Исследование l-лизин-оксидазы trichoderma harzianum rifai

На правах рукописи

ШНЕЙДЕР ЮРИЙ АНДРЕЕВИЧ

Исследование l-лизин--оксидазы trichoderma harzianum rifai

03.02.03 – микробиология

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени

кандидата биологических наук

Москва – 2012

Работа выполнена на кафедре биохимии медицинского факультета Федерального

государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Российский университет дружбы народов»

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Смирнова Ирина Павловна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, Орлова Валентина Сергеевна профессор ГОУ ВПО «Российский университет дружбы народов» (г. Москва), Профессор кафедры системной экологии кандидат биологических наук, Войшвилло Наталия Евгеньевна Центр «Биоинженерия» РАН, г.Москва, старший научный сотрудник

Ведущая организация:

Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии (ФБУН ГНЦ ПМБ)

Защита состоится « » 2012 года в _ часов на заседании диссертационного совета Д 212.203.05 в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский университет дружбы народов» по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д 8.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Российский университет дружбы народов» по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 6.

Автореферат разослан «»_ 2012 года

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук, доцент О.Б. Гигани

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Поиск средств лечения злокачественных новообразований, опасных вирусных инфекций продолжает оставаться актуальной проблемой современной медицины.

В настоящее время одним из наиболее изучаемых грибов является род Trichoderma. Повышенный интерес к этому роду обусловлен практической и экологической его значимостью. Грибы этого рода могут расти на различных субстратах, играют важную роль в биоценозе и используются как продуцент различных биологически-активных соединений (Yedidia, I. et al., 2001;

Howell, C.R., 2003).

Особый интерес грибы рода Trichoderma представляют с точки зрения биосинтеза фермента L-лизин--оксидазы, который был впервые описан японскими исследователями в середине 70-х годов прошлого века. Они показали, что найденный штамм Trichoderma viride обладает антилейкозной активностью (Kusakabe C., 1979).

На кафедре биохимии Российского университета дружбы народов найден продуцент фермента L-лизин--оксидазы штамм Trichoderma harzianum Rifai F (Смирнова И.П., Берёзов Т.Т.,1982), разработан метод определения его активности (Берёзов Т.Т., Сяткин С.П., Смирнова И.П.,1983) и проводятся исследования фермента L-лизин--оксидазы. Фермент был получен в гомогенном состоянии (НПО «Фермент» г. Вильнюс). Результатами работ Жуковой О.С., Лукашевой Е.В. и Хадуева С.Х. было показано, что L-лизин--оксидаза отечественного штамма обладает противоопухолевой активностью (Жукова О.С. и др., 1986;

Хадуев С.Х. и др., 1987, Лукашева Е.В. и др., 2004). Впоследствии была показана антивирусная активность продуцента Trichoderma harzianum Rifai F180 на герпес I и II типов, а также ингибирование ВИЧ инфекции (Смирнова И.П., Алексеев С.Б., Берёзов Т.Т. и др.,1994, 1997, 2000, 2003).

Исследование L-лизин--оксидазы Trichoderma harzianum Rifai, изучение его биосинтеза, регуляции, термостабильности, новых биологических свойств, а также создание отечественной промышленной технологии получения лизиноксидазы представляют не только практический, но и большой теоретический интерес, поскольку полученные результаты будут способствовать выяснению тонких молекулярных механизмов действия ферментов.

Работа является частью исследований, проводимых с L-лизин--оксидазой Trichoderma harzianum Rifai на кафедре биохимии Российского университета дружбы народов, исследований, выполняемых в рамках Государственного контракта №П "Создание противоопухолевого и антивирусного препарата на основе фермента L лизин--оксидазы" 2009г., а также фундаментального научного исследования НИР/НИОКР "Молекулярные основы патологических процессов и система их внутриклеточной регуляции;

структура и биологическая активность бактериальных ферментов с антиопухолевой и антивирусной активностью" (тема №030520-1).

Цель работы: провести исследование культуральной жидкости Trichoderma harzianum Rifai F180 – продуцента L-лизин--оксидазы в процессе длительного хранения (7 лет), определить оптимальные условия биосинтеза L-лизин--оксидазы грибом Trichoderma harzianum Rifai в лабораторных условиях, разработать производственную схему технологии получения фермента, тест-систему определения антивирусной активности L-лизин--оксидазы на растительных объектах и изучить влияние L-лизин--оксидазы на некоторых возбудителей особо опасных заболеваний растений и человека.

Задачи исследования:

1. Исследовать биологические и биохимические свойства культуральной жидкости (КЖ) продуцента противоопухолевого и антивирусного фермента L-лизин -оксидазы Trichoderma harzianum Rifai F180 в процессе длительного хранения (7 лет) при температуре +4С.

2. Определить оптимальные условия для максимального образования L-лизин -оксидазы грибом при глубинном способе Trichoderma harzianum Rifai культивирования.

3. Осуществить культивирование Trichoderma harzianum Rifai штамм F180 в полупромышленных условиях с целью накопления исходного продукта.

4. Исследовать антивирусную активность L-лизин--оксидазы Trichoderma harzianum Rifai штамм F180 на объектах растительного происхождения.

5. Исследовать антивирусную активность L-лизин--оксидазы Trichoderma harzianum Rifai штамм F180 на объектах животного происхождения.

Научная новизна. Впервые показана стабильность L-лизин--оксидазы в культуральной жидкости гриба Trichoderma harzianum Rifai F180, полученной при глубинном культивировании на среде с пшеничными отрубями и хранящейся при температуре +4оС в течение 7 лет.

Установлена роль гемицеллюлозного субстрата (пшеничных отрубей) – индуктора биосинтеза L-лизин--оксидазы Trichoderma harzianum Rifai.

