Татьяна николаевна изучение структурной организации и полиморфизма микросателлитных локусов у партеногенетической ящерицы darevskia unisexualis.
На правах рукописи
УДК 577.21:598.112
Бадаева Татьяна Николаевна
Изучение структурной организации и полиморфизма
микросателлитных локусов у партеногенетической ящерицы
Darevskia unisexualis.
Специальность 03.00.26 – «молекулярная генетика»
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва 2008
Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биологии гена РАН, лаборатории организации генома
Научный руководитель:
Доктор биологических наук, профессор, член-корреспондент РАН Рысков А.П.
Официальные оппоненты:
Доктор биологических наук, профессор Крамеров Д.А.
Доктор биологических наук, профессор Сулимова Г.Е.
Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН
Защита диссертации состоится “22” октября 2008 года в 11 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.037.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биологии гена РАН по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова 34/5.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва В-334, ул. Вавилова 32.
Автореферат разослан “22” сентября 2008 года.
Ученый секретарь Диссертационного совета канд. фарм. наук Грабовская Л.С.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Партеногенетические позвоночные благодаря особенностям системы размножения образуют линии генетически идентичных животных и поэтому являются уникальными модельными организмами для экологических, эволюционных и молекулярно-генетических исследований. В частности, они могут быть использованы для изучения генетической нестабильности гипервариабельных ДНК, причин и механизмов, приводящих к ее появлению. Для большинства однополых позвоночных установлено, что они возникают в результате межвидовой гибридизации, изменяющей цитологические механизмы репродукции [Dawley, 1989;
Vrigenhoek, 1994]. Их популяции состоят из самок, размножающихся клонально. Даули [Dawley, 1989] сформулировал две наиболее важные проблемы в исследовании клональных видов позвоночных: (1) выяснение цитологических механизмов клонального размножения и (2) определение причин внутри и межпопуляционного клонального разнообразия.
Кавказские скальные ящерицы рода Darevskia представлены в Закавказье и соседних районах Турции 18 бисексуальными и 7 партеногенетическими видами.
Все партеногенетические виды этого рода имеют гибридное происхождение, характеризуются диплоидным набором хромосом, невысоким уровнем гетерозиготности аллозимных локусов [Fu et al., 1998] и незначительной вариабельностью сайтов рестрикции митохондриальной ДНК [Moritz et al., 1992].
Проведенные ранее ДНК-фингерпринтные исследования ящериц рода Darevskia выявили значительный уровень популяционной неоднородности особей по отдельным микросателлитным маркерам ДНК [Кан и др., 1998;
Токарская и др., 2000].
Популяционной разнообразие однополых видов принято объяснять мутациями, множественным гибридным происхождением и возможной незаконной рекомбинацией [Parker and Selander, 1976;
Parker, 1979;
Cole et al., 1988;
Moritz et al., 1989;
Fu et al., 2000]. Однако степень влияния каждого из этих факторов на уровень генетической вариабельности остается неясным. Более того, практически нет данных о природе мутаций и их вкладе в геномное и клональное разнообразие однополых позвоночных. Наиболее простой путь для выявления мутационной составляющей - это прямое изучение мутационных событий в родословных, например при сравнении геномов матери и потомков. ДНК фингерпринтный анализ семей партеногенетических ящериц показал, что в геноме D. unisexualis и D. armeniaca существуют нестабильные локусы, изменчивость в которых приводит к разнообразию ДНК-фингерпринтных фенотипов у потомков и в популяциях [Токарская и др., 2003, Malysheva et al., 2007]. Однако что лежит в основе наблюдаемых изменений – мутации в сайтах рестрикции, изменение длины микросателлитного кластера или мутации в участках ДНК, прилежащих к микросателлитному кластеру, остается неясным.
Поэтому необходимо проведение молекулярно-генетических исследований индивидуальных микросателлитсодержащих локусов в популяционных и семейных образцах ДНК, что позволит определить структуру аллельных вариантов локусов, молекулярную природу и механизмы возникновения микросателлитных мутаций у клонально размножающихся животных.
Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы является изучение структурной организации и полиморфизма микросателлитных локусов генома, поиск и характеристика мутаций по этим локусам у партеногенетических ящериц Darevskia unisexualis и D. armeniaca, а также у ряда двуполых видов рода Darevskia. Для выполнения этой работы были поставлены следующие задачи:
1. Выделение и характеристика рекомбинантных клонов, содержащих (GATA)n, (TCC)n и (TCT)n микросателлиты, из геномной библиотеки D.unisexualis.
2. Молекулярно-генетический анализ микросателлитсодержащих локусов у D.unisexualis и двуполых родительских видов D. (raddei) nairensis и D.valentini.
3. Поиск и характеристика de-novo мутаций полиморфных локусов на больших выборках семейных образцов D.unisexualis и D. armeniaca.
4. Молекулярно-генетическая характеристика и сравнительный анализ вариабельных микросателлитсодержащих локусов у ряда представителей двуполых видов рода Darevskia.
Научная новизна работы. Впервые показано существование супернестабильного микросателлитного локуса, содержащего (GATA)n, в геноме клонально размножающихся ящериц D. unisexualis. Впервые выявлена и определена молекулярная структура мутантных аллелей супернестабильного локуса у партеногенетических потомков первого поколения D. unisexualis. Тем самым получены прямые свидетельства о вкладе и характере мутационных событий в геномное и клональное разнообразие однополых популяций позвоночных. Впервые на молекулярном уровне получены данные о межвидовой изменчивости ряда микросателлитных локусов у однополых и двуполых ящериц рода Darevskia.
Практическое значение работы. Полученные результаты важны для понимания факторов, определяющих геномное и клональное разнообразие однополых популяций. Работа вносит важный вклад в современные представления о геномной нестабильности и характере мутационной изменчивости микросателлитных локусов у клональных видов позвоночных. В практическом отношении важны данные о молекулярной структуре индивидуальных локусов в исследованных геномах однополых и двуполых ящериц, которые могут быть использованы для целей геномного маркирования, определения филогенетических связей, реконструкции эволюционных событий у представителей рода Darevskia. Кроме того, эти данные могут быть использованы в курсах лекций по молекулярной генетике и эволюционной биологии для студентов биологических специальностей высших учебных заведений.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на следующих конференциях: International conference «The Biology of Genomes» (Cold Spring Harbor USA, 2007), 14th European Congress of Herpetology (Porto Portugal, 2007), XVII зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2005), International conference «Modern problems of genetics, radiobiology, radioecology and evolution»
(Yerevan Armenia, 2005), 9th evolutionary meeting at Marseilles (Marseille France, 2005).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ из них 6 статей и 8 тезисов докладов и материалов конференций.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 126 страницах и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения результатов, выводов, списка литературы (218 источников) и раздела благодарностей. Работа включает 3 таблицы и 47 рисунков.
