Эколого-биологическая роль грибов рода trichoderma в различных биоценозах средней сибири
На правах рукописи
Прудникова Светлана Владиславна
ЭКОЛОГО-БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ ГРИБОВ РОДА
TRICHODERMA В РАЗЛИЧНЫХ БИОЦЕНОЗАХ
СРЕДНЕЙ СИБИРИ
03.00.16-экология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Красноярск, 2000
Работа выполнена на кафедре физиологии и микробиологии Красно-
ярского государственного университета.
Научные руководители:
доктор биологических наук, профессор В.М.Гольд кандидат биологических наук, доцент Т.И.Громовых
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук Н.Д.Сорокин кандидат биологических наук, доцент Т.В.Марченкова
Ведущая организация:
Красноярский государственный аграрный университет
Защита состоится «22 » 2000 г в 14 часов на заседании дис июня сертационного совета К 002.70.01 по присуждению ученой степени кандида та наук в Институте леса им. В.Н.Сукачева по адресу:
660036, Красноярск, Академгородок, Институт леса им. В.Н.Сукачева СО РАН факс: (3912)433-686, e-mail: [email protected]
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института леса им.
В.И.Сукачева СО РАН
Автореферат разослан «17»мая О.А.Зырянова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. В последние годы во всем мире постоянно ухудшается фитопатологическая ситуация в связи с нарушением экологического равно весия в природе - увеличением площадей монокультуры основных видов культурных растений, накоплением возбудителей болезней и вредителей, прогрессирующим повышением их устойчивости к химикатам. В этих усло виях в агроэкосистемах создается необычайно высокий инфекционный фон по сравнению с естественными биогеоценозами, поэтому корневые гнили растений становятся экологически неизбежным явлением.
Одними из естественных антагонистов фитопатогенных микроорга низмов являются грибы рода Trichoderma, обнаруживающие космополитизм и встречающиеся во всех типах почв. В связи с широким применением гри бов рода Trichoderma в самых разных странах, накоплен огромный фактиче ский материал, касающийся физиолого-морфологических, биохимических и генетических исследований грибов, а также технологии получения биопре паратов и их успешного применения. Однако, в большинстве случаев не учитывается тот факт, что внесение антагониста в сложившийся агроценоз вызывает комплекс сложных взаимодействий с почвенной микрофлорой и высшими растениями. Таким образом, недооценка биотических факторов может стать одной из причин более низкой эффективности биопрепаратов по сравнению с лабораторными испытаниями. Кроме того, остается мало изученным вопрос о возможности использования для защиты растений ме стных изолятов грибов рода Trichoderma, как наиболее приспособленных к конкретным почвенно-климатическим условиям. В связи с этим представля ет большой интерес изучение сибирских изолятов рода Trichoderma, кото рые до настоящего времени не исследовались.
Цель работы: изучение грибов рода Trichoderma как потенциальных агентов биологического контроля фитопатогенов в агро- и лесных биоцено зах Средней Сибири.
Задачи исследований:
1. Оценка влияния интродукции гриба Trichoderma harzianum Rifai aggr. на структуру микробоценозов ризосферы и ризоплана зерновых культур и се янцев ели.
2. Исследование динамики численности популяции грибов рода Trichoderma, интродуцированных в различные биоценозы.
3. Оценка эффективности интродукции гриба T.harzianum в оздоровлении корневой системы растений и подавлении фитопатогенов в ризосферной почве.
4. Выделение и идентификация грибов рода Trichoderma, встречающихся в почвах лесопитомников Средней Сибири.
5. Исследование биологических свойств выделенных видов рода Trichoderma.
Научная новизна. Проведенная комплексная экологическая оценка влияния интродукции гриба T.harzianum на различные почвенные микробоценозы позволила определить возможность интродукции активных штаммов рода Trichoderma для биологического контроля фитопатогенов.
Установлены сроки ограничения численности возбудителей корневых гни лей зерновых культур и сеянцев хвойных в Средней Сибири. Выделены ви ды рода Trichoderma, ранее не описанные в почвах лесопитомников Средней Сибири, и проведена оценка их антагонистической активности в отношении почвенных фитопатогенов. В экспериментальных исследованиях, проводи мых в условиях фитотрона и лесопитомника, выявлена необходимость под бора оптимальной дозы биологического агента, превышение которой может приводить к ингибированию прорастания семян и снижению некоторых рос товых показателей сеянцев ели.
Практическая значимость. Выделены и собраны в коллекцию виды грибов рода Trichoderma, встречающиеся в почвах лесопитомников Средней Сибири. Показана возможность использования биологического антагонизма в борьбе с сосудистыми микозами сеянцев хвойных в лесопитомниках Си бири. Отобраны два перспективных штамма, которые могут быть рекомен дованы для защиты сеянцев хвойных в Сибири. Штамм гриба Trichoderma sp. МГ 97 депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микро организмов. Установлено, что использование грибов рода Trichoderma в за щите зерновых культур от корневых гнилей в Красноярском крае не только эффективно подавляет возбудителей инфекции, но и позволяет повысить урожайность и улучшить качество зерна нового поколения.
Апробация работы.
Результаты исследований были представлены на ХХХШ Международной студенческой конференции "Студент и научно технический прогресс" в Новосибирском госуниверситете, 1995;
II Всероссийской научной конференции "Агроэкология и устойчивое разви тие регионов" в КрасГАУ, 1998;
II Региональной научной конференции "Экология Южной Сибири - год" в Хакасском государственном университете, 1998;
IUFRO International Symposium "Larix-98: World Resources for Breeding, Resistance and Utilization" Krasnoyarsk, 1998.