Впервые показан ингибирующий эффект L-лизин--оксидазы на опасные фитопатогены – тосповирус некротической пятнистости бальзамина и неповирус кольцевой пятнистости табака при активности фермента равной 2 Ед/мл и 1 Ед/мл соответственно.

Впервые показан ингибирующий эффект на вирус L-лизин--оксидазы клещевого энцефалита в концентрации 25 мкг/мл и 12,5 мкг/мл с удельной активностью фермента 50 Ед/мг белка.

Практическая значимость работы 1. Установлена термостабильность культуральной жидкости гриба Trichoderma harzianum Rifai F180 в процессе длительного хранения, позволяющая проводить ее накопление и хранение без потери активности фермента L-лизин--оксидазы.

2. Совместно с сотрудниками Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН им. Г.К. Скрябина (ИБФМ РАН) разработан «Технологический регламент получения лизиноксидазы» в полупромышленных условиях.

3. Разработана тест-система определения антивирусной активности L лизин--оксидазы на растительных объектах, показан ингибирующий эффект культуральной жидкости продуцента и гомогенного фермента на опасные вирусные заболевания растений: вирус некротической пятнистости бальзамина (Impatiens necrotic spot tospovirus) и вирус кольцевой пятнистости табака (Tobacco ringspot nepovirus). Поданы заявки на 2 патента: Смирнова И.П., Шнейдер Ю.А. Заявка на Патент Регистрационный № 2010150343 / Штамм Trichoderma harzianum Rifai – продуцент ингибитора тосповируса некротической пятнистости бальзамина (Impatiens necrotic spot tospovirus) от 09.12.2010 г.;

Смирнова И.П., Шнейдер Ю.А. Заявка на Патент Регистрационный № 2011111098 / Штамм Trichoderma harzianum Rifai – продуцент ингибитора вируса кольцевой пятнистости табака (Tobacco ringspot virus) от 24.03.2011 г.

4. Показано влияние фермента L-лизин--оксидазы штамма Trichoderma harzianum Rifai F180 на опасное вирусное заболевание человека: вирус клещевого энцефалита. Установлен ингибирующий эффект L-лизин--оксидазы на вирус клещевого энцефалита.

Основные положения, выносимые на защиту:

Культуральная жидкость Trichoderma harzianum Rifai F180, проявляет 1.

биологическую и биохимическую стабильность в процессе длительного хранения ( лет, при температуре +4С).

Гемицеллюлозный субстрат отруби) оказывает 2. (пшеничные индуцирующий эффект на биосинтез L-лизин--оксидазы. Определены оптимальные условия биосинтеза L-лизин--оксидазы в лабораторных условиях.

Осуществлена разработка и апробация препаративных методов выделения 3.

и очистки L-лизин--оксидазы (хроматографического и мембранного). Предложена схема получения в L-лизин--оксидазы Trichoderma harzianum Rifai полупромышленных условиях. По разработанной схеме на ферментере БИОР- осуществлена наработка исходной культуральной жидкости гриба с удельной активностью L-лизин--оксидазы 50 Ед/мг белка.

4. Разработана тест-система, позволяющая выявлять антивирусное действие L лизин--оксидазы на объектах растительного происхождения.

5. Впервые установлено антивирусное действие L-лизин--оксидазы, фермента Trichoderma harzianum Rifai штамм F180, на тосповирус некротической пятнистости бальзамина (Impatiens necrotic spot tospovirus) при активности фермента равной Ед/мл и на неповирус кольцевой пятнистости табака (Tobacco ringspot nepovirus), при активности 1 Ед/мл.

6. Впервые проведено исследование влияния L-лизин--оксидазы на ряд опасных вирусных инфекций человека (вирус клещевого энцефалита и вирус Западного Нила (сем. Flaviviridae), вирус Синдбис (Alphavirus), вирус Дхори (сем.

Orthomyxoviridae), вирус Тягиня (сем. Bunyaviridae)), которое показало, что максимальная антивирусная активность проявлялась в L-лизин--оксидазы отношении вируса клещевого энцефалита. Было отмечено снижение титра вируса клещевого энцефалита с 8,0 lg ЦПД100 до 5,0 lg ЦПД100 при добавлении L-лизин- оксидазы в концентрации фермента как 25 мкг/мл, так и 12,5 мкг/мл, что показывает ее антивирусное действие.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на XII Научно-практической конференции по медицинской микологии (XII Кашкинские чтения) (С.-Петербург, 2009);

VI Международной конференции «Биоресурсы и вирусы» (Киев, Украина, 2010), Международной конференции «Возобновляемые лесные и растительные ресурсы: химия, технология, фармакология, медицина» (С. Петербург, 2011);

International conference: Ecology of soil microorganisms (Prague, Czech Republic. 2011);

XIV Научно-практической конференции по медицинской микологии (XIV Кашкинские чтения) (С.-Петербург, 2011);

Международной научно практической конференции «Интегрированная защита растений: стратегия и практика»

(Минск, Республика Беларусь, 2011) Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 работ. Из них 7 – статьи в журналах, рекомендованных ВАК для публикаций материалов докторских и кандидатских диссертаций, остальные тезисы докладов на международных конференциях. Поданы 2 заявки на патенты.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственного исследования и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций, библиографического списка. Работа изложена на 150 страницах машинописного текста, содержит 23 таблицы, 22 рисунка.

Библиографический список используемой литературы включает 245 источников, из которых 202 зарубежных.

Личный вклад автора.

