Анализ специфичности расщепления днк ультразвуком

На правах рукописи

Нечипуренко Дмитрий Юрьевич

АНАЛИЗ СПЕЦИФИЧНОСТИ РАСЩЕПЛЕНИЯ ДНК

УЛЬТРАЗВУКОМ

03.01.02 - Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата физико-математических наук

Москва 2010

Работа выполнена на кафедре биофизики физического факультета

МГУ им. М.В. Ломоносова

Научный руководитель: доктор физико-математических наук, профессор В.А. Твердислов

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук, профессор Р.Г. Ефремов;

доктор физико-математических наук, профессор В.А. Намиот.

Ведущая организация:

Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Защита диссертации состоится 24 февраля 2011 г. в 14-00 на заседании диссертационного совета Д 501.001.96 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу:

119991, Москва Ленинские горы, МГУ, биологический факультет, кафедра биофизики, аудитория «Новая».

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ им. Ломоносова.

Автореферат разослан декабря 2010 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета Д 501.001. кандидат биологических наук, с.н.с. М.Г. Страховская

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы В процессах функционирования ДНК в живой клетке существенную роль играют взаимодействия ДНК с белковыми комплексами и другими лигандами. Эти взаимодействия, как правило, реализуется по принципу «узнавания» молекулами - лигандами определенных сайтов молекулы ДНК.

Среди множества видов ДНК - белкового узнавания выделяют два принципиально различных типа – это так называемое «прямое» и «непрямое» узнавание. В случае «прямого» узнавания белок распознает определенную последовательность пар оснований ДНК, образуя с их заряженными группами сеть контактов, присущую только данной конкретной последовательности нуклеотидов и соответствующую геометрии белковой молекулы. В случае же «непрямого» узнавания избирательность связывания белковой молекулы с ДНК определяется локальными и зависящими от нуклеотидной последовательности конформационно-динамическими характеристиками ДНК – такими как гибкость, термодинамическая стабильность двойной спирали, е геометрия, подвижность определенных молекулярных групп и т.п.

Таким образом, зависимость локальных конформационно динамических свойств от последовательности пар оснований в ДНК играет важнейшую роль при функционировании молекулы ДНК в клетке. Поэтому, изучение контекстно-зависимых конформационных и динамических свойств молекулы ДНК является одной из важнейших задач молекулярной биофизики.

Существует ряд экспериментальных подходов к изучению структурных свойств молекулы ДНК. Для исследования влияния последовательности нуклеотидов на конформацию ДНК применяются методы рентгеноструктурного анализа, ЯМР, и ИК - спектроскопии.

Экспериментальные данные о гибкости молекулы ДНК получают при помощи анализа е расщепления неспецифичными эндонуклеазами, а изменения геометрии малой бороздки двойной спирали вдоль ДНК изучают методами химического расщепления молекулы гидроксильными радикалами и другими химическими агентами.

При помощи перечисленных экспериментальных методик достаточно сложно извлечь информацию о динамических характеристиках изучаемых фрагментов ДНК. Здесь на помощь приходят методы молекулярного моделирования: молекулярная динамика, метод Монте-Карло, а также квантово-химические расчеты.

В Институте молекулярной биологии РАН в настоящее время развивается новый экспериментальный метод, позволяющий изучать конформационно-динамические свойства двойной спирали ДНК.

Метод основан на анализе картин расщепления фрагментов ДНК под действием ультразвука высокой интенсивности. Контекстная специфичность расщепления, то есть зависимость профилей ультразвукового расщепления фрагментов ДНК от их нуклеотидной последовательности, позволяет изучать влияние последовательности пар оснований в ДНК на ее структурные свойства в масштабах от нескольких десятков до сотен нуклеотидов.

Явление контекстной специфичности разрывов ДНК под действием ультразвука представляет несомненный научный интерес как дополнительный источник информации о контекстно-зависимых характеристиках ДНК. Тем не менее, физика этого явления практически не изучена, что вызывает серьезные трудности при попытке интерпретации полученных результатов, а также ставит под сомнение возможность их практического применения.

