Молекулярно-цитогенетическая характеристика коллекции промежуточных пшенично-пырейных гибридов
На правах рукописи
КРУПИН ПАВЕЛ ЮРЬЕВИЧ
МОЛЕКУЛЯРНО-ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА
КОЛЛЕКЦИИ ПРОМЕЖУТОЧНЫХ ПШЕНИЧНО-ПЫРЕЙНЫХ
ГИБРИДОВ
Специальность: 03.02.07 – генетика, 03.01.06 – биотехнология
(в том числе бионанотехнологии)
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание учёной степени
кандидата биологических наук
Москва 2011
Работа выполнена в научно-образовательном Центре молекулярной биотехнологии Российского государственного аграрного университета – МСХА имени К.А. Тимирязева доктор биологических наук Научные руководители:
Карлов Геннадий Ильич кандидат биологических наук Дивашук Михаил Георгиевич доктор биологических наук,
Официальные оппоненты:
профессор Пухальский Виталий Анатольевич кандидат биологических наук Большева Надежда Логиновна
Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН
Защита состоится «15» июня 2011 г. в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 220.043.10 при Российском государственном аграрном университете – МСХА имени К.А. Тимирязева по адресу: 127550, Москва, ул. Тимирязевская, д. 49.
С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева.
Автореферат разослан «13» мая 2011 г.
и размещён на сайте университета www.timacad.ru Учёный секретарь Диссертационного совета Л.С. Большакова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Пшеница является важной продовольственной культурой. Рост населения Земли требует повышения производства продуктов питания к 2050 году в 2 раза (FAO, 2010), что делает необходимым увеличение объёмов производства пшеницы во всем мире.
Однако решение этой задачи наталкивается на ряд глобальных проблем (изменение климата, развитие эпифитотий, эрозия пахотных земель), преодоление которых требует селекционно-генетического улучшения пшеницы.
Генетическая эрозия пшеницы требует привлечения новых генетических ресурсов с помощью отдалённой гибридизации. Отдельные виды пырея с различной геномной конституцией – средний (Thinopyrum intermedium, 2n=42, JSJS), удлиненный (Th. elongatum, 2n=14, J), понтийский (Th. ponticum, 2n=70, JJJJSJS) – являются донорами хозяйственно-ценных признаков и относительно хорошо скрещиваются с пшеницей, что позволило создать пшенично-пырейные гибриды (Цицин, 1978). В ходе селекции были созданы ценные формы промежуточных пшенично-пырейных гибридов (ППГ), включающие в свою родословную несколько видов пырея, которые отличаются многолетним образом жизни, устойчивостью к болезням и вредителям, устойчивостью к засолению и морозостойкостью.
Следовательно, они могут использоваться как самостоятельный объект экологически устойчивых агросистем (Bell, 2010), так и в качестве эффективного селекционного мостика для передачи полезных генов пырея в геном пшеницы (Chang et al., 2010) Созданные в России ППГ отличаются большим биоразнообразием и подробно охарактеризованы с точки зрения морфологии, биологии развития, агротехники (Белов, 2001). Существенным препятствием к их внедрению в селекционные программы является отсутствие комплексной молекулярно цитогенетической характеристики. В то же время применение современных генетических и биотехнологических подходов объяснило бы наблюдаемое биоразнообразие на геномном, хромосомном, генетическом и молекулярном уровнях. Такая характеристика позволит выявить полиморфизм пырейного субгенома ППГ, а также в перспективе создать маркеры на полезные гены пырея, что предоставило бы возможность направленно интрогрессировать их в геном пшеницы. Кроме того, исследование пшенично-пырейных амфидиплоидов позволит глубже понять взаимодействие и отношения геномов пшеницы и пырея.
Цели и задачи работы. Цель работы – дать комплексную молекулярно-цитогенетическую характеристику коллекции пшенично пырейных гибридов.
В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:
1. Провести скрининг коллекции ППГ на наличие пырейного генома с использованием молекулярных маркеров.
2. Установить особенности геномной конституции ППГ с помощью геномной гибридизации in situ.
3. Адаптировать SSR-маркеры пшеницы для изучения геномов пырея среднего и пырея удлиненного.
4. Изучить полиморфизм SSR-локусов пшеницы и пырея в геномах ППГ.