Диссертационная работа представляет собой законченный, самостоятельно выполненный труд автора. Все представленные в диссертации результаты получены лично Шнейдером Ю.А. на базе лаборатории кафедры биохимии и кафедры ботаники, физиологии, патологии растений и агробиотехнологии РУДН, в лаборатории ГУ НИИ вирусологии им.Д.И. Ивановского РАМН, в лаборатории Института геохимии и аналитической химии им. В.И. Вернадского, а также на опытной технологической установке ИБФМ РАН им. Г.К. Скрябина (г. Пущино, Московская обл.). Автором проанализированы отечественные и зарубежные литературные источники по теме диссертации, получены и обобщены результаты исследования. В работах, выполненных в соавторстве, использованы результаты исследований с долей личного участия автора 75-95%.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы исследования Объекты исследования В нашей работе была использована культура гриба Trichoderma harzianum Rifai штамм F180, которая была предоставлена кафедрой биохимии Российского университета дружбы народов.

Культуральная жидкость гриба Trichoderma harzianum Rifai штамм F180, хранилась при температуре +4°С в течении 7 лет на кафедре биохимии Российского университета дружбы народов и была использована для изучения ее стабильности с целью возможного накопления и хранения.

В качестве объектов для исследования антивирусной активности использовались растительные изоляты тосповируса некротической пятнистости бальзамина (Impatiens necrotic spot tospovirus) и неповируса кольцевой пятнистости табака (Tobacco ringspot nepovirus), полученные в РГАУ – МСХА имени К.А. Тимирязева: Стрептокарпус (Streptocarpus spp.), Бальзамин (Impatiens spp.).

Вируссодержащие суспензии мозговой ткани инфицированных новорожденных белых мышей (нбм), служившие источником заражения клеток, были получены в НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского.

Антивирусные свойства культуральной жидкости Trichoderma проводили на перевиваемых линиях клеток почки эмбриона зеленой мартышки (Vero, клон Е6) и перевиваемых линиях клеток почки эмбриона свиньи (SPEV), которые были получены в Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН.

Изучение биологических свойств культуральной жидкости гриба проводили на коллекции фитопатогенных и сапрофитных грибов (24 штамма), полученных на кафедре фитопатологии МГУ им. М.В. Ломоносова.

Используемые среды Для поверхностного выращивания Trichoderma harzianum Rifai использовались среды: сусло-агар, среда Чапека, среда Soda.

Для глубинного культивирования гриба Trichoderma harzianum Rifai использовались традиционные среды для культивирования Trichoderma. В качестве источника углерода в средах были использованы крахмал, соевая мука, пшеничные отруби. В качестве источников азота использовали (NH4)2SO4, NaNO3.

Перевиваемые линии клеток почки эмбриона зеленой мартышки (Vero, клон Е6) выращивали на питательной среде Игла, перевиваемые линии клеток почки эмбриона свиньи (SPEV) выращивали на питательной среде 199 (Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН).

Для приготовления разведений вируса и L-лизин--оксидазы использовалась питательная среда Игла или среда 199 (соответствующая среде для выращивания клеток) (Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН) с 1% эмбриональной телячьей сыворотки («High Clone», США) – поддерживающая среда.

Методы исследования Определение активности L-лизин--оксидазы Активность L-лизин--оксидазы в культуральной жидкости рассчитывали по приросту Н2О2, количество которого определяли спектрофотометрическим орто дианизидиновым микрометодом (Смирнова и соавт. 1984). Сущность метода заключается во взаимодействии образующейся в реакции Н2 О2 с орто дианизидингидрохлоридом. Инкубационная смесь содержала 20 мкг пероксидазы, 250 мкг орто-дианизидингидрохлорида и 0,1-0,5 мг белка в 1мл конечного объема.

После 10 мин. инкубации в термостате при 37оС пробы охлаждали до 0-4оС.

Оптическую плотность окрашенных растворов опытной и контрольной (без субстрата) проб измеряли на спектрофотометре СФ-16 при 540 нм против контрольной пробы (без пероксидазы).

За единицу активности принимали количество фермента, катализирующего образование 1 мкмоль Н2О2 за 1 мин. при 37оС.

Определение белка по методу Лоури Белок определяли по модифицированному методу Лоури. В качестве стандарта использовали 0,05% раствор кристаллического бычьего альбумина (фирма «Reanal», Венгрия).

L-лизин--оксидазы Определение антивирусной активности на растительных объектах К соку растений, зараженных тосповирусом некротической пятнистости бальзамина (Impatiens necrotic spot tospovirus) и неповирусом кольцевой пятнистости табака (Tobacco ringspot nepovirus) добавлялась культуральная жидкость гриба Trichoderma harzianum Rifai в различных разведениях для получения конечной активности L-лизин--оксидазы 2, 1, 0,5, 0,1 Ед/мл. Эксперименты ставились в трехкратной повторности.

Выделение нуклеиновых кислот Для выделения нуклеиновых кислот из растительного материала были использованы наборы «Проба НК» (ООО «Агродиагностика, Россия). Выделение нуклеиновых кислот проводилось согласно инструкции из набора. Набор «Проба НК»

был получен в ФГБУ «Всероссийский центр карантина растений».

Определение антивирусной активности L-лизин--оксидазы на клетках животного происхождения Для определения антивирусной активности готовили последовательные 10 кратные разведения вируса (разведения от 10-2 до 10-8) (Табл. 1). Каждое разведение вносили в лунки 96-луночных планшетов с монослоем клеток. Контакт вируса с клетками проводили в течение 1 часа при +370С. Затем в лунки, предназначенные для определения противовирусной активности, добавляли поддерживающую среду, содержащую L-лизин--оксидазу. Эксперименты ставились в трехкратной повторности.