РЕЗУЛЬТАТЫ 1. Изучение структурной организации и полиморфизма микросателлит содержащих локусов у D. unisexualis и двуполых родительских видов D.
(raddei) nairensis и D. valentini.
1.1 Получение и молекулярная характеристика рекомбинантных клонов партеновида содержащих микросателлитные D. unisexualis, кластеры.
В работе была использована ранее созданная геномная клонотека партеновида D. unisexualis [Корчагин и др., 2004a,b]. Из нее были отобрано клона, содержащие (GATA)-последовательность, 1 клон – (ТСТ) и 1 клон – (TCC) последовательность. Клоны были секвенированы, к ним подобраны специфичные пары праймеров для выявления аллельных вариантов с помощью ПЦР.
1.2 Анализ популяций D. unisexualis по локусам Du47, Du418, Du161, Du222 и Du334.
Всего было изучено особей из различных популяций.
ПЦР анализ показал, что (GATA) содержащие локусы представлены электрофоретически (ЭФ) разли чающимися аллелями (рисунок 1).
Локусы, содержащие ТСТ и TCC, представлены только одним Рисунок 1. Электрофорез в ПААГ ПЦР продуктов локусов Du418 (а) Du47 (b) и Du 161 (с) ПЦР продуктом (рисунок 2).
особей D. unisexualis из разных популяций.
Практически все исследованные Стрелками обозначены аллельные варианты.
Маркеры молекулярного веса 100 bp+ Ladder особи не вариабельны, только по “Fermentas” с 100 п.н.
локусу Du 161 найдена одна отличная от других особь. Таким образом, все исследованные локусы оказались мономорфны в исследованных популяционных выборках, а три из них (Du47, Рисунок 2. Электрофорез в 8%-ном ПААГ ПЦР- Du418 и Du161) представлены ЭФ продуктов локусов Du334 (а) и Du222 (b) различных популяций D. unisexualis. Маркеры различающимися аллелями. Затем молекулярного веса 50 bp Ladder “Fermentas” с шагом был изучен аллельный полимор 50 п.н.
физм этих локусов в популяциях двуполых родительских видов.
1.3 Анализ внутри- и межпопуляционного полиморфизма локусов Du47, Du418 и Du161 у двуполых родительских видов D. (raddei) nairensis и D.valentini.
В связи с тем, что D. unisexualis (как и другие партеновиды рода Darevskia) имеет гибридное происхождение, нами были исследованы локусы, ортологичные Du47, Du418 и Du161, у родительских видов D. valentini и D. (raddei) nairensis.
Следует отметить, что ПЦР-продукты ортологичных локусов имеют примерно те же электрофоретические подвижности, что и у D.unisexualis, однако, они обнаруживают разную степень полиморфизма. Высокий уровень полиморфизма у родительских видов выявлен по локусам Du418 и Du161 во всех исследованных популяциях (рисунок 3).
По локусу, ортологичному Du47, двуполые родительские виды показали разную степень полиморфизма.
Рисунок 3. Электрофорез в ПААГ ПЦР-продуктов локуса Особи D. (raddei) Du418 (а) и Du161 (b) особей родительских видов: D.
(raddei) nairensis (3 – 7) и D.valentini (8 - 15).Р – продукт ПЦР nairensis были мономо плазмидной ДНК, ПЦР продукты особей D.unisexualis были рфны и гомозиготны по использованы для сравнения(1 – 3). Маркер молекулярного веса 50 bp+ Ladder “Fermentas” с шагом 50 п.н. изучаемому локусу, а особи D.valentini – гетерозиготны и на исследованной выборке представлены как минимум шестью аллельными вариантами.
1.4 Первичная структура ДНК аллельных вариантов локусов Du47, Du418 и Du161 у D.unisexualis.
Для получения информации о строении аллелей локусов Du47, Du418 и Du161 было предпринято клонирование и секвенирование различающихся по ЭФ подвижности ПЦР-продуктов для каждого локуса с последующим компьютер ным анализом данных.
Нуклеотидные последовате льности двух аллелей локуса Du47 представлены на Рис. 4. Аллели отлича ются размером и составом микросателлитного класте Рисунок 4. Сравнение нуклеотидных последовательностей двух аллелей локуса Du47 между ра, а также однонуклео собой и с нуклеотидной последовательностью части тидными заменами во клона Du47. Микросателлитный кластер выделен рамкой.
последовательностях фланкирующих последова Мутации во фланкирующих выделены прямоугольниками. Верхняя строка – тельностях ДНК. Анализ консенснусная последовательность.
нуклеотидных последовательностей микросателлитных кластеров показал, что они имеют сложное строение.
Все три аллельных варианта локуса Du418 содержат микросателлитную последовательность. Отличия в ЭФ подвижности аллелей связаны с различиями в количестве повторяющихся звеньев в микросателлитном кластере, а также крупными делециями или инсерциями во фланкирующих последовательностях.
Мономорфность этого локуса в популяциях объясняется тем, что особи содержат одновременно все три аллеля. Аллели локуса Du161отличаются друг от друга по длине микросателлитного кластера: вариант # 3, найденный у особи из популяции Загалу, идентичен нуклеотидной последовательности клона Du161;
аллель # отличается количеством повторяющихся звеньев в микросателлитном кластере;
а аллель # 1 характеризуется несколькими точковыми заменами во фланкирующих последовательностях ДНК и отсутствием несовершенного повтора GAT в конце микросателлитного кластера.
1.5 Первичная структура ДНК локуса Du47 у двуполых родительских видов D. (raddei) nairensis и D.valentini.
Нуклеотидные последовательности шести аллельных вариантов локуса Du47 у особей двуполого родительского вида D. valentini приведены на рис. 5.
Рисунок 5. Нуклеотидные последовательности аллельных вариантов локуса Du47 у D. unisexualis в сравнении с двуполым родительским видом D. valentini.
Однонуклеотидные замены во фланкирующих последовательностях ДНК у двух аллелей D.unisexualis выделены серым цветом. Микросателлит содержащей кластер выделен рамкой. Верхняя строка – консенснусная последовательность.
Во всех аллельных вариантах ближе к концу микросателлитного кластера присутствовал микросателлит GACA, в конце микросателлитного кластера также обнаружена характерная последовательность GATGATAGATATA. Аллельные варианты D. valentini отличаются от двух аллелей D. unisexualis длиной и составом микросателлитного кластера, а также транзициями и делециями во фланкирующих областях.