5. Оценить коллекцию ППГ на устойчивость к листовой ржавчине и поиск нуклеотидной последовательности, гомологичной гену устойчивости к листовой ржавчине.
6. Выявить линии ППГ, несущие гены высокомолекулярных глютенинов пырея.
Научная новизна. Результаты по молекулярно-цитогенетической характеристике коллекции пшенично-пырейных гибридов являются оригинальными. Впервые установлены хромосомные числа и геномный состав 45 форм коллекции первичных и вторичных ППГ. Впервые выявлены различия между изучаемыми ППГ по геномному составу и конституции пырейных хромосом с использованием молекулярно-цитогенетических маркеров (GISH, SCAR-, RAPD-, SSR-маркеры). Выявлены SSR-маркеры пшеницы, которые могут быть использованы для изучения геномов пырея среднего и пырея удлиненного. Образцы изучаемой коллекции ППГ оценены на устойчивость к 10 изолятам листовой ржавчины. Выявлен фрагмент гена кандидата устойчивости к листовой ржавчине. Выявлены формы ППГ, несущие гены высокомолекулярных глютенинов пырея.
Практическая значимость. Результаты работы имеют важное теоретическое и практическое значение и могут быть использованы в селекции пшеницы. Линии с выявленными хромосомными перестройками могут служить селекционным мостиком для создания интрогрессивных форм пшеницы, несущих хозяйственно-ценные гены пырея. Выявленные SSR маркеры пшеницы, пригодные для анализа геномов пырея, могут быть применены для оценки биоразнообразия существующих коллекций ППГ и пырея в качестве исходного селекционного материала. Выявленные устойчивые к листовой ржавчине формы ППГ могут быть использованы в селекции на устойчивость к этому фитопатогену.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на Международной конференции молодых учёных (Сербия, Чачак, 2007), XV и XVII Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных Ломоносов-2010, секция «Биология» (Москва, 2008 и 2010), 8-й Международной конференции по пшенице (8 International Wheat Conference, Санкт-Петербург, 2010), Международной научной конференции молодых ученых и специалистов, посвященной 145-летию Академии имени К.А.Тимирязева (Москва, 2010), Международной научной конференции «Современная биотехнология сельскохозяйственных растений и биобезопасность» (Украина, Одесса, 2010), Международной научной конференции «Генетика и биотехнология на рубеже тысячелетий» (к 45 летию основания Института генетики и цитологии НАН Беларуси) (Беларусь, Минск, 2010).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ.
Объём и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 177 страницах машинописного текста и включают 53 рисунка, 28 таблиц.
Диссертация состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты исследований и их обсуждение», «Заключение», «Выводы» и «Список литературы». Список цитируемой литературы включает 219 наименований, из них 196 иностранных.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объекты исследования. В работе был использован следующий растительный материал: первичные октоплоидные формы ППГ, полученные в результате гибридизации между T aestivum и пыреем средним (Th.
intermedium, 2n=42, JSJS), удлиненным (Th. elongatum, 2n=14, J), понтийским (Th. ponticum, 2n=70, JJJJSJS) – Истра 1, Зернокормовая 169, Останкинская, Отрастающая 38, 1779, 1514, 70с, 1744, 209, 80, 186, 5787, 1754, 1867, 4044, 1375, 1405, 548, 12, 4082, 4015, 116, 1670, 237, 90, 33, 1689, 77, 2087, 5542, 1416, 4056, 1797 (предоставлены к.б.н. В.И. Беловым, Отдел отдалённой гибридизации ГБС РАН имени Н.В. Цицина);
вторичные октоплоидные формы, полученные в результате гибридизации сортов пшеницы и ППГ между собой – 96 trs, 98 trs, 207/2 trs, 116 trs, 197/2-1-2 trs, 67 trs, 211 trs (предоставлены к.б.н. Е.В. Семёновой, Отдел отдалённой гибридизации ГБС РАН имени Н.В. Цицина);
образцы Th. intermedium (1121/17, 1111/4, предоставлены к.б.н. Л.И. Глуховой, Отдел отдалённой гибридизации ГБС РАН имени Н.В. Цицина), Th. ponticum (PI 547312, PI 508561), Th.
bessarabicum (W6 21890, W6 10232), Th. elongatum (PI 401120, PI 401007), Pseudoroegneria spicata (PI 563867, PI 537371), сорта мягкой пшеницы в качестве контроля, мутант сорта мягкой пшеницы сорта Chinese Spring, несущий мутацию ph1b по локусу Ph.