Публикации: по материалам диссертации опубликовано 15 работ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методической части, четырех глав экспериментальной части, заключения, выводов, библиографического списка, включающего 163 рабо ты отечественных и 138 - зарубежных авторов, приложение. Материалы дис сертации изложены на 139 страницах текста, содержат 10 таблиц, 39 рисун ков, 10 фотографий.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Объектами исследований стали 5 видов грибов, принадлежащих к ро ду Trichoderma Pers.:Fr.: Trichoderma harzianum Rifai aggr, Trichoderma ана морфа Hypocrea gelatinosa (Tode:Fr.), T.virem (Miller, Giddens & Foster) von Arx, T.longibrachiatum Rifai и T.viride Pers.:Fr.
Вид Т. harzianum штамм «Универсальный» был предоставлен станцией защиты растений. Остальные 4 вида были выделены нами из почв лесопи томников Средней Сибири.
Работа состояла из двух этапов. На первом этапе осуществляли интро дукцию гриба T.harzianum Rifai aggr. штамм «Универсальный» в ризосфер ную почву различных агроценозов. Этот штамм используется для защиты растений от широкого спектра фитопатогенов и разрешен для применения в сельском и лесном хозяйстве. На втором этапе проводили выделение и иден тификацию грибов рода Trichoderma, распространенных в почвах лесопи томников Средней Сибири, и оценивали возможность использования абори генных изолятов для защиты сеянцев хвойных в лесопитомниках.
Идентификацию проводили на основании физиолого морфологических и культуральных особенностей выделенных изолятов по методам, предложенным M.Rifai (1960) и J.Bissett (1984, 1991а-с). Изучение антибиотической активности и спектра действия грибов рода Trichoderma в отношении фитопатогенных микромицетов проводили методами перпенди кулярных штрихов и бумажных дисков (Егоров, 1976;
Сэги, 1983). Гиперпа разитическую активность оценивали по методике ЛЛ.Великанова и др.
(1994). Фунгистатическую активность летучих выделений гриба T.harzianum исследовали по методике, предложенной для фитонцидов (Завелишко, Ни колаев, 1990).
В период с 1992 по 1994 гг. был поставлен ряд экспериментов по вне сению спор гриба T.harzianum в ризосферную почву агроценозов. В качестве модельных агроценозов исследовали посевы зерновых культур на опытных делянках Солянского ОПХ КНИИСХ, которое расположено в лесостепной зоне Канско-Рыбинской котловины. Среднегодовое количество осадков 260-400 мм, продолжительность периода с температурой выше +10 °С - 115 120 дней. Почва - выщелоченный чернозем.
Исследовали ризосферную микрофлору зерновых культур яровой пшеницы сорта «Красноярская-83» и ярового ячменя сорта «Кедр». Предпо севную обработку семян спорами гриба T.harzianum проводили методом опудривания. Инфекционная нагрузка - 2 г на 1 кг семян (6x10 спор в 1 г).
Анализ микробного населения ризосферной почвы и степени инфицирован ности корневой системы растений фитопатогенами проводили в различные фазы развития растений (всходы, кущение, колошение, восковая спелость).
Почвенные образцы отбирали по методу Д.Г.Звягинцева (1976). Мето дической основой исследования численности микроорганизмов послужили рекомендации отдела почвенных микроорганизмов Института микробиоло гии РАН. Бактерии, использующие органические формы азота, учитывали на мясопептонном агаре (МПА), бактерии и актиномицеты, использующие ми неральные формы азота - на крахмало-аммиачной среде (КАА), олигонитро филы и аэробные азотфиксаторы - на среде Эшби. Численность микромице тов изучали на среде Чапека и сусловом агаре. Идентификацию микроорга низмов проводили по методикам Берги (1980), В.И.Билай (1977), В.И.Билай и З.А.Курбацкой (1990), Н.А.Красильникова (1974), М.А.Литвинова (1967), Н.М.Пидопличко (1977), T.Watanabe (1994).
Оценку действия гриба T.harzianum на ризопланную микрофлору и морфо-физиологические параметры сеянцев ели сибирской (Picea obovata L) проводили в Проблемной научно-исследовательской лаборатории светофи зиологии и светокультуры КрасГУ. Обработку семян спорами гриба T.harzianum штамм «Универсальный» проводили методом опудривания.
Инфекционная нагрузка - 2 г на 1 кг семян (титр 8,3х109 спор в 1 г). Посев осуществляли в стерильный керамзит. В процессе выращивания поддержи вали температуру 25-30 °С и влажность 55-75%. Образцы для анализа ризо планной микрофлоры сеянцев отбирали через 3,5 месяца.
Оценку влияния предпосевной обработки семян спорами гриба T.harzianum на морфо-физиологические параметры сеянцев ели проводили при различных световых режимах методом двухфакторного дисперсионного анализа: I фактор: предпосевная обработка семян, II фактор: интенсивность света (5 градаций от 32 до 66 Вт/м2 ФАР) Учитывали следующие показатели: всхожесть, длину надземной части, длину главного корня, диаметр корневой шейки, вес надземной и подземной части, количество хвои, концентрацию хлорофилла в хвое.
Возможность использования грибов рода Trichoderma для защиты се янцев хвойных в Сибири исследовали на модельном лесопитомнике, распо ложенном на территории Мининского лесного хозяйства, находящегося в зоне таежного редколесья Восточного Саяна. Среднегодовое количество осадков - 400-600 мм, продолжительность периода с температурой выше + °С - 110-115 дней. Исследовали ризосферную микрофлору и некоторые морфометрические параметры сеянцев ели сибирской. Перед посевом семе на обрабатывали по следующей схеме:
1. Контроль.
2. Семена опудрены спорами гриба T.harzianum (титр 9 x 1 0 9 спор в 1 г) в количестве 7,0 г на 1 кг семян. Инфекционная нагрузка - 1,5 х 105 спор на см2 почвы.