Рисунок 6. Нуклеотидные последовательности аллельных вариантов локуса Du47 D. unisexualis в сравнении с двуполыми видами D. raddei и D. (raddei) nairensis. Однонуклеотидные замены во фланкирующих последовательностях ДНК у двух аллелей D. unisexualis отмечены серым цветом. Микросателлитный кластер выделен рамкой.
Верхняя строка – консенснусная последовательность Секвенирование ПЦР-продуктов подтвердило существование только одного аллельного варианта локуса Du47 в D. (raddei) nairensis (Рис. 6). Аллельные варианты особей D. raddei и D. (raddei) nairensis идентичны между собой и по последовательности соответствуют второму аллельному варианту локуса Du47 у D. unisexualis.
2. Выявление и молекулярная характеристика de-novo мутаций в (GATA)n содержащих локусах партеногенетических потомков D.unisexualis.
Известно, что наиболее прямой и адекватный способ выявления мутаций – это сравнительный анализ генома или индивидуальных локусов у родителей и потомков в семейном анализе. Мы использовали две выборки семейных образцов партеновидов D. unisexualis (49 семей, 168 потомков F1) и D. armeniaca (50 семей, 147 потомков F1). Среди всех изученных в нашей лаборатории микросателлитных локусов D. unisexualis большинство (в т.ч. охарактеризованные в этой работе) были мономорфными. Только два (GATA)n-содержащих локуса - Du281 и Du215, оказались полиморфными [Корчагин 2004а,б;
Korchagin et al., 2007]. В настоящей работе проводился поиск мутаций по этим локусам у потомков семей D.
unisexualis и D. armeniaca.
2.1 Монолокусный PCR-анализ анализ локусов Du281 и Du215 на панели семейных образцов D. armeniaca.
Первая серия экспериментов была выполнена совместно с к.б.н.
Малышевой Д.Н. (Институт биологии гена РАН). Ни в одной из 50 семей D.
armeniaca не было обнаружено мутаций по исследуемым локусам.
2.2 Монолокусный PCR-анализ локусов Du281 и Du215 на панели семейных образцов D.unisexualis.
Аналогичный анализ семейных образцов D. unisexualis по Du215 также не выявил внутрисемейных вариаций в подвижности ПЦР амплификантов. В то же время по локусу Du у потомков четырех семей были обнаружены Рисунок 7. Внутрисемейная ЭФ мутации. На рис. 7 представлены результаты вариабельность ПЦР продуктов ПЦР анализа этих семей. Таким образом, локуса Du281. a–d - семьи 1–4.
Материнские ДНК обозначены M1- частота мутаций по локусу Du281 у D.unisexualis M4 соответственно;
ДНК потомков - показаны стрелками и пронуме- равна 1,428 х 10 событий на зародышевую рованы в каждой семье.
ткань, что на несколько порядков превышает среднюю частоту мутаций микросателлитных локусов. Прямое подтверждение мутантной природы аллелей, а также определение характера мутаций может быть получено с помощью их клонирования и секвенирования.
2.3 Молекулярная характеристика мутантных аллелей у потомков D. unisexualis.
Сравнение нуклеотидных последовательностей локуса Du281 в материнских особях и их потомках выявило мутации только в микросателлитном кластере, мутации во фланкирующих районах обнаружены не были (Рис. 8-9).
Материнские аллели и соответствующие им аллели потомков определялись по гаплотипам T-A-T и C-G-C, образованным фиксированными мутациями в прилежащих к микросателлиту областях каждого аллеля локуса Du281 [Korchagin et al. 2007].
В семье 1, состоящей из материнской особи и одного потомка, была обнаружена делеция одного GATA-мономера в обеих аллелях потомка (Рис. 8A).
В семье 2, состоящей из материнской особи и пяти потомков, только в одной аллели, несущей гаплотип C-G-C, у всех потомков произошла одинаковая мутация – делеция GATATA в микросателлитном кластере (Рис. 8В), а вторая аллель осталась неизменной. В семье 3, состоящей из матери и двух потомков, произошла инсерция одного GATA-мономера в микросателлитном кластере обеих аллей потомков (Рис. 8С).
В четвертой семье, состоящей из матери и четырех потомков, несколько различных мутаций обнаружены в аллели, несущей гаплотип C-G-C (Рис. 9).
A B C Рисунок 8. Нуклеотидные последовательности аллелей локуса Du281 в семейных образцах ДНК D. unisexualis (А - семья 1, В – семья 2, С- семья 3). Мутации выделены серым цветом. Однонуклеотидные замены, образующие гаплотипы обведены прямоугольником.
Микросателлит содержащей кластер выделен рамкой.
Так, у трех потомков мутантный аллель отличался от материнского делецией одного GATA- мономера, а у другого (# 2) произошла делеция GATATA последовательности в микросателлитном кластере.
Рисунок 9. Нуклеотидные последовательности аллелей локуса Du281 в семейных образцах ДНК D. unisexualis (семья 4). Мутации выделены серым цветом.
Однонуклеотидные замены, образующие гаплотипы, обведены прямоугольником.
Микросателлит содержащей кластер выделен рамкой.
В семьях доминировали изменения на одно повторяющееся звено. В двух семьях (все потомки семьи 2 и потомок #2, семьи 4) материнский аллель и аллель потомка отличались друг от друга делецией GATATA-последовательности.
Мутации могут происходить в двух или только в одной аллели. В двух семьях мутации были одинаковыми у всех потомков одной семьи, а в четвертой паттерны мутаций у потомков отличались.
3. Сравнительный анализ (GATA)n- содержащих локусов Du281 и Du у различных двуполых видов рода Darevskia.
Мутационную изменчивость у микросателлитов можно изучать, сравнивая аллели ортологичных микросателлитных локусов у родственных видов. Этот подход дает возможность оценить исторически накопленные мутации, однако он не позволяет определить последовательность и характер мутационных событий.
С помощью локус-специфического ПЦР-анализа с парами праймеров, подобранные для локусов Du281 и Du47, проводилось изучение аллельного полиморфизма ортологичных локусов у различных двуполых видов рода Darevskia. Были выявлены аллельные варианты этих локусов и определены их различия на уровне первичной структуры ДНК.
3.1. Полиморфизм двуполых видов рода Darevskia по локусу Du281.