Выделение ДНК. ДНК выделяли из молодых листьев растений согласно методике Bernatsky & Tanksley (1986) с некоторыми модификациями.
ПЦР-анализ. Детекцию пырейного J-субгенома у образцов ППГ осуществляли с помощью SCAR-маркеров F03 (Li et al., 2007) и ple2 (Wang и Wei, 1995);
детекцию субгенома S осуществляли с помощью RAPD-маркера OPN01 (Zhang et al., 1998). Детекцию мутации ph1b осуществляли с помощью маркеров ABC302.3 (Blake et al., 1996) и PSR2120 (Roberts et al., 1999). Ген-кандидат устойчивости к листовой ржавчине выявляли с помощью праймеров Ag15F4 и Ag15R1 (Gennaro et al., 2009). Для идентификации высокомолекулярных глютенинов использовали маркер HMWN (Jiang et al., 2010). Секвенирование ПЦР-продуктов осуществляли с помощью секвенатора ABI 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems).
Микросателлитный анализ. Микросателлитный анализ образцов проводили с использованием SSR-маркеров Xbarc12, Xbarc170, Xbarc321, Xbarc55, Xbarc57, Xcfd168, Xcfd68, Xgdm33, Xgdm8, Xgwm111, Xgwm149, Xgwm155, Xgwm156, Xgwm157, Xgwm174, Xgwm179, Xgwm190, Xgwm194, Xgwm205, Xgwm232, Xgwm264, Xgwm268, Xgwm292, Xgwm312, Xgwm314, Xgwm319, Xgwm325, Xgwm335, Xgwm340, xgwm341, Xgwm382, Xgwm397, Xgwm428, Xgwm429, Xgwm44, Xgwm46, Xgwm469, Xgwm484, Xgwm493, Xgwm494, Xgwm52, Xgwm538, Xgwm642, Xgwm71, Xwmc121, Xwmc153, Xwmc170, Xwmc221 (http://wheat.pw.usda.gov). Фрагментный анализ осуществляли с помощью секвенатора ABI 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems).
Анализ нуклеотидных последовательностей. Анализ секвенированных последовательностей проводили с помощью программного обеспечения GenDoc (Multiple sequence alignment editor and shading utility.
Ver. 2.6.002. Copyright © by K. Nicholas);
Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0.;
Lasergene ver.7.1, Comprehensive Software for DNA & Protein Sequence Analysis. Поиск гомологичных последовательностей и их анализ проводили в открытой базе генетических данных GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov).
Оценка на устойчивость к листовой ржавчине. Устойчивость к листовой ржавчине определяли совместно с Отделом микологии и иммунитета ВНИИФ с помощью следующих тест-изолятов: 558-3, 693-5, 698-1, 687-5, 681-13, 550-4, 555-6, 702-5, 717-2, 689-5. Всходы образцов инокулировали урединиоспорами тест-изолятов, затем на 16-20 часов помещали во влажную камеру, после чего переносили в климатическую камеру PGV-36 с заданными параметрами: температура воздуха +20°С, относительная влажность воздуха 60-70%, освещенность 10-15 тыс. люкс, фотопериод 16 часов. На 10-й день после инокуляции учитывали тип реакции образцов на тест-изоляты.
Геномная гибридизация in situ (GISH). Геномную гибридизацию in situ на цитологических препаратах хромосом ППГ осуществляли согласно стандартной методике с модификациями Karlov et al. (1999). В качестве блока использовали ДНК мягкой пшеницы, а в качестве пробы – меченую ДНК пырея среднего (Th. intermedium) и псевдорогнерии (Ps. spicata).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1 Детекция пырейного генома в пшенично-пырейных гибридах В результате селекционного процесса в поздних поколениях ППГ происходит стабилизация генома, в результате чего возможна полная элиминация пырейных хромосом, их интрогрессия в геном пшеницы или стабилизация числа пырейных хромосом на определенном уровне. Для детекции наличия пырейного генома в изучаемых линиях ППГ использовали молекулярные маркеры на высококопийные диспергированные повторы на субгеномы пырея J (F03 и ple2) и S (OPN01). Было показано наличие субгеномов J и S во всех линиях селекции Отдела отдалённой гибридизации за исключением линий 116 и 5787 (отсутствовал субгеном S).