3. Биопрепарат "Триходермин БЛ" (ТУ 10.01.25-88) вносили в почву вместе с посевным материалом. Количество вносимого биопрепарата составляло 125 г на 1 кг семян, инфекционная нагрузка - 6 х 105 спор на 1 см2 почвы.
4. Внесение гриба T.harzianum в почву проводили аналогично варианту № 3, но количество биопрепарата было увеличено в 2 раза (250г на 1 кг семян).
б Инфекционная нагрузка составила 1,2 х 10 спор на 1 см почвы.
Анализировали сеянцы 2-го года вегетации. Учитывали жизнеспособ ность сеянцев и следующие показатели: длину охвоенной части, длину над земной части, длину главного корня, диаметр корневой шейки, величину приростов 1-го и 2-го года, вес надземной части, вес подземной части. Дис персионный анализ и оценку достоверности различий по критерию Фишера для уровня вероятности не менее 95% (Зайцев, 1984) проводили с использо ванием пакета программ Statistica 5.0.
ГЛАВА 3. Взаимоотношения гриба Trichoderma harzianum с микрофло рой ризосферы растений Микробиологический анализ ризосферной почвы и пораженных органов растений показал, что среди фитопатогенов, вызывающих болезни зерновых культур в Красноярском крае, наиболее распространены грибы из родов Biporalis Shoem. и Fusarium Bilai (рис. 1). Сосудистые микозы сеянцев в лесопитомниках чаще всего вызывают грибы из родов Fusarium и Alter naria Nees ex Wall. Несколько реже - Botrytis Mich.ex Fr.,C.ladosporium Link ex Fr. и Pythium Hesse (рис. 2). Выбор именно зерновых и хвойных культур для обследования был обусловлен не только их высокой ценностью в народ ном хозяйстве, но также тем, что большая часть территории, на которой в настоящее время расположены лесопитомники, ранее была занята посевами сельскохозяйственных культур либо находится вблизи них. Поэтому многие из фитопатогенов являются общими для зерновых и хвойных растений.
Фитопатогенные микромицеты, вызывающие болезни зерновых куль тур и сеянцев хвойных, в большинстве случаев обладали средней и сильной чувствительностью к метаболитам гриба T.harzianum (зона отсутствия роста составляла более 15 мм). Наиболее чувствительными оказались грибы родов Biporalis, Alternaria и Botrytis, а из представителей рода Fusarium F.gibbosum, F.avenaceum v. herbarum, F.heterosporum, F.avenaceum, F.moniliforme (диаметр зоны отсутствия роста превышал 30 мм).
Проведенный сравнительный анализ активности метаболитов культу ральной жидкости гриба T.harzianum и ее летучих выделений показал, что зависимость между ними отсутствовала. Этот факт может свидетельствовать о том, что гриб T.harzianum проявляет разные формы антагонистического действия по отношению к фитопатогенам, и при этом контакт с мицелием не является обязательным условием.
Для того, чтобы оценить, насколько избирательно осуществлялось действие вносимых антагонистов, изучали влияние метаболитов гриба T.harzianum на сапрофитную микрофлору почвенного микробоценоза расте ний. Лабораторные исследования показали, что ризосферные бактерии про являли только среднюю и слабую чувствительность к антибиотическим ве ществам гриба T.harzianum (рис. 3).
Виды фитопатогенов Рис. 1. Биологическая активность метаболитов гриба Trichoderma harzianum в отношении фитопатогенов зерновых культур 1. Biporalis australiensis;
8. Fusarium graminearum;
13. F. oxysporum v. orthoceras;
2. Fusarium gibbosum;
9. Fusarium sporotrichiella v. 14. Fusarium moniliforme;
3. Fusarium avenaceumv. poae;
15. Fusarium tabacinum;
herbarum;
10. Fusarium moniliforme v. 16 Fusarium moniliforme v.
4 Fusarium heterosporum;
lactis;
subglutinans;
5. Fusarium sporotrichiella;
11. Fusarium solani v. 17. Fusarium solani;
6. Fusarium solani v. argillaceum;
18. Fusarium flavum.
coeruleum;
12. Fusarium oxysporum;
19. Fusarium nivale;
7. F. avenaceum;
Виды фитопатогенов Рис. 2. Биологическая активность метаболитов гриба Trichoderma harzianum в отношении фитопатогенов сеянцев хвойных 1. Alternaria alternata;
8. Fusarium moniliforme v. lactis;
2. Alternaria tennuis;
9. Fusarium oxysporum v. orthoceras;
3. Botrytis cinerea;
10. Fusarium nivale;
4 Cladosporium epyphillum;
11. Fusarium oxysporum;
5. Pythiura debaryanum;
12. Fusarium solani;
6 Fusarium avenaceum;
13. Fusarium solani v. argillaceum;
7. Fusarium moniliforme;
14. Fusarium sporotrichiella v. sporotrichioides Виды бактерий Рис. 3. Антибиотическая активность гриба Trichoderma harzianum в отношении ризосферных бактерий 1. Actinomyces globisporus, 10. Bacillus idosus, 19. Pseudomonas herbicola, 2. Actinomyces rectus, 11. Bacillus brevis, 20. Pseudomonas pantotropha, 3. Bacillus glutinosus, 12. Bacillus subtilis, 21. Pseudomonas sinuosa, 4. Bacillus coagulans, 13. Bacillus cereus, 22. Pseudomonas liquida, 5. Bacillus tenuissimus, 14. Bacillus oligonitrophilus, 23. Micrococcus roseus, 6. Bacillus natans, 15. Bacillus mesentericus, 24. Micrococcus flavus 7. Bacillus megaterium, 16. Pseudomonas aurantiaca, 25. Micrococcus luteus, 8. Bacillus nudiosporus, 17. Pseudomonas fluorescens, 26. Micrococcus albus, 9. Bacillus mycoides, 18. Pseudomonas carnea, Сапрофитные микромицеты в большинстве оказались слабочувстви тельными, либо совсем нечувствительными к антибиотическим веществам гриба T.harzianum. Исключение составили Aspergillus fumigatus и Penicillium chrysogenum, проявившие среднюю чувствительность к метаболитам антаго ниста.