Анализ и моделирование расщепления ДНК ультразвуком, которым посвящена данная работа, необходимы для более глубокого исследования физики этого процесса с целью дальнейшего применения и развития основанной на этом явлении методе изучения конформационно-динамических свойств ДНК.

Цели и задачи диссертационной работы Целью данного исследования являлось выявление основных закономерностей процесса расщепления ДНК под действием ультразвука, разработка физических моделей, адекватно описывающих характерные особенности этого явления и применение полученных данных по расщеплению ДНК для анализа функциональных участков ДНК человека. Для достижения этих целей решались следующие основные задачи:

- установить характерные особенности расщепления ДНК ультразвуком;

- провести анализ контекстной специфичности расщепления;

- разработать модель, описывающую процесс расщепления фрагментов ДНК;

- сравнить полученные теоретические результаты с экспериментальными;

- разработать модель, качественно описывающую явление контекстной специфичности расщепления ДНК ультразвуком.

- исследовать особенности теоретических профилей ультразвукового расщепления, построенных для промоторных последовательностей ДНК человека.

На защиту выносятся следующие положения и результаты:

- получены относительные частоты ультразвукового расщепления фрагментов ДНК в ди- и тетрануклеотидном приближении;

- выявлено увеличение степени ультразвукового расщепления фосфодиэфирной связи, следующей за дезоксицитозином (в направлении от 5’ к 3’ концу фрагмента ДНК);

- предложен подход к моделированию процесса расщепления ДНК под действием кавитационных эффектов, который позволяет описать характерные особенности наблюдаемого расщепления;

- разработана модель, позволяющая качественно описать явление контекстной специфичности ультразвукового расщепления;

- продемонстрирована возможность применения полученных относительных частот ультразвукового расщепления для анализа промоторных участков ДНК человека.

Апробация результатов диссертационной работы По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ, из них статей в рецензируемых научных журналах ВАК России:

« Биофизика », « Журнал Структурной Химии », « Обозрение прикладной и промышленной математики », « Journal of Biomolecular Structure & Dynamics », « In collection: NATO Science for Peace and Security Series B: Physics and Biophysics, Nanomaterials for Application in Medicine and Biology », « Biophysical Journal ».

Основные результаты исследований, представленные в диссертационной работе, докладывались на следующих международных и российских конференциях:

13-ой международной конференции «Математика, компьютер, образование. (Дубна 2006), 15-ой международной конференции «Математика, компьютер, образование (Дубна, 2008), 17 -ой международной конференции «Математика, компьютер, образование»

(Дубна, 2010) и 15-ом Симпозиуме по межмолекулярному взаимодействию и конформациям молекул (Петрозаводск, 2010), The second Saint-Petersburg International Conference on NanoBio Technologies, (NanoBio' 08, Санкт Петербург, Россия, 2008), 7th EBSA European Biophysics Congress, (EBSA, Генуя, Италия, 2009), Solvation and Ionic Effects in Biomolecules: Theory to Experiment, (Цахкадзор, Армения, 2010).

Список опубликованных статей по теме диссертации приведен в конце настоящего автореферата.

Научная новизна и практическая значимость работы Все представленные выше результаты получены впервые.

Предложенный подход к моделированию расщепления ДНК под действием ультразвука высокой интенсивности позволяет описать характерные особенности ультразвукового расщепления ДНК.

Выявленная корреляция относительных частот ультразвукового расщепления с имеющимися в литературе данными о конформационной подвижности дезоксирибозы позволяет построить модель, качественно описывающую явление контекстной специфичности расщепления ДНК. В соответствии с предложенной моделью, различие в относительных степенях ультразвукового расщепления является следствием отличия конформационной динамики дезоксирибозных групп сахарофосфатного остова ДНК.

Таким образом, относительные частоты ультразвукового расщепления, по всей видимости, позволяют описывать влияние нуклеотидной последовательности ДНК на подвижность определенных участков сахарофосфатного остова. Полученные результаты могут быть использованы для выявления функциональных сайтов ДНК при анализе геномных последовательностей.

Личный вклад автора Все результаты оригинальных теоретических исследований получены лично автором, либо при его непосредственном участии.

Экспериментальные результаты были получены в лаборатории ДНК белковых взаимодействий Института молекулярной биологии им. В.А.