2 Молекулярно-цитогенетическая характеристика пшенично пырейных гибридов 2.1 Оптимизация методики дифференциальной GISH Под первичными ППГ понимают формы, полученные в результате скрещивания пшеницы и пырея с последующим отбором. При работе с первичными октоплоидными ППГ в наших исследованиях нами был установлен феномен неравномерной гибридизации меченой ДНК пырея среднего на пырейных хромосомах ППГ (рисунок 1а). Данный рисунок воспроизводился на хромосомах при различных соотношениях блока и пробы (от 50:1 до 300:1), а также при использовании ДНК, выделенной из различных образцов пырея среднего. Кроме того, такой же тип дифференциации воспроизводился на хромосомах самого пырея среднего, что свидетельствует о данном явлении как о свойстве самих хромосом пырея (рисунок 1б).
б а Рисунок 1. GISH на метафазной пластинке ППГ сорта Останкинская (а) и пырея среднего (б). Блок – мягкая пшеница (красный цвет), проба – меченая ДНК пырея среднего (зелёный цвет). Стрелками у ППГ обозначены хромосомы с дифференциацией.
Из литературных данных известно о подобной дифференциации при использовании меченой ДНК псевдорогнерии, донора субгенома S пырея среднего и понтийского (Chen et al., 2005). Нами было проведено сравнение типов гибридизации меченой ДНК пырея и псевдорогнерии, которое свидетельствует о принципиальной схожести получаемых рисунков гибридизации (рисунок 2). Более того, использование меченой ДНК пырея среднего позволяет лучше выявить возможную транслокацию, так как сигнал в данном случае распределён по хромосоме более равномерно.
а б Рисунок 2. GISH на пырейных хромосомах линии 197/2-1-2 с использованием в качестве пробы ДНК (зелёный цвет) пырея среднего (а) и псевдорогнерии (б);
блок – мягкая пшеница (красный цвет).
2.2 Первичные ППГ Дифференциальная GISH позволяет наряду с центромерным индексом и абсолютным размером хромосом идентифицировать отдельные хромосомы пырея. В результате кариотипирования пырейных хромосом ППГ были составлены идиограммы сортов Останкинская, Зернокормовая 169, Истра 1 и Отрастающая 38 (рисунок 3). Эти сорта были выбраны как наиболее хорошо изученные агрономически и часто используемые в селекционных программах.
а б в г Рисунок 3. Идиограммы пырейных хромосом сортов Останкинская (а), Зернокормовая 169 (б), Истра 1 (в) и Отрастающая 38 (г).
Было показано, что сорта Останкинская, Истра 1, Зернокормовая 169 и Отрастающая 38 несут кроме 42 хромосом пшеницы 14 хромосом пырея, различающихся между собой по центромерному индексу, абсолютному размеру и типу дифференциации. Данный полиморфизм по пырейным хромосомам может объяснять различия между данными формами по биологии развития, морфологии, а также хозяйственно-ценным признакам.
Следует отметить наличие пшенично-пырейных хромосомных перестроек выявленных у отдельных растений сортов Истра 1 и Останкинская, что свидетельствует о продолжающемся формоообразовательном процессе.
2.3 Вторичные ППГ Вторичные ППГ получены в результате скрещивания первичных ППГ с пшеницей и между собой с последующим отбором. Изучаемые вторичные ППГ были созданы как потенциальный источник интрогрессий пырейного хроматина в геном пшеницы. С целью получения большего количества перестроек в родословную вторичных ППГ была введена форма сорта Chinese Spring, несущая мутацию ph1b. Для оценки сохранения этой мутации в поздних поколениях вторичных ППГ были использованы два ПЦР-маркера ABC302.3 и PSR2120. Из семи проанализированных линий мутация ph1b была выявлена только у линии 116 trs (рисунок 4).
а 500 bp б Рисунок 4. Идентификация мутации ph1b у вторичных октоплоидных ППГ с помощью маркеров ABC302.3 (а) и PSR2120 (б). Отсутствие целевого бэнда, обозначенного стрелкой, свидетельствует о наличии мутации. CSph – мутантная по Ph локусу форма сорта Chinese Spring.