Таблица Схема эксперимента «Определение активности L-лизин--оксидазы на клетках животного происхождения»

1** 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -2 - *A -3 -3 -3 -3 -3 -3 -3 -3 -3 -3 -3 - B -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 - C -5 -5 -5 -5 -5 -5 -5 -5 -5 -5 -5 - D -6 -6 -6 -6 -6 -6 -6 -6 -6 -6 -6 - E -7 -7 -7 -7 -7 -7 -7 -7 -7 -7 -7 - F -8 -8 -8 -8 -8 -8 -8 -8 -8 -8 -8 - G Контроль токсичности Контроль токсичности Контроль клеток H Поддерживающая среда L-лизин--оксидаза L-лизин--оксидаза 25 мкг/мл 12,5 мкг/мл без L-лизин--оксидазы Примечание: * - Номера горизонтальных рядов на 96-луночном планшете ** - Номера вертикальных рядов на 96-луночном планшете Метод мембранного фракционирования Для фракционирования компонентов нативного раствора использовали проточную систему непрерывного мембранного фракционирования с 4 мембранами с последовательно уменьшаемыми размерами пор от 0,2 мкм до 30 kD в мембранах, разработанную авторами (В.М. Шкинев и соавт.,1998).

Метод определения чистоты продукта Для определения чистоты получаемого продукта использовался метод капиллярного электрофореза на установке Капель-105 производства фирмы Люмекс (С.-Петербург).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Изучение стабильности в процессе длительного хранения 1.

культуральной жидкости Trichoderma harzianum Rifai Нами изучалась термостабильность культуральной жидкости Trichoderma harzianum Rifai F180 после 7 лет хранения при температуре +4°С. Проводили исследование на коллекции фитопатогенных и сапрофитных грибов (24 штамма) на среде сусло-агар. Грибы Botryotrichum piluliferum, Fusarium poae, Fusarium solani, Fusarium oxysporum, Fusarium verticillioides, Paecilomyces variotii почти полностью приостановили свой рост, за исключением представителей рода Penicillium. Грибы рода Aspergillus неодинаково реагировали на присутствие культуральной жидкости Trichoderma. Так, Aspergillus ochaceus, Aspergillus ustus, Aspergillus fischeri и грибы рода Penicillium активно росли в течение пяти суток, в то время как штаммы Aspergillus niger, Aspergillus terreus, Aspergillus versicor, Aspergillus flavus приостанавливали свой рост в присутствии культуральной жидкости Trichoderma harzianum Rifai F180. Таким образом, культуральная жидкость гриба Trichoderma не теряет своей биологической активности в процессе длительного хранения, проявляя в отношении ряда грибов свои антагонистические свойства.

Исследование влияние температуры (37, 50, 60 и 70°С) на термостабильность L лизин--оксидазы культуральной жидкости Trichoderma harzianum Rifai в разном временном диапазоне представлено на рисунке №1. Как видно из рисунка, при температуре 37оС фермент стабилен в течение 3 часов, при температуре 60оС снижение стабильности отмечалось незначительно при инкубации до 3-х часов. При температуре 70оС наблюдалась резкая инактивация фермента. Потеря L-лизин- оксидазной активности по сравнению с инкубацией при 37оС происходила почти на 50% в течение 10 минут, а к 3 часам инкубации фермент полностью терял активность.

Рисунок №1. Данные по термостабильности L-лизин--оксидазы после 7 летнего хранения.

Обозначения к рисунку: ряд 1 - температура 37оС, ряд 2 - температура 50оС, ряд 3 - температура 60оС, ряд 4 - температура 70оС Исследование субстратной специфичности культуральной жидкости Trichoderma harzianum Rifai длительного хранения в отношении деструкции 20 L-аминокислот показало, что проявляемый спектр аминооксидазных активностей аналогичен ранее установленному: относительно аминокислоты L-лизина высокая активность (100 %), а по отношению к L-фенилаланину (8%) и L-метионину (1,2%) – очень низкая. К другим аминокислотам оксидазных активностей не было обнаружено. L-лизин- оксидаза гриба Trichoderma harzianum Rifai, находившаяся при хранении в течение длительного срока, имеет оптимум рН равный 5,7-5,9.

Таким образом, нами установлено, что культуральная жидкость исследуемого штамма в процессе длительного хранения стабильна и ее можно использовать для хранения и накопления исходной субстанции.

Изучение условий культивирования штамма-продуцента L-лизин-а 2.

оксидазы С целью создания производственного регламента получения лизиноксидазы нами был изучен биосинтез фермента при различных способах выращивания Trichoderma: глубинном, стационарном и поверхностном.

Наилучший способ для биосинтеза L-лизин--оксидазы грибом Trichoderma – это поверхностный способ выращивания. Активность фермента при этом способе превышала активность по сравнению с другими способами выращивания. Однако, как известно, при практическом применении из-за поражения грибами аппаратуры, поверхностный способ культивирования штамма не может быть использован в производстве. Поэтому нами было использовано глубинное культивирование, которое было применено при создании регламента получения «Технологического лизиноксидазы».

В дальнейших исследованиях была поставлена задача: выяснить роль субстрата – пшеничных отрубей в образовании фермента L-лизин--оксидазы грибом Trichoderma harzianum Rifai. Были изучены традиционные среды для выращивания Trichoderma с целью получения фермента с более высокой активностью. При исследовании образования L-лизин--оксидазы в динамике на средах, которые различались источниками углерода, нами было выяснено, что только на среде с пшеничными отрубями возможно наибольшее образование фермента (рисунок № 2).

На других традиционных средах для культивирования Trichoderma биосинтез фермента оказался весьма незначительным.

Рисунок № 2. Динамика образования L-лизин--оксидазы инокулятом гриба Tr.harzianum Rifai при глубинном культивировании на средах разного состава.

Примечание: вариант среды №1 содержал крахмал;

вариант №2 – соевую муку;

вариант №3 – пшеничные отруби. Максимальное значение активности фермента было принято за 100% (вариант среды №3, на пятые сутки роста).

В состав вносились различные источники углерода: вариант №1 содержал крахмал;

вариант №2 – соевую муку;

вариант №3 – пшеничные отруби. Как видно из рисунка № 2, максимальная активность фермента наблюдалась на среде №3 на пятые сутки роста культуры - 100%.