Энгельгардта РАН к.х.н. С.Л. Гроховским.

Структура и объем диссертации Диссертационная работа состоит из введения, пяти глав и заключения.

Каждая глава снабжена краткой аннотацией, состоит из нескольких разделов и заключения. В конце работы приведены список публикаций автора по теме диссертации и библиографический список используемой литературы. Полный объем диссертационной работы составляет страниц, включая 30 рисунков.

Благодарности Автор выражает благодарность к.х.н. Гроховскому С.Л., к.ф.-м.н.

Ильичевой И.А., д.ф.-м.н. Полозову Р.В. и д.ф.-м.н. Нечипуренко Ю.Д.

за внимание и постоянную помощь в работе, а также к.т.н. Панченко Л.А. за участие в проведении статистического анализа, д.ф.-м.н., профессору Твердислову В.А. и к.ф.-м.н. Есиповой Н.Г. за ценное обсуждение результатов работы.

Краткое содержание диссертации Во Введении дано обоснование темы диссертационной работы, сформулированы цели и направление исследований;

показана актуальность рассматриваемой проблемы, а также научная новизна полученных результатов и их практическая значимость;

сформулированы основные положения, выносимые на защиту. Также приведена структура диссертации и кратко изложено ее содержание по главам.

Глава 1 посвящена обзору литературы в области физики ДНК и воздействия ультразвука на молекулы полимеров. В разделе 1. приведено краткое рассмотрение существующих подходов к исследованию конформационно-динамических свойств ДНК. В разделе 1.2 приведены результаты экспериментальных исследований механических свойств единичных молекул ДНК, а также дается обзор моделей, используемых для описания различных режимов упругого растяжения ДНК. В разделе 1.3 дается обзор существующих представлений о воздействии ультразвука высокой интенсивности на полимеры, в том числе на молекулы ДНК.

Во второй главе представлены основные результаты анализа экспериментальных данных по расщеплению ДНК ультразвуком.

Кратко изложена методика проведения эксперимента, описана процедура обработки данных.

Раздел 2.1 посвящен описанию как экспериментальной методики расщепления ДНК ультразвуком, так и теоретических методов анализа результатов эксперимента.

Описываемая методика основана на гелевом электрофорезе, позволяющим получать профили ультразвукового расщепления ДНК.

На Рис.1 приведено характерное изображение, получаемое при помощи гелевого электрофореза облученных ультразвуком фрагментов ДНК.

В результате оцифровки получаемых изображений, а также их последующей компьютерной обработки, были получены профили ультразвукового расщепления. Соотнесение последовательности полос на геле с соответствующей нуклеотидной последовательностью (для этого используются данные по химическому расщеплению) позволяет количественно описывать особенности ультразвукового расщепления фрагментов ДНК.

На Рис.2. приводятся характерные профили ультразвукового расщепления, полученные в результате обработки отдельной дорожки геля, изображенного на Рис.1.

Рис.1. Изображение геля, полученного в результате электрофореза облученных ультразвуком меченых фрагментов ДНК различной начальной длины. Дорожки 2 - соответствуют облучению двунитевых фрагментов ДНК длиной 311 пар оснований при различных временах облучения. Дорожки 7- соответствуют облучению фрагментов длиной в 251 пару оснований, а дорожки 13-17 – облучению фрагментов длиной 218 нуклеотидных пар.

Дорожки 1 и 18 соответствуют химическому расщеплению фрагментов ДНК по пуринам.

Каждая полоса на геле соответствует фрагментам ДНК определенной длины, образованным в результате разрыва первоначального фрагмента по соответствующей фосфодиэфирной связи.

Интенсивность засветки изображения полосы на экране, то есть степень ее «почернения», считается пропорциональной концентрации соответствующих фрагментов.

In Rn 31 n I k k n Рис.2. Профили ультразвукового расщепления, полученные в результате обработки дорожки 17 на геле, приведенном на Рис 1. Высота столбца пропорциональна концентрации соответствующих ему фрагментов ДНК, а его цвет соответствует типу нуклеотида, за которым происходит разрыв (в направлении от 5’ к 3’ концу цепи, содержащей метку). Нижняя диаграмма получена путем нормировки начальных данных с целью минимизации позиционного эффекта, наблюдаемого на первой диаграмме. Нормировка производилась путем деления интенсивности каждой полосы на локальную среднюю величину интенсивности расщепления – формула приведена на рисунке. Величины R далее называются относительными частотами ультразвукового расщепления.

