Влияние квч-излучения на морфофизиологические показатели и активность ферментов прорастающих семян зерновых культур
На правах рукописи
Калье Мария Игоревна
ВЛИЯНИЕ КВЧ-ИЗЛУЧЕНИЯ НА МОРФОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ
ПОКАЗАТЕЛИ И АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ ПРОРАСТАЮЩИХ
СЕМЯН ЗЕРНОВЫХ КУЛЬТУР
Специальность 03.01.05 – физиология и биохимия растений
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Москва 2011
Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Нижегородская государственная сельскохозяйственная академия» на кафедре ботаники и физиологии растений
Научный руководитель: кандидат биологических наук, доктор педагогических наук ДЯТЛОВА Ксения Дмитриевна
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор ПАНИЧКИН Леонид Александрович кандидат биологических наук, старший научный сотрудник СТЕЦЕНКО Лариса Алексеевна
Ведущая организация: ГНУ Московский научно-исследовательский Институт сельского хозяйства «Немчиновка»
Россельхозакадемии
Защита диссертации состоится 22 декабря 2011 года в 14 часов 30 минут на заседании диссертационного совета Д220.043.08 в ФГБОУ ВПО РГАУ МСХА имени К.А.Тимирязева по адресу: 127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, 49, Ученый совет РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева
С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке имени Н.И. Железнова ФГБОУ ВПО РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева Автореферат разослан «19» ноября 2011 г., размещен на сайте университета www.timacad.ru и направлен по адресу в ВАК [email protected]
Ученый секретарь диссертационного совета С.Л. Белопухов ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы В настоящее время актуальной проблемой биологической науки является поиск новых технологий для целенаправленного воздействия на животные и растительные организмы. Часто подобные технологии основываются на воздей ствии, физических факторов, например, особое внимание исследователи уделяют изучению воздействий различных видов излучений. К категории таких факторов относят и КВЧ-излучение, т. е. излучение крайне высокой частоты (30 – 300 ГГц) нетепловой интенсивности, миллиметрового диапазона (1 – 10 мм).
Основным источником миллиметрового излучения в биосфере является Солнце. Кроме того считается, что миллиметровые волны входят в состав ре ликтового излучения, или космического волнового фонового излучения, кото рое сохранилось с начальных этапов существования Вселенной и равномерно ее заполняет. Планета Земля и все находящиеся на ней тела также являются ис точниками КВЧ-излучения. Однако доля данного излучения в общем потоке электромагнитных волн, приходящихся на поверхность Земли, ничтожно мала.
Несмотря на это ученые придают важное значение данному виду излучения, относя его в разряд информационных, т.е. способных передавать некую инфор мацию об окружающем нас мире (Пресман, 1968;
Чижевский, 1976;
Девятков и др., 1991).
Считается, что целенаправленное воздействие КВЧ-излучения на организм позволяет управлять многими процессами жизнедеятельности, в том числе, влиять на рост и развитие бактерий, животных, тканей и органов человеческого организма (Grundler, 1983;
Девятков, Бецкий, 1985;
Бессонов и др.,1999;
Бецкий и др., 2000;
Тамбиев, 2000). Поэтому данный вид излучения находит применение в медицине и некоторых отраслях биотехнологической промышленности.
В последние годы окрепло направление по исследованию действия этого фактора на фотосинтезирующие живые системы (Тамбиев, Кирикова, 1999;
Лященко, Лихолат, 2000;
Бецкий, 2002;
Гапочка и др. 2003). Однако основная доля работ посвящена изучению влияния излучения на цианобактерии и микроводоросли (Тамбиев, Кирикова 2000). Сведения о воздействии КВЧ излучения на высшие растения встречаются редко и имеют фрагментарный характер (Петров, Бецкий, 1989;
Петров и др., 1991;
Лященко, Лихолат, 2000).
Так, показан стимулирующий эффект КВЧ-излучения на рост рассады и при предпосевной обработке семян овощных культур (Акимов и др., 1996;
Лященко, Лихолат, 2000). В то же время отмечено, что в зависимости от параметров КВЧ-излучение может оказывать не только стимулирующее, но и угнетающее воздействие (Лунева, Шуб и др., 1987;
Тамбиев, Кирикова и др., 1990;
Исаева, 1991). И, если эффект активации ростовых процессов может использоваться в растениеводстве, то снижение интенсивности прорастания может быть применено в процессе солодоращения для пивоваренного производства.
Механизм действия КВЧ-излучения на живые организмы остается пока невыясненным, хотя выдвигается множество теорий, которые нуждаются в экспериментальной проверке. Например, наиболее часто упоминаемая теория стрессового воздействия излучения из-за недостатка доказательной базы пока не находит однозначного подтверждения (Гаркави и др., 1990;
Селье, 1972).
Цель и задачи исследования Целью работы являлось изучение влияния электромагнитного излучения КВЧ-диапазона на морфофизиологические показатели и активность ферментов прорастающих семян зерновых культур и подбор режимов излучения, оптимальных для солодоращения и растениеводства.
Для достижения указанной цели решались задачи:
1. Изучить влияние различных режимов КВЧ-излучения на морфофизиологиче ские параметры прорастающих семян ячменя, пшеницы и кукурузы и погло щение ими воды.
2. Изучить влияние КВЧ-излучения при различных режимах на ферментатив ную активность прорастающих семян ячменя, пшеницы и кукурузы.
3. Изучить влияние КВЧ-излучения при различных режимах на содержание ос новных запасных веществ в эндосперме прорастающих семян ячменя, пшеницы и кукурузы.
4. Определить характер воздействия КВЧ-излучения на прорастающие семена.
5. Подобрать время экспозиции КВЧ-излучения для регуляции процессов про растания семян зерновых культур с целью использования в растениеводстве и производстве солода.
Научная новизна В работе впервые проведены комплексные исследования процессов про растания семян трех видов зерновых сельскохозяйственных культур при разном времени воздействия КВЧ-излучения. Установлена видоспецифичность изме нения процессов прорастания семян в зависимости от времени облучения, по зволяющая регулировать прорастание в целях растениеводства и производства солода.
Теоретическая и практическая значимость работы Проведенные исследования позволяют расширить представление о меха низмах воздействия на растительный организм КВЧ-излучения как фактора, вызывающего развитие неспецифической ответной реакции - стресса.
КВЧ-излучение как простой, дешевый (малое энергопотребление) и эко логически безопасный метод воздействия на прорастающие семена может при меняться для повышения качества солода в пивоварении и регуляции всхоже сти семян в растениеводстве.
Положения диссертации, выносимые на защиту • Обработка КВЧ-излучением сверхнизкой интенсивности приводит к изменению морфофизиологических показателей прорастания семян ячменя, пшеницы и кукурузы. Эффект стимуляции или угнетения прорастания этих растений зависит от времени облучения.
• Под действием КВЧ-излучения у семян наблюдается изменение динамики влагопоглощения.
• Воздействие КВЧ-излучения на семена в процессе прорастания приводит к изменению активности гидролитических ферментов и, как следствие, к изме нениям содержания основных запасных веществ эндосперма.
• КВЧ-излучение исследованных режимов является внешним физическим фактором, приводящим к развитию не глубокой стрессовой реакции.
• Апробация работы Вторая международно-практическая конференция «Медбиотек – 2» «Пер спективы развития биотехнологии в России» (Пущино, 2005);
Международная научно-практической конференция «Дни науки 2006» (Днепропетровск, Наука и просвещение, 2006);
Нижегородская сессия молодых ученых. Естественнона учные дисциплины (Н.Новгород, 2009);
ІІ Международная научно практическая конференция «Наука и современность» (Новосибирск 2010);
Все российская научно-практическая конференция с международным участием «Актуальные проблемы современной науки и образования» (Биологические науки) (Уфа, 2010);
Международная научная конференция молодых ученых и специалистов (Москва, 2011);
II Съезд Общества физиологов растений России «Физиология растений – фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий» и Международная научная школа «Инновации в биологии для развития биоиндустрии сельскохозяйственной продукции» (Нижний Новгород, 2011).
Публикации результатов исследования По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том чис ле 2 в изданиях, рекомендованных ВАК.
Объем и структура работы Диссертация изложена на 119 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, объектов и методов исследований, собствен ных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и приложения. Работа содержит 3 таблицы, 20 рисунков и 2 приложения. Список литературы включа ет 199 источников.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объекты исследования и постановка опытов. Исследования проводи лись в 2003-2007 годах на семенах ячменя сорта Джин, пшеницы сорта Москов ская 35 и кукурузы сорта Сахарная (рис. 1). Предварительные эксперименты и анализ литературных данных показали, что облучение сухих семян малоэффек тивно, поэтому обработке КВЧ-излучением подвергались предварительно за моченные набухшие семена.
Семена ячменя и пшеницы в количестве 100 шт. помещали в чашку Петри на лист фильтровальной бумаги и заливали 10 мл дистиллированной воды. В опыте с кукурузой 50 семян заливали 20 мл воды. Семена ячменя и пшеницы замачивали в течение 2 часов, кукурузы - 10 часов. Затем проводили облучение (по заданным технологическим параметрам) и проращивали в темноте при температуре 200С: семена ячменя и пшеницы в течение 5 суток, кукурузы - суток.
Параметры излучения. Набухшие семена обрабатывали КВЧ излучением. Использовали генератор излучения с частотой 61,20 ГГц (мощ ность излучения 12 мВт, длина волны 4,9 мм). Применялась экспозиция облу чения 5, 10, 15, 30 минут, расстояние от источника излучения до объекта явля лось постоянным и составляло 20 см.
Определение показателей прорастания. У семян определяли энергию прорастания и всхожесть (ГОСТ 12038-84), а также жизнеспособность по окра шиванию зародыша методом Иванова (Третьяков и др., 1990). У ячменя изме ряли длину корней и проростков, количество корней. Во время прорастания определяли влагопоглощение семян через 1, 2, 4, 8, 24, 48 часов после замачи вания (Ермаков и др., 1972). По окончании периода прорастания семена высу шивали при 700С до постоянной массы. Режим сушки соответствует таковому при производстве солода. Отшелушивали корешки и проростки от эндосперма и определяли их массу. Эндосперм перемалывали на лабораторной мельнице. В солодовой муке определяли активность гидролитических ферментов, содержа ние редуцирующих сахаров и белка.
Определение активности амилаз. Активность амилаз определяли по гидролизу крахмала. Навеску материала (солод) 1 г растирали с 1% раствором NaCl, фильтрат использовали для определения суммарной активности - и амилаз. Далее проводили инкубацию фильтрата с 2% раствором крахмала в ацетатном буфере (рН 5,5), при 400С в течение 30 мин. Активность -амилаз определяли при условии инактивации -амилаз путем добавления КВЧ-излучение частота 61,20 ГГц Ячмень Пшеница Кукуруза 100 сем 100 сем 50 сем Время облучения, мин 15 5 Пролин Химический Морфологические Влагопогло Лабораторная Активность Энергия состав показатели проро- щение семян всхожесть ферментов прорастания стков Сахара Длина и Колич-во Масса эн- - и - Кислые и Сахара Длина и Каталаза и Белок моно щелочные сумма масса корней досперма амилаз масса перокси протеазы корней прор-в даза 9 3 5 6 4 Рис. 1 Схема экспериментального изучения влияния КВЧ-излучения на прорастание семян зерновых культур (Каждый эксперимент проводился в 3-4 повторностях).
уксуснокислого кальция и повышения температуры до 700С. Степень гидролиза крахмала определяли по реакции с раствором йода. Оптическую плотность оценивали при 595 нм. Параллельно ставили соответствующие холостые опы ты. Активность - амилаз определяли по разности между суммарной активно стью амилаз и -амилаз. (Методы биохимического анализа растений, 1978).
Определение активности протеаз. Протеолитическую активность опре деляли по методу Ансона. В качестве субстрата для определения щелочных протеаз использовали 2% раствор казеина с рН 8,0, кислых протеаз - 2% рас твор гемоглобина с рН 3,0. Активность ферментов выражали в условных еди ницах на 1 г навески за 1 час (Филипович и др., 1975).
Определение активности пероксидазы. Метод основан на определении скорости реакции окисления бензидина. Навеску материала 500 мг смешивали с ацетатным буфером рН 4,7, переносили в мерную колбу на 50 см3. После мин настаивания вытяжку центрифугировали при 4000 об./мин. Измерение проводили на фотоэлектроколориметре при 595 нм. Активность фермента оце нивали по скорости изменения интенсивности окрашивания опытного раствора при помощи секундомера (Ермаков, 1972).
Определение активности каталазы проводили газометрическим мето дом (Ермаков, 1972).
Определение содержания редуцирующих сахаров. Экстракцию сахаров проводили в течение 30 мин, на бане при 800С. Осаждение белков проводили путем добавления уксуснокислого свинца. В каждую колбу добавляли по 5 мл 10% раствора сульфата натрия и две капли толуола. Полученный раствор ос тавляли на сутки в холодильнике, а затем фильтровали. Методика определения содержания сахаров основана на обесцвечивании жидкости Фелинга. Для опре деления содержания моносахаров в фильтрат добавляли 2 мл 20% HCl. Колбы помещали на водяную баню на 7 мин при температуре 700С для гидролиза са харозы. Содержание сахаров определяли по калибровочной кривой. В качестве стандарта использовали раствор глюкозы (Сказкин, 1958).
Определение содержания белка. Содержание белка определяли по ме тоду Лоури (Lowry et al, 1951).
Определение содержания пролина. Содержание пролина в прорастаю щих семенах на 1,2 и 3 сутки проращивания определяли колориметрическим методом, измеряя интенсивность окрашивания его соединений с нингидрином (Paleg, Aspinal, 1981).
Статистическая обработка данных. Опыты проводили в 3-4 кратной повторности. Результаты обрабатывали при помощи методов вариационной статистики (средние значения и стандартное отклонение) (Лакин, 1973). Оценку достоверности разницы между средними арифметическими двух выборочных совокупностей проводили по t – критерию Стьюдента. Достоверными счита лись изменения показателей при р0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Морфофизиологические показатели прорастающих семян Обработка КВЧ-излучением приводит к изменению энергии прорастания и всхожести семян всех опытных культур. Излучение оказывает выраженное угнетающее действие на семена ячменя: значительное снижение лабораторной всхожести и энергии прорастания по всем вариантам, максимальное при 15 мин экспозиции (рис. 2).
У пшеницы также наблюдается, торможение ростовых процессов. Наи меньшее значение лабораторной всхожести зафиксировано при 15 и 30 мин.
У кукурузы, под действием излучения, величина показателей прорастания повысилась только в варианте с продолжительностью об лучения 10 мин.
Подтверждением угнетающего воздействия КВЧ-излучения явля ется меньшая потеря массы эндос перма за счет снижения массы кор ней и проростков. Так, под дейст вием излучения на семена ячменя Рис. 2 Показатели прорастания семян ячменя при действии разных экспозиций излучения наибольшая масса эндосперма полу чена при 15 мин - 4,3829 г, наи с частотой 61,2 ГГц меньшая в контроле – 3,7734 г.
Измерение основных морфофизиологических показателей прорастающих семян ячменя на сутки после облучения показало, что длина проростков и корней при 5, и 30 мин практически не отличается от контроля. При 15 мин облучения длина проростков и корней ячменя уменьшена и составляет 6 и 8 мм соответственно (рис. 3).
Рис. 3 Длина проростков и корней пророс ших семян ячменя при действии разных экс позиций излучения с частотой 61,20 ГГц Эта же экспозиция максимально влияет и на количество корней (рис. 4). Излучение небольшой длительности (5 и мин) способствовало увеличению количества корней в 1,2 раза. А минутное облучение привело к сокращению числа корней до 4, шт., а при увеличение времени облучения (30 мин) количество Рис. 4 Количество корней у прорастающих корней снова возрастает до семян ячменя при действии разных экспози контрольного числа.
ций излучения с частотой 61,2 ГГц Полученные результаты дают возможность предположить, что изменения процесса прорастания при облуче нии (угнетение или активация) напрямую зависит от параметров излучения.
Снижение показателей прорастания на начальном этапе (5, 10 и 15 мин.), воз можно, связано с развитием первой стадии фитостресса, которая сопровождает ся торможением анаболических, но усилением катаболических процессов. По вышение энергии прорастания при усилении воздействия (30 мин облучения), вероятно, связано развитием второй стадии фитостресса и адаптацией растения к физическому воздействию.
Облучение трех видов культур показало, что разные культуры неодинаково реагируют на облучение, т.е. формируют видоспецифичные ответные реакции.
2. Содержание воды в семенах в процессе прорастания Так как запуск процесса прорастания связан с уровнем оводненности тка ней семени, нами было изучено действие КВЧ-излучения на изменение влажно сти семян ячменя, пшеницы и куку рузы. Обработка излучением с час тотой 61,2 ГГц приводит к измене нию влагопоглощения семян (рис.
5). Причем в период замачивания от 1 до 8 часов влагопоглощение в не которых вариантах повышалось, а на более поздних сроках 24-48 часов наоборот было ниже, чем у необлу Рис. 5 Влажность семян ячменя через 48 ча- ченных семян. Пшеница и кукуруза сов проращивания при действии разных экс реагировали так же, и уменьшение позиций излучения с частотой 61,20 ГГц оводненности под действием излучения было даже более выраженным, чем у ячменя, что, вероятно, связано с отсутствием у семян этих культур пленчатой оболочки. Так как излучение не повреждает семенные покровы, можно предпо ложить, что изменение оводненности обусловлено структурными изменениями осмотически активных молекул, причем степень изменения зависит от времени облучения.
3. Активность амилаз Под действием КВЧ-излучения происходит небольшое, но достоверное снижение общей активности амилаз ячменя при 5, 15 и 30 мин облучения (рис. 6). Излучение влияет и на соотношение активности - и -амилаз. Облу чение в течение 5 и 10 мин способствует повышению активности -амилаз, в то время как более длительная обработка 15 и 30 мин снижает их активность. Об ратный эффект получен по амилазам: при 5 и 10 мин облуче ния активность их резко снижает ся, а при 15 возрастает. Следует отметить, что -амилазы относят к стресс - индуцируемым белкам, и их активность увеличивается при развитии стрессовой реакции (Пахомова, 1995;
Тарчевский, 2000;
Шакирова, 2001). Также изменения активности амилаз Рис. 6 Активность амилаз в ячменном солоде может быть связано с воздейст при действии разных экспозиций излучения с вием ферментов - протеаз. Из частотой 61,2 ГГц вестно, что при прорастании се мян латентная форма -амилаз активируется именно под действием этих фер ментов (Кислухина, Кюлудас, 1997). Таким образом, изменение активности амилолитических ферментов тоже может расцениваться как проявление стрес совой реакции, причем экспозиция 15 мин знаменует максимальную выражен ность первой фазы стресса, а экспозиция 30 мин – переход к фазе адаптации.
Общая активность амилаз пшеницы при обработке частотой 61,20 ГГц падала с минимумом при 5 мин облучения. Аналогично происходило измене ние - и -амилазной активности.
Общая активность амилаз кукурузы под действием излучения снижалась незначительно, так же как и -амилаз. Активность –амилаз повысилась при времени облучения 5 и 30 мин.
Таким образом, электромагнитные излучения КВЧ-диапазона при малых параметрах воздействия снижают активность амилаз. Определенная степень угнетения наблюдалась по всем культурам. Возможно, снижение общей актив ности амилаз связано с уменьшением потребности проростка в глюкозе и энер гии вследствие отмеченного нами торможения ростовых процессов или с по вреждением ферментных систем на первой стадии стресса.
4. Активность протеаз Установлено, что изменение активности протеаз под действием КВЧ излучения происходит разнонаправлено. Так, активность щелочных протеаз ячменя, обработанного в течение 10 и 30 мин, повышается по сравнению с кон тролем в 2,4 и 1,4 раза. На активность кислых протеаз излучение оказывало уг нетающее действие.
Для пшеницы стимулирующее воздействие на активность щелочных про теаз оказало время обработки 30 мин. Активность кислых протеаз пшеницы из лучение повысило.
Семена кукурузы проявили большую, чем по другим культурам, ампли туду колебаний активности щелочных протеаз: в облученных в течение 15 мин она увеличивалась, после обработки частотой длительностью 5, 10 и 30 мин уменьшалась. Кислые протеазы кукурузы отреагировали падением активности на действие излучения.
Повышение активности ферментов в некоторых вариантах, скорее всего, связано с усилением катаболических процессов и развитием первой фазы фито стресса после воздействия электромагнитного излучения. Снижение же актив ности протеолитических ферментов может быть связано с замедлением росто вых процессов и меньшими потребностями растущего зародыша в строитель ных материалах при дальнейшем развитии стрессовой реакции. Кроме того, при воздействии стрессовых условий происходит увеличение количества эндоген ных ингибиторов протеаз белковой природы (Мосолов, 1998).
5. Содержание редуцируюших сахаров К углеводам, входящим в состав непроросшего зерна, относятся, в основ ном, крахмал, целлюлоза, гемицеллюлозы, гумми, продукты расщепления раз личных полисахаридов. Так как предполагается, что КВЧ-излучение оказывает влияние на обмен веществ в клетке, то важно исследовать изменения содержа ния сахаров как продукта гидролиза крахмала.
Под действием излучения КВЧ-диапазона на семена ячменя достоверной разницы в содержании суммы сахаров между вариантами выявлено не было.
Но содержание моносахаров изменялось: вначале под действием излучения ( мин) оно падает, затем немного повышается (10 мин), достигает своего макси мума (15 мин) и снова падает до контрольного значения.
Разнонаправленые изменения в суммарном содержании сахаров наблюдались и у пшеницы. Минимальное значение получено при 30 мин - в 1, раза ниже контрольного значения.
Обработка излучением семян кукурузы вызывает значительное изменение суммарного содержания сахаров по вариантам. При 5 мин экспозиции облучения происходит снижение содержания сахаров относительно контроля в 1,3 раза. При увеличении продолжительности облучения отмечено повышение содержания сахаров в 1,6 раза (10 мин), 1,3 раза (15 мин), 1,9 раза (30 мин).
Можно предположить, что значительное повышение содержания сахаров в ва рианте с 30 мин облучения связано с относительно высокой амилолитической активностью и с небольшой лабораторной всхожестью при данных параметрах облучения.
Таким образом, КВЧ-излучение оказывает влияние на процессы гидроли за крахмала семени, о чем свидетельствует колебания содержания сахаров в опытных вариантах. Эти изменения также могут являться следствием наруше ния ростовых процессов семени.
6. Содержание белка Проведенные исследования показали, что под действием КВЧ-излучения про исходит изменение количества белка (табл. 1). Обработка излучением способ ствует снижению количества белка в семенах ячменя при 5 и 30 мин в 1,2 раза, а при 10 и 15 мин в 1,3 раза по сравнению с контролем. Следует отметить, что в варианте с 15 мин облучения, несмотря на низкую общую протеолитическую активность и показатели прорастания, получено невысокое содержание белка.
Вероятно, это связано с тем, что в данных условиях высокую активность имели цистеиновые протеазы, работающие при рН среды 5,5, которые в данном случае нами не определялись.
Таблица Содержание общего белка в солоде ячменя, пшеницы и кукурузы при действии разных экспозиций излучения, мг/г (М±m, n=3, Р0,05) Вариант Ячмень Пшеница Кукуруза Контроль 126,7 ± 4,4 241,7 ± 24,9 145,0 ± 5, 5 мин 110,0 ± 2,9 196,7 ± 13,0 71,7 ± 3, 10 мин 98,3 ± 6,0 183,3 ± 33,5 165,0 ± 5, 15 мин 101,0 ± 2,1 181,7 ± 13,3 163,3 ± 9, 30 мин 106,7 ± 6,0 225,0 ± 16,1 121,7 ± 7, Облучение семян пшеницы приводит к снижению количества белка: при 5 мин - в 1,2 раза, 10 и 15 мин в 1,3 раза. Увеличение продолжительности облу чения до 30 мин, несмотря на высокую протеолитическую активность, вызвало повышение содержания белка до показаний, близких к контролю. Скорее всего, это связано с низкой всхожестью семян и малыми затратами белка на процессы роста в этом варианте.
Значительное падение количества белка кукурузы, практически в 2 раза, произошло в варианте 5 мин.
В остальных вариантах содержание белка менялось незначительно.
Таким образом, КВЧ-излучение влияет на содержание общего белка в тканях эндосперма разнонаправлено и эффект зависит от времени облучения.
Разнонаправленность изменений обусловлена, вероятно, дисбалансом гидроли тической ферментативной системы на фоне нарушения ростовых процессов.
7. Активность каталазы и пероксидазы Одной из ответных реакций растительной клетки на действие неблаго приятного фактора является активное образование и накопление перекиси во дорода и других активных форм кислорода. Это ведет к увеличению активности ферментов пероксидазы и каталазы, так как большое содержание перекисей приводит к необратимому повреждению клеточных мембран и других структур клетки (Андреева, 1988;
Барабой, Блехман, 1992).
Повышение содержания АФК - жизненно необходимый процесс, иниции рующий реакции ПОЛ, повышение проницаемости мембран, направленный на уничтожения поврежденных клеточных структур. Известно, что АФК в доста точно низких концентрациях могут оказывать многостороннее регуляторное действие на биосистемы, АФК сейчас рассматривают как одну из систем внут риклеточных и межклеточных месенджеров (Аверьянов, 1991;
Гамалей, Клю бин, 1996). Отмечено, что воздействие электромагнитного излучения КВЧ диапазона на водные растворы также вызывает образование АФК (Поцелуева и др., 1998).
Как показали наши исследования, активность пероксидазы прорастающих семян ячменя возрастает с увеличением времени облучения. Ферментативная ак тивность каталазы ячменя также возрастает при увеличении времени облучения:
экспозиция 5 и 10 мин повысила активность незначительно, однако увеличение времени до 15 и 30 мин дало превышение в 1,4 раза по сравнению с контролем.
Активность пероксидазы и каталазы семян пшеницы после воздействия излучения повышалась при всех экспозициях обработки.
Наши данные о повышении пероксидазной и каталазной активности у се мян ячменя и пшеницы косвенно подтверждают наблюдения М.М. Поцелуевой, А.В. Пустовидко и др. (1998) о возможности образования АФК под действием излучения. Это свидетельствует о том, что КВЧ-излучение в той или иной сте пени оказывает стрессовое воздействие на растения.
8. Содержание пролина Известно, что при возникновении неблагоприятных условий в клетках возрастает содержание аминокислоты пролина, которая участвует в защитных реакциях, стабилизируя цитоплазму (Stewart, Boggess, 1978;
Полевой, 1987).
Существует мнение, что низкомолекулярные органические антиоксиданты, к которым можно отнести и пролин, могут эффективно защищать клеточный ме таболизм от АФК (Курганова, Веселов, 1997).
Показанное нами увеличение активности ферментов пероксидазы и ката лазы в прорастающих семенах под действием КВЧ-излучения позволяет пред положить, что излучение КВЧ-диапазона может провоцировать развитие окис лительного стресса. А так как стресс-зависимая аккумуляция пролина является универсальной ответной реакцией, то интересно проследить, как воздействие излучения отразится на накоплении пролина в прорастающих семенах (рис.7).
Длительность обработки 5 и 10 мин приводит к максимальному увеличе нию содержания пролина по сравнению с другими вариантами. Причем в вари анте с 10 мин превышение наблюдалось уже на первые сутки, а с 5 мин - на вторые и продолжало увеличиваться до конца эксперимента. Накопление про лина происходило равномерно без скачков. При 15 и 30 мин облучения наблю далась иная динамика: в 1 сутки проращивания количество пролина практиче ски не изменилось и осталось на уровне показаний до облучения. На вторые су тки концентрация вещества повысилась и достигла уровня контроля. На третьи сутки существенного отличия от контроля выявлено не было.
Повышение содержа ния пролина при небольших экспозициях КВЧ-излучения (5-10 мин) может служить проявлением начала стрес совой реакции в ответ на действие фактора - включе ния защитной антиокси дантной системы и наступ ления фазы адаптации к фи зическому воздействию.
Рис. 7 Динамика накопления пролина в прорастающих семенах ячменя при воздействии разных экспозиций Снижение же содержания пролина при более длитель излучения с частотой 61,2 ГГц ной экспозиции КВЧ-излучения (15 и 30 мин), возможно, объясняется развити ем глубокой стресс-реакции и связано с его расходом на инактивацию АФК, так как пролин способен к окислительно-восстановительным реакциям (тушению окислительного стресса).
Также можно отметить, что количество накапливаемого при действии из лучения пролина в наших опытах выросло незначительно. Известно, что под действием сильных стрессоров концентрация данного вещества может увеличи ваться в десятки раз. Следовательно, можно предположить, что КВЧ-излучение изученных параметров является небольшим по силе стрессовым фактором.
9. Метаболический и хозяйственный эффект воздействия КВЧ излучения на прорастающие семена ячменя, пшеницы и кукурузы Представленные результаты позволяют говорить о КВЧ-излучении как о факторе, существенно влияющем на процесс прорастания семян. Это соответ ствует представлениям о неспецифической резистентности организма, сход ных адаптационных реакциях на разные внешние стимулы в рамках концеп ции Селье (теории стресса). Согласно этой концепции в ответ на сильное не благоприятное воздействие в организме индуцируются цепь неспецифических реакций, сопровождающихся перестройкой защитных систем – генерализован ный адаптационный синдром, в котором выделяют три стадии: тревоги, рези стентности и истощения (Селье, 1972;
Барабой, 1991). У растений неспецифи ческая реакция носит название фитостресс и также протекает в три стадии: пер вичная реакция, стадия адаптации и стадия истощения (Родченко и др.,1988;
Пахомова, 1995;
Шакирова, 2001). На первой стадии происходит мобилизация защитных сил организма, сопровождающаяся катаболизмом различных биопо лимеров. При воздействии сильного стрессора растение может погибнуть уже на этой стадии. Затем в ходе длительного, но нелетального воздействия насту пает вторая стадия, которая, наоборот, характеризуется активацией синтетиче ских процессов, приводящих часто к усилению выше нормы степени сопротив ляемости клеток организма. И, наконец, если действие стрессогенного агента продолжается, а достигнутая адаптация оказывается недостаточной, то проис ходит истощение резервов живой системы - наступает стадия истощения. Ис черпываются компенсаторные механизмы организма, достигнутая адаптация и сопротивляемость падает ниже нормы, что приводит к его гибели.
В нашем случае после воздействия КВЧ-излучения мы, вероятно, наблю дали фазу первичной реакции, которая сопровождалась торможением анаболи ческих процессов (показатели прорастания снижались). Так, у ячменя и пшени цы под действием излучения по всем вариантам отмечено некоторое торможение ростовых процессов. У кукурузы снижение анаболизма вызвала обработка дли тельностью 5 мин. При этом наблюдалась активация катаболических процессов:
повышение активности –амилаз и протеаз и активный распад запасных полиме ров крахмала и белков. Максимальное преобладание катаболизма над анаболиз мом для ячменя и пшеницы выявлено при экспозиции 15 мин, для кукурузы – мин. Повышение активности пероксидазы и каталазы и содержания пролина также свидетельствует в пользу развития фитостресса при воздействии КВЧ излучения.
Фаза адаптации сопровождается ускорением метаболизма и преобладани ем анаболических процессов – энергия прорастания и лабораторная всхожесть повышались при прорастании ячменя и пшеницы при экспозиции 30 мин и для кукурузы при 10 минутном воздействии.
Видимо, изученные параметры КВЧ-излучения не достигали критических для растений значений и фаза истощения не наступила. Скорее всего, эта фаза может развиться при более длительной или (и) мощной обработке излучением.
Полученные метаболические эффекты воздействия КВЧ-излучения могут быть целенаправленно использованы в процессе производства солода, а также в растениеводстве. На наш взгляд, для производства солода из ячменя и пшеницы можно использовать экспозиции облучения 15 мин, для кукурузы 5 мин. Дан ная обработка позволяет затормозить нежелательные при производстве солода ростовые процессы и сохранить массу солода в результате уменьшения потерь, связанных с удалением корешков и проростков. Активность амилолитических ферментов под действием этих экспозиций излучения снижается незначитель но, а протеолитических - повышается. То есть гидролиз запасных питательных веществ в эндосперме идет по-прежнему активно, о чем свидетельствует сни жение общего белка и повышение содержания моносахаров. При этом полу чившиеся мономеры ограниченно тратятся на ростовые процессы. Повышение содержания моносахаров и снижение общего белка и являются положительны ми для пивоварения, поскольку моносахара в первую очередь сбраживаются дрожжами в процессе спиртового брожения, а высокое содержание белков в со лоде нежелательно, так как в дальнейшем может вызвать помутнение пива.
Применение КВЧ-излучения исследуемых параметров в растениеводстве целесообразно только для обработки семян кукурузы. Излучение длительно стью 10 мин оказывает стимулирующее действие на процесс прорастания. Ис следуемые нами экспозиции КВЧ-излучения в прорастающих семенах ячменя и пшеницы, как правило, тормозили ростовые процессы. Кроме того, для эффек тивного облучения необходимо предварительное замачивание, проводить кото рое для зерновых культур не представляется возможным. Предпосевное зама чивание может применяться только для кукурузы.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, КВЧ-излучение оказывает влияние на прорастание семян.
Выявлена зависимость изменения динамики влагопоглощения у семян, под вергшихся облучению. Получены данные об изменении активности гидролити ческих ферментов, а также содержания основных веществ эндосперма. Обна ружены изменения активности окислительных ферментов (каталазы и перокси дазы) и изменение содержания пролина под действие ММ-волн. Полученные результаты позволяют рассматривать излучение КВЧ-диапазона как физиче ский фактор, оказывающий слабое стрессовое воздействие на прорастающие семена. При этом формирование ответа происходит путем включения неспеци фических реакций.
Изучение трех сельскохозяйственных культур позволило выявить видос пецифичность ответных реакций на воздействие излучения. Тот или иной эф фект воздействия излучения КВЧ–диапазона на данную культуру зависит от времени экспозиции и восприимчивости этой культуры. Путем подбора пара метров излучения представляется возможным направленно регулировать рос товые процессы семян в различных промышленных и сельскохозяйственных целях.
ВЫВОДЫ 1. Под действием КВЧ-излучения происходит изменение морфофизиологи ческих параметров прорастающего семени. Степень этих изменений зависит от параметров воздействия. Так, при большинстве экспозиций, изученных нами, излучение оказывает угнетающее действие на прорастание. Максимальное тор можение анаболических процессов у ячменя и пшеницы вызывает экспозиция 15 мин, у кукурузы 5 мин. Активация ростовых процессов наблюдается у куку рузы, обработанной излучением длительностью 10 мин.
2. Установлено, что под действием излучения происходит изменение скоро сти поглощения воды семенами.
3. Под действием излучения происходит изменение активности основных гидролитических ферментов, и как следствие, изменение в процессах расщеп ления веществ эндосперма. Так, излучение несколько снижает общую актив ность амилаз, что наблюдается практически по всем культурам. Активность протеаз меняется разнонаправлено, но преобладает усиление протеолиза. Дока зано также, что под действием КВЧ-излучения происходит увеличение актив ности ферментов окислительно-востановительного комплекса (каталазы и пе роксидазы), причем степень этих изменений зависит от параметров воздейст вия.
4. Под влиянием КВЧ-излучения исследуемых параметров происходит тор можение анаболических и усиление катаболических процессов в прорастающих семенах злаков, что выражается в изменении содержания основных запасных веществ в эндосперме. Излучение приводит к снижению содержания общего белка эндосперма у ячменя во всех вариантах, у пшеницы при 5 и 10 мин, у ку курузы при 5 мин облучения.
5. Повышение активности ферментов окислительно-востановительного комплекса, рост содержания пролина и преобладание катаболических процес сов подтверждает мнение, что КВЧ-излучение изученных диапазонов является небольшим по силе стрессогенным фактором, а развивающиеся в прорастаю щих семенах ответные реакции можно рассматривать как фазы фитостресса.
6. Видоспецифичность изменения метаболизма при воздействии КВЧ излучения позволяет подобрать время экспозиции для регуляции ростовых процессов семян зерновых культур с целью использования в растениеводстве и производстве солода.
Основные положения диссертации изложены в следующих публикациях:
Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК РФ 1. Калье М.И. Влияние КВЧ-излучения миллиметрового диапазона на физиоло гические процессы прорастания семян пивоваренного ячменя // Вестник Ниже городского государственного университета им. Лобачевского, 2010. - № 2(2).
С. 399-401.
2. Калье М.И. Влияние КВЧ-излучения на содержание пролина в прорастающих семенах ячменя // Биомедицинская радиоэлектроника, 2010.- № 10.- С. 45-48.
Научные статьи и материалы конференций 3. Калье М.И. Изменение физиологии прорастающего семени пивоваренного ячменя при действии КВЧ-излучения миллиметрового диапазона // Материалы второй Международной научно-практической конференции «Медбиотек – 2». – Москва, 2005. С. 66-69.
4. Калье М.И. Изменение физиологии прорастающего семени пшеницы под действием излучения КВЧ-диапазона // Материалы ІІ Международной научно практической конференции «Дни науки – 2006». – Днепропетровск, 2006. С. 22 25.
5. Калье М.И. Особенности прорастания семени пивоваренного ячменя при действии излучения КВЧ-диапазона // Научные труды Нижегородской ГСХА (Агрономия). – Н. Новгород, 2006.- С. 151-153.
6. Калье М.И. Влияние КВЧ-излучение на содержание воды в семенах в про цессе прорастания // Тезисы XІV нижегородской сессии молодых ученых «Ес тественнонаучные дисциплины». – Нижний Новгород, 2009. - С. 128-129.
7. Калье М.И. Влияние КВЧ-излучения на всхожесть семян ячменя и на актив ность фермента амилазы в ячменном солоде // Материалы ІІ Международной научно-практической конференции «Наука и современность - 2010». – Новоси бирск, 2010. - С. 28-33.
8. Калье М.И. Влияние КВЧ-излучения на активность каталазы и пероксидазы в семенах ячменя при прорастании // Материалы Всероссийской научно практической конференции с международным участием «Актуальные пробле мы современной науки и образования», секция биологические науки. – Уфа, 2010. - С. 177-182.
9. Калье М.И. Возможный механизм развития ответной реакции прорастающих семян зерновых культур на воздействие КВЧ-излучения // Актуальные пробле мы гуманитарных и естественных наук. – Москва, 2011. - № 3. – С. 24-26.
10. Влияние КВЧ-излучения на морфофизиологические показатели и актив ность ферментов прорастающих семян зерновых культур // Материалы VII Съез да Общества физиологов России. – Нижний Новгород, 2011. – Часть II. – С. 806.
Сокращения, используемые в работе КВЧ - излучение крайне высокой частоты АФК - активные формы кислорода ПОЛ - перекисное окисление липидов