Для оценки взаимоотношений в почвенном микробоценозе были про ведены исследования влияния метаболитов бактерий на гриб T.harzianum. В результате выяснилось, что из 26-ти исследованных видов ризосферных бак терий только 8 оказывали влияние на гриб T.harzianum, однако в целом, сте пень влияния была слабой за исключением вида P.fluorescens, который про являл среднюю антибиотическую активность в отношении T.harzianum.
Таким образом, взаимоотношения грибов рода Trichoderma с компо нентами микробоценоза ризосферы растений являются разносторонними, а влияние, оказываемое друг на друга, - взаимным. Эти данные подтверждают тот факт, что в естественных условиях большую роль играют конкурентные взаимоотношения с аборигенной микрофлорой почвы, поэтому представля ло интерес исследовать влияние интродукции гриба T.harzianum в ризосфер ную почву на сложившийся комплекс почвенных микроорганизмов.
ГЛАВА 4. Оценка эффективности интродукции гриба Trichoderma harzianum в различные биоценозы 4.1. Изменение структуры микробоценозов при интродукции гриба Trichoderma harzianum в ризосферу растений По данным исследований, проводимых в 1989-1992 гг, почвы Красно ярского края повсеместно имеют высокую заселенность конидиями возбуди телей корневых гнилей. В среднем, количество патогенных грибов в ризо сфере превышает порог вредоносности в 3-5 раз и повышается к концу веге тационного периода (Воронцов, Семенкова, 1988;
Халанская, Громовых, Анисимова, 1992). Это свидетельствует о необходимости проведения меро приятий по оздоровлению почв сельскохозяйственных и лесных угодий.
В течение вегетационного периода 1994 г. изучали влияние интродук ции гриба T.harzianum на общую численность микроорганизмов, а также на численность сапрофитных и патогенных микромицетов, обитающих в ризо сфере пшеницы. Анализ динамики общей численности бактерий показал, что наибольшее количество бактерий было отмечено в фазу кущения (июль) и составило (11,8±0,2)х106 клеток в 1г воздушно-сухой почвы. Интродукция гриба T.harzianum в ризосферу пшеницы привело к снижению общего коли чества бактериальной микрофлоры на 12,7-14,2% по сравнению с контро лем. Однако, в фазу восковой спелости различия в контроле и опытном ва рианте уже не являлись достоверными.
Не смотря на некоторое снижение общей численности бактерий в опытном варианте, качественный состав не претерпел значительных измене ний и процентное соотношение представителей основных семейств досто верно не изменялось во все фазы развития растений. Преобладающими, как правило, являлись неспоровые формы бактерий, среди которых доминиро вали представители сем. Pseudomonodaceae, к концу вегетационного перио да возрастала доля спорообразующих бактерий сем. Васillaсеае.
Анализируя процентное соотношение представителей различных ро дов микромицетов ризосферы пшеницы, можно отметить, что в качествен ном составе произошли изменения. Количество сапрофитных микромицетов родов Penicillium и Aspergillus достоверно не изменялось, в то же время чис ленность фитопатогенов из родов Biporalis и Fusarium в опытном варианте уменьшилось в 3,6-5,4 раза. Представители рода Alternaria в вариантах с внесением спор T.harzianum обнаружены не были (табл. 1).
В данной работе оценивалась возможность применения грибов рода Trichoderma для защиты сеянцев хвойных от возбудителей сосудистых ми козов. Поскольку такие исследования в Красноярском крае проводились впервые, был поставлен лабораторный эксперимент по выращиванию сеян цев ели в условиях светокультуры, на основании результатов которого могли бы судить о целесообразности применения грибов рода Trichoderma для за щиты сеянцев хвойных пород.
Таблица Численность микромицетов в ризосфере пшеницы (контроль / опыт) Представители Количество микромицетов, тыс. в 1 г почвы родов Июль Август Сентябрь М±m M±m М±m t(эксп) t(эксп) t(эксп) Penicillium 0,4 127,5±2,1 2,0 135,0±14,4 0, 114,5±11. 121,5±2,0 129,9±12, 107,5±9, 34,8±6, Aspergillus 45,0±6,7 2,4 85,7±12,3 2, 1, 26,5±3,4 68,4±8, 27,5±2, 16,5±1,3 10,0±2, Trichoderma 12,4±1,8 *8,2 0, *6, 28,3±1,4 14,6±5, 36,6±2, Alternaria 27,5±6,4 *4,0 - 32,5±8,0 34,2±10, 0 1,4±0, Biporalis 92,5±9,9 *9,0 132,5±10,6 *8,0 174,5±12,1 *8, 3,0±0,5 36,7±5,5 32,5±11, 25,7±2,2 27,5±3, Fusarium *7,7 *5,2 40,5±6,8 *4, 7,0±1,0 10,0±0,9 10,0±2, 22,5±1, Mucor 8,0±1,5 *3,0 - 10,0±2,5 0, 3,0±0,6 13,6±3, Примечание: знаком "*" отмечено достоверное различие с контроль ным вариантом при 95% уровне вероятности Численность фитопатогенных грибов из рода Fusarium и Alternaria в ризоплане контрольных сеянцев была достаточно велика и составляла 24 и 7% соответственно. Это свидетельствовало о том, что большая доля семян ели содержала внутреннюю инфекцию, поскольку в стерильном керамзите сеянцы не могли инфицироваться фитопатогенами из внешней среды. Обра ботка семян спорами гриба T.harzianum привела к уменьшению общей чис ленности ризопланной микрофлоры в 1,5 раза. Вероятно, это связано с вы сокой биологической активностью «Универсального» штамма гриба T.harzianum и низкой конкурентноспособностью микроорганизмов, обитаю щих в ризоплане сеянцев, выращиваемых в керамзите, а не в почве. Кроме того, изменилось соотношение среди представителей как бактериальной, так и грибной микрофлоры сеянцев. Количество неспоровых бактерий в опыт ном варианте увеличилось на 22,4%, а количество грибов - на 39,9%. Рост общей численности грибов в ризоплане сеянцев произошел в основном за счет увеличения популяции грибов рода Trichoderma, в том числе вносимых T.harzianum, в то же время численность фитопатогенных грибов родов Alternaria и Fusarium значительно снизилась по сравнению с контрольным вариантом и составила всего 6 %.