Представленные профили демонстрируют специфичность ультразвукового расщепления к последовательности пар оснований ДНК: большинство пиков, явно выделяющихся на общем фоне, соответствуют расщеплению фрагментов по фосфодиэфирным связям, следующим за цитозином (в направлении от 5’ к 3’ концу соответствующей цепи двунитевого фрагмента) и говорят об увеличении вероятности расщепления ДНК в этих участках.

В разделе 2.2 приведены результаты исследования характерных свойств ультразвукового расщепления ДНК.

Под характерными свойствами ультразвукового расщепления здесь и далее понимаются основные закономерности изменения частоты расщепления вдоль фрагмента ДНК, а также зависимость общего уровня расщепления от условий проведения эксперимента.

Исследование таких свойств позволяет сделать определнные выводы о механизме расщепления фраментов ДНК под действием ультразвука.

Ниже приведены характерные свойства наблюдаемого расщепления:

уменьшение частоты расщепления на концах фрагмента;

увеличение общего уровня расщепления при увеличении длины облучаемых фрагментов;

увеличение общего уровня расщепления при увеличении вязкости раствора;

уменьшение общего уровня расщепления при увеличении температуры;

добавление соединений, способствующих нейтрализации свободных радикалов, не оказывает влияния на наблюдаемые картины расщепления ДНК.

Указанные свойства свидетельствуют о механохимической природе наблюдаемого разрыва фрагментов ДНК. Результаты данного раздела используются в Главе 3 диссертации при построении модели расщепления ДНК.

В разделе 2.3. приведены результаты анализа большого массива экспериментальных данных по расщеплению ДНК ультразвуком.

Целью проведенного анализа является статистическое описание эффекта контекстной специфичности расщепления при помощи ди- и тетрануклеотидных приближений.

Результаты анализа, проведенного в динуклеотидном приближении (то есть в случае параметризации относительных частот ультразвукового расщепления шестнадцатью типами возможных динуклеотидов, в которых происходит расщепление) демонстрируют статистически значимое увеличение относительной частоты ультразвукового расщепления ДНК по фосфодиэфирным связям, следующим за цитозином, в частности – существенное увеличение частоты расщепления межнуклеотидной связи в 5’-CpG-3’ динуклеотиде (см.

Рис.3).

Рис.3. Средние относительные частоты ультразвукового расщепления ДНК ( R ) для 16 возможных динуклеотидов.

Для каждого из 16 динуклеотидов было исследовано влияние ближайших нуклеотидов на относительную частоту ультразвукового расщепления. Для этого был проведен анализ специфичности расщепления в тетрануклеотидном приближении и получен массив, содержащий 256 средних выборочных значений ультразвукового расщепления центральной фосфодиэфирной связи всех тетрануклеотидов.

На Рис.4 приведены средние значения относительных частот расщепления для 64 тетрануклеотидов, типа 5’-N1 C2 * N3 N4-3’, в которых расщепление происходит между нуклеотидом C2 и N3.

Рис.4. Средние относительные частоты ультразвукового расщепления ДНК ( R ) для 64 возможных тетрануклеотидов типа 5’-N1 C2 * N3 N4-3’ (звездочкой обозначено место разрыва). Небольшой сдвиг некоторых точек по оси асбцисс произведен для удобства представления результатов.

Статистический анализ показал, что влияние фланкирующих (то есть ближайших по цепи) нуклеотидов на величину относительной частоты ультразвукового расщепления ДНК является значимым для всех динуклеотидов, причем как видно из рисунка 4, это влияние модулируется типами фланкирующих нуклеотидов схожим образом для различных динуклеотидов.

Третья глава диссертации посвящена моделированию процессов, приводящих к расщеплению молекулы ДНК под действием ультразвука.

Раздел 3.1 посвящен моделированию гидродинамических процессов, связанных с явлением кавитации в растворе, подверженном воздействию ультразвука.