Локус Du281 высоко полиморфен, среди исследованных особей D. raddei он представлен как минимум шестью аллельными вариантами, различающимися по электрофоретической подвижности продуктов амплификации в пределах нуклеотидных пар. У представителей D. portschinski portschinski локус представлен четырьмя аллельными вариантами. Среди исследованных особей D.portschinski nigrita было выявлено три аллельных варианта. У D. caucasica и D.
driada он представлен двумя аллелями, а D. dagestanica и D. chlorogaster одной.
3.2. Полиморфизм двуполых видов рода Darevskia по локусу Du47.
Исследованные особи D. raddei были гомозиготны по локусу Du47, и в исследованных выборках он представлен одним аллельным вариантом. У представителей D. portschinski portschinski, наоборот, он оказался высоко полиморфным. Большинство исследованных особей гетерозиготны, а локус представлен пятью аллельными вариантами. В выборке D. portschinski также выявлено пять аллельных вариантов, причем ПЦР-продукты локуса Du47 у особей обоих подвидов значительно отличались. D. dagestanica, D. caucasica и D. driada были гомозиготами по изучаемому локусу, а D. chlorogaster гетерозиготой.
3.3. Секвенирование аллельных вариантов локуса Du281 у ряда представителей двуполых видов рода Darevskia.
Было проведено секвенирование ПЦР-продуктов представителей нескольких видов с последующим компьютерным анализом данных. Ранее были исследованы аллельные варианты ортологов Du281 двуполых родительских видов [Korchagin et al., 2007] и было показано, что аллельные варианты с гаплотипом – T-A-T перешли от D. (raddei) nairensis, а с гаплотипом C-G-C - от D.
valentini. Как и у D. unisexualis, у родительских видов аллельные варианты различались по длине и структуре микросателлитного кластера. При рассмотрении структуры самих микросателлитных кластеров у всех изученных видов была обнаружена короткая последовательность из несовершенных мономеров (GATATA или GATGATATA), четко фиксированная около 3’- конца кластера. Причем оказалось, что последовательность GATATA ассоциирована с гаплотипом C-G-C, а последовательность GATGATATA - с гаплотипом T-A-T.
В работе проводили изучение аллельного полиморфизма ортологичного локуса Du281 у особей D. raddei. Нуклеотидные последовательности аллелей представлены на рис. 10. Видно, что D. raddei также как и D. (raddei) nairensis, несут гаплотип T-A-T, однако аллельные варианты отличаются наличием делеций и транзиций во фланкирующих последовательностях. Обнаружены также мутации в микросателлитных кластерах.
Рисунок 10. Нуклеотидные последовательности двух аллельных вариантов локуса Du281 D. unisexualis в сравнении с двуполым видом D. raddei. Мутации во фланкирующих последовательностях ДНК выделены серым цветом. Однонуклеотидные замены, образующие гаплотипы, обведены прямоугольником. Микросателлитный кластер выделен рамкой.
На рис. 11. приведены результаты секвенирования аллельных вариантов локуса Du281 у особей D. portschinski portschinski и D. portschinski nigrita.
Рисунок 11. Нуклеотидные последовательности двух аллельных вариантов локуса Du281 D. unisexualis в сравнении с двуполыми видами D. portschinski portschinski и D.
portschinski nigrita. Однонуклеотидные замены, образующие гаплотипы выделены прямоугольником. Микросателлитный кластер выделен рамкой.
Видно, что аллельные варианты D. portschinski portschinski и D. portschinski nigrita несут гаплотип C-G-C. Аллели отличаются только длиной микросателлитного кластера, мутаций во фланкирующих последовательностях ДНК не обнаружено. Число мономерных звеньев у D. portschinski portschinski варьирует от 7 до 11, а у D. portschinski nigrita, от 10 до 16. У D. portschinski portschinski микросателлитный кластер состоит только из совершенных повторов.
У D. portschinski nigrita в одном аллельном варианте произошли две однонуклеотидные делеции. Характерных для локуса Du281 D. unisexualis последовательностей GATGATATA и GATATA в конце микросателлитного кластера не обнаружено.
Результаты секвенирования аллельных вариантов локуса Du281 у особей D. dagestanica, D. caucasica, D. driada, D. chlorogaster представлены на рис. 12.
Рисунок 12. Нуклеотидные последовательности двух аллельных вариантов локуса Du281 D. unisexualis в сравнении с двуполыми видами D. dagestanica, D. caucasica, D.
driada, D. chlorogaster. Мутации во фланкирующих последовательностях ДНК выделены серым цветом. Однонуклеотидные замены, образующие гаплотипы, обведены прямоугольником.
Микросателлитный кластер выделен рамкой.
У D. caucasica выявлен гаплотип CGC, а у D. clorogaster - гаплотип T-A-T. У видов D. dagestanica и D. driada найдены другие гаплотипы - C-G-T и T-G-T, соответственно. Число звеньев в микросателлитном кластере у этих видов варьирует от 10 до 24, в них выявлены инсерции динуклеотида ТА и делеции последнего нуклеотида «А» в GATA. Во фланкирующих последовательностях обеих аллелей D. driada найдена одна транзиция, а у D. dagestanica - одна транзиция и одна инсерция. У представителей D. dagestanica, D. driada, D.
chlorogaster присутствует консервативный элемент GATATA в составе микросателлитного кластера.
3.4 Секвенирование аллельных вариантов локуса Du47 у ряда представителей двуполых видов рода Darevskia.
На рис. 13. представлены результаты секвенирования аллельных вариантов локуса Du47 у особей D. portschinski portschinski и D. portschinski nigrita.
Рисунок 13. Сравнение нуклеотидных последовательностей двух аллельных вариантов локуса Du47 D. unisexualis с нуклеотидными последовательностями аллельных вариантов локуса Du 47 у двуполых видов D.portschinski portschinski и D.portschinski nigrita.
Микросателлит содержащей кластер выделен рамкой. Мутации во фланкирующих последовательностях ДНК выделены серым цветом.
У D. portschinski portschinski и D. portschinski nigrita ближе к началу микросателлитного кластера обнаружен микросателлит другого типа – GACA, и в конце микросателлитного кластера - консервативная последовательность GATAGATATA.
Результаты секвенирования аллельных вариантов локуса Du47 у особей D.
dagestanica, D. caucasica, D. driada, D. chlorogaster представлены на рис. 14.
Между видами обнаружены значительные различия по длине и составу микросателлитного кластера. У D. driada выявлена инсерция последовательности ААТАААТА, у D. dagestanica и D. caucasica встречаются мотивы GAGA, и у всех видов в начале микросателлитного кластера встречается микросателлит GACA.
