Структурно-функциональные изменения в онтогенезе растений кукурузы (zea mays l.) под дейстивием ауксина и цитокинина
На правах рукописи
КАЛИНИНА Екатерина Андреевна
СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ В
ОНТОГЕНЕЗЕ РАСТЕНИЙ КУКУРУЗЫ (Zea mays L.)
ПОД ДЕЙСТИВИЕМ АУКСИНА И ЦИТОКИНИНА
03.01.05 – Физиология и биохимия растений
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Москва - 2010
Работа выполнена на кафедре агрономии Федерального государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Калининградский государственный технический университет»
(ФГОУ ВПО «КГТУ»)
Научный руководитель:
доктор биологических наук, профессор Роньжина Елена Степановна
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор Кондратьев Михаил Николаевич кандидат биологических наук Кондратьева Вера Валентиновна
Ведущая организация: государственное Федеральное образовательное учреждение высшего профессионального об разования «Вологодский государ ственный педагогический универ ситет»
Защита диссертации состоится « 19» января 2010 г. в «14.00» часов на за седании Диссертационного Совета Д 220.043.08 при Федеральном государст венном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский государственный аграрный университет – МСХА имени К.А. Ти мирязева» (ФГОУ ВПО «РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева») по адресу: 127550 г. Москва, ул. Тимирязевская, 49;
т. 8(495)976-04-80;
факс:
8(495)976-29-10;
e-mail: [email protected]
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «РГАУ МСХА имени К.А. Тимирязева»
Автореферат разослан « » декабря 2009 г.
Ученый секретарь диссертационного совета Белопухов С. Л.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Проблема пищевых ресурсов человечества мо жет быть успешно решена только путем интенсификации растениеводства и повышения урожайности сельскохозяйственных культур. Одним из эффектив ных приемов управления физиолого-биохимическими процессами, в том числе ответственными за продуктивность растений, является применение фиторегу ляторов. Среди них особое место занимают фитогормоны и их синтетические аналоги. Именно гормональная регуляция является наиболее эффективной сис темой управления жизнедеятельностью растений (Полевой, 1986;
Тарчевский, 2002). Весьма перспективными с точки зрения продуктивности растений явля ются препараты с ауксиновой и цитокининовой активностью. Показано, что ауксины и цитокинины влияют на целый комплекс физиологических и биохи мических программ, оказывая существенные положительные эффекты на важ нейшие процессы, протекающие в растительном организме (Кулаева, 1973, Со колова, 1986;
Основы химической регуляции, 1987;
Борзенкова и др., 1988).
В последние годы благодаря мощному прорыву в исследовании гормо нальной системы регуляции у растений стали относительно понятны молеку лярные механизмы рецепции и трансдукции гормонального сигнала в расти тельной клетке (Kakimoto, 2001;
Takei et al., 2001, 2004;
Романов, 2009 и др.).
Однако роль фитогормонов как регуляторов роста, развития и функционирова ния интактного растения пока исследована недостаточно. Также практически не проведено сопоставления характера многих интегральных эффектов фитогор монов для растений разных систематических групп, в частности, однодольных и двудольных. Например, для однодольных растений показано стимулируемое ауксином удлинение осевых надземных органов за счет активации растяжения клеток (Cocking, 1977;
Полевой, 1989 и др.), для двудольных такая возможность остается недоказанной. В тоже время для травянистых двудольных растений известна активация цитокининами роста изолированных семядолей, листьев и их фрагментов (Miller, 1961;
Кулаева, 1973, и др.), тогда как подобные эффекты для однодольных растений показаны лишь в единичных работах (De Boer, Feieraben, 1978;
Чернядьев, Козловских, 1992;
Kulaeva et аl., 1996). Хорошо из вестно положительное влияние цитокининов на фотосинтез (см., напр. Кулаева, 1973;
Кузнецов, 1995;
Чернядьев,1993, 2000), о роли ауксинов в регуляции это го процесса известно мало (Пузина и др., 2000 и др.).
Специфика молекулярных механизмов действия фитогормонов, их поли функциональность, а также влияние со стороны других органов в единой до норно-акцепторной системе зачастую вызывают сомнения в возможности эф фективной регуляции физиолого-биохимических процессов в интактном расте нии. Однако подобное заключение можно сделать только после детального изу чения влияние фитогормонов, прежде всего ауксинов и цитокининов, на такие интегральные процессы как рост, фотосинтез, дыхание, особенно в системе це лого растения, что до настоящего времени не сделано.
Выяснение этих вопросов особенно важно для эффективного управления формировавнием урожая тех сельскохозяйственных культур, которые возделыва ются в условиях, отличающихся от оптимальных. В Калининградской области такой культурой является кукуруза. Высокая продуктивность этой культуры, определяющаяся С4-типом фотосинтеза и интенсивными ростовыми процесса ми, обусловила ее широкое использование в пищевых и кормовых целях. Одна ко недостаток ФАР, суммы эффективных температур и избыточное увлажнение почвы в критические периоды развития позволяют возделывать эту культуру в Калининградской области лишь на зеленую массу и силос с относительно не высокой урожайностью 13-18 т/га.
Вполне вероятно, что уменьшить действие этих неблагоприятных факто ров на растения кукурузы и повысить ее продуктивность можно с помощью фи торегуляторов ауксиновой и цитокининовой природы.
Исходя из изложенного выше, целью работы явилось изучение действия ауксина (индолил-3-масляной кислоты - ИМК) и цитокинина (6 бензиламинопурина - БАП) на интегральные физиологические характеристики рост, фотосинтетическую и дыхательную функцию вегетативных надземных органов в онтогенезе растений кукурузы.
В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:
1. Охарактеризовать действие ИМК и БАП на рост изолированных коле оптилей, а также стебля и листьев интактных растений кукурузы в онтогенезе.
2. Провести изучение ауксин- и цитокинин-зависимого роста на двух принципиально различных системах: исследуемой (колеоптили кукурузы) и модельной (листовые высечки тыквы). Для этого исследовать влияние ИМК и БАП на ряд физиологических характеристик исследуемых объектов (динамику роста, биоэлектрического тканевого потенциала (БЭП), рН среды инкубации, позволяющих сравнить механизмы действия этих фиторегуляторов.
3. Исследовать влияние ИМК и БАП на рост, мезоструктуру листа, интен сивность фотосинтеза и дыхания листьев кукурузы в системе целого растения.
4. Изучить действие ИМК и БАП на формирование урожая зеленой массы кукурузы.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. ИМК и БАП в оптимальных концентрациях (10-5М и 10-4 М) активируют рост вегетативных надземных органов (изолированных колеоптилей, стебля и листьев интактных растений кукурузы).
2. Ауксин- и цитокинин-зависимый рост растяжением у изученных расти тельных объектов (изолированных колеоптилей кукурузы, листовых высечек тыквы) имеет близкий характер, вызывает сходные изменения БЭП и связан со снижением рН апопласта.
3. ИМК и БАП стимулируют формирование мезоструктуры листа (деление, рост клеток мезофилла, репликацию пластид, накопление фотосинтетических пигментов), активируют фотосинтетическую деятельность листьев интактных растений кукурузы.
4. ИМК и БАП стимулируют дыхательную активность листьев интактных растений кукурузы. Однако при этом отношение интенсивность фотосинте за/интенсивность дыхания повышается.
5. Обработка растений ИМК и БАП увеличивает чистую продуктивность фотосинтеза и может приводить к повышению урожая зеленой массы кукурузы.
Научная новизна. Установлена возможность стимуляции фиторегулято рами ауксиновой и цитокининовой природы роста, развития и функционирова ния (фотосинтеза и дыхания) не только изолированных органов, но и интакт ных растений кукурузы. Проведено сравнительное изучение действия ИМК и БАП на эти процессы на разных этапах онтогенеза растений. Доказана принци пиальная возможность стимуляции с помощью цитокининов роста растяжением клеток листа однодольного растения. Обнаружена стимуляция экзогенными как экзогенным ауксином, так и цитокинином фотосинтетической и дыхательной активности листьев, увеличение отношения фотосинтез/дыхание и чистой про дуктивности фотосинтеза у интактных растений кукурузы. Выявлено сходство ауксин- и цитокинин-зависимого роста растяжением у различных растительных объектов (колеоптилей кукурузы, листовых высечек тыквы). Отмечено пози тивное действие ИМК и БАП на величину урожая зеленой массы кукурузы.
Теоретическая и практическая значимость работы. Работа расширяет и конкретизирует существующие в настоящее время представления о влиянии ауксинов и цитокининов на ростовые процессы, фотосинтетическую и дыха тельную активность листьев интактных растений. Она создает основу для воз можного управления формированием урожая зеленой массы кукурузы с помо щью фиторегуляторов ауксиновой и цитокининовой природы. Результаты рабо ты используются в учебном процессе в ФГОУ ВПО «Калининградский госу дарственный технический университет» в лекционных курсах «Физиология растений» и «Инновационные технологии в АПК» для подготовки студентов сельскохозяйственных специальностей.
Апробация работы. Материалы диссертации представлены на Междуна родной научно-технической конференции, посвященной 70-летию Калинин градского государственного технического университета (Калининград, 2000);
V съезде РОФР, Международной конференции «Физиология растений – основа фитобиотехнологии» (Пенза, 2003);
VI съезде РОФР, Международной конфе ренции «Современная физиология растений: от молекул до экосистем» (Сык тывкар, 2007);
IV Съезде Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинни кова (Пущино, 2006);
научно-практической конференции «Пищевая и морская биотехнология: проблемы и перспективы» (Москва, 2006);
Международных конференциях: «Физиологические и молекулярно-генетические аспекты сохра нения биоразнообразия» (Вологда, 2005);
«Инновации в науке и образовании – 2006, 2007, 2009» (Калининград, 2006, 2007, 2009);
«Sink – Sourсе Relationships in Plants» (Kaliningrad, 2007);
научно-методическом семинаре «Биология расте ний в новом тысячелетии (Калининград, 2008).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 24 работы.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзо ра литературы, описания материалов и методов исследований, изложения полу ченных результатов, их обсуждения, выводов и списка использованной литера туры (330 источников, в том числе 161 - на иностранных языках). Работа изло жена на 158 страницах, содержит 34 рисунка, 6 таблиц.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Основным объектом исследований явилась кукуруза (Zea mays L., гиб рид СТК-189 МВ). Для изучения физиологических эффектов ауксинов и цито кининов на начальных этапах онтогенеза растений, а также анализа гормон зависимого роста проростков кукурузы использовали изолированные колеопти ли. Дополнительно проводили сравнительное изучение гормон-зависимого роста на принципиально иных растительных объектах – листовых высечках тыквы (Cucurbita pepo L., сорт Мозолеевская столовая). Для экспериментов бы ли выбраны ИМК и БАП, как высокоэффективные, наиболее стабильные фито регуляторы с ауксиновой и цитокининовой активностью.
Исследуемые части опытных растений обрабатывали водными раствора ми ИМК и/или БАП, концентрации которых были подобраны в предваритель ных экспериментах, контрольных – дистиллированной водой. Размеры изоли рованных органов определяли на аппарате Микрофот-5-ПО1 (Россия), рН среды инкубации растительных тканей регистрировали на универсальном ио номере (ТМ 6, Россия). Биоэлектрическую активность тканей оценивали по изменению БЭП, измеренного путем экстраклеточного отведения (Методы изу чения мембран…, 1986). Площадь листовой пластинки (S) кукурузы опреде ляли по линейным размерам: S = 0,65. (l. d), где l – длина, d – ширина;
тыквы – весовым методом (Третьяков и др., 2003).
Для анализа действия ауксина и цитокинина на более поздних этапах онтогенеза кукурузы проводили полевые мелкоделяночные опыты на интакт ных растениях. Растения выращивали в открытом грунте с использованием ос новных элементов агротехники, принятой для этой культуры. Норма высева со ставляла 78 кг/га всхожих семян, количество взрослых растений - 100 тыс./га.
Учетная площадь делянки - 10 м2 (схема посадки – 2х5 м), повторность четы рехкратная. Надземную часть опытных растений в фазы всходов, выбрасывания метелки и цветения початков опрыскивали водным раствором ИМК (10-5 М) или БАП (10-4 М) (концентрации подбирали предварительно). Динамику роста интактных растений в онтогенезе оценивали по изменению длины, толщины стебля, площади листа средней формации и суммарной площади листьев (асси миляционного потенциала). Анализ мезоструктуры листа проведен по А.Т.
Мокроносову и Р.А. Борзенковой (1978) на мацерированном (35 мин, 2н HCl, 90°С) материале. Размеры клеток измеряли с помощью винтового окулярного микрометра МОВ-1-15х (Россия). УППЛ (сухую массу единицы площади лис та) определяли путем высушивания листовых высечек определенной площади при температуре 1050 С (Третьяков и др., 2003). Содержание фотосинтетиче ских пигментов анализировали по Веттштейну (Гавриленко и др., 1975) с ис пользованием спектрофотометра «Specol-11» (Carl Zeiss, Германия). Интен сивность фотосинтеза и дыхания определяли бескамерным методом, осно ванным на регистрации увеличении содержания углерода органических ве ществ в листовых высечках на свету и учете его траты в темноте (Бородулина и др., 1985). Содержание органических веществ определяли методом мокрого сжигания в хромовой смеси по Х.К. Аликову с применением этого же спектро фотометра (Третьяков и др., 1990). Чистую продуктивность фотосинтеза (ЧПФ) оценивали в фазу начала цветения початков по приросту сухой массы растений, отнесенному к площади листовой поверхности за учетный период (Гродзинский А.М., Гродзинский Д.М., 1973). Урожай зеленой массы анали зировали в течение 3-х вегетационных сезонов по общей биомассе надземной части растений в фазу молочно-восковой спелости, согласно ГОСТ 13634-90.
Биологическая повторность – 5-10 кратная, воспроизведение – 3-5-кратное.
Результаты обработаны статистически. В таблицах и на рисунках пред ставлены средние арифметические значения, в таблицах дополнительно – дове рительные интервалы, рассчитанные по стандартным отклонениям. Достовер ность различий между вариантами оценивали с помощью дисперсионного анализа при Р = 0,95.
Ряд экспериментов (динамика роста изолированных органов, измерение БЭП, исследование свойств клеточных стенок) проводили в лаборатории функ циональной активности мембран растительных клеток БИНИИ СпбГУ (г.
Санкт-Петербург) в рамках научного сотрудничества под руководством проф.
В.В. Полевого совместно с к.б.н. Е.И. Шаровой (БИНИИ СпбГУ) и Ю.В. Ев тушевской (КГТУ).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ На первом этапе исследований изучили влияние ИМК (10-5М) и БАП (10 М) на рост проростков кукурузы на начальных этапах онтогенеза. Под земное прорастание моделировали с использованием этиолированных пророст ков. При этом использовали две системы – изолированные отрезки 4-суточных этиолированных колеоптилей (15 мм) и аналогичные колеоптили с удаленной на 5 мм верхушкой. В последнем случае предполагали, что у декапитированных колеоптилей существенно снижено содержание эндогенных ауксинов. Отрезки колеоптилей погружали в растворы ИМК (10-5 М) и/или БАП (10-4 М) и изме ряли их длину через 1, 5, 24 и 48 ч.
Обработка ИМК достоверно стимулировала рост колеоптилей в обоих ва риантах уже к 5 ч опыта;
к 24 ч реакция была наиболее выраженной – наблюда ли увеличение длины на треть у декапитированных, и почти в 1,6 раза – у неде капитированных проростков (рис. 1). В последующие 24 ч (48 ч) изменения практически отсутствовали. БАП также стимулировал рост, за 24 ч увеличивая длину этиолированных декапитированных и недекапитированных колеоптилей в 1,3 и 1,4 раза соответственно (рис. 1).
Из проведенных экспериментов следует, что декапитация проростков тор мозила их рост, а обработка ИМК и БАП – стимулировала его. Однако, фиторе гуляторы интенсифицировали рост и недекапитированных растений.
Следующая серия экспериментов была проведенна с этиолированными ос вещенными проростками (имитация выхода растений на поверхность почвы).
Освещение этиолированных колеоптилей несколько затормаживало ростовые процессы в них. ИМК и БАП активировали рост колеоптилей рис.1). Обработка ИМК недекапитированных колеоптилей приводила к увеличению их длины в 2,4, декапитированных – в 2,1 раз за 24 ч. Под действием БАП длина недекапи тированных проростков увеличивалась в 1,6, декапитированных – в 1,8 раз.
Реакция первого листа на освещение и обработку фиторегуляторами была качественно сходной с реакцией освещенных колеоптилей, но количественно более слабой.
Таким образом, в результате проведенных экспериментов было установле но стимулирующее действие ИМК и БАП на ростовые процессы, протекающие в проростках кукурузы на ранних этапах онтогенеза.
4, Изменение длины, мм 3, 2, 1, 0, контроль ИМК БАП ИМК+БАП Варианты опыта Рис. 1. Изменение длины колеоптилей кукурузы при разных условиях об работки за 24 ч.
Контроль – дистиллированная вода, концентрации ИМК - 10-5М, БАП - 10-4М Варианты опыта: 1 – этиолированные недекапитированные проростки в темноте (НСР0,5=0,1);
2 – этиолированные декапитированные проростки в тем ноте (НСР0,5=0,1);
3 – этиолированные недекапитированные проростки, осве щенные (НСР0,5=0,2);
4 – этиолированные декапитированные проростки, осве щенные (НСР0,5=0,3).
Четкая ростовая реакция колеоптилей не только на ауксин, но и на цитоки нин, явилась основой для сравнительного изучения гормон-зависимого рос та растяжением. В настоящее время известно, что ауксин, вызывая удлинение колеоптилей, стимулирует рост клеток растяжением клеток, в частности за счет активации работы Н+ - помпы плазмалеммы, приводящей к выбросу Н+ в апо пласт и серии последующих событий, к увеличению в следствие этого эластич ности клеточной стенки. В сочетании с активацией метаболизма это создает ос нову для роста клеток растяжением. Для цитокининов подобный механизм не установлен. Исходя из изложенных выше результатов, была выдвинута гипоте за, что подобным образом действует не только ауксин, но и цитокинин. Для проверки этой гипотезы были проведены эксперименты по влиянию экзоген ных ИМК и БАП на БЭП, изменение рН среды инкубации колеоптилей, а также инкубирование исследуемых объектов при разных рН.
Для исследования биоэлектрической активности использовали этиоли рованные декапитированные проростки кукурузы и измеряли БЭП. Изменение рН среды инкубации измеряли с интервалом 5-10 мин в течении 1 ч и по ис течению 24 ч. Разные значения рН инкубационной среды создавали при помо щи 2 мМ ацетатного буфера с рН 7,0;
6,5;
3,5. Для проверки универсальности обнаруженных эффектов, аналогичные эксперименты были проведены с листо выми высечками тыквы (двудольного растения).
В результате проведенных экспериментов как под действием ИМК, так и БАП наблюдали:
1. Изменение биоэлектрической активности тканей (рис. 2 а). При этом под влиянием как ИМК, так и БАП в первые 25-30 мин эксперимента происхо дила электронегативация тканевого потенциала на 25-45 мВ, что соответство вало деполяризации плазмалеммы. После этого происходила электропозитива ция БЭП на 8-12 мВ в течение 10-15 мин, соответствовавшая гиперполяриза ции плазмалеммы. Затем наблюдали затухавшие со временем колебания, что, по-видимому, соответствовало выходу Н+ из клетки и последующему входу Са2+ в клетку. Следует отметить, что изменения БЭП под действием БАП были более быстрыми, чем под действием ИМК, а динамика изменения происходив шими при совместном влиянии двух фиторегуляторов была сходной с измене ниями под действием одной ИМК. Таким образом, обработка колеоптилей ре гулятором как цитокиноновой, так и ауксиновой природы приводила к интен сивным колебаниям и значительному снижению уровня БЭП, при этом реакция была сходной, независимо от природы фиторегулятора.
момент обработки контроль Напряжение, мВ БАП (вода) 80 ИМК+БАП ИМК -10 0,0 0,5 1,0 1,5 5,0 5,5 6,0 6,5 24,0 24,5 25,0 25, Время, ч Рис. 2. Изменение БЭП отрезков колеоптилей 4-х суточных этиолирован ных декапитированных проростков кукурузы при действии ИМК, 10-5 М и БАП, 10-4 М.
2. Результаты типичных экспериментов по влиянию ИМК и БАП на рН среды инкубации приведены на рис. 3. Из представленных результатов следует, что внесение как ИМК, так и БАП в среду инкубации колеоптилей кукурузы в первые же минуты вызывало резкое снижение рН с 6,50 до 6,10 – 6,32 (рис. 3 а).
Далее величина рН медленно изменялась и через сутки опыта снижалась до 5,67. Снижение рН среды инкубации растительных тканей под влиянием иссле дуемых фиторегуляторов, скорее всего, указывает на активацию работы Н+ помпы плазмалеммы, которая осуществляет выход Н+ в периплазматическое пространство.
3. Снижение рН инкубационной среды вызывало ускорение растяжения и приводило к увеличению размеров исследуемых растительных тканей, резуль таты типичного эксперимента представлены на рис. 3 б. При этом степень уве личения прямо пропорционально зависит от уровня рН, максимальный эффект зарегистрирован для наиболее низкой из исследуемых рН – 3,5. Следует особо отметить, что наблюдаемый эффект при этом значении рН был практически идентичен как по интенсивности, так и по динамике развития с эффектами, на блюдавшимися после обработки ИМК и БАП.
7,0 25, Изменение длины, мм/сут момент (а) (б) контроль 20, 6, БАП 15, рН 10, 6, ИМК 5, 5,5 0, 24 48 0 0,5 Время, ч Рис. 3. Изменение рН инкубационной среды (2 мМ ацетатный буфер) (а) и длины отрезков колеоптилей 4-х суточных этиолированных декапитирован ных проростков кукурузы при действии ИМК, БАП и рН инкубационной среды (б).
Варианты опыта: 1,4,5 – рН 7,0;
2 – рН 6,5;
3 - рН 3,5;
1-3 - (без фиторегу лятора);
4 – ИМК (10-5 М);
5 - БАП (10-4 М).
Важно, что эти явления были обнаружены нами не только при обработке колеоптилей, но и при обработке растительных тканей принципиально иного типа - листовых высечек тыквы, у которой тоже была зарегистрирована четкая ростовая реакция на ауксин и цитокинин (рис. 4, 5).
момент обработки контроль (вода) Напряжение, мВ 10 БАП ИМК+БАП -10 0,0 0,5 1,0 1,5 5,0 5,5 6,0 6,5 24,0 24,5 25,0 25, - ИМК - -15 Время, ч Рис. 4. Изменение БЭП высечек из растущих (50% Smax ) листьев тыквы при действии ИМК, 10-5 М, БАП, 10-4 М.
(а) (б) Изменение площади, дм2/дм 0, 7,0 момент обработки контроль 0, 6, 0, БАП рН 6, 0, 5,5 0, 0, 5, 24 48 0 50 100 150 200 Время, мин Время, ч Рис. 5. Изменение рН инкубационной среды (2 мМ ацетатный буфер, рН 6,5) (а) и площади высечек из растущих (50% Smax ) листьев тыквы при действии БАП, 10-4 М и рН инкубационной среды (б).
Варианты опыта см. рис. 3.
Таким образом, из представленных результатов можно сделать заключе ние, что обработка фиторегуляторами как ауксиновой, так и цитокининовой природы по целому набору исследуемых характеристик приводит к близким физиологическим эффектам.
Поскольку результаты лабораторных экспериментов подтвердили гипотезу о близких эффектах ауксинов и цитокининов на ряд физиологических характе ристик растений кукурузы на начальных этапах онтогенеза, следующий этап работы был направлен на изучение действия ИМК и БАП на формирование и функционирование растений кукурузы на более поздних этапах онтоге неза. Для этого проводили полевые мелкоделяночные опыты. Надземную часть опытных растений в фазы всходов, выбрасывания метелки и цветения початков опрыскивали водным раствором ИМК (10-5 М) или БАП (10-4 М). Оценивали динамику роста растений по изменению ряда физиологических параметров (см.
материалы и методы исследований). Кроме того, исследовали особенности ме зоструктуры листа, сухую массу единицы площади (УППЛ), содержание фито синтетических пигментов, интенсивность фотосинтеза и дыхания, содержание органических веществ, ЧПФ и урожай зеленой массы растений кукурузы.
Полученные результаты по влиянию ИМК и БАП на физиологические характеристики интактных растений кукурузы представлены на рис. 6, 7 и в табл. 1, 2. Из них следует, что обработка растений фиторегуляторами приводи ла к удлинению и утолщению стебля (рис. 6), стимуляции роста листьев, прояв лявшейся в увеличении УППЛ (табл. 1), площади каждого отдельного листа и ассимиляционного потенциала (суммарной листовой поверхности) растений в целом (рис. 7).
Кривые роста стебля и листьев представленные в натуральном и полулога рифмическом виде, имеют типичную S-образную форму. На них хорошо про сматриваются типичные фазы роста. Стоит отметить отсутствие лаг-фазы (на чальной фазы) и немедленное наступление фазы ускорения роста у растений как контрольного, так и опытных вариантов. Продолжительность фазы экспо ненциального роста в пределах разных вариантов составила 10-15 сут. Фаза за медления роста наступала на 20-30 сут, а переход в стационарную фазу, как правило, – на 50 сут. Влияния фиторегуляторов на ускорение прохождения фаз роста не обнаружено, однако четко отмечено их действие на интенсивность ростовых процессов, характеризующееся увеличением конечных размеров ор ганов интактных растений кукурузы.
Степень проявления эффектов различалась на разных стадиях развития растений. После обработки всходов фиторегуляторами нам не удалось зареги стрировать заметного увеличения длины или толщины стебля растений. Однако более поздняя обработка ИМК или БАП 50-суточных растений в фазу выбра сывания метелки уже существенно увеличивала длину стебля, которая к концу опыта превышала длину растений контрольного варианта на 20 (ИМК) и 14% (БАП) (рис. 6 а). Диаметр стебля под влиянием фиторегуляторов увеличивался на 13-19% (рис. 6 б).
(а) (б) 2 3, 250, 3 Диаметр стебля, см 2, 200,0 1 Длина стебля, см 2, 150, 1, 100, 1, 50,0 0, 0, 0, 0 20 40 60 0 20 40 60 (в) (г) 4, 4, 2 3, 3 3, Ln X/X Ln Y/Y 1 2, 2, 1, 1, I II III IV I II III IV 0, 0, 0 20 40 60 0 20 40 60 Возраст растений, сут Рис. 6. Кривые роста стебля растений кукурузы в онтогенезе при действии ИМК, 10-5 М (2) и БАП, 10-4 М (3);
(а, в) – длина стебля (Х) (НСР0,5 = 3,4);
(б, г) – диаметр стебля (У) (НСР0,5 = 0,1) 1 – контроль (без фиторегулятора):
Стрелками показано время обработки фиторегуляторами Фазы роста: I - фаза ускорения роста;
II – фаза экспоненциального роста;
III – фаза замедления роста;
IV – стационарная фаза.
ИМК стимулировала рост листьев, приводя к увеличению площади листа средней формации на 21, а суммарной листовой поверхности - более чем на 40%. Проявление эффекта наблюдали после второй обработки 50-суточных растений, он сохранялся до конца эксперимента (рис. 5). Площадь отдельного листа под действием БАП увеличивалась также на 20%, однако суммарная площадь листьев у опытных и контрольных растений статистически достоверно не отличалась, существовала лишь тенденция к увеличению этой величины.
Третья обработка 70-суточных растений в фазу цветения початков дополни тельно не приводила к существенному увеличению длины, диаметра стебля или площади листьев.
В наших опытах УППЛ обработанных ИМК листьев была на 5, а БАП – почти на 8% больше, чем контрольных (табл. 1).
Из литературных данных известно, что величина УППЛ свидетельствует, в первую очередь, об оптимизации работы фотосинтетического аппарата расте ний (Чернядьев, 2002).
(а) (б) 5,00 160, Площадь листа, дм Суммарная площадь 2 4, 3 120, листьев, дм 1 3, 80, 2, 40, 1, 0, 0, 0 20 40 60 0 20 40 60 6, (в) (г) 5,0 5, 4, 3 4, Ln Z/Z Ln H/H 3, 3, 2,0 2, 1,0 1, I II III IV I II III IV 0, 0, 0 20 40 60 0 20 40 60 Возраст растений, сут Рис. 7. Кривые роста листьев растений кукурузы в онтогенезе при действии ИМК, 10-5 М (2) и БАП, 10-4 М (3);
(а, в) – площадь листа средней формации (Z);
(б, г) – суммарная площадь листьев на растении (H), (НСР0.5=1,9).
1 – контроль (без фиторегулятора). Фазы роста как на рис. 6.
Таблица 1. Действие ИМК и БАП на УППЛ листа средней формации интакт ного растения кукурузы Варианты обработки УППЛ мг/см % от контроля Контроль (без фиторегулятора) 0,520 + 0,017 100, - Опыт ИМК, 10 М 0,547 + 0,018 105, - БАП, 10 М 0,560 + 0,015 107, Примечание. Растения обрабатывали фиторегуляторами в фазу полного появле ния всходов (10 сут.), начала выбрасывания метелки (50 сут.);
анализировали – суточные растения.
Таким образом, в результате проведенных экспериментов был зарегистри рованы стимулирующие эффекты ИМК и БАП на рост различных типов вегета тивных органов однодольного растения (стебля, листьев) и установлена онтоге нетическая динамика этих явлений. Однако необходимо отметить, что ауксин в этом отношении был более эффективен, поскольку он действовал в меньших концентрациях (10-5 М), чем цитокинин (10-4 М) и в ряде случаев оказывал бо лее сильный ростовой эффект (рис. 6-7).
Весьма важным результатом работы явилось установления того факта, что стимуляция роста была получена нами не только в модельных системах изолированных органах, но и в системе целого растения. Этот факт представ ляет несомненный интерес с теоретической и практической точки зрения, по скольку на интактном растении ответную реакцию на фиторегуляторы по ряду причин наблюдать сложнее.
Хорошо известно, что продуктивность зависит не только от интенсивности ростовых процессов, но и от фотосинтетической и дыхательной деятельности растений (Ничипорович, 1982). Существенное значение также имеет соотноше ние активности фотосинтеза и дыхания. В связи с этим, ряд экспериментов был связан с изучением влияния ИМК и БАП на эти процессы.
Как показали исследования, проведенные другими авторами на большом числе видов и сортов сельскохозяйственных растений, основными морфологи ческими характеристиками, по изменению которых можно судить о фотосинте тической деятельности растений являются УППЛ (табл. 1), ассимиляционный потенциал, а так же мезоструктура листа (Мокроносов, 1994;
Васильчук и др., 2000).
Данные по действию ИМК и БАП на УППЛ и ассимиляционный потенци ал растений представлены выше (табл. 1, рис. 7). При анализе мезоструктуры было зарегистрировано, что обработка ИМК и БАП приводила к увеличению числа клеток в листе в 1,7 под действием ИМК и 1,3 раза под влиянием БАП, вероятно за счет активации клеточных делений. Фиторегуляторы стимулирова ли увеличение объема клеток мезофилла, который под действием ИМК изме нялся в 1,4, БАП – в 1,6 раза. О степени увеличения объема говорит не только увеличение средних арифметических значений, но также и сдвиг максимума функции распределения в сторону бльших значений, отражающий появление новых фракций клеток бльшего объема, отсутствовавших в листьях необрабо танных растений (рис. 8).
Под действием фиторегуляторов увеличивалось также количество хлоропла стов в клетках хлоренхимы листа (рис. 8). Характер распределение клеток ме зофилла по числу хлоропластов отчетливо свидетельствуют о сдвиге экстрему мов функции распределения в сторону увеличения числа хлоропластов в клет ках, обработанных ИМК или БАП листьев. В частности, в результате обработки ИМК, и особенно БАП в листе появлялись новые фракции клеток с увеличен ным до 120-149, а в отдельных клетках до 154 числом хлоропластов.
Частота встречаемости % 40 (а) 12,0-14, 15,0-17, 18,0-20, 21,0-23, 24,0-27, 9,0-11, 3,0-5, 6,0-8, 0-2, Объем, тыс. мкм Частота встречаемости % (б) 120 - 150 - 90 - 30 - 60 - 1 - Число хлоропластов, 1/кл Рис. 8. Действие 10-5 М ИМК (2) и 10-4 М БАП (3) на распределение клеток мезофилла листа кукурузы по объему (а) и по числу хлоропластов (б).
1 – контроль (без фиторегулятора).
Сроки обработки и анализа растений – см. табл. 1.
Позитивное действие ИМК и БАП на фотосинтетический аппарат растений выражалось также и в увеличении содержания фотосинтетических пигмен тов - хлорофиллов и каротиноидов в листьях (табл. 2). После третьей обра ботки растений ИМК содержание хлорофиллов a и b возрастало на 17, БАП – на 47%. Эти факты свидетельствовали о потенциально более эффективном погло щении и преобразовании энергии ФАР обработанными растениями.
Таблица 2. Действие ИМК и БАП на содержание фотосинтетических пигмен тов (мг/дм2) в листе средней формации растений кукурузы Хлорофиллы Варианты опыта Кароти a в a+b a/b ноиды 13.08.2004 (60 – суточные растения) Контроль (без 1,7 ± 0,3 1,0 ± 0,4 2,7 1,7 0,2 ± 0, фиторегулятора) ИМК (10-5 М) 1,9 ± 0,6 1,1 ± 0,1 3,0 1,7 0,6 ± 0, - БАП (10 М) 2,0 ± 0,1 1,3 ± 0,5 3,3 1,5 1,0 ± 0, 06.09.2004 (80-суточные растения) Контроль (без 2,1 ± 0,1 1,4 ± 0,2 3,5 1,5 1,4 ± 0, фиторегулятора) ИМК (10-5 М) 2,6 ± 0,1 1,5 ± 0,5 4,1 1,7 1,6 ± 0, - БАП (10 М) 2,9 ± 0,2 1,8 ± 0,4 4,7 1,6 1,7 ± 0, Примечание. Растения обрабатывали фиторегуляторами 12.06.2004 (фаза пол ного появления всходов);
03.08.2004 (фаза начала выбрасывания метелки) и 27.08.2004 (фаза полного цветения початков). В таблице указаны даты опреде ления пигментов и возраст растений.
Анализ мезоструктуры позволил нам предположить, что и ИМК, и БАП могут оказывать позитивное влияние на фотосинтез интактных растений ку курузы. Наши исследования показали, что, действительно, ИМК и БАП стиму лировали фотосинтез, увеличивая фотосинтетическую активности единицы площади листа (рис. 9). В середине вегетации, через 10 дней после второй об работки 50-суточных растений ИМК, интенсивность фотосинтеза возрастала в 1,3, а БАП - в 1,6 раза. Вероятно, это явилось следствием обнаруженного пози тивного влияния фиторегуляторов на формирование (количество, объем) клеток мезофилла и снижение за счет этого мезофилльного сопротивления, а также на количество пластид и содержание фотосинтетических пигментов. Стоит отме тить, что влияние БАП на интенсивность фотосинтеза было достоверно более сильным, чем ИМК.
Таким образом, обработка ИМК и БАП приводила к стимуляции роста рас тений кукурузы в генеративную фазу развития (фазы выбрасывания метелки и цветения початков), а также к изменению структурно-функциональных особен ностей листа. При этом наблюдаемые эффекты были сходными для фиторегу ляторов ауксиновой и цитокининовой природы.
При анализе интенсивности дыхания было установлено, что оба фиторе гулятора приводят к его активации, очевидно, улучшая субстратное и энергети ческое обеспечение ростовых процессов. Причем и в этом случае БАП оказывал более сильное влияние, чем ИМК. У 60-сут растений (фаза выбрасывания ме телки) после второй обработки ИМК или БАП интенсивность дыхания увели чивалась соответственно в 1,1 и 1,5 раз (рис. 9).
15 мг СО2 /(дм2* ч) (а) (б) мг СО2/ (дм2*ч) Фотосинтез, Дыхание, 5 0 1 2 1 2 Варианты опыта Рис. 9. Действие ИМК, 10-5 М (2) и БАП, 10-4 М. (3) на интенсивность фо тосинтеза (а) и дыхания (б) листьев интактных растений кукурузы (НСР0,5=0,1).
1 – контроль (без фиторегулятора).
Сроки обработки и анализа растений – см. табл. 1.
В этой ситуации принципиальное значение имеет соотношение стимули рующего действия ИМК и БАП на фотосинтез и дыхание. Анализ показал, что стимуляция фотосинтеза каждым из фиторегуляторов существенно выше по сравнению с дыханием, то есть их действие увеличивало отношение фотосин тез/дыхание. Действительно, оценка эффективности функционирования листо вого аппарата показала увеличение чистой продуктивности фотосинтеза в ре зультате обработки растений: в некоторой степени после обработки ИМК, и существенно (в 1,5 раза) при обработке БАП (рис.10).
10,0 Рис. 10. Действие ИМК, 10-5 М (2) ЧПФ, г /(м *сут) и БАП, 10-4 М, (3) на чистую продук 8, тивность фотосинтеза (ЧПФ) листьев 6, интактных растений кукурузы (НСР0,5 = 4,0 0,8). 1 – контроль (без фиторегулятора).
Сроки обработки см. табл. 1. ана 2, лизировали 70 суточные растения.
0, 1 2 Варианты опыта Эти результаты позволили высказать предположение, что обработка расте ний кукурузы как ИМК, так и БАП может повысить накопление органической массы растений.
Заключительная серия экспериментов была направлена на изучение влия ния ИМК и БАП на продуктивность интактных растений кукурузы. Учитыва ли урожай вегетативной массы растений в фазу молочно-восковой спелости (90-сут растений). Обработка фиторегуляторами надземных органов растений кукурузы приводила к увеличению биомассы на 7-9 при использовании ИМК и на 12-14% в результате применения БАП (табл. 3).
Таблица 3. Действие ИМК и БАП на биомассу надземной части (кг с учетной делянки) интактных растений кукурузы в фазу молочно-восковой спелости Сырая масса Варианты 2003 год 2004 год 2005 год обработки % от % от % от кг/10 м2 кг/10 м2 контроля кг/10м контроля контроля Контроль 26 100 34 100 14 (вода) ИМК, 28 108 37 109 15 10-5 М Опыт БАП, 29 112 38 112 16 10-4 М НСР0,5 2,0 - 2,0 - 2,4 В итоге, несмотря на то, что в ряде случаев эффекты БАП были слабее, чем ИМК (см. рис. 6-7), влияние БАП на ЧПФ и урожай зеленой массы оказалось выше, чем ИМК. Возможно, это связано с сильным протекторным действием ци токининов (Кулаева, 1973;
Чернядьев, 2005).
В заключение следует подчеркнуть, что высокая физиологическая актив ность ауксиновых и цитокининовых препаратов, возможность их использова ния в низких концентрациях (г/га) и относительная экологическая безопасность в сочетании с описанными выше физиологическими эффектами этих препара тов делают ауксины и цитокинины перспективными соединениями для исполь зования в растениеводстве.
ВЫВОДЫ 1. ИМК (10-5 М) и БАП (10-4 М) активируют рост вегетативных надземных органов (колеоптилей, стебля, листьев) интактных растений кукурузы в течение всего онтогенеза.
2. Ауксин- и цитокинин– зависимый рост растяжением у различных изу ченных типов растительных объектов (изолированных колеоптилей кукурузы, листовых высечек тыквы) основан на сходных явлениях, связанных с измене нием БЭП и снижением рН апопласта.
3. ИМК и БАП стимулируют формирование мезоструктуры листа (деление, рост клеток мезофилла, репликацию пластид, накопление фотосинтетических пигментов) и активируют фотосинтетическую деятельность листьев интактных растений кукурузы.
4. ИМК и БАП стимулируют дыхание листьев интактных растений кукуру зы, отношение интенсивность фотосинтеза/интенсивность дыхания при этом, повышается.
5. ИМК и БАП увеличивают чистую продуктивность фотосинтеза листьев интактных растений кукурузы.
6. С помощью обработки растений водными растворами ИМК (10-5 М) и БАП (10-4 М) можно увеличить урожай зеленой массы кукурузы на 7-9 и 12 14% соответственно.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ В рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК 1. Калинина Е.А. Влияние ИМК и БАП на рост, фотосинтетическую функцию и продуктивность кукурузы (Zea mays L.) / Е.А. Калинина // Известия ТСХА. – 2009. – № 3. – С. 181-186.
2. Роньжина Е.С. Использование синтетических ауксинов и цитокининов для повышения урожайности зеленой массы кукурузы / Е. С. Роньжина, Е. А.
Калинина // Агро XXI. – 2007. – № 7-9. – С. 36-37.
В региональных и зарубежных изданиях, материалах, съездов и конференций 3. Роньжина Е.С. К вопросу о механизме цитокинин-зависимого роста рас тительных тканей / Е.С. Роньжина, Е.А. Калинина, Ю.В. Евтушевская // Меж дунар. научно-технич. конф., посвященная 70-летию Калининградского государ ственного технического университета: материалы / КГТУ. – Калининград, 2000. Ч. I. - С. 239 - 240.
4. Калинина Е.А. Сравнительная характеристика действия ауксина и ци токинина на рост растительных тканей / Е.А. Калинина // I Агрономическая на учно-практическая конференция студентов, аспирантов и молодых ученых (11-12 апр.): тезисы докладов / КГТУ. – Калининград, 2002. – С. 25.
5. Калинина Е.А. Изучение механизма действия ауксина на рост осевых органов однодольного растения / Е.А. Калинина // Современные проблемы сельского хозяйства: международный сборник научных трудов – Калининград:
Изд-во КГТУ, 2002. - С. 179.
6. Калинина Е.А. Изучение механизма действия ауксина на рост тканей листа двудольного растения / Е.А. Калинина // Вопросы сельского хозяйства:
междунар. сборник научн. трудов. – Калининград: КГТУ, 2003. – С. 134-139.
7. Собещанская Ю.Ю. Влияние цитокинина на химический состав клеточ ных мембран / Ю.Ю. Собещанская, Е.А. Калинина // Физиология растений основа фитобиотехнологии: международная конференция;
V съезд общества фи зиологов растений России (15-21 сент.): тезисы докладов. – Пенза, 2003. – С. 432.
8. Калинина Е.А. Действие ауксина на рост и биоэлектрическую актив ность растительных тканей / Е.А. Калинина, Ю.Ю. Собещанская // Физиология растений - основа фитобиотехнологии: международная конференция;
V съезд об щества физиологов растений России (15-21 сент.): тезисы докладов. – Пенза, 2003. – С. 396.
9. Калинина Е.А. К вопросу о влиянии ауксинов и цитокининов на рост тканей однодольных растений / Е.А. Калинина // Вопросы сельского хозяйства:
международный сборник научных трудов. – Калининград: Изд-во КГТУ, 2004. – С. 194-199.
10. Роньжина Е. С. Регуляция цитокининами роста, развития и продуктив ности зерновых и зернобобовых культур / Е. С. Роньжина, Е. А. Калинина // Физиологические и молекулярно-генетические аспекты сохранения биоразно образия: международная конференция (19 - 23 сент.) – Вологда, 2005. – С. 150.
11. Роньжина Е.С. Изменение биоэлектрической активности тканей листа двудольного растения в связи с проблемой цитокинин-зависимого роста / Е.С.
Роньжина, Е.А. Калинина // Инновации в науке и образовании: международная конференция (20-22 окт.): труды. – Калининград: КГТУ, 2004. – С. 62-63.
12. Роньжина Е. С. Стимуляция цитокининами роста растяжением клеток ме зофилла листа двудольных и осевых органов однодольных растений / Е. С. Ронь жина, Е. А. Калинина // Физиологические и молекулярно-генетические аспекты сохранения биоразнообразия: международная конференция (19-23 сент.).– Воло гда, 2005. – С. 151.
13. Калинина Е. А. Перспективы использования регуляторов роста и раз вития растений цитокининовой и ауксиновой природы для повышения урожай ности сельскохозяйственных культур / Е. А. Калинина, Е. С. Роньжина // Пище вая и морская биотехнология: проблемы и перспективы: научно-практическая конференция (4-5 июля): материалы. – Калининград, 2006. – С. 58.
14. Калинина Е.А. Ауксины и цитокинины в регуляции роста, развития и продуктивности растений / Е.А. Калинина // IV съезд общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (6-7 дек.): материалы. – М.: Пущино, 2006. – С. 90.
15. Роньжина Е.С. Действие ауксина и цитокинина на рост, развитие и формирование урожая растений кукурузы / Е.С. Роньжина, Е.А. Калинина // Проблемы сельского хозяйства: международный сборник научных трудов. – Калининград: КГТУ, 2006. – С. 249-256.
16. Калинина Е. А. Влияние ауксина и цитокинина на рост и биоэлектриче скую активность органов однодольных и двудольных растений / Е. А. Калинина // Инновации в науке и образовании: IV междунар. науч. конф. (18-20 окт.): тру ды: в 2-х ч. / КГТУ. – Калининград: Изд-во КГТУ, 2006. – Ч. I. – С. 141.
17. Kalinina E. A. The Effect of Auxin and Cytokinin on the Sourсе Function of Leaves and Crop Formation in Zea mays Plant / E. A. Kalinina, E. S. Ron'zhina // Sink-Sourсе Relationships in Plants: International Symposium (May, 21 – 26). – Ka liningrad, 2007. – P. 32.
18. Роньжина Е.С. Цитокинины и ауксины в регуляции роста и развития растений / Е.С. Роньжина, Е.А. Калинина // Современная физиология расте ний: от молекул до экосистем: междунар. конф. – VI съезд Общества физиоло гов растений России (18-24 июня): материалы: в 3-х ч. – Ч. I. – Сыктывкар, 2007. – С. 354-355.
19. Роньжина Е.С. Возможность использования ауксинов и цитокининов для повышения урожайности зерновых культур на примере кукурузы (Zea mays L.) / Е.С. Роньжина, Е.А. Калинина // Современная физиология растений: от моле кул до экосистем: междунар. конф. – VI съезд Общества физиологов растений России (18-24 июня): материалы: в 3-х ч. – Ч. I. – Сыктывкар, 2007. – С. 353-355.
20. Калинина Е.А. Использование регуляторов роста и развития растений - перспективное направление современного растениеводства / Е.А. Калинина, Е.С. Роньжина / Инновации в науке и образовании: V междунар. науч. конф.
(23-25 окт.): труды: в 2-х ч. / КГТУ. – Калининград. Изд-во ФГОУ ВПО «КГТУ». – 2007. – Ч. 1. – С. 160-161.
21. Роньжина Е.С. Химическая регуляция роста, развития и углеродного метаболизма как фактор повышения продуктивности растений / Е.С. Роньжина, Е.А. Калинина, И.Н. Волошина и др. // Инновации в науке и образовании:
V международная научная конференция (23-25 окт.): труды: в 2-х ч. / КГТУ. – Калининград. Изд-во ФГОУ ВПО «КГТУ», 2007. – Ч. 1. – С. 164-166.
22. Роньжина Е.С. Сравнительный анализ действия ауксина и цитокинина на рост и продуктивность однодольных и двудольных растений / Е.С. Роньжи на, Е.А. Калинина // Известия КГТУ. – 2007. – №12. - С. 125-131.
23. Калинина Е.А. Возможность использования ИМК и БАП для повышения урожая зеленой массы кукурузы (Zea mays L.) / Аграрная наука и практика: про блемы и перспективы», посвященная 270-летию со дня рождения великого рус ского агронома А.Т. Болотова: научно-практ. конф. (20-23 окт.): материалы. – Ка лининград, 2009. – С. 26-32.
24. Калинина Е.А. О возможности применения ауксина и цитокинина в технологии выращивания кукурузы / Е.А. Калинина // Инновации в науке и об разовании: междунар. науч. конф. (20-22 окт.): в 2-х ч. / КГТУ. – Калининград.
Изд-во ФГОУ ВПО «КГТУ», 2009. – Ч. 1. – С. 139-141.
Заказ № Подписано к печати 02.12.2009. Формат 6084/ Объем 1,0 усл. п.л Тираж 125 экз.
Отпечатано УОП ФГОУ ВПО «Калининградский государственный технический университет».
236022, г. Калининград, Советский проспект,