В настоящее время считается, что разрывы молекул полимеров под действием ультразвука происходят в результате их взаимодействия с высокоградиентными течениями жидкости, вызванными кавитационными явлениями в облучаемом растворе. Общепринятой является следующая модель расщепления: при схлопывании кавитационного пузырька возникает сильный радиальный градиент скорости течения жидкости, который приводит к растяжению полимера и, в конечном итоге, к его расщеплению (Рис.5).

Рис.5.

Иллюстрация к гидродинамической модели расщепления полимеров под действием ультразвука.

Для определения величин градиентов скорости течения жидкости, возникающих вблизи кавитационных пузырьков, было проведено моделирование динамики кавитационного пузырька. Для этого использовалось уравнение Рэлея-Плессета:

2 4 dR d 2 R 3 dR R 2 Pi Po R R dt (1), 2 dt dt где R – радиус кавитационного пузырька, t – время, – плотность жидкости, – е поверхностное натяжение, – динамическая вязкость жидкости, Pi – давление газа внутри пузырька, а P0 - давление окружающей пузырек жидкости, складывающееся из атмосферного давления Pa и давления ультразвуковой волны: Po=Pa + Pu sin(t), где Pu – амплитуда колебаний давления, – циклическая частота колебаний, t – время.

Результаты численного интегрирования уравнения (1) использовались для расчета радиального градиента скорости течения жидкости в зависимости от расстояния до стенки пузырька и времени:

V R 2 dR G (r, t ) 2 3 (2), r r dt где G – радиальный градиент скорости течения жидкости, V – радиальная скорость жидкости на расстоянии r от центра пузырька (rR). На рисунке 6 приведен результат расчтов градиента скорости течения жидкости на стадии схлопывания.

Рис.6. Зависимость радиального градиента скорости течения жидкости G вблизи кавитационного пузырька на стадии схлопывания от расстояния до поверхности пузырька d и времени t.

В разделе 3.2 полученные значения градиентов скоростей течения жидкости использовались для вычисления силовых профилей деформации молекулы – то есть для определения характера изменения силы растяжения вдоль полимера. Для этого была использована следующая модель: фрагмент ДНК представлялся системой шариков определенного гидродинамического радиуса, связанных пружинами определенной жесткости.

Сила взаимодействия каждого звена такой модельной системы с жидкостью определялась в соответствии с законом Стокса:

F 6rV (3), F где – сила взаимодействия, r - гидродинамический радиус шарика V (принятый равным 1 нм), – скорость шарика относительно жидкости, – динамическая вязкость жидкости. Динамика фрагмента ДНК рассчитывалась численным интегрированием уравнений движений Ньютона в случае одномерного движения фрагмента в жидкости с постоянным значением градиента скорости течения. Таким образом, были получены профили сил растяжения фрагмента для различных значений градиентов скорости течения. На Рис. представлены результаты расчетов.

Рис.7. Зависимость силы растяжения F звена модельной системы от его положения вдоль цепи i. Приведены данные расчетов для трех значений градиента скорости течения жидкости G.

В разделе 3.3 результаты предыдущих вычислений использовались для исследования кинетики расщепления фрагментов ДНК на основании общепринятого подхода к описанию механохимических реакций.

При растяжении химических связей частота их разрывов k (то есть вероятность разрыва за единицу времени) может быть выражена уравнением аналогичным уравнению Аррениуса, в котором от энергии активации разрыва связи отнимается энергия, связанная с действием постоянной силы вдоль условной координаты реакции.

Модифицированное уравнение имеет следующий вид:

E(F ) k k0e RT (4), где k - скорость реакции при наличии «катализирующей» силы F, k0 – скорость реакции в отсутствие действия силы, E – энергия, равная работе постоянной силы F, совершаемой при изменении координаты реакции, R – универсальная газовая постоянная, T – абсолютная температура. Уравнение (4) позволяет оценить долю разорванных по i ому звену фрагментов за один цикл схлопывания кавитационного пузырька, так как последняя может быть выражена следующим образом:

E* E ( fi ( G ( r,t ))) 4r 2 n(r, t ) ( f (G (r, t ))) Ae dtdr RT (5), k i отн t,r 4r n (r )dr r где n – концентрация фрагментов ДНК, r – расстояние до центра пузырька, – фактор ориентации (01), fi – сила растяжения i-ого звена цепи, G – градиент радиальной скорости жидкости, A – предэкспоненциальный фактор уравнения Аррениуса, E* - барьер реакции разрыва фосфодиэфирной связи. Для каждого момента времени интегрирование ведется по области пространства, окружающей пузырек. Рассматривается временной промежуток, соответствующий схлопыванию пузырька до некоторого критического размера. Ниже приведены результаты вычисления для простейшего случая, когда концентрация фрагментов и температура считаются постоянными, ориентационный фактор принят равным единице, а параметры, входящие в модифицированное уравнение Аррениуса, соответствуют реакции гидролиза фосфодиэфирной связи.

Рис.8. Сравнение теоретического профиля относительных скоростей разрыва звеньев модельной системы с экспериментальных профилем расщепления ДНК ультразвуком.

В разделе также приводится анализ абсолютных значений скорости расщепления модельных фрагментов и их соотношение с экспериментальными данными.

В Главе 4 на основании экспериментальных данных по специфичности расщепления ДНК ультразвуком, а также известных особенностей конформационно-динамических параметров двойной спирали ДНК, предложен подход, позволяющий объяснить наблюдаемое явление специфичного расщепления ДНК.

В разделе 4.1 результаты, полученные при анализе специфичности расщепления ДНК, сравниваются с имеющимися в литературе данными о конформационной динамике ДНК.

Показано, что увеличение относительной частоты расщепления фосфодиэфирной связи, соединяющий цитозин со следующим по цепи нуклеотидом, по всей видимости, связано с особенностью конформационной динамики дезоксирибозы цитозина. Известно, что сахарный цикл цитозина в большей степени подвержен конформационным S N переходам, чем дезоксирибозы других нуклеотидов.

Проведенный анализ кристаллографических структур ДНК показывает, что в N (то есть C3’ эндо) конформации С3’-O3’ связь, которая подвергается разрыву при облучении фрагментов ДНК ультразвуком, расположена под меньшим углом к оси спирали, чем в S (то есть С2’ эндо) конформации, свойственной B форме ДНК (см. рис.9).

Рис.9 Расположение фосфодиэфирной связи по отношению к оси спирали ДНК в случае C2’ эндо и С3’ эндо конформации дезоксирибозы.

С3’ эндо конформация изображена менее ярко. Ось z – ось двойной спирали ДНК.

В разделе 4.2 описывается математическая модель, основанная на выводах раздела 4.1 и качественно описывающая эффект контекстной зависимости расщепления. Основная идея предложенной модели заключается в том, что при наличии растягивающего усилия, направленного вдоль фрагмента ДНК, уменьшение угла между направлением химической связи и осью спирали приводит к увеличению энергии деформации этой связи. В свою очередь, это приводит к уменьшению энергетического барьера гидролиза, а значит, к увеличению скорости механохимической реакции. Таким образом, при увеличении конформационной подвижности дезоксирибозы увеличивается время пребывания сахарного цикла в N конформации, при которой вероятность осуществления механохимической реакции выше, а значит относительная частота расщепления увеличивается.

Глава 5 диссертации посвящена исследованию возможности применения полученных данных по расщеплению ДНК ультразвуком для анализа и выявления функциональных сайтов в геномных последовательностях.

В разделе 5.1 обсуждается связь полученных в результате анализа данных по специфичности рсщепления ДНК с некоторыми из описанных в литературе особенностей влияния последовательности нуклеотидов на конформационно-динамические свойства молекулы.

В разделе 5.2 приведен анализ теоретического ультразвукового расщепления промоторных областей генома человека при помощи полученных данных по специфичности расщепления ДНК.

Используя средние значения относительных частот расщепления, полученные в тетрануклеотидном приближении, были рассчитаны теоретические профили ультразвукового расщепления для последовательностей 648 промоторов генома человека (MYC кластер).