Известно, что питательные среды в лабораторных испытаниях обычно стерилизуют в автоклаве. Однако нагревание в автоклаве может вызывать разрушение или изменение состава некоторых компонентов питательной среды. Нами было изучено образование фермента при использовании сред, автоклавированных при разных режимах. При автоклавировании среды №3 (с пшеничными отрубями) в течение часа при 1 атмосфере наблюдалось повышение активности фермента по сравнению с тридцатиминутным автоклавированием. Предварительная стерилизация среды с пшеничными отрубями, которая происходит при повышенном давлении и высокой температуре, приводит субстрат в более доступную для использования грибами форму, являющуюся более подходящим источником углерода для биосинтеза фермента грибом Trichoderma. И это вполне понятно, так как в естественных условиях обитания в почве представители данного рода утилизируют целлюлозосодержащие растительные остатки, как бы адсорбируясь на них. Не исключено, что адгезия мицелия гриба на пшеничных отрубях способна изменять интенсивность и направленность физиолого–биохимических процессов, осуществляемых Trichoderma. В результате такой иммобилизации возможно значительное изменение проницаемости клеточных стенок. Гемицеллюлозный субстрат пшеничные отруби, как показали наши исследования, является индуктором биосинтеза L-лизин--оксидазы Trichoderma. Использование мицелиальной формы инокулята, как нами было показано, повышает активность фермента, что было использовано для максимального накопления L-лизин--оксидазы.

Из литературных источников известно, что оптимальное значение рН питательных сред, предназначенных для культивирования мицелиальных грибов, лежит в пределах 5-6. Нами было изучено влияние исходного рН среды на образование фермента. Максимальное образование фермента наблюдается уже на первые сутки роста гриба при рН 5,6. При этих же условиях наблюдается лучший рост культуры и большая активность фермента.

Весьма важным исследованием было изучение зависимости проявления аминооксидазных активностей грибом Trichoderma от срока культивирования гриба Как видно из таблицы 2, наблюдается расширение спектра проявления аминооксидазных активностей штаммом Tr. harzianum Rifai в зависимости от срока культивирования гриба на среде с пшеничными отрубями. Причем проявляемая активность в отношении деструкции аминокислоты L-лизина всегда была наибольшей.

Таблица Изучение субстратной специфичности штамма Tr. harzianum Rifai в зависимости от возраста культуры, выращенной на среде с пшеничными отрубями.

Возраст культуры 3-и сутки роста 8-ые сутки роста 18-ые сутки роста Активность по лизину 3.9 5.4 6. Ед/мл Субстрат* 1.DL- лизин 100% 100% 100% 2.DL-фенилаланин 1.2% 10.0% 18.0% 3. L-аргинин 0 0 7.0% 4. DL- метионин 0 1.0% 6.0% *Примечание: Штамм-продуцент не проявлял оксидазную активность в отношении L аминокислот: валина, треонина, серина, триптофана, аланина, пролина, цистеина, аспарагина, аспартата, изолейцина, тирозина, глицина, глутамата, лейцина.

Технология культивирования в 3. Trichoderma harzianum Rifai полупромышленных условиях Отработанная в лабораторных условиях технология выращивания гриба Trichoderma harzianum Rifai была применена в полупромышленных условиях.

Ферментация производилась на оборудовании Опытной технологической установки ИБФМ РАН им. Г.К.Скрябина (г. Пущино). Использовали ферментер типа БИОР-01 объемом 100 л с коэффициентом заполнения 0,6.

Подготовленный ферментер засевали посевным материалом Trichoderma.

Посевная доза составляла не менее 5% объема. Продолжительность выращивания 94 98 часов, конечные значения рН от 5,3 до 7.5. После ферментации была оценена активность фермента в культуральной жидкости, которая составила 0,54–0,56 Ед/мл.

Затем культуральную жидкость направляли на участок предварительной очистки, где мицелий гриба отделяли фильтрованием под вакуумом на нутч-фильтре. Вес полученной биомассы составил 3,5 кг. Полученный нативный раствор подвергали дополнительному сепарированию на сепараторе типа ОСБ при 9000 об/мин. в течение часа при температуре 2-4С. Нативный раствор в объеме 55л, полученный после отделения биомассы, концентрировали ультрафильтрацией на колонках с полыми волокнами (АР-3,0) до 1,5 л. Концентрат после пропускания через колонку имел удельную активность фермента 3,17 Ед/мл. Концентрат, полученный вышеописанным способом, затем подвергался мембранному фракционированию. Для фракционирования компонентов нативного раствора использовали как стандартные фильтрационные ячейки объемом 200 и 10 мл производства фирмы Биоспектр (С. Петербург), так и проточную систему непрерывного мембранного фракционирования, описанную ниже.

Мембранное фракционирование.

В данном исследовании для доочистки и концентрирования фермента L-лизин- оксидазы была применена последовательная непрерывная, или каскадная, ультрафильтрация. Проводилось также сравнение данного варианта очистки с хроматографическим методом. Выбор размеров пор в мембранах определялся известными из литературы размерами молекул фермента. На первом этапе с использованием мембраны с размерами пор 0,22 мкм проводилась условная стерилизация раствора и удаление механических примесей. Затем удаляли примеси белков, с размером молекул более 500 кДа, после этого проводили более тонкую очистку раствора с мембранами 300 кДа, на последней стадии концентрировали фермент и промывали его фосфатным буферным раствором с использованием мембран с порами менее 50 кДа. Данный процесс осуществлялся как в каскадном варианте, так и режиме непрерывной проточной фильтрации. В результате получены сходные результаты.

Во фракциях определяли содержание белка и активность фермента. За чистотой продукта наблюдали методом капиллярного электрофореза.