Предварительные исследования в лаборатории светокультуры показа ли возможность использования грибов рода Trichoderma для защиты сеянцев от возбудителей сосудистых микозов, вызываемых грибами Alternaria и Fusarium. В дальнейших экспериментах исследовали влияние интродукции гриба T.harzianum в ризосферную микрофлору сеянцев ели на модельном лесопитомнике Мининского лесхоза.
Анализ динамики общей численности бактерий в ризосфере ели, про водимый в вегетационный период 1997 г, показал, что максимальная чис ленность бактериального населения приходилась на июль и составила (6,14±0,62)x107 клеток в 1 г почвы. В августе численность бактериального населения уменьшилась до (2,57±0,34)х10 клеток в 1 г почвы. Количество бактерий в ризосфере ели коррелировало со среднемесячной температурой (r = 0, 5 9 ) и осадками ( r = 0, 4 1 ). Обогащение ризосферы ели грибами T.harzianum привело к снижению общей численности бактерий в июле на 38,1% по сравнению с контролем. Однако, в последующие месяцы это раз личие уменьшилось и не являлось достоверным.
Соотношение представителей основных семейств бактерий в ризосфе ре сеянцев существенных различий в контрольном и опытном вариантах не обнаруживало. В течение всего вегетационного периода количественно пре обладали неспоровые бактерии, обладающие высокой скоростью размноже ния и активным полиферментным аппаратом. К концу вегетационного пе риода возрастала доля спорообразующих бактерий.
Обогащение ризосферы ели грибами T.harzianum не привело к досто верным изменениям общей численности микромицетов по сравнению с кон трольным вариантом. В течение всего вегетационного периода она изменя лась слабо и составляла от 103±31 до 144±37 тыс. пропагул в 1 г почвы.
Идентификация представителей сапрофитной микобиоты ризосферы пока зала, что во всех почвенных образцах доминировали представители рода Penicillium. Численность популяций представителей фитопатогенных мик ромицетов в контрольном варианте была достаточно высокой. Преобладали грибы родов Alternaria и Fusarium. Интродукция спор гриба T.harzianum в ризосферу сеянцев ели позволила достоверно уменьшить численность фито патогенных микромицетов в опытных образцах (табл. 2).
4.2. Динамика численности популяции грибов рода Trichoderma, при интро дукции в различные биоценозы В настоящей работе был проведен анализ динамики численности по пуляции грибов T.harzianum, интродуцированных в ризосферу пшеницы и сеянцев ели вместе с посевным материалом. В результате было установлено, что в первый месяц после интродукции происходило увеличение плотности популяции грибов рода Trichoderma и некоторое время она находилась на достаточно высоком уровне: в 2,5-3,3 раза выше, чем в контрольных образ цах. В дальнейшем наблюдалась тенденция снижения плотности популяции грибов рода Trichoderma и постепенного приближения ее к контрольной в конце периода вегетации. В в ризосфере сеянцев ели в опытном варианте численность грибов рода Trichoderma увеличивалась в июле до 31,8 ± 1, тыс. в 1 г ризосферной почвы и сохранялась на таком уровне до конца пе риода наблюдения. Тем не менее, достоверных различий численности в опытном и контрольном вариантах в сентябре отмечено не было (табл. 2).
Эти факты свидетельствуют о том, что интродукция гриба T.harzianum в ес тественный микробоценоз не приводит к длительным экологическим нару шениям.
Таблица Численность микромицетов в ризосфере сеянцев ели (контроль / опыт) Представители Количество микромицетов, тыс. в 1 г почвы родов Июль Август Сентябрь М±m М±m М±m t(эксп) t(эксп) t(эксп) 34,1±1,8 36,3±2,3 99,2±7, Penicillium 1,9 2,86 3, 34,6±1,7 67,0±5, 40,3±2, Aspergillus 23,0±1,4 1,2 22,3±0,9 54,1±2,4 2, 1, 25,7±1,6 20,1±1,6 43,1±3, Trichoderma 9,7±0,5 *15,8 15,8±0,8 *8,8 23,9±2,3 3, 31,8±1,3 31,7±1,6 33,9±1, Fusarium 7,6±0,3 *5,2 5,6±0,3 *11,7 6,2±0,2 3,1±0,8 1,9±0, 5,4±0,2 8,3±0, Alternaria *14,7 5,6±0,3 *7,7 2,1±0,1 2,8±0, 3,7±0, Mucor 0,8±0,1 - 2,4 6,2±0,3 0 4,8±0, Примечание: знаком "*" отмечено достоверное различие с контроль ным вариантом при 95% уровне вероятности ГЛАВА 5. Влияние гриба Trichoderma harzianura на растения 5.1. Влияние гриба T.harzianum на инфицированностъ зерновых культур воз будителями корневых гнилей В 1992-93 гг. в Солянском ОПХ были проведены исследования влия ния интродукции гриба T.harzianum на пораженность корневой системы пшеницы и ячменя возбудителями корневых гнилей. В качестве эталона для сравнения эффективности использовали химический фунгицид пентатиурам.