Последовательности были выравнены: рассматривались нуклеотидов до сайта старта транскрипции и 300 - после. Для каждой последовательности восстанавливался профиль относительных интенсивностей ультразвукового расщепления, после чего все профили складывались, и находился усредненный профиль расщепления. На Рис. 10 приведен суммарный профиль ультразвукового расщепления, полученный арифметическим усреднением 648 профилей.

Рис.10. Зависимость относительной частоты расщепления R от позиции разрыва вдоль цепи (n). Профиль получен усреднением профилей, рассчитанных для нуклеотидных последовательностей промоторных участков ДНК человека.

Из Рис. 10 видно, что рассматриваемая характеристика имеет явную аномалию в районе старта транскрипции (позиция n=0). Полученный профиль соответствует описанным в литературе результатам и отражает в среднем возрастающую к месту сайта старта транскрипции относительную встречаемость цитозинов и гуанинов в последовательности. Для того, чтобы нивелировать вклад этого фактора, была использована величина, которая характеризует влияние фланкирующих (то есть ближайших по цепи) нуклеотидов на ультразвуковое расщепление фосфодиэфирной связи в данном динуклеотиде:

R(N n-1 N n*N n1 N n 2 ) R(N n*N n1 ) Sn = (6), R(N n-1 N n*N n1 N n 2 ) здесь R(Nn-1Nn*Nn+1Nn+2) – средняя относительная частота расщепления центральной фосфодиэфирной связи тетрануклеотида Nn-1NnNn+1Nn+2, а R(Nn*Nn+1) - средняя относительная частота расщепления динуклеотида NnNn+1. Звездочка обозначает условное положение разрыва.

При Sn0 фланкирующие нуклеотиды приводят к уменьшению ультразвукового расщепления и, следовательно, к уменьшению подвижности сахарофосфатного остова, а при Sn0 – наоборот, - к увеличению ультразвукового расщепления по сравнению со средним значением для данного динуклеотида, а значит, к увеличению подвижности остова.

На рис. 11 представлен усредннный профиль, полученный аналогично предыдущему рисунку, но для величины Sn. Из Рис. 11 видно, что область до сайта старта транскрипции в среднем характеризуется величинами Sn0, причем переход к более высоким значениям Sn достигается на сравнительно небольшом участке – в области от 570 до 700 нуклеотида, после чего величины Sn принимают значения, близкие к нулевому.

Рис.11. Профиль, характеризующий изменение величины Sn вдоль молекулы ДНК, полученный усреднением 648 профилей, рассчитанных для нуклеотидных последовательностей промоторных участков генома человека.

Полученный результат позволяет предположить, что нуклеотиды в промотоных участках генома человека в среднем отобраны таким образом, что имеет место тенденция к уменьшению подвижности сахарофосфатного остова. Уменьшение подвижности промоторных участков ДНК может иметь своей целью увеличение доступности сайтов связывания для факторов, регулирующих экспрессию, так как по мере уменьшения гибкости участков ДНК, как известно, происходит уменьшение вероятности образования комплексов ДНК с гистонами.

Уменьшение гибкости и стабильности ДНК (по плавлению) в промоторных участках было описано различными авторами и активно используется в алгоритмах по предсказанию функциональных сайтов в геномных последовательностях. Эти алгоритмы, как правило, сводятся к построению профилей различных физико-химических параметров ДНК в рамках динуклеотидных приближений.

Проведенный в разделе 5.2 анализ свидетельствует о наличии эффектов последовательности в промоторных участках генома человека, проявляющихся на уровне тетрануклеотидного приближения, а также о возможности выявления этих эффектов при помощи полученных данных по ультразвуковому расщеплению фрагментов ДНК.

В заключении сформулированы основные результаты и выводы диссертационной работы, которые перечислены ниже:

1. Получены средние относительные частоты ультразвукового расщепления ДНК, описывающие зависимость вероятности расщепления сахарофосфатного остова от последовательности нуклеотидных пар в рамках ди- и тетрануклеотидного приближений.

2. Характер изменения частоты расщепления фосфодиэфирных связей от их положения в цепи фрагмента, а также специфика зависимости общего уровня расщепления ДНК от физико-химических параметров облучаемого раствора свидетельствуют о механохимической природе наблюдаемых разрывов в фрагментах ДНК под действием ультразвука.