На рисунке 3 представлены спектры исходного раствора до мембранной очистки. Из рисунка видно, что раствор характеризуется большим числом полос не известной идентификации и данный спектр указывает на загрязненность препарата различными органическими соединениями (представленные графики получены с помощью прибора Капель-105).

Интенсивность сигнала, мАВ 5.33 mAU мин Capel 1 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Время, мин.

Рисунок 3. Спектр исходного концентрата фермента до очистки (капиллярный электрофорез) Условия анализа: фосфатный буфер, рН 7,4, 20мМ, длина волны 220нм, напряжение 15кВ, ток 64 мкА. Ввод пробы при 40/10 мБар/с.

2.59 mAU Интенсивность сигнала, мАВ мин 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Время, мин.

а.

21.3 mAU Интенсивность сигнала, мАВ Capel мин 12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Время, мин.

б.

Рисунок 4. Спектры растворов фермента (0,05мг/мл)после мембранной очистки в двух различных масштабах (а – до 2,59 мАВ и б – до 21,3 мАВ) Условия анализа: фосфатный буфер, рН 7,4, 20мМ, длина волны 220нм, напряжение 15кВ, ток 64 мкА. Ввод пробы при 40/10 мБар/с Для характеристики чистоты препарата после мембранной очистки был получен спектр фермента представленный на рисунке 4 в двух различных масштабах (до 2, и до 21,3 мАВ). Видно, что спектр очищенного фермента представлен широкой полосой от 3 до 12 минут, что является характерным для оксидаз и пероксидаз различного строения.

При уменьшении концентрации фермента до мг/мл наблюдается 0, уменьшение максимума при 6-8 мин, при этом полоса при 4 мин сохраняется.

Это дает возможность предположить, что максимум полосы L-лизин--оксидазы находится в данном диапазоне. Выход фермента при последовательной мембранной фильтрации составил до 85%, при этом содержание белка наблюдалось, как и при хроматографическом выделении на уровне 0,2 мг/мл а удельная активность была равна 50Ед/мг белка.

Определение антивирусной активности L-лизин--оксидазы на 4.

опасные фитовирусы В качестве объекта исследования антивирусной активности были использованы опасные фитовирусы: тосповирус некротической пятнистости бальзамина (Impatiens necrotic spot tospovirus) и неповирус кольцевой пятнистости табака (Tobacco ringspot virus).

Для определения антивирусной активности L-лизин--оксидазы на опасные фитовирусы к соку растений добавлялась культуральная жидкость гриба Trichoderma harzianum Rifai в различных разведениях для получения конечной активности L лизин--оксидазы 0,1;

0,5;

1,0;

2,0 Ед/мл.

После этого проводили полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с обратной транскрипцией. С кДНК после обратной транскрипции проводили амплификацию, используя праймеры из диагностических протоколов ЕОКЗР.

Далее проводили электрофорез с продуктами амплификации.

Полученные результаты свидетельствуют о проявлении (рисунок 5) антивирусной активности по отношению к исследуемым фитовирусам.

а. б.

Рисунок 5. Электрофореграммы: а) влияние L-лизин--оксидазы на тосповирус некротической пятнистости бальзамина (Impatiens necrotic spot tospovirus) и б) на неповирус кольцевой пятнистости табака (Tobacco ringspot nepovirus).

*Примечание. М-маркер длины продукта ПЦР, ряд 1 – контроль (зараженное растение без внесения культуральной жидкости, ряд 2 – активность культуральной жидкости равна 0, Ед/мл, ряд 3 – 0,5 Ед/мл, ряд 4 – 1 Ед/мл, ряд 5 – 2 Ед/мл.

Определение антивирусной активности в 5. L-лизин--оксидазы отношении вируса клещевого энцефалита Нами было проведено определение цитотоксического действия L-лизин- оксидазы на перевиваемые линии клеток и противовирусной активности L-лизин- оксидазы в отношении вируса клещевого энцефалита.

Для определения цитотоксического действия на L-лизин--оксидазы перевиваемые линии клеток, клетки SPEV и Vero E6 выращивали в 96-луночных планшетах на питательных средах, описанных выше, а затем после образования монослоя клеток в лунках планшетов к ним последовательно добавляли L-лизин- оксидазу в разных концентрациях 2.0, 1.0, 0.5, 0.25, 0.1, 0.05, 0.025, 0.012, 0.006, 0.003, 0.0012, 0.0006 мг/мл. Токсический эффект препарата оценивали по развитию цитопатического действия (ЦПД) (гибель клеток). Было установлено, что в обеих линиях клеток выраженный токсический эффект развивается в концентрациях 0. мг/мл и выше. Концентрации 0.025 мг/мл и 0.012 мг/мл являются максимально допустимыми, хотя и вызывают тормозящее действие на размножение клеток.

При определении антивирусной активности к вирусу клещевого энцефалита были подготовлены последовательные 10-кратные разведения вируса (от 10-2 до 10 ), которые затем вносили по 100 мкл в лунки 96-луночных планшетов с монослоем клеток SPEV. В ряд (Н) вносили поддерживающую среду без вируса. Контакт вируса с клетками проводили в течение 1 часа при +37°С.

Учет реакции проводили ежедневно в течение 7 дней, наблюдая за развитием ЦПД вируса на клетки, просматривая лунки планшетов под инвертированным микроскопом. Титр вируса оценивали в lg ЦПД100.

Было установлено, что титр вируса в контроле составил 8,0 lg ЦПД100, а с L лизин--оксидазой как в концентрации 25 мкг/мл, так и 12,5 мкг/мл составил 5,0 lg ЦПД100 (таблица 3).

Так как в контрольном титровании вируса не удалось обнаружить ни одной живой клетки, то обнаружение живых клеток в лунках с L-лизин--оксидазой свидетельствует о ее противовирусной активности. Индекс противовирусной активности составил 3 lg.