Идентификация возбудителей болезни позволила установить, что осо бую опасность для зерновых культур представляла гельминтоспориозная инфекция, вызываемая грибами Biporalis australiensis (M.B.Ellis)Tsuda. Ин фицированность корневой системы растений этими грибами в контроле воз растала к концу вегетации и в фазу восковой спелости составила 23,0-33,0 % для ячменя и 51,0-75,0 % для пшеницы в разные годы. Пораженность расте ний грибами из рода Fusarium, была несколько меньше. Исследования пока зали, что пшеница была сильнее подвержена корневым инфекциям, чем яч мень, в том числе и смешанным (гельминтоспориозно-фузариозным).
Предпосевная обработка семян пшеницы и ячменя биологическим (T.harzianum) и химическим (пентатиурам) фунгицидами позволила снизить пораженность зерновых культур возбудителями корневых гнилей, однако эффективность препаратов зависела от специфичности возбудителя и вида исследуемой культуры: наиболее заметный положительный эффект бы по лучен при обработке семян пшеницы;
тенденция снижения инфицированно сти корневой системы грибами из рода Biporalis достигала 52-79%, а гриба ми из рода Fusarium - 69,6-89%, при этом защитное действие биологическо го агента не уступало химическому фунгициду, а в фазу восковой спелости действие гриба T.harzianum было в 1,4-1,9 раза эффективнее.
Интродукция гриба T.harzianum в ризосферу ячменя достоверно сни жала инфицированность корневой системы грибами рода Biporalis на 65,1 82% и была менее эффективна в защите от фузариоза. Протравливание се мян пентатиурамом принесло положительный результат в борьбе с корне выми гнилями только в 1993 г, но к концу вегетационного периода эффек тивность этого препарата заметно снижалась.
Длительное действие биологического предполагает возможность за щитить растения от проникновения фитопатогенов в зерно и развития внут рисемейной инфекции. В дальнейших исследованиях было показано, что об работка посевного материала спорами гриба T.harzianum позволила значи тельно уменьшить количество пораженных семян первого поколения. Эф фективность предпосевной обработки зерна спорами гриба T.harzianum в наших исследованиях оказалась выше по сравнению с химическим протра вителем и достигала 50-90 %. Лабораторная всхожесть зерна, полученного в результате предпосевной обработки спорами T.harzianum, в среднем была на 8,6-10,1 % выше, чем в контроле, а энергия прорастания - на 12,4-12,6%. Ре зультаты исследований также свидетельствуют о том, что предпосевная об работка семян спорами T.harzianum обеспечила достоверную прибавку уро жайности яровой пшеницы на 13,7-21,1% и ячменя - на 9,5-20,3% по сравне нию с контролем.
5.2. Влияние гриба Trichoderma harzianum на физиологические показатели сеянцев ели в условиях светокультуры и лесопитомника Вопрос о влиянии грибов рода Trichoderma на растения ставится мно гими исследователями и является одним из наиболее важных при решении проблемы о возможности использования биологического антагонизма в за щите растений. Модельные эксперименты, проводимые в условиях свето культуры, показали, что при недостатке органических веществ и отсутствии фитопатогенов в субстрате (стерильный керамзит) эффективность грибов T.harzianum, вносимых с семенами ели при посеве, была низкая. Тем не ме нее, в эксперименте было отмечено стимулирование развития корневой сис темы в опытном варианте при интенсивности света 32-52 Вт/м2 ФАР: увели чивалась длина главного корня, диаметр корневой шейки, биомасса корне вой системы, количество хвои, концентрация хлорофилла. Ослабленные се янцы ели, выращиваемые в условиях избыточного освещения (60-66 Вт/м ФАР), оказались не восприимчивыми к действию гриба T.harzianum (рис. 4).
Рис. 4. Влияние предпосевной обработки спорами гриба Trichoderma harzianum на развитие сеянцев ели в условиях светокультуры - контроль, _ _ _ _- обработка спорами T.harzianum Эксперименты, проводимые в условиях лесопитомника, показали, что влияние грибов рода Trichoderma на развитие сеянцев ели проявлялось в большей степени по отношению к корневой системе, чем к надземной части.
Длина главного корня увеличивалась при внесении триходермина-БЛ на 18,3-29,3 %, а биомасса корневой системы - на 36,7 % - при внесении чистых спор T.harzianum и на 10,2-34,7 % - при внесении триходермина-БЛ (рис. 5).
В то же время, длина надземной части и ее биомасса достоверно не изменя лась при всех видах обработки.
Анализ качества сеянцев ели показал, что внесение гриба T.harzianum с посевным материалом позволило увеличить выход здоровых сеянцев по сравнению с контролем. Распределение по категориям жизненного состоя ния изменялось в зависимости от количества внесенного в ризосферу гриба T.harzianum. Наибольшее количество здоровых сеянцев было получено при внесении в почву спор T.harzianum и составляло 84,1 %. В этом же варианте было меньше всего погибших сеянцев - 2,8 %. При внесении триходермина БЛ в количестве 125 г количество здоровых сеянцев составляло 73,6 %, а при дальнейшем увеличении инфекционной нагрузки (250 г триходермина БЛ) - количество здоровых сеянцев уменьшалось до 34,1 % и увеличивалось количество сеянцев с пожелтевшей хвоей.
Рис. 5. Влияние предпосевной обработки спорами гриба T.harzianum на кор невую систему сеянцев ели в условиях лесопитомника 1- контроль, 3 - триходермин-БЛ (125г), 2 - споры T.harzienum, 4 - триходермин-БЛ (250г) Таким образом, интродукция гриба T.harzianum в почву агроценозов и лесопитомников Сибири оказывала оздоравливающее действие на ризо сферную микрофлору и корневую систему растений и не проводила к нару шению сапрофитного комплекса микроорганизмов.