3. Развит подход к моделированию расщепления фрагментов ДНК под действием кавитационных эффектов в облучаемом расстворе, на основе которого показано, что возникающие вблизи кавитационных пузырьков высокие градиенты скорости течения жидкости (порядка с-1) способны приводить к разрыву фрагментов ДНК длиной в несколько сотен нуклеотидных пар.

4. Предложена модель, качественно описывающая явление контекстной специфичности расщепления ДНК ультразвуком. В соответствии с разработанной моделью, наблюдаемое увеличение частоты расщепления фосфодиэфирной связи, примыкающей к дезоксицитидину, связано с особенностью конформационной динамики дизоксирибозы этого нуклеотида.

5. При помощи полученных статистических даных по ультразвуковому расщеплению ДНК показано, что в промоторных областях генов MYC- кластера человека, имеет место тенденция к уменьшению ультразвукового расщепления по сравнению с кодирующими областями.

Список публикаций по теме диссертации 1. Нечипуренко Ю.Д., Полозов Р.В., Нечипуренко Д.Ю., Ильичева И.А., Воробьев Е.А., Гроховский С.Л. и Гурский Г.В. Математические модели регуляции экспрессии генов: механические возмущения структуры ДНК. // Математика. Компьютер. Образование: Сб.

научных трудов. Том.2 / Под ред. Г.Ю.Ризниченко. - М.-Ижевск: НИЦ "Регулярная и хаотическая динамика". 2006, С. 392-402.

2. Yury Nechipurenko, Sergey Grokhovsky, Georgy Gursky, Dmitry Nechipurenko and Robert Polozov. DNA-Based Nanostructures: Changes of Mechanical Properties of DNA upon Ligand Binding. In collection: NATO Science for Peace and Security Series B: Physics and Biophysics, Nanomaterials for Application in Medicine and Biology, Springer. 2008, p.

59-67.

3. Гроховский С.Л., Ильичева И.А., Нечипуренко Д.Ю., Панченко Л.А., Полозов Р.В., Нечипуренко Ю.Д. Локальные неоднородности структуры и динамики двухспиральной ДНК: исследование при помощи ультразвука. Биофизика. 2008, Т.53, С. 417- 4. Ю.Д. Нечипуренко, М.В. Головкин, Д.Ю. Нечипуренко, И.А.

Ильичева, Л.А. Панченко, Полозов Р.В., Гроховский С.Л. Характерные особенности расщепления ДНК ультразвуком. Ж. структурной химии.

2009, Т. 50, № 5, С. 1040 – 1047.

5. I. A. Il'icheva, D. Yu. Nechipurenko, S. L. Grokhovsky Ultrasonic Cleavage of Nicked DNA J. of Biomolecular Structure & Dynamics. 2009, 27, № 3, P. 391-397.

6. И. А. Ильичева, Л. А. Панченко, Д. Ю. Нечипуренко, М. В.

Головкин, Ю. Д. Нечипуренко, Р.В.Полозов, С. Л Гроховский.

Позиционные эффекты и эффекты последовательности при ультразвуковом расщеплении ДНК. Обозрение прикладной и промышленной математики. 2009, Т. 16, вып. 4, С. 660- 7. D. Yu. Nechipurenko, I. A. Il'icheva, S. L. Grokhovsky. Ultrasonic Cleavage of Nicked DNA. (Abstracts of 7th EBSA Europian Biophysics Congress July 11-15 2009 Genova, Italy) Europian Biophysics J. 2009, 38, S1, P – 122.

8. Головкин М.В., Нечипуренко Д.Ю., Ильичева И.А., Панченко Л.А., Полозов Р.В., Гроховский С.Л. Нечипуренко Ю.Д. Математические методы анализа электрофоретических картин расщепления ДНК.

Компьютерные исследования и моделирование. 2009, Т.1, №3, С. 287– 9. Sergei L. Grokhovsky, Irina A. Il’icheva, Dmitry Yu. Nechipurenko, Michail V. Golovkin, Larisa A. Panchenko, Robert V. Polozov and Yury D.

Nechipurenko. Sequence-Specific Ultrasonic Cleavage of DNA. Biophysical Journal. 2011,V.100.1-