Как и в аллелях D. unisexualis, у этих видов в конце микросателлитного кластера находится последовательность GATGATAGATATA. Во фланкирующих последовательностях найдены мутации типа транзиций и инсерций.
Рисунок 14. Нуклеотидные последовательности двух аллельных вариантов локуса Du D. unisexualis в сравнении с различными двуполыми видами рода Darevskia.
Микросателлитный кластер обведен рамкой. Мутации во фланкирующих последовательностях ДНК выделены серым цветом.
3.5. Структурные взаимоотношения аллельных вариантов локуса Du281 у разных видов рода Darevskia.
Структурные взаимоотношения аллельных вариантов локуса Du281 у разных видов представлены в виде Байесовских деревьев на рис. 15.
Данные деревья отражают существующий на сегодняшний день взгляд на эволюционные отношения в пределах рода Darevskia [Даревский, 1993].
Рисунок 15. Байесовское древо 3.6. Структурные взаимоотношения аллелей локуса Du281 для ряда представителей рода Darevskia. а - без аллельных вариантов локуса Du47 у учета микросателлитов, б - с учетом микросателлитов. 1-8 D. raddei, 9-12 D. (raddei) разных видов рода Darevskia.
nairensis, 13-18 D. unisexualis, 19-20 D. valentini, Структурные взаимоотношения 21-22 D. portschinskii (nigrita), 23-25 D.
portschinskii, 26-27 D. caucasica, 28 - D. аллельных вариантов разных видов dagestanika, 29-30 D. driada, 31 - D.
ящериц по локусу Du47 представлены в chlorogaster.
виде Байесовских деревьев на рисунке 16.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ Однополые позвоночные - это уникальные модельные органи змы для изучения генетической изменчивости, поскольку мутации можно легко обнаружить в клональных популяциях, семьях и последующих поколениях. Уро вень их генетической вариабель Рисунок 16..Байесовское древо аллелей локуса ности невысокий по сравнению с Du47 для ряда представителей рода Darevskia. а - родственными двуполыми видами без учета микросателлитов, б - с учетом микросателлитов. 1-5 D. portschinskii (nigrita), 6-7 D. [Dawley, 1989;
Гребельный 2005].
unisexualis, 8-11 D. portschinskii,12-17 D. valentini, 18 D. raddei, 19 - D. (raddei) nairensis, 20 - D. caucasica, 21 Клональное разнообразие одно - D.driada, 22 - D. dagestanica.
полых видов принято объяснять мутациями, гибридным происхождением и незаконной рекомбинацией [Parker and Selander, 1976;
Parker, 1979;
Cole et al., 1988;
Moritz et al., 1989;
Fu et al., 2000].
Ранее с помощью мультилокусного ДНК-фингерпринтинга было показано, что на фоне видоспецифических спектров партеновидов рода Darevskia выявляется генетическая неоднородность особей по некоторым микросателлитным маркерам [Кан и др., 1998;
Tokarskaya et al., 2001;
Мартиросян и др. 2002;
2003]. Анализ семей D. unisexualis и D. armeniaca выявил мутантные ДНК-фингепринтные паттерны у потомков нескольких семей, которые отличались от материнских несколькими фрагментами [Tokarskaya et al., 2004;
Malysheva et al., 2007]. Эти результаты показывают, что в геноме партеногенетических ящериц существуют нестабильные локусы, которые можно выявить с помощью микросателлитных проб. Но причины такой вариабельности, механизмы ее возникновения не ясны. Очевидно, что для решения этих вопросов требуются новые подходы, в том числе анализ индивидуальных локусов.
Опубликовано мало работ по клонированию и характеристике индивидуальных микросателлитсодержащих локусов у однополых позвоночных.
Так, Wilmhoff et al. [2003] клонировал и секвенировал 16 вариабельных динуклеотидных микросателлитных локусов партеногенетического геккона Lepidodactylus lugubris. Генетическая вариабельность этих локусов, выявленная с помощью локус-специфического ПЦР анализа, оказалось неожиданно высокой.
Gardner et al. [2004] изолировали и секвенировали шесть полиморфных локусов, содержащих (AAC)n и (AAAG)n микросателлиты, из триплоидной партеногенетической формы австралийской ящерицы Menetia greyii и предложили использовать их для анализа непартеногенетических линий комплекса M. greyii.
Однако молекулярную характеристику аллельных вариантов полиморфных локусов они не проводили.
Ранее в нашей лаборатории была создана геномная клонотека партеновида D. unisexualis, из которой были отобраны клоны, содержащие разные микросател литы. Два – Du281 и Du215, оказались полиморфными [Korchagin at al., 2007]. В настоящем исследовании выделены и охарактеризованы три новых (GATA)n содержащих локуса и два локуса, содержащих (ТСТ)n и (ТСС)n микросателлиты.
Мы определили строение всех аллельных вариантов этих локусов, а для одного из них - аллели ортологов двуполых родительских видов. На популяционной выборке D. unisexualis (N=68) эти локусы оказались мономорфными, причем содержащие (GATA)n были гетерозиготами, а (ТСТ/ТСС)n - гомозиготами.
По классификации [Weber and Wong, 1993] микросателлитные последовательности подразделяются на три категории: совершенные, несовершенные и сложные. Согласно этой классификации, локусы Du418 и Du содержат несовершенные микросателлитные звенья, а Du47 включает как сложные, так и несовершенные микросателлитные мономеры. Несовершенные звенья типа GAT или TA могли возникнуть в результате мутации «сдвига рамки считывания» на неполное мономерное звено. В локусах Du418 и Du161 в составе микросателлитных кластеров были найдены последовательности TATATTTA и GGCTC соответственно;
они могли появиться или в результате рекомбинационных событий, или мутации микросателлитного звена типа транзиций и трансверсий.
По локусам Du418 и Du47 не было обнаружено вариации по ЭФ подвижности ПЦР продуктов, а по локусу Du161 была выявлена только одна отличающаяся особь. Интересно, что локус Du418 у D. unisexualis амплифицировался в виде трех аллелей, тогда как у родительских видов он представлен двумя или одной аллелью. Наиболее вероятно, что третья аллель возникла в результате дупликации этого локуса у партеновида. Известно, что локусы, содержащие несовершенные повторы или вставки других по составу повторов, гораздо более стабильны, чем содержащие идеальные повторы [Bichara et al., 1995;
Heale and Petes, 1995]. Этим может объяснить мономорфность изученных (GATA)n-содержащих локусов. Причины стабильности локусов Du222 и Du334 остаются неясными. Возможно, это связано с их относительно небольшими размерами или особенностями строения окружающих участков генома.