Гриб T.harzianum, как и большинство видов рода Trichoderma предла гаемых в настоящее время для защиты растений, выделен европейскими ис следователями. Но анализ литературных сведений показал, что использова ние для защиты растений стандартных музейных штаммов не всегда прино сит ожидаемый эффект, так как в естественных условиях большую роль иг рают конкурентные взаимоотношения с аборигенной микрофлорой почвы, поэтому с точки зрения экологической безопасности весьма перспективно вести поиск активных штаммов-антагонистов среди представителей абори генных микромицетов рода Trichoderma.
Глава 6. Биологические свойства аборигенных штаммов грибов из рода Trichoderma Обследование почв ряда лесопитомников, расположенных на террито рии Красноярского края, показало, что грибы рода Trichoderma являются типичными представителями микробоценозов. На основании макро- и мик роморфологических признаков, описанных в работах Дж.Биссет (1984, а-с, 1992), нам удалось проанализировать более 200 изолятов и идентифици ровать 4 вида, принадлежащих к 3 секциям.
Секция Pachybasium: Trichoderma анаморфа Hypocrea gelatinosa (Tode:Fr.), Trichoderma virens (Miller, Giddens & Foster) von Arx.
Секция Longibrachiatum: Trichoderma longibrachiatum Rifai.
Секция Trichoderma: Trichoderma viride Pers.:Fr.
Поиск активных антагонистов, которые могут хорошо развиваться в широком диапазоне температур, важен для защиты растений в условиях Си бири, так как данные условия характеризуются резкими колебаниями темпе ратуры и влажности в начале вегетационного периода, когда защитное дей ствие особенно необходимо для растений. Было установлено, что исследуе мые виды имеют не одинаковый температурный оптимум: Trichoderma ана морфа H.gelatinosa и T.viride лучше развивались при температуре 15-20 °С, а T.virens и T.longibrachiatum - при 25-35 °С. Все исследуемые виды активно утилизировали субстраты растительного происхождения.
В настоящей работе был проведен анализ антибиотической и гиперпа разитической активности выделенных аборигенных видов рода Trichoderma по отношению к наиболее опасным и часто встречающимся в лесопитомни ках Средней Сибири почвенным фитопатогенам. Для сравнения использова ли T.harzianum "Универсальный" штамм как эталон.
Исследования показали, что все аборигенные виды проявляли разную степень активности. Наибольшей гиперпаразитической активностью (до баллов по методике ЛЛ.Великанова) обладали Trichoderma анаморфа H.gelatinosa и T.virens. Оценка антагонистической активности метаболитов культуральной жидкости аборигенных видов рода Trichoderma показала, что они обладают способностью к быстрому накоплению антибиотиков во внешней среде и проявляют высокую активность в подавлении роста тест культур (рис. 6).
Рис. 6. Сравнительная оценка антибиотической активности метаболитов аборигенных видов рода Trichoderma Fusarium nivale Bilai, Fusarium avenaceum, Fusarium sporotrichiella v. poae, Fusarium gibbosum Fusarium moniliforme v. lactis, выводы 1. Интродукция гриба T.harzianum в ризосферу растений привела к из бирательному подавлению фитопатогенных микромицетов. В ризосферной почве зерновых культур количество фитопатогенов из родов Biporalis и Fusarium уменьшилось на 40,4-65,8 % в сравнении с контролем;
в ризосфере сеянцев хвойных количество фитопатогенов из родов Altemaria и Fusarium уменьшилось на 65,3-96,8 %. В то же время численность сапрофитных мик ромицетов и бактерий в ризосфере исследуемых растений существенно не изменялось.
2. Анализ динамики численности грибов рода Trichoderma, интроду цированных в естественный микробоценоз, показал, что в течение первых 30-ти суток после внесения спор происходило увеличение плотности попу ляции в 2,5-3,3 раза. В последующие месяцы наблюдалась тенденция к сни жению численности грибов рода Trichoderma и приближение ее к контроль ной. Этот факт может свидетельствовать о том, что интродукция гриба T.harzianum в микробоценоз не приводит к длительным экологическим на рушениям.
3. Предпосевная обработка семян ячменя и пшеницы спорами гриба T.harzianum позволила существенно снизить инфицированность корней воз будителями сосудистых микозов, на 50-90% уменьшить количество семян, содержащих внутреннюю инфекцию, а также повысить урожайность на 20,3 21,1 %.
4. Изучение влияния гриба T.harzianum на развитие сеянцев хвойных в условиях фитотрона и лесопитомника показало, что предпосевная обработка семян спорами гриба является благоприятным фактором для развития кор невой системы, предотвращает ее инфицированность и позволяет увеличить выход здоровых сеянцев.
5. Грибы рода Trichoderma являются типичными представителями почвенной микрофлоры лесопитомников Красноярского края. В результате обследования почв ряда лесопитомников было выделено более 200 изолятов грибов рода Trichoderma, принадлежащих к 4 видам: Trichoderma анаморфа Hypocrea gelatinosa (Tode:Fr.), T.viride Pers.:Fr., T.virens (Miller, Giddens & Foster) von Arx, T.longibrachiatum Rifai.
6. Грибы рода Trichoderma, выделенные из почв лесопитомников Красноярского края подавляют рост возбудителей сосудистых микозов се янцев хвойных. Антагонистическая и гиперпаразитическая активность видов Trichoderma анаморфа Н.gelatinosa и T.virens сопоставима с активностью уже использующегося в защите растений гриба T.harzianum, а в ряде случаев превосходит ее. Высоко активные изоляты выделены из почв малоинфици рованных питомников, что подтверждает сдерживающее действие антагони стов в природных условиях на возбудителей эпифитотий фузариоза.
