молекулярные машины».
7. I. Shkundina, D. Ghilarov, and K. Severinov. Mutational analysis of Microcin B17. Abstract book of the Conference “DNA Topoisomerases in biology and medicine”, Norwich, United Kingdom, July 20-24, 2008.