В каждом из (GATA)n содержащих локусов аллели также отличались несколькими делециями/инсерциями или транзициями и трансверсиями одного и более нуклеотидов во фланкирующих последовательностях ДНК. Возможно, что подобные нуклеотидные замены встречаются с определенной периодичностью в геноме различных видов ящериц рода Darevskia. Например, наличие точковых замен во фланкирующих областях было показано для локусов Du215 и Du281 у D.
unisexualis [Корчагин, 2004а,b]. Они могут соответствовать горячим точкам мутаций, которые возникают вблизи повторяющихся элементов генома.
Механизмы нестабильности микросателлитных локусов в полной мере не известны, однако существует ряд гипотез по этому вопросу [Strand et al., 1993;
Pearson et al., 1996]. Нестабильность зависит от целого ряда факторов, главными из которых являются нуклеотидный состав и характеристики геномного окружения [Weissenbach et al., 1992;
Weber, Wong, 1993;
Jin et al., 1996;
Goldstein, Pollok, 1997]. Изменения числа повторов коротких последовательностей обычно связывают с явлением “проскальзывания” нити ДНК во время репликации или репарации. Известны и другие механизмы, обуславливающие высокую частоту инсерций и делеций, а также многочисленные точковые мутации во фланкирующих микросателлит областях ДНК [Ellegren, 2000].
На панелях семейных образцов D. unisexualis и D. armeniaca нами были исследованы два полиморфных локуса – Du281 и Du215. Сравнение аллелей у материнских особей и потомков проводилось по обоим локусам, однако только по Du281 у потомков были выявлены de novo мутации. Подсчитанная частота мутаций равнялась 1,428 х 10-1 событий на зародышевую ткань. Это хорошо соотносится с более высоким уровнем популяционного полиморфизма у D.
unisexualis по локусу Du281 в сравнении с Du215 [Korchagin et al., 2007]. В то же время, обнаруженная нами частота мутаций на порядок превышает значения, полученные для индивидуальных микросателлитсодержащих локусов у бисексуальных видов. Например, в родословных человека частота мутаций микросателлитных локусов варьировала от 3x10-3 до 6x10-4 [Ellegren, 2000b], в других работах приводится значение 10-4 [Dib et al., 1996;
Weissbach et al., 1992].
Для (AAAG)n-локуса частота мутаций составляла 5.7x10-3 для деревенской ласточки – касатки [Brohede et al., 2002], а для австралийской двуполой ящерицы Egernia stokesii она равнялась 4.2x10-2 [Gardner et al., 2000]. Гипервариабельный микросателлит (TATC)n с частотой мутаций 1.7x10-2 был найден в Х хромосоме человека [Mahtani and Willard, 1993]. У локуса, содержащего (GGCAGG)n повторяющийся мотив, частота мутаций в клетках зародышевой линии грызунов была 8.8x10-2 на гамету [Mitani et al., 1990]. Следовательно, микросателлитный локус Du281 у D. unisexualis является гипермутабельным, и это первый пример такого локуса у однополых позвоночных.
Наличие в семье нескольких потомков с одинаковым мутантным фенотипом свидетельствует о том, что изменения произошли в герминальных клетках родителей. Фенотипически нормальные индивидуумы могут нести несколько гамет, произошедших клонально от одной предковой клетки, мутация в которой возникла у родителей на ранних стадиях развития [Youssoufian and Pyeritz, 2002].
В трех из четырех семей D. unisexualis паттерны мутаций были одинаковыми у всех потомков. Вероятно, они возникли в клетках зародышевой линии. В четвертой семье у одного из потомков паттерн мутации отличался от остальных.
Эта особь могла мутировать дважды - сначала вместе с другими потомками, и затем на более поздней стадии дифференциации, или же мутация произошла однажды на поздней стадии дифференциации клеток зародышевой линии.
Для объяснения мутационного поведения микросателлитов предложено несколько основных моделей и ряд их модификаций. Согласно модели пошаговых мутаций (Stepwise mutation model) [Ohta and Kimura, 1973] мутации в микросателлитах происходят путем последовательного добавления или утраты одного повторяющегося звена. Основным фактором, приводящим к изменению длины аллеля, считается эффект “проскальзывания” ДНК-полимеразы в процессе репликации. Эта модель получила прямые и косвенные экспериментальные подтверждения [Schlotterer and Tautz, 1992;
Weber and Wong, 1993], однако многочисленные наблюдения показали, что поведение микросателлитов далеко не всегда согласуется с обобщенным вариантом модели. Ее модифицированный вариант, “two-phase mutation model” [Di Rienzo et al., 1994], предполагает, что в некоторых микросателлитных локусах мутации могут происходить либо последовательно, “шаг за шагом”, либо скачкообразно, приводя к огромному единовременному увеличению длины повтора (экспансии) [Wells, 1996;
Djian, 1998]. Анализ индивидуальных микросателлитных локусов в различных организмах показывает, что от 5% до 75% мутаций носят характер мультиповторных мутаций [Ellegren, 2004]. Мутации, затрагивающие один микросателлитный повтор, у человека происходят гораздо чаще, чем «многошаговые» мутации [Weber and Wong, 1993]. У рыб Danio rerio 68% мутаций в микросателлитных локусах мультиповторны (или имеют мультиступенчатый характер) [Shimoda et al., 1999].
Описаны и более сложные процессы, происходящие в микросателлит содержащих локусах;
такие как асимметрия в распределении мутаций вдоль кластера, инсерции и делеции, а также многочисленные точковые мутации, нуклеотидные замены во фланкирующих последовательностях ДНК [Rubinsztein et al., 1995;
Ellegren et al., 1997;
Colson, Goldstein, 1999]. Так, например, у краба Limutus polyphemus был обнаружен (CA)n-содержащий микросателлитный локус размером 570 п.н. с 34 аллельными вариантами. Основные различия между аллелями были обусловлены полиморфизмом фланкирующих зон, содержащих нуклеотидные замены в 22-х сайтах [Orti et al., 1997]. Скорость мутационных изменений в самих микросателлитах может быть ниже, чем скорость замен во фланкирующих областях ДНК [Ellegren et al., 1997]. Так, у некоторых видов дрозофилы различия фланкирующих областей были выше, чем в самих микросателлитных повторах. Отличия аллельных вариантов могут ограничиваться только прилежащими участками ДНК [Colson and Goldstein, 1999].