По материалам диссертации опубликованы следующие работы:
1. Громовых Т. И., Гукасян В. М., Халанская А. П., Саврасова С В., Черняк Н. Г., Ильина Н. О. Экологические аспекты применения биологических и хи мических фунгицидных препаратов / Сб. тез. "Актуальные проблемы биоло гии". Изд-во КГУ: Красноярск, 1994. С. 49.
2. Шмарловская С. В. Эффективность новых форм биологических препара тов в борьбе с корневыми гнилями яровой пшеницы / Тез. Всерос. студ. науч.
конф. "Экология и проблемы зашиты окружающей среды". Изд-во КГУ: Крас ноярск, 1994. С. 14.
3. Шмарловская С. В., Сазикова Н. Г. Экологические аспекты интродукции штаммов грибов Trichoderma в агроценозах / Студент и научно-технический прогресс//Мат. ХХХШ Междунар. студ. конф. НГУ: Новосибирск, 1995. С. 13.
4. Голованова Т. И., Гукасян В. М., Громовых Т.И., Шмарловская СВ. Дей ствие грибов рода Trichodeima на компоненты агроценозов томатов.
/Методические аспекты экспериментальной работы в исследованиях агрономи ческого профиля: Мат. регион, науч. конф. КрасГАУ. Красноярск, 1995. С.56 57.
5. Громовых Т. И., Тюльпанова В.А., Гукасян В.М., Шмарловская СВ., Ха ланская А.П. Эффективность использования биологических препаратов против корневых гнилей злаков в лесостепной зоне Красноярского края /Методические аспекты экспериментальной работы в исследованиях агрономического профи ля: Мат. регион, науч. конф. КрасГАУ. Красноярск, 1995. С.47-48.
6. Шмарловская С В., Громовых Т. И., Гольд В. М., Тюльпанова В. А.
Использование биологического контроля против возбудителей корневых гнилей зерновых культур / Сб. науч. тр. "Регуляция численности беспозво ночных и фитопатогенов". Новосибирск, 1997. С. 114-119.
7. Громовых Т. И., Гукасян В.М., Голованова Т.И., Шмарловская С. В.
Trichoderma harzianum Rifai aggr. как фактор повышения устойчивости тома тов к возбудителям корневой гнили // Микология и фитопатология, 1998.
Вып. 2. С. 72-76.
8. Громовых Т. И., Шмарловская С. В., Гусева Е. А. Оценка антагонисти ческой активности некоторых штаммов гриба Trichoderma harzianum в от ношении возбудителей сосудистых микозов сеянцев хвойных. Депонирована в ВИНИТИ за № 466-В98 от 17.02.98 г.
9. Шмарловская СВ. Сравнительная оценка действия биопрепарата на ос нове гриба Trichoderma harzianum на ризосферную микобиоту в различных биоценозах / Мат. Всерос. науч. конф. "Агроэкология и устойчивое развитие регионов", посвящ. 45-лет КрасГАУ. Красноярск, 1998. С. 41-43.
10. Gromovykh Т. I., Gukasyan V. М., Golovanova Т. I, Shmarlovskava S. V..
Shilkina E. A. Perspectives of biopreparatioas use in increase of Larix sibirica seedling keeping. In "Larix-98: World Resourses for Breeding, Resistance and Utilization" IUFRO Int. Symp., Sept. 1-5, Krasnoyarsk, 1998 (abstracts) P. 36-37.
11. Громовых В. С, Махова Е. Г., Шмарловская С В. Перспективы ис пользования аборигенных штаммов рода Trichoderma против фузариозов в лесопитомниках Южной Сибири / Мат. Южно-Сибирской Региональной на учной конференции студентов и молодых ученых 11-13 ноября 1998, г. Аба кан "Экология Южной Сибири - 2000 год". Абакан, 1998. С. 94.
12. Громовых Т.И., Шмарловская СВ., Голованова Т.И., Корянова Т.А., Шилкина Е.А. Перспективы использования биометода для лесовозобновле ния в Сибири / Мат. VI регион, научно-практ. и метод, конф.
"Производительные силы Красноярского края в современных социально экономических условиях". - Красноярск, 1999. - С. 44.
13. Gromovykh Т., Shmarlovskava S., Corjanova Т., Malinovsky A. Use of different formes of Trichoderma as a soil fumigant Picea obovata II Ann. Int.
Research Conf. On Methyl Bromide Alternatives And Emissions Reductions. November 1-4, - San Diego, 1999.-P. 38/1-38/5.
14. Gromovykh Т., Tulpanova V., Shmarlovskava S., Gromovykh V., Makhova H. Strains of Trichoderma benifit for biological control seedlings pathogenes // Ann. Int. Research Conf. On Methyl Bromide Alternatives And Emissions Reductions. - November 1-4, - San Diego, 1999.- P. 39/1-39/4.
15. Гукасян B.M., Громовых Т.Н., Голованова Т.Н., Шмарловская С.В. Ма хова Е.Г. Микробы-антагонисты как фактор устойчивости сеянцев хвойных / Тез. докл. Международного совещания "Методы оценки состояния и устой чивости сеянцев хвойных". 5-9 августа, Красноярск, 1999.
Подписано в печать 13.05.00. Формат 60x84/16.
Бумага «Xerox Paper». Печать офсетная.
Усл.печ.л. 1,0. Уч.-изд. л. 1,0.
Тираж 100 экз. Заказ № 120. Цена договорная.
Издательский центр Красноярского государственного университета.
660041 Красноярск, пр. Свободный, 79.
Отпечатано с оригиналов заказчика в ИЦ КрасГУ, ООП биологического факультета.