Таблица Результат испытания противовирусного действия L-лизин--оксидазы 1**** 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 ЦПД* ЦПД ЦПД ЦПД ЦПД ЦПД ЦПД ЦПД ЦПД ЦПД ЦПД ЦПД A*** ЦПД ЦПД ЦПД ЦПД ЦПД ЦПД ЦПД ЦПД ЦПД ЦПД ЦПД ЦПД B ЦПД ЦПД ЦПД ЦПД ЦПД ЦПД ЦПД ЦПД ЦПД ЦПД ЦПД ЦПД C ЦПД ЦПД ЦПД ЦПД ЦПД ЦПД ЦПД ЦПД ЦПД ЦПД ЦПД ЦПД D ЖК** ЖК ЖК ЖК ЖК ЖК ЖК ЖК ЦПД ЦПД ЦПД ЦПД E ЖК ЖК ЖК ЖК ЖК ЖК ЖК ЖК ЦПД ЦПД ЦПД ЦПД F ЖК ЖК ЖК ЖК ЖК ЖК ЖК ЖК ЦПД ЦПД ЦПД ЦПД G ЖК ЖК ЖК ЖК ЖК ЖК ЖК ЖК ЖК ЖК ЖК ЖК H Примечание: * - цитопатическое действие (гибель клеток), ** - живые клетки *** - номера горизонтальных рядов на 96-луночном планшете **** - номера вертикальных рядов на 96-луночном планшете ВЫВОДЫ 1. Показана биологическая и биохимическая стабильность культуральной жидкости Trichoderma harzianum Rifai F180 в процессе длительного хранения (семь лет, при температуре +4С).

2. Показан индуцирующий эффект гемицеллюлозного субстрата (пшеничных отрубей) на биосинтез L-лизин--оксидазы. Добавление в среду пшеничных отрубей увеличивает активность фермента на 5-е сутки роста до 1,2 Ед/мл. Определены оптимальные условия биосинтеза L-лизин--оксидазы в лабораторных условиях.

3. Осуществлена разработка препаративных методов выделения и очистки L лизин--оксидазы (хроматографического и мембранного методов). Предложена производственная схема получения фермента L-лизин--оксидазы и осуществлена наработка исходной культуральной жидкости гриба с удельной активностью L-лизин -оксидазы 50 Ед/мг белка на ферментере БИОР-01 в полупромышленных условиях.

Проведен поиск зараженного вирусами растительного материала и 4.

разработана тест-система для выявления антивирусного действия L-лизин--оксидазы на объектах растительного происхождения.

5. Впервые установлена антивирусная активность культуральной жидкости Trichoderma harzianum Rifai штамм F180 продуцента фермента L-лизин--оксидазы с активностью 2 Ед/мл по отношению к тосповирусу некротической пятнистости бальзамина (Impatiens necrotic spot tospovirus) и с активностью 1 Ед/мл по отношению к неповирусу кольцевой пятнистости табака (Tobacco ringspot nepovirus).

Впервые исследовано влияние L-лизин--оксидазы на ряд опасных 6.

вирусных инфекций человека: вирус клещевого энцефалита и вирус Западного Нила (сем. Flaviviridae), вирус Синдбис (Alphavirus), вирус Дхори (сем. Orthomyxoviridae), вирус Тягиня (сем. Bunyaviridae). Максимальная антивирусная активность L-лизин- оксидазы была показана в отношении вируса клещевого энцефалита. При добавлении L-лизин--оксидазы в концентрациях как 25 мкг/мл, так и 12,5 мкг/мл было отмечено снижение титра вируса клещевого энцефалита с 8,0 lg ЦПД100 до 5,0 lg ЦПД100, что показывает ее антивирусное действие. Выраженный цитотоксический эффект фермента L-лизин--оксидазы в обеих перевиваемых линиях клеток SPEV и Vero Е6, развивался в концентрациях 0,05 мг/мл.

Практические рекомендации 1. Рекомендовать возможность, с целью получения и накопления фермента L лизин--оксидазы, хранение культуральной жидкости продуцента Trichoderma harzianum Rifai F180 при температуре +4 С 2. Рекомендовать для наработки L-лизин--оксидазы штаммом Trichoderma harzianum Rifai F180 среду с использованием индуктора L-лизин--оксидазы гемицеллюлозного субстрата (пшеничных отрубей).

3. Рекомендовать L-лизин--оксидазу Trichoderma harzianum Rifai F180 для разработки мероприятий по отношению к опасным заболеваниям растений:

тосповирусу некротической пятнистости бальзамина (Impatiens necrotic spot tospovirus) и к неповирусу кольцевой пятнистости табака (Tobacco ringspot nepovirus).

4. Рекомендовать L-лизин--оксидазу Trichoderma harzianum Rifai F180 для разработки мероприятий по отношению к опасному заболеванию человека: вирусу клещевого энцефалита.

Используемые в автореферате сокращения:

SPEV – перевиваемые линии клеток почки эмбриона свиньи 1.

Vero Е6 - перевиваемые линии клеток почки эмбриона зеленой мартышки 2.

ЕОКЗР – Европейская организация по карантину и защите растений 3.

ЖК – живые клетки 4.

КЭ – вирус клещевого энцефалита 5.

ЛО – L-лизин--оксидаза 6.

нбм – новорожденные белые мыши.

7.

ПЦР – полимеразная цепная реакция 8.

ЦПД – цитопатическое действие 9.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

Шнейдер Ю.А. L-лизин--оксидаза — экзоцеллюлярный фермент Trichoderma 1.

sp / Пакина Е.Н., Смирнова И.П., Хасанов И.Ш., Шнейдер Ю.А. // Научно практический журнал «Проблемы медицинской микологии». С.-Петербург. 2009.

Том 11. № 2. С.103.

Шнейдер Ю.А. Биологическая и биохимическая стабильность метаболитов 2.