Мы обнаружили de-novo мутации, затрагивающие несовершенный микросателлитный повтор (GATATA), т.е. более одного мономера. Наиболее вероятными механизмами подобной мутации могут быть двухфазная модель [Di Rienzo et al., 1994]. В других семьях изменения ЭФ подвижности были вызваны делецией или инсерцией одного повтора GATA, что можно объяснить пошаговой моделью мутационных изменений [Kimura and Ohta, 1978]. Однако ни в одной семье не было найдено мутаций, затрагивающих фланкирующие последовательности ДНК.
Данные, полученные при изучении двуполых видов животных [Primmer et al., 1998], а также человека [Amos et al., 1996;
Ellegren, 2000a] показали, что количество инсерций превосходит количество делеций. В нашем исследовании в 10 из 12 случаев мутация вела к уменьшению размера аллеля. Возможно, это связано со строением Du281 локуса или с особенностями организации гибридного генома D. unisexualis.
Для оценки исторически накопленных мутаций по локусам был изучен аллельный полиморфизм локусов, ортологичных Du47 и Du281, у разных двуполых видов рода Darevskia. Поскольку они двуполые, аллельный полиморфизм может быть следствием как мутационных, так и рекомбинационных явлений. Особи D. (raddei) nairensis и D. raddei характеризуются высокой степенью генетического сходства по данным RAPD анализа [Рябинина и др., 1998], таксонопринтного анализа [Гречко и др., 1998], а также по данным исследования мтДНК [Moritz et al., 1992]. Результаты настоящей работы показали, что особи D.
(raddei) nairensis и D. raddei идентичны и мономорфны по локусу Du47, но сильно отличаются по локусу Du281, причем различия затрагивают как структуру микросателлитсодержащего кластера, так и фланкирующие последовательности ДНК. Различия могут быть связаны с разной геномной локализацией Du47 и Du281. Локус Du281 может находиться в участке генома, более подверженным мутациям, чем Du47. Этим так же можно объяснить стабильность локуса Du47 в популяциях D. unisexualis.
Ранее по данным RAPD анализа [Рябинина и др., 1998], таксонопринтного анализа [Гречко и др., 1998], рестрикционного картирования мтДНК [Moritz et al., 1992], мультилокусного аллозимного анализа [MacCulloch et al., 1995] и анализа первичной структуры двух генов мтДНК [Fu et al., 1997] было показано высокое генетическое сходство видов D. portschinski и D. valentini. Мы установили, что по локусу Du47 D. portschinski (включая подвид D. portschinski nigrita) и D. valentini имеют идентичную структуру микросателлитного кластера, а у D. portschinski portschinski и D. valentini идентичные фланкирующие последовательности, отличающиесяся от D. portschinski nigrita одной трансверсией. По локусу Du281 D.
portschinski и D. valentini идентичны по фланкирующим последовательностям, но отличаются по строению микросателлитного кластера. У D. portschinski portschinski он состоит из совершенных микросателлитных повторов, а аллели отличаются между собой числом мономерных звеньев. У D. portschinski nigrita встречаются несовершенные микросателлитные повторы, и локус менее вариабелен. Поскольку аллели, содержащие несовершенные повторы, гораздо более стабильны, можно предположить, что высокая вариабельность локуса Du281 у D. portschinski portschinski связана с особенностями строения микросателлитного кластера. Подвиды D. portschinski (portschinski и nigrita) также вариабельны по Du47 локусу. Как у D. unisexualis, в состав микросателлитного кластера входят сложные и несовершенные микросателлитные звенья. У D.
portschinski portschinski встречается GACC микросателлит, который мог возникнуть в результате мутации GACA последовательности.
Аллели локусов Du281 и Du47 у представителей видов D. dagestanica, D.
caucasica, D. driada, D. chlorogaster различаются мутациями типа транзиций, трансверсий и инсерций во фланкирующих последовательностях. Наиболее вероятно, что эти участки являются горячими точками мутаций. У всех исследованных нами видов количество транзиций превышает количество трансверсий. Известно, что транзиции GCAT – одни из наиболее часто встречаемых спонтанных нуклеотидных замен, происходящих вследствии дезаминирования цитозина [Чобану и др., 2003]. Выявлены значительные отличия и по строению микросателлитного кластера, чаще всего – это мутации типа сдвига рамки считывания, приводящее к появлению несовершенных микросателлитных повторов, иногда это другие типы мутации, приводящие к появлению микросателлита другого типа. Структурные взаимоотношения аллельных вариантов изученных локусов у разных видов рода в виде Байесовских деревьев отражают существующий на сегодняшний день взгляд на эволюционные отношения в пределах рода Darevskia [Даревский, 1993]. Деревья, построенные с учетом и без учета изменчивости микросателлитов, имеют сходную топографию, что, возможно, связано с нахождением в составе микросателлитов исследованных видов эволюционно консервативных нуклеотидных группировок.
Таким образом, с помощью клонирования и секвенирования ДНК установлена молекулярная структура ряда микросателлитных локусов и их аллельных вариантов у партеновида D. unisexualis. В исследованной популяционной выборке эти локусы оказались мономорфными, что, возможно, связано с особенностями строения микросателлитных кластеров данных локусов, или со специфическими характеристиками прилежащих ДНК.
На двух больших выборках семейных образцов партеновидов D. unisexualis и D. armeniaca изучена стабильность (GATA)n- содержащих локусов Du281 и Du215. Полученные данные свидетельствуют о супернестабильности Du281 у D.unisexualis: частота мутаций этого локуса достигает 1,428х10-1 событий на зародышевую ткань, что на несколько порядков превышает среднюю частоту мутаций микросателлитов и сравнимо с наиболее нестабильными локусами, описанными у двуполых видов. Выявлено и установлена структура 15 мутантных аллелей;
показано, что большинство мутаций - это делеции одиночных микросателлитных мономеров. Показано, что de novo мутации у партеногенетических потомков возникают, вероятно, в результате ошибок при репликации ДНК и происходят в клетках зародышевой линии. Полученные результаты являются первым прямым доказательством того, что мутации вносят существенный вклад в геномное разнообразие популяций клонально размножающихся позвоночных.
Генетико-инженерное изучение аллельных вариантов ряда микросателлитных локусов партеновидов D. unisexualis и их ортологов у двуполых видов позволило выявить особенности их мутационной изменчивости в группе ящериц рода Darevskia, которые связаны как с вариациями числа повторяющихся единиц микросателлитных кластеров, делециями и инсерциями в микросателлитах и в прилегающих областях ДНК.