Дифференциальная GISH также показала различия между вторичными ППГ по набору пырейных хромосом. У линии 116 trs, несущей мутацию ph1b, были обнаружены пшенично-пырейные транслокации (рисунок 5).
б а Рисунок 5. GISH на метафазной пластинке лини 116 trs. Блок – мягкая пшеница (красный цвет), проба (зелёный цвет) – пырей средний (а), псевдорогнерия (б). Стрелками обозначены пшенично-пырейные транслокации.
У отдельных растений 211 trs и 98 trs также показаны пшенично пырейные хромосомные перестройки. Во всех изученных линиях (кроме trs) число пшеничных и пырейных хромосом варьировалось, что свидетельствует о несбалансированном геноме и продолжающемся формообразовательном процессе (таблица 1).
Таблица 1. Хромосомная конституция вторичных ППГ (Пш – хромосомы пшеницы, Пр – хромосомы пырея) Линии вторичных ППГ Встречаемые геномные формулы 116 trs 42Пш+13Пр 211 trs 41Пш+11Пр;
44Пш+11Пр;
42Пш+10Пр 207/2 trs 41Пш+10Пр;
42Пш+10Пр 98 trs 42Пш+14Пр 96 trs 40Пш+14Пр;
42Пш+14Пр 197/2-1-2 trs 42Пш+14Пр;
43Пш+13Пр 67 trs 40Пш+14Пр;
42Пш+14Пр Таким образом, изученные линии вторичных ППГ могут использоваться для получения дополненных и замещенных линий, а 116 trs – для поиска ценных пшенично-пырейных транслокаций.
3 Микросателлитный анализ 3.1 Адаптация микросателлитных маркеров пшеницы для изучения геномов пырея среднего и пырея удлиненного Микросателлитные маркеры (SSR) – одни из наиболее широко применяемых методов для оценки полиморфизма у растений семейства Злаков. В результате проведенных исследований из 48 испытанных нами SSR-маркеров пшеницы были отобраны 40 эффективных маркеров генома пырея среднего (все, кроме Xgwm157, Xgwm469, Xgwm428, Xcfd68, Xgwm179, Xgwm429, Xgwm494, Xgwm155) и 40 маркеров генома пырея удлиненного (все, кроме Xgwm428, Xgwm179, Xgwm429, Xgwm194, Xbarc12, Xwmc121, Xgwm190, Xgwm155).
3.2 Анализ полиморфизма SSR-локусов пырея между ППГ При анализе образцов ППГ с использованием 40 SSR-маркеров, отобранных в нашей работе, 14 из них давали фрагменты, характерные для генома пырея (рисунок 6).
а б в г Рисунок 6. Фрагментный анализ SSR-маркера Xgwm325: пшеница (а), пырей средний (б), пырей удлиненный (в), ППГ Отрастающая 38 (г). Синий цвет – анализируемый фрагмент, красный цвет – маркер размеров.
В результате фрагментного анализа с использованием этих маркеров был показан полиморфизм между сортами Останкинская, Зернокормовая 169, Истра 1 и Отрастающая 38, что соответствует результатам, полученным при цитогенетической характеристике этих сортов методом геномной гибридизации in situ. Выявленные SSR маркеры могут быть использованы в качестве маркеров на пырейные хромосомы в дальнейшей селекционной работе с данными ППГ (таблица 2).
Таблица 2. Полиморфизм первичных октоплоидных ППГ по SSR-фрагментам пырейного типа.