почвенного сапрофита Trichoderma harzianum Rifai / Пакина Е.Н., Шнейдер Ю.А., Смирнова И.П. // Вестник Российского университета дружбы народов. Серия «Агрономия и животноводство». М., 2009. №4. С.27-32.

Шнейдер Ю.А. Гемицеллюлозный субстрат — индуктор биосинтеза L-лизин 3.

-оксидазы триходермой / Смирнова И.П., Шнейдер Ю.А. // Вестник Российского университета дружбы народов. Серия «Агрономия и животноводство». М., 2010. №1.

С. 20-26.

Шнейдер Ю.А. Тосповирусы на декоративных культурах / Шнейдер Ю.А., 4.

Приходько Ю.Н., Живаева Т.С., Белошапкина О.О.// «Защита и карантин растений». М., 2010. №10. С.32-35.

Шнейдер Ю.А. Выявление тосповируса некротической пятнистости бальзамина в 5.

Российской Федерации / Шнейдер Ю.А., Приходько Ю.Н., Живаева Т.С., Шероколава Н.А. / Тезисы VI Международной конференции: Биоресурсы и вирусы. Киев, Украина, 2010. С. 253-254.

Шнейдер Ю.А. Технологии выделения и очистки L-лизин--оксидазы / 6.

Смирнова И.П., Шкинев В.М., Руднев А.В., Шнейдер Ю.А., Кузовников А.Е. // Биотехнология. М., 2010. № 6. С.52-60.

Шнейдер Ю.А. Культивирование сапрофитного гриба триходерма и 7.

биосинтез L-лизин--оксидазы / Шнейдер Ю.А., Хомик А.С., Кишмахова Л.М., Смирнова И.П. // Вестник Российского университета дружбы народов. Серия «Агрономия и животноводство». М., 2010. № 4, С.49-55.

8. Shneyder Yu.A. Metabolic stability of soil saprophyte Trichoderma spp. in association with other soil fungi. / Shneyder Yu.A., Karimova E.V., Kishmahova L.M., Smirnova I.P. / Abstracts book. International conference: Ecology of soil microorganisms, Prague, Czech Republic. 2011. P. 131.

Шнейдер Ю.А. Определение оптимального состава среды для биосинтеза L 9.

лизин--оксидазы гриба Trichoderma harzianum Rifai / Шнейдер Ю.А., Смирнова И.П. // Научно-практический журнал «Проблемы медицинской микологии». С. Петербург, 2011. Том 13. № 2. С.123.

10. Shneyder Yu.A. L-lysine--oxidase biosynthesis by soil saprophyte Trichoderma harzianum Rifai / Shneyder Yu.A., Smirnova I.P., Karimova E.V. / Abstracts book.

International conference: Renewable Wood and Plant Resources: Chemistry, Technology, Pharmacology, Medicine. St-Petersburg, 2011. P. 193-194.

Шнейдер Ю.А. Выявление вируса кольцевой пятнистости табака в растительном 11.

материале с помощью метода ИФА и ПЦР / Шнейдер Ю.А., Приходько Ю.Н., Живаева Т.С. / Материалы Международной научно-практической конференции: Интегрированная защита растений: стратегия и тактика. Минск, Республика Беларусь, 2011. С.588-591.

Шнейдер Ю.А. Заявка на Патент РФ. Регистрационный № 2010150343 / Смирнова 12.

И.П., Шнейдер Ю.А. / Штамм Trichoderma harzianum Rifai – продуцент ингибитора тосповируса некротической пятнистости бальзамина (Impatiens necrotic spot tospovirus) от 09.12.2010 г.

Шнейдер Ю.А. Заявка на Патент РФ. Регистрационный № 2011111098 / Смирнова 13.

И.П., Шнейдер Ю.А. / Штамм Trichoderma harzianum Rifai – продуцент ингибитора вируса кольцевой пятнистости табака (Tobacco ringspot virus) от 24.03.2011г.

Шнейдер Юрий Андреевич (Россия) Исследование L-лизин--оксидазы Trichoderma harzianum Rifai В работе проведено исследование L-лизин--оксидазы – фермента гриба Trichoderma harzianum Rifai. Изучена биологическая и биохимическая стабильность фермента и культуральной жидкости в процессе длительного хранения (7 лет при +4°С). Установлена роль гемицеллюлозного субстрата (пшеничных отрубей) в процессе образования L-лизин--оксидазы грибом Trichoderma harzianum Rifai.

Определены оптимальные условия для максимального образования фермента в лабораторных условиях. Исследована антивирусная активность L-лизин--оксидазы на объектах растительного и животного происхождения. Впервые показан ингибирующий эффект L-лизин--оксидазы Trichoderma harzianum Rifai штамм F на опасные вирусы растительного и животного происхождения: тосповирус некротической пятнистости бальзамина, неповирус кольцевой пятнистости табака и вирус клещевого энцефалита.

Shneyder Yury Andreevich (Russia) Study Trichoderma harzianum Rifai metabolite L-lysine--oxidase In this work we study L-lysine--oxidase - an enzyme of the fungus Trichoderma harzianum Rifai. The enzyme`s and the culture fluid`s biological and biochemical stability were studied during prolonged storage (7 years at 4°C). The role of hemicellulose substrate was found out during the formation of L-lysine--oxidase by the fungus Trichoderma harzianum Rifai. The optimum conditions were determined for enzyme`s maximum formation in vitro. The L-lysine--oxidase`s antiviral activity was investigated at the objects of plant and animal origins. For the first time the inhibitory action of L-lysine--oxidase from Trichoderma harzianum Rifai strain 180 was shown on some dangerous plant`s and human`s viruses: Impatiens necrotic spot tospovirus, Tobacco ringspot nepovirus viruses and Tick-borne encephalitis virus.