ВЫВОДЫ 1. В работе впервые клонированы и охарактеризованы пять новых микросателлитсодержащих локусов у партеногенетических ящериц Darevskia unisexualis. Сходство спектров амплификации для каждого из локусов у 68 особей свидетельствует о том, что изученные популяции мономорфны по этим маркерам.
Анализ их молекулярной структуры на популяционной выборке D. unisexualis показал, что исследованные особи гетерозиготны по локусам, содержащим (GATA)n последовательности, и гомозиготны по локусам, содержащим (TCC)n и (TCT)n.
Частота мутаций, равная 1,428 х 10-1, подсчитанная для локуса Du281 на 2.
семьях (168 потомков) D. unisexualis, свидетельствует о супернестабильности данного локуса. В связи с тем, что у D. armeniaca мутаций по этому локусу не было обнаружено, можно предположить, что супернестабильность локуса Du проявляется не у всех партеногенетических видов этого рода.
3. Определена молекулярная структура 15 мутантных аллелей по локусу Du281 у партеногенетических потомков первого поколения. Показано, что большинство мутаций происходит в клетках зародышевого пути и выражаются в делециях мономерного звена в микросателлитном кластере.
4. Сравнительный анализ первичной структуры аллельных вариантов локусов Du281 и Du47 у представителей двуполых видов рода Darevskia позволил установить особенности межвидовой изменчивости, связанной с вариациями числа мономеров в микросателлитных кластерах, делециями и инсерциями в микросателлитах и точковых нуклеотидных заменах в прилежащих к ним областях ДНК.
ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.
1. Badaeva T.N., Malysheva D.N., Korchagin V.I., Ryskov A.P. Genetic variation and de novo mutations in the parthenogenetic Caucasian rock lizard Darevskia unisexualis. // Plos ONE, 2008, 3(7), e2730 (сайт: http://www.plosone.org/home.action).
2. Korchagin V.I., Badaeva T.N., Tokarskaya O.N., Martirosyan I.A., Ryskov A.P. Molecular characterization of allelic variants of (GATA)n microsatellite loci in parthenogenetic lizards Darevskia unisexualis (Lacertidae). // Gene, 2007, 392(1-2): 126-133.
3. Бадаева Т.Н., Корчагин В.И., Токарская О.Н., Рысков А.П. Выявление и молекулярная характеристика мутантных аллелей локуса Du281 у партеногенетических потомков Darevskia unisexualis. // Докл. Аккад. Наук, 2006, 409(1): 120-122.
4. Tokarskaya O.N., Martirosyan I.A., Badaeva T.N., Malysheva D.N., Korchagin V.I., Darevsky I.S., Danielyan F.D., Ryskov A.P. Instability of (GATA)n microsatellite loci in the parthenogenetic Caucasian rock lizard Darevskia unisexualis (Lacertidae). // Mol. Gen.
Genomics, 2004, 270: 509-513.
5. Токарская О.Н., Даревский И.С., Мартиросян И.А., Бадаева Т.Н.,. Корочкин Л.И, Даниелян Ф.Д., Петросян В.Г., Рысков А.П. Генетическая нестабильность (GATA)n микросателлитных повторов ДНК и соматический мозаицизм у однополых ящериц Darevskia unisexualis. // Докл. Акад. Наук, 2003, 388(6): 825-828.
6. Рысков А.П., Мартиросян И.А., Бадаева Т.Н., Корчагин В.И., Даниелян Ф.Д., Петросян В.Г., Даревский И.С., Токарская О.Н. Супернестабильность (TCT/TCC)n микросателлитных днк у партеногенетических ящериц Darevskia unisexualis (сем.
Lacertidae). // Генетика, 2003, 39(9): 1172-1179.
7. Badaeva T.N., Malysheva D.N., Korchagin V.I., Martirosyan I.A. Mutations as a major source of population genomic variation in clonally reproduced parthenogenetic lizards of genus Darevskia. The Biology of Genomes, 8-12 May 2007, Cold Spring Harbor, USA, p.28.
8. Badaeva, V. I. Korchagin, O. N. Tokarskaya, Ryskov A. P. “Microsatellite instability in parthenogenetic rock lizard Darevskia unisexualis”. 14th European Congress of Herpetology, Porto, Portugal, 19-23 September 2007, p.174.
9. Бадаева Т.Н. Токарская О.Н. Рысков А.П. “Изучение вариабельности (ТСТ/ТСС)n микросателлитных ДНК партеногенетической ящерицы Darevskia unisexualis (Darevskia).” XVII зимняя молодежная научная школа « перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии. Москва, 7-10 февраля 2005, Тезисы докладов и стендовых сообщений стр. 53.
10. Martirosyan I.A., Korchagin V.I., Malysheva D.N., Badaeva T.N., Tokarskaya O.N., Danielyan F.D., Darevsky I.S., Ryskov A.P. “Clonal diversity and genome instability in parthenogenetic lizards of genus Darevskia.” The second international conference Modern problems of genetics, radiobiology, radioecology and evolution. Yerevan, 8-11 September 2005, p.78.
11. Martirosyan I.A., Korchagin V.I., Malysheva D.N., Badaeva T.N., Tokarskaya O.N., Danielyan F.D., Darevsky I.S., Ryskov A.P. “Study of clonal diversity, genome instability and genetically instable loci in parthenogenetic rock lizards genus Darevskia.” 9th evolutionary meeting at Marseilles. 21-23 September Marseille, 2005. p.23.
12. Korchagin V.I., Martirosyan I.A., Malysheva D.N., Badaeva T.N., Tokarskaya O.N., Ryskov A.P. “Study of genomic diversity, genetically unstable loci and somatic mosaicism in clonally reproduced (parthenogenetic) lizards, genus Darevskia.” Advanced in molecular cell biology” devoted to the 10th anniversary of the center for Medical Studies (1993-2003).
Moscow, June 17-18 2004, p. 73 – 82.
13. Martirosyan I.A., Badaeva T.N., Malysheva D.N., Korchagin V.I., Petrosyan V.G., Danielyan F.D., Darevsky I.S., Tokarskaya O.N. “Variation multilocus DNA markers in parthenogenetic rock lizards Darevskia unisexualis.” 12th ordinary General Meeting of Societas Europaea Herpetologica. St. Petersburg, 12-16 August 2003, Programme & Abstracts p. 106.
14. Korchagin V.I., Martirosyan I.A., Malysheva D.N., Badaeva T.N., Tokarskaya O.N. Highly instable (GATA)n-containing sequences in parthenogenetic lizards Darevskia unisexualis (Lacertidae). International conference “Molecular genetics of Eucariotes”. Moscow, 4- February 2003, Institute of Gene Biology RAS. p.26.