Зернокормовая Останкинская Отрастающая Локализация удлиненный средний Истра Пырей Пырей Маркер 2D, Xcfd168 2A 238 – – – – 2D, Xcfd168 2A – 273 – 275 275 – 5В, Xgdm8 3D 153, 160 160, 162 156 160 165 Xgwm312 2A – 177 176 176 – – 6B, Xgwm325 6D 125 125 125 – 125 – Xgwm157 2DL 127 127 127 127 127 1B, 5D, Xgwm469 6DS. – 160 160 160 163 Xgwm340 3BL 140 140 – 140 140 2AL, 2B, Xgwm382 2D 120 120 120 – – Xgwm397 4А 184 182 181 181 181 Xgwm268 1B – 185 187 – – Xgwm111 7D 150 150 – – – 4B, Xgwm314 3D 137 140 – – – 6B, 5B, Xgwm156 5А 176 177 176 176 176 Xgwm292 5DL 186 185 – 190 190 – 4 Оценка коллекции ППГ на устойчивость к листовой ржавчине 4.1 Оценка на устойчивость к листовой ржавчине В результате оценки изучаемой коллекции ППГ на устойчивость к листовой ржавчине, проведенной совместно с Отделом микологии и иммунитета ВНИИФ, среди ее образцов был выявлен полиморфизм по устойчивости к различным расам. В коллекции были выявлены как формы, устойчивые ко всем расам (Истра, 67trs, 98 trs, 207/2 trs, 116 trs, 197 trs, trs, 1375, 2087, 548, 77, 1416, 4015, 4056, 90, 1405), так и восприимчивые к отдельным расам листовой ржавчины (таблица 2).
Таблица 2. Устойчивость образцов ППГ к тест-изолятам листовой ржавчины (обозначение тест-изолятов: 1 – 558-3;
2 – 693-5;
3 – 698-1;
4 – 687-5;
5 – 681-13;
6 – 550-4;
7 – 555-6;
8 – 702-5;
9 – 717-2;
10 – 689-5).
Образец ППГ Номера тест-изолятов Останкинская 1-3, 5-7, 9, Отрастающая 38 4, 6, Зернокормовая 169 1, 3-5, 8- 116 1, 3- 4082 186 2, 4-7, 9, 5542 5-7, 9, 1514 1-7, 9, 4044 1, 4- 33 12 1670 1, 2, 5, 6, Различия по устойчивости к листовой ржавчине вероятно связаны с полиморфизмом пырейного компонента в геномах ППГ, который был продемонстрирован нами в исследованиях с использованием геномной гибридизации in situ и SSR маркеров.
4.2 Поиск нуклеотидной последовательности, гомологичной гену устойчивости к листовой ржавчине Так как в родословную изучаемых ППГ входит пырей понтийский, донор эффективного гена устойчивости к листовой ржавчине Lr19, нами были использованы праймеры, разработанные на последовательность гена кандидата Lr19. В результате ПЦР был обнаружен полиморфизм амплификации фрагмента размером 800 п.н. Данный фрагмент амплифицировался у всех образцов, устойчивых ко всем расам, а также у части образцов, показавших устойчивость к большинству рас листовой ржавчины. Амплификация этого фрагмента не наблюдалась у полностью неустойчивых и у некоторых частично устойчивых форм ППГ (рисунок 7).
800 bp R R S/R R R S/R S/R R S/R R Рисунок 7. Электрофореграмма продуктов амплификации с праймеров гена кандидата Lr19 у образцов ППГ, устойчивых (R) и частично устойчивых (S/R) к тест изолятам листовой ржавчины ПЦР-продукт различных линий ППГ был секвенирован. Выравнивание последовательностей показало высокую степень гомологии данного фрагмента между различными образцами ППГ.
BLAST-анализ показал высокую степень гомологии к генам устойчивости. Хотя амплификация шла с праймеров на ген-кандидат Lr19, полученная нами последовательность существенно от него отличалась.
Данный фрагмент показал высокую степень гомологии (68-75%) к различным генам устойчивости, в том числе и к фрагменту гена-кандидата Th. ponticum ag15 (NBS-LRR) gene, AgL allele, exons 1-2 (75%). Таким образом, нами была обнаружена неизвестная до сих пор последовательность, гомологичная гену-кандидату Lr19.
5 Анализ полиморфизма образцов коллекции ППГ по генам высокомолекулярных глютенинов пырея Для анализа полиморфизма генов высокомолекулярных глютенинов пырея у 26 образцов ППГ нами был использован STS-маркер на гены высокомолекулярных глютенинов. После ПЦР кроме фрагментов, характерных для пшеницы были выявлены фрагменты пырейного происхождения.
В результате проведенного анализа между образцами коллекции ППГ был выявлен полиморфизм по данным генам. У 10 образцов были выявлены пырейные фрагменты, близкие по длине к фрагментам генов высокомолекулярных глютенинов пшеницы. Размер этих фрагментов варьировался от 1800 до 3000 п.н. (Останкинская, Зернокормовая 169, 1405, 12, 4015, 90, 67 trs, 5542, 4056, 116). У других 10 линий были выявлены фрагменты меньше 1800 п.н. (1670, 1416, 33, Истра, 1689, 116 trs, 197/2-1- trs, 211 trs, 77, 548). Ввиду того, что гены высокомолекулярных глютенинов локализованы на первой гомеологичной группе, выявленный полиморфизм по этим генам между образцами ППГ может быть связан с полиморфизмом хромосом первой гомеологичной группы пырея. Также это может быть следствием того, что в изучаемых образцах ППГ представлены хромосомы первой гомеологичной группы различных субгеномов пырея.
Таким образом, проведенные нами исследования продемонстрировали полиморфизм между октоплоидными формами ППГ по их пырейному компоненту. Данные различия были нами выявлены на геномном, хромосомном и генном уровнях. Биоразнообразие изучаемых форм ППГ, основанное не только на морфологическом, но и как показано в нашей работе, на генетическом уровне, является залогом успешного поиска и клонирования хозяйственно-полезных генов пырея, которые могут внести существенный вклад в улучшение пшеницы методами биотехнологии и молекулярной генетики.
ВЫВОДЫ 1. Адаптирована методика дифференциальной геномной гибридизации in situ (GISH) для анализа пшенично-пырейных гибридов ППГ. Выявлена дифференциация пырейных хромосом по распределению сигнала у ППГ при проведении GISH с меченой ДНК пырея среднего в качестве пробы.
2. Установлена геномная и хромосомная конституция четырёх первичных (Останкинская, Истра 1, Зернокормовая 169, Отрастающая 38) и семи вторичных (116 trs, 211 trs, 207/2 trs, 96 trs, 98 trs, 197/2-1- trs, 67 trs) октоплоидных ППГ. Геномы изученных форм ППГ несут в своем составе хромосомы субгеномов пырея в различной комбинации.
3. Показана геномная нестабильность линий ППГ 116 trs, trs, 207/2 trs, 96 trs, 197/2-1-2 trs, 67 trs. У отдельных растений сортов ППГ Истра 1 и Останкинская, а также растений линий 211 trs и 98 trs показаны пшенично-пырейные хромосомные перестройки. В геноме линии 116 trs, несущей ph1b-мутацию, выявлены пшенично-пырейные транслокации.
4. Показана возможность адаптации SSR маркеров пшеницы для анализа геномов пырея среднего и пырея удлиненного. Из изученных SSR-маркеров пшеницы адаптировано 40 маркеров, пригодных для анализа генома пырея среднего и 40 маркеров для пырея удлиненного.
5. SSR-анализ с использованием этих маркеров на четырех сортах ППГ (Останкинская, Зернокормовая 169, Истра 1, Отрастающая 38) показал полиморфизм между сортами и выявил 14 SSR локусов пырейного компонента их генома.
6. Выявлено 16 линий ППГ (Истра 1, 197, 1375, 77, 548, 1416, 67, 98, 116tr, 207, 211, 2087, 4015, 4056, 1405, 90), устойчивых к тест-изолятам листовой ржавчины. У данных линий идентифицирован и секвенирован фрагмент (800 п.н.), гомологичный гену-кандидату устойчивости к листовой ржавчине Lr19.
7. Показан полиморфизм генов высокомолекулярных глютенинов между образцами коллекции ППГ. Выявлено 20 образцов ППГ (Останкинская, Зернокормовая 169, 1405, 12, 4015, 90, 67 trs, 5542, 4056, 116, 1670, 1416, 33, Истра, 1689, 116 trs, 197/2-1-2 trs, 211 trs, 77, 548), несущих гены высокомолекулярных глютенинов пырейного генома.
БЛАГОДАРНОСТИ Автор выражает благодарность за предоставленные образцы пшенично-пырейных гибридов и пыреев к.б.н. Белову В.И., к.б.н. Семёновой Е.В., к.б.н. Глуховой Л.И. (Отдел отдалённой гибридизации учреждения Российской академии наук Главный ботанический сад им. Н.В. Цицина РАН), за помощь в оценке образцов ППГ на устойчивость к листовой ржавчине д.б.н. Коваленко Е.Д., к.б.н. Жемчужину А.И., к. б. н. Жемчужину Н.С. (Всероссийский научно-исследовательский институт фитопатологии), за помощь при проведении фрагментного анализа к. б. н Фесенко И.А. (Центр молекулярной биотехнологии ФГОУ ВПО РГАУ-МСХА имени К.А.
Тимирязева). Автор благодарен д.б.н. Карлову Г.И. и к.б.н. Дивашуку М.Г. за руководство, сотрудникам Центра молекулярной биотехнологии за вдохновение и поддержку, а также папе, маме и сестре за помощь и понимание.
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ, ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России», ГК № 02.740.11.0286 и ГК П598 от 06 августа 2009 г.
СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ 1. Kroupin, P. Cytogenetic analysis and polymorphism level estimation of bread wheat cultivar Zvezda and cv. Zvezda-based lines / P. Kroupin, M.
Klymushina // Материалы Международной конференции по агрономии молодых учёных. Сербия, г. Чачак. – 2007. – P. 67- 2. Крупин, П.Ю. Цитогенетический анализ пшеницы сорта Звезда и линий, полученных на его основе / П.Ю. Крупин // Материалы XV Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных Ломоносов-2008, секция «Биология». – 2008.– C. 3. Крупин, П.Ю. Цитогенетический анализ сорта Звезда и линий, полученных на её основе / П.Ю. Крупин, М.Г. Дивашук // Материалы Международной школы-конференции молодых учёных. Звенигород, 7 12 декабря 2008 г. – C. 41.
4. Cytogenetic analysis and polymorphism level estimation of bread wheat cultivar Zvezda and its derivatives / P.Y. Kroupin [et al] // Izvestia of Timiryazev Academy. Special Issue: March-May – Moscow, 2009. – P. 89 94.
5. Крупин, П.Ю. Молекулярно-цитогенетическая характеристика промежуточных пшенично-пырейных гибридов, полученных с участием пырея среднего / П.Ю. Крупин // Материалы XVII Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных Ломоносов-2010, секция «Биология». – C. 85-86.
6. Kroupin, P. Yu. Molecular-Cytogenetic characterization of the partial wheat intermediate wheatgrass hybrids (Tritipyrum) / P. Yu. Kroupin, M. G.
Divashuk, G. I. Karlov // Материалы 8-й международной конференции по пшенице: 1–4 Июня 2010, Санкт-Петербург, Россия. – P. 107-108.
7. Крупин, П.Ю. Исследование пырейного компонента октаплоидных пшенично-пырейных гибридов / П.Ю. Крупин // Материалы Международной научной конференции молодых ученых и специалистов, посвященной 145-летию Академии имени К.А.Тимирязева, 1-2 июня 2010 г. – Т. 1. – С. 469- 8. Крупин, П.Ю. Адаптация SSR маркеров мягкой пшеницы для изучения геномов дикорастущих злаков / П.Ю. Крупин, М.Г. Дивашук, Г.И. Карлов // Материалы Международной конференции "Современная биотехнология сельскохозяйственных растений и биобезопасность" (“Modern Biotchnology of Agricultural Plants and Biosafety”). Одесса, Украина 7-10 сентября 2010 г. – C.50.
9. Цитогенетический анализ и оценка уровня полиморфизма сорта Звезда и линий, полученных на её основе / П.Ю. Крупин [и др.] // Известия ТСХА. – 2010. – № 5. – С. 89-95.
10.Дивашук, М.Г. Разработка специфичных SSR маркеров геномов дикорастущих злаков на базе микросателлитных локусов пшеницы / М.Г. Дивашук, П.Ю. Крупин, Г.И. Карлов // Материалы Международной научной конференции «Генетика и биотехнология на рубеже тысячелетий» (к 45-летию основания Института генетики и цитологии НАН Беларуси). 25-29 октября 2010 г. Минск, Республика Беларусь. – C. 47.
11.Сравнительная молекулярно-цитогенетическая характеристика промежуточных пшенично-пырейных гибридов / П.Ю. Крупин [и др.] // Генетика. – 2011. – Т. 47, № 4. – С. 492–498.
12.Адаптация микросателлитных SSR маркеров пшеницы для анализа геномов пырея среднего, пырея удлиненного и пшенично-пырейных гибридов / П.Ю. Крупин [и др.] // Известия ТСХА. – 2011. – № 